Artykuł metodologiczny

Izolacja naciekających leukocytów ze skóry myszy za pomocą trawienia enzymatycznego i separacji gradientowej

DOI:

10.3791/53638

⸱

25 stycznia 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Macalester College, 2Department of Medicine, Division of Rheumatic and Autoimmune Diseases, Center for Immunology, University of Minnesota

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje enzymatyczne trawienie skóry myszy w pożywce bogatej w składniki odżywcze, a następnie separację gradientową w celu wyizolowania leukocytów. Uzyskane w ten sposób ogniwa mogą być wykorzystywane do różnych zastosowań końcowych. Jest to skuteczna, ekonomiczna i ulepszona alternatywa dla maszyn do dysocjacji tkanek i ostrzejszych protokołów trawienia tkanek opartych na trypsynie i dyspazie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dysocjacja mysiej skóry w zawiesinie pojedynczej komórki jest niezbędna do dalszej analizy komórkowej, takiej jak charakterystyka naciekających komórek odpornościowych w modelach zapalenia skóry u gryzoni. W tym miejscu opisujemy protokół trawienia skóry myszy w bogatym w składniki odżywcze roztworze z kolagenazą D, a następnie separacji komórek krwiotwórczych za pomocą nieciągłego gradientu gęstości. Uzyskane w ten sposób komórki mogą być wykorzystane do badań in vitro, transferu in vivo oraz innych dalszych analiz komórkowych i molekularnych, w tym cytometrii przepływowej. Protokół ten jest skuteczną i ekonomiczną alternatywą dla drogich mechanicznych dysocjatorów, specjalistycznych kolumn separacyjnych i ostrzejszych metod trawienia opartych na trypsynach i dyspazie, które mogą zagrozić żywotności komórkowej lub gęstości białek powierzchniowych istotnych dla charakterystyki fenotypowej lub funkcji komórkowej. Jak pokazano w naszych reprezentatywnych danych, protokół ten wytworzył wysoce żywotne komórki, zawierał specyficzne podzbiory komórek odpornościowych i nie miał wpływu na integralność wspólnych białek markerów powierzchniowych stosowanych w analizie cytometrii przepływowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroby skóry, począwszy od kontaktowego zapalenia skóry, egzemy, łuszczycy, cellulitu, infekcji grzybiczych i ropni, a skończywszy na nieczerniakowym raku skóry, zostały uznane za jedne z 50 najbardziej rozpowszechnionych chorób na świecie i czwartą najczęstszą globalną przyczynę chorób niezakończonych zgonem w 2010 roku1. W związku z tym badanie mechanizmów molekularnych i komórkowych leżących u podstaw różnych patologii skóry jest niezbędnym i aktywnym obszarem badań. Modele gryzoni okazały się niezwykle przydatne w zrozumieniu stanów zapalnych skóry, takich jak atopowe zapalenie skóry2, łuszczyca3 lub zakażenie Staphylococcus aureus 4. Niedrogie, wydajne i proste protokoły enzymatycznego trawienia tkanki skóry myszy mogą zapewnić przygotowanie komórek, które można wykorzystać do różnych dalszych zastosowań, aby lepiej zrozumieć patofizjologię chorób skóry. W tym miejscu opisano prostą i ekonomiczną metodę enzymatycznego trawienia tkanki skórnej myszy i izolacji leukocytów naciekających skórę, które można wykorzystać do hodowli komórek, transferu adoptywnego in vivo, analizy cytometrii przepływowej i sortowania lub badań ekspresji genów. Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny leukocytów naciekających skórę o wysokiej żywotności komórek, przy jednoczesnej minimalizacji kosztów zwykle związanych z niestandardowymi zestawami odczynników i dysocjatorami mechanicznymi.

Istniejące metody dysocjacji tkanki skórnej5-7 mogą skutkować niską żywotnością komórek i integralnością markerów powierzchniowych, lub wymagać niestandardowych zestawów enzymatycznych i drogich maszyn do dysocjacji tkanek8-11. Podczas gdy trawienie tkanki skórnej ucha myszy jest dość powszechne12-13, trawienie silnie zrogowaciałej tkanki skórnej (np. z boku) może skutkować zanieczyszczeniem preparatów komórkowych dużymi ilościami zanieczyszczeń niekomórkowych. W niedawnym badaniu Zaid i współpracownicy trawili skórę boku myszy przez 90 minut w 2,5 mg / ml dispazy, a następnie 45 minut w 3 mg / ml kolagenazy7. W innym badaniu naukowcy wykorzystali wiele inkubacji z łącznym trawieniem trwającym 2,5 godziny, w tym użycie trypsyny/EDTA, kolagenazy III i dyspazy5. Stosowanie trypsyny nie jest zalecane do enzymatycznego trawienia skóry, ponieważ wykazano, że leczenie trypsyną różnych producentów mierzalnie wpływa na integralność białek powierzchniowych komórek na komórkach ssaków14-15. Ponadto dyspaza może mieć znaczący wpływ na zdolności proliferacyjne limfocytów T CD4 i CD8α oraz wpływać na obfitość powierzchniową co najmniej 20 cząsteczek, w tym powszechnych markerów aktywacji limfocytów T, takich jak CD62L16. Inne protokoły wykorzystują RPMI 1640 w pożywce mineralizacyjnej6. Jednak obecność Mg2+ i Ca2+ w RPMI może powodować rozległą agregację komórek17.

Idealny protokół dysocjacji tkanek powinien dążyć do wysokiej żywotności komórek, niskiego poziomu agregacji komórek i minimalnego uszkodzenia białek na powierzchni komórki. Wysokiej jakości preparaty komórek zrębu węzłów chłonnych zostały osiągnięte dzięki protokołom, które wykorzystują krótsze inkubacje enzymów, pożywki wolne od Ca2 + i Mg2 + oraz unikają trypsyny i dyspazy18. Jednak protokoły tego typu nie zostały ustalone dla dysocjacji całej skóry myszy.

Tutaj opisany jest protokół dysocjacji, izolacji i wzbogacania leukocytów infiltrujących skórę od skóry boku myszy z alergenem. Krótko mówiąc, wycięta skóra jest wstępnie inkubowana w Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) z 10% płodową surowicą bydlęcą przez 1 godzinę, aby zmiękczyć tkankę do trawienia i usunąć nadmiar martwej skóry lub tkanki tłuszczowej. Następnie następuje 30-minutowy etap trawienia enzymatycznego z 0,7 mg / ml kolagenazy D. Kolagenaza D ma minimalny wpływ na gęstość markerów powierzchniowych komórek i nie ma wpływu na proliferację limfocytów T in vitro16,18, dzięki czemu doskonale nadaje się do zastosowań obejmujących charakterystykę białek powierzchniowych. Po trawieniu enzymatycznym zastosowano wirowanie w nieciągłym gradionym gradiencie gęstości w celu usunięcia komórek nabłonkowych i zanieczyszczeń z zawiesiny jednokomórkowej oraz wzbogacenia w komórki hematopoetyczne. Co ważne, procedura ta pozwala uniknąć kosztownych kolumnowych odczynników do magnetycznej separacji komórek i maszyn do dysocjacji tkanek8-11 i może być wykonywana przy użyciu sprzętu i materiałów znajdujących się w podstawowym laboratorium badań biomedycznych. W tym przypadku protokół ten został wykorzystany do wyizolowania leukocytów ze skóry boku, trzykrotnie prowokowanej haptenem oksazolonem (Ox) u wcześniej uczulonych szwajcarskich myszy ND4 (zaadaptowanych z 19). Komórki analizowano za pomocą wieloparametrycznej cytometrii przepływowej. Technika ta pozwoliła uzyskać zawiesinę komórek z minimalnymi zanieczyszczeniami i >95% żywotnością izolowanych limfocytów, które analizowano za pomocą wieloparametrycznej cytometrii przepływowej w celu zmierzenia infiltracji limfocytów T i neutrofili do dotkniętej skóry.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga: Do tych badań wykorzystano 8-12 tygodniowe samice szwajcarskich myszy Webster ND4, tradycyjnie trzymane ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody. Zastosowany protokół eksperymentalny (B13S1) został zatwierdzony przez IACUC Macalester College.

1. Uczulenie i wyzwanie z Oxazolonem

  1. Dzień 0
    1. Przygotuj komorę anestezjologiczną, dodając 3 ml izofluranu do chłonnych ręczników umieszczonych pod siatką na dnie szklanego słoika o pojemności 4 litrów. W przypadku użytych tutaj samic myszy ND4 czas w komorze wynosi 30-60 sekund, aż badany zostanie odpowiednio znieczulony; Zoptymalizuj podawanie środka znieczulającego dla używanego szczepu myszy.
    2. Ogol grzbiet i bok każdej znieczulonej myszy za pomocą trymera do sierści zwierzęcej.
  2. Dzień 1
    1. Sporządzić 2% roztwór 4-etoksymetyleno-2-fenylo-2-oksazolin-5-onu (Ox) na absolutny etanol i inkubować w temperaturze 50 °C przez 15 minut na obracającej się płytce w inkubatorze.
    2. Krótko znieczulić myszy za pomocą znieczulenia izofluranem, jak opisano w 1.1.1 i nałożyć 100 μl 2% Ox na ogolone plecy w kilku seriach po około 20 μl każda. Odczekaj 5-10 sekund między kolejnymi aplikacjami, aż roztwór wyschnie.
    3. Uważaj, aby nie rozlać 2% roztworu Ox na obszary inne niż plecy i poczekaj, aż roztwór wyschnie między aplikacjami.
  3. Dni 5-7
    1. Sporządzić 1% roztwór (Ox) w absolutnym etanolu i inkubować w temperaturze 50 °C przez 15 minut na obracającej się płytce w inkubatorze.
    2. Delikatnie, ale stanowczo unieruchomij mysz na karku i podstawie ogona z brzuchem skierowanym do góry i szyją lekko pochyloną w dół (podobnie jak w przypadku wstrzyknięcia dootrzewnowego) i nałóż 100 μl 1% Ox na ogolony bok w kilku seryjnych aplikacjach, a następnie poświęć trochę czasu na wysuszenie skóry, jak opisano powyżej.
    3. W przypadku myszy kontrolnych nanieść 100 μl bezwzględnego nośnika etanolu na ogoloną flankę.

2. Zbieranie skórek z flanki

  1. Poddaj myszy eutanazji za pomocą inhalacji dwutlenkiem węgla i ostrożnie wytnij pożądany obszar skóry boku (~25 mm x 25 mm skóry) nożyczkami chirurgicznymi o długości 10 cm.
  2. Za pomocą czystego, ostrego ostrza chirurgicznego zeskrob nadmiar tłuszczu i tkanki łącznej ze skóry boku.
  3. Umieść 3 kawałki skóry boku od 3 myszy w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml RT HBSS [z czerwienią fenolową, bez wapnia i magnezu, 5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 10 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS)].

3. Mycie tkanek przed trawieniem

  1. Umieścić probówkę zawierającą fragmenty skóry na obracającej się płytce na 30 minut w suchym, niegazowanym inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 37°C.
  2. Wirować energicznie przez 10 sekund pod koniec okresu inkubacji.
  3. Przecedzić zawartość probówki przez sitko o średnicy 70 μm, aby wyrzucić bufor do płukania i zebrać tkankę. Pojedyncze sitko może być ponownie wykorzystane podczas całej procedury w ramach grupy leczenia biologicznego.
  4. Za pomocą kleszczy przenieść skórę boczną z sitka do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml świeżej pożywki RT HBSS (zawierającej EDTA, HEPES i FBS, jak opisano powyżej).
  5. Za pomocą 12,5 cm nożyczek chirurgicznych do preparacji zanurzonych w probówce, zmiel każdy kawałek skóry bocznej tak, aby przeciętny kawałek tkanki miał powierzchnię około 2,2 mm x 2,2 mm.
  6. Umieścić probówkę zawierającą fragmenty skóry na obracającej się płytce na 30 minut w suchym, niegazowanym inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 37°C.
  7. Wirować energicznie przez 10 sekund pod koniec inkubacji

4. Trawienie skóry przez kolagenazę

  1. Przecedzić zawartość probówki przez sitko o średnicy 70 μm, zebrać i przenieść kawałki skóry bocznej do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml świeżej pożywki RT HBSS uzupełnionej 0,7 mg/ml kolagenazy D.
  2. Umieścić probówkę zawierającą pożywkę wytrawiającą i fragmenty skóry na obracającej się płytce na 30 minut w suchym, niegazowanym inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 37°C.
  3. Pod koniec inkubacji energicznie wirować zawartość probówki przez 10 sekund.
  4. Przefiltrować zawartość probówki przez sitko o średnicy 70 μm do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml; utrzymać przepływ zawierający strawioną tkankę i wyrzucić sitko oraz resztki skóry bocznej.
  5. Przemyć przepływowy roztwór w 50 ml pożywki HBSS, odwirować przez 5 minut przy 350 g i zdekantować supernatant.

5. Wirowanie w gradiencie gęstości

  1. Za pomocą pipety serologicznej dodać 3 ml pożywki wirowej RT o gradientowej gęstości 67% w 1X buforowanej soli fizjologicznej (PBS) do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml dla każdej próbki.
  2. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml pożywki wirowej RT o gradiacji gęstości 44% w HBSS z czerwienią fenolową.
  3. Delikatnie nałożyć 5 ml pożywki wirowej o gradientowej gęstości 44% zawierającej komórki na próbkę pożywki wirowej o gradientowej gęstości 67% za pomocą pipety serologicznej. Upewnij się, że pipetor jest ustawiony na najniższą prędkość i umieść pipetę wzdłuż ścianki stożkowej rurki. Uważaj, aby nie potrząsnąć, nie zakłócić ani nie odwrócić gradientu.
  4. Ustaw przyspieszenie na najniższe ustawienie, wyłącz hamulec i odwiruj nachylenie na poziomie 931 x g przez 20 minut przy RT, upewniając się, że wirówka jest zrównoważona.
  5. Po odwirowaniu ostrożnie usuń gradient z wirówki i delikatnie przetransportuj na stół laboratoryjny, trzymając probówkę w pozycji pionowej. Za pomocą plastikowej pipety transferowej o pojemności 5 ml usuń warstwę komórek na granicy faz pożywki wirowej o gradientowym gradientu gęstości 44% i 67% i przenieś do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Jeśli interfejs nie jest widoczny, po prostu usuń około 2 ml płynu na granicy 67%-44%.
  6. Napełnij stożkową probówkę zawierającą komórki z granicy faz 2% FBS w 1X lodowatym PBS, odwiruj komórki przez 5 minut przy 350 x g i zdekantuj supernatant.
    Uwaga: Jest to pierwszy raz, kiedy komórki mogą być chłodzone/utrzymywane w niskiej temperaturze, ponieważ etapy trawienia odbywają się w temperaturze 37°C, a etapy wirowania w gradiencie gęstości są w temperaturze RT. Komórki można ponownie zawiesić w rozcieńczeniu błękitu trypanowego w stosunku 1:1 i w tym momencie można uzyskać informacje o liczbie i żywotności.

6. Blokowanie i barwienie do analizy cytometrycznej przepływowej

  1. Zablokuj receptory FcγRII/III na komórkach, aby zapobiec nieswoistemu barwieniu przeciwciałami. W opisanych tutaj eksperymentach należy wykonać główne mieszaniny przeciwciał w PBS z 2% FBS zawierającymi 1:100 rozcieńczenie niesprzężonego przeciwciała przeciwko CD16 / 32 (2.4G2) w celu związania i zablokowania receptorów FcγRII / III.
  2. Inkubuj zablokowane komórki z odpowiednimi mieszankami głównymi przeciwciał przeciwko CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8α (53-6,7), CD11b (M1/70), CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 (30-F11), CD45R (RA3-6B2), CD62L (MEL-14) i Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5), a także żywej/martwej barwie Brilliant Violet 510 w celu identyfikacji martwych komórek. Stosować wszystkie przeciwciała w rozcieńczeniu zalecanym przez producentów lub wcześniej zoptymalizowanym przez badaczy. Do opisanych tutaj eksperymentów należy użyć wszystkich przeciwciał w rozcieńczeniu 1:100.
  3. Umyj komórki i ponownie zawieś w 50 μl bufora barwiącego 1X PBS z 2% FBS. Przechowywać na lodzie do czasu, aż dane dotyczące fluorescencji będą mogły zostać uzyskane na cytometrze przepływowym.
    Uwaga: Ważne jest, aby parametry kompensacji były wstępnie zoptymalizowane za pomocą tkanki limfatycznej i wspólnego antygenu powierzchniowego komórki (takiego jak CD4 lub CD8) przed uzyskaniem danych fluorescencyjnych.
  4. Aby zwiększyć liczbę komórek do analizy za pomocą cytometrii przepływowej, należy pozyskać dane z całych próbek barwionych komórek.

7. Analizuj dane cytometrii przepływowej przy użyciu standardowych metod, aby wykonać kroki opisane poniżej

  1. Najpierw bramka w regionie limfocytów wykresu rozproszenia do przodu (obszaru) według bocznego rozrzutu (obszaru).
  2. Następnie zaznacz pojedyncze komórki, używając rozproszenia do przodu (szerokość) przez rozproszenie boczne (szerokość), aby uniknąć analizowania dubletów. Można to również osiągnąć za pomocą wykresu wysokości rozproszenia do przodu na wykresie wysokości punktu bocznego.
  3. Następnie należy wziąć pod uwagę zdarzenia ujemne i CD3-dodatnie (CD11b, CD11c i CD45R/B220), aby wykluczyć odpowiednio makrofagi, komórki dendrytyczne i limfocyty B, a następnie ograniczyć analizy do przedziału limfocytów T, jeśli celem jest, tak jak tutaj, ocena naciekających limfocytów T.
  4. Następnie bramka na żywych komórkach, które wykluczają żywą/martwą plamę.
  5. Na koniec przelej bramkę na interesującej nas populacji komórek (patrz sekcja reprezentatywnych wyników).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Splenocyty traktowane kolagenazą D wykazują podobne poziomy α CD4 i CD8 na limfocytach T w porównaniu do kontrolnych traktowanych pożywką
Po pierwsze, wszelkie potencjalne skutki kolagenazy D na częstość i liczebność powierzchniową markerów linii i aktywacji na podzbiorach limfocytów T oceniono przy użyciu wtórnej tkanki limfatycznej jako kontroli. Zawiesinę splenocytów uzyskano od myszy ND4 i przemyto przez 1 godzinę pożywką HBSS. Na...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Scharakteryzowanie zmian w leukocytach rezydujących w skórze w modelach chorób skóry gryzoni, takich jak atopowe zapalenie skóry lub łuszczyca, jest ważne dla zrozumienia mechanistycznych powiązań między napływem komórek zapalnych a patologią choroby. Tutaj opisujemy ekonomiczną technikę izolowania leukocytów z tkanki skórnej za pomocą podstawowego sprzętu, który można znaleźć w większości laboratoriów badań biomedycznych. Ta stosunkowo szybka technika pozwala uniknąć użycia drogich maszyn do dysocjacji tkanek oraz niest...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych interesów finansowych ani innych do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Narodowe Instytuty Zdrowia (NIH R15 NS067536-01A1 do DC), National Vulvodynia Association (nagroda dla DC) i Macalester College wsparły tę pracę. CB otrzymał stypendium w ramach Macalester College Beckman Scholars Program, ufundowanego przez Fundację Arnolda i Mabel Beckmanów. BTF i TM są obsługiwane przez JDRF 2-2011-662. Dziękujemy dr Jasonowi Schenkelowi i dr Julianie Lewis za porady techniczne, a wszystkim obecnym i byłym członkom laboratorium Chatterjea za ich pomoc i wsparcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
HBSS z czerwienią fenolową, bez wapnia, bez magnezu, płynSigma Aldrich55021CPrzechowywać w sterylnej pozycji do dnia użycia.
HEPES, ≥ 99,5% (miareczkowanie)Sigma AldrichH3375
EDTA roztwór soli disodowejSigmaAldrich E7889Przechowywać w sterylnej formie do dnia użycia.
Płodowa surowica bydlęca, USDA, inaktywowana termicznie, Premium SelectMidSciS01520HIZachowaj sterylność do dnia użycia.
Perkol, pH 8,5-9,5 (25° C)Sigma AldrichP1644Utrzymuj sterylność. Percoll musi być wykonany izotonicznie ze sterylnym 10X PBS przed użyciem.
Zestaw trymerów Combo KentScientificCL9990-1201 Użyj większego trymera do golenia boku i grzbietu.
4-etoksymetyleno-2-fenylo-2-oksazolin-5-onSigma AldrichE0753-10GRozpuścić w 100% EtOH w 50& stopni; C przez 15 minut na obracającej się płycie.
Oczyszczony anty-mysie CD16/CD32 (2.4G2)Tonbo Biosciences70-0161Przeciwciało stosowane do blokowania nieswoistego wiązania przeciwciał podczas barwienia przeciwciał do cytometrii przepływowej
anty-CD3ε-BV650 (145-2C11)Becton Dickinson564378Przeciwciało stosowane do barwienia komórek do cytometrii przepływowej
anty-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)eBioscience47-0042-80Przeciwciało stosowane do barwienia komórek do przepływu cytometria
anty-CD8&alfa;-BV785 (53-6.7)BioLegend100749Przeciwciało stosowane do barwienia komórek do cytometrii przepływowej
anty-CD11b-eFluor450 (M1/70)eBioscience48-0112-80Przeciwciało stosowane do barwienia komórek do cytometrii przepływowej
anty-CD11c-eFluor450 (N418)eBioscience48-0114-80Przeciwciało stosowane do barwienia komórek do cytometrii przepływowej
anty-CD44-BV711 (IM7)Becton Dickinson563971Przeciwciało stosowane do barwienia komórek do cytometrii przepływowej
anty-CD45-FITC (30-F11)Tonbo Biosciences35-0451-U025Przeciwciało stosowane do barwienia komórek do cytometrii przepływowej
anty-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)eBioscience48-0452-80Przeciwciało stosowane do barwienia komórek do cytometrii przepływowej
anty-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)BioLegend104431Przeciwciało stosowane do barwienia komórek do cytometrii przepływowej
anty-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5)BioLegend108407Przeciwciało stosowane do barwienia komórek do cytometrii przepływowej
Ghost Dye-BV510Tonbo Biosciences13-0870-T100Barwnik żywotności do cytometrii przepływowej
LSR FortessaBecton DickinsonN/AAnalizator komórek (18 parametrów)
Kolagenaza D z Clostridium histolyticumRoche Applied Science11088858001Podwielokrotny liofilizowany enzym w dawce 5 mg/ml w HBSS z czerwienią fenolową, bez wapnia i bez magnezu w 1 ml podwielokrotności. Przechowywać natychmiast w temperaturze -20° C przez okres do sześciu miesięcy.
ND4 Szwajcarskie samice myszyHarlan0-32w wieku 8-12 tygodni; konwencjonalnie trzymane z bezpłatnym dostępem do jedzenia i wody oraz używane zgodnie z wytycznymi IACUC Macalester College.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hay, R. J., et al. The Global Burden of Skin Disease in 2010: An Analysis of the Prevalence and Impact of Skin Conditions. J. Invest. Dermatol. 134 (6), 1-8 (2013).
  2. Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. J. Invest. Dermatol. 133 (2), 303-315 (2013).
  3. Gudjonsson, J. E., Johnston, A., Dyson, M., Valdimarsson, H., Elder, J. T. Mouse models of psoriasis. J. Invest. Dermatol. 127 (6), 1292-1308 (2007).
  4. Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Braughton, K. R., DeLeo, F. R. Mouse Models of Innate Immunity. Mouse Models of Innate Immunity: Methods and Protocols. 1031, 109-116 (2013).
  5. Mackay, L. K., et al. Cutting Edge: CD69 Interference with Sphingosine-1-Phosphate Receptor Function Regulates Peripheral T Cell Retention. J. Immun. 194, 2059-2063 (2015).
  6. Schaerli, P., et al. A skin-selective homing mechanism for human immune surveillance T cells. J. Exp. Med. 199 (9), 1265-1275 (2004).
  7. Zaid, A., et al. Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (14), 5307-5312 (2014).
  8. Harris, J. E., Harris, T. H., Weninger, W., Wherry, E. J., Hunter, C. A., Turka, L. A. A mouse model of vitiligo with focused epidermal depigmentation requires IFN-Γ for autoreactive CD8+ T cell accumulation in the skin. J. Invest. Dermatol. 132 (7), 1869-1876 (2012).
  9. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (22), e1029(2008).
  10. Nagao, K., et al. Murine epidermal Langerhans cells and langerin-expressing dermal dendritic cells are unrelated and exhibit distinct functions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 3312-3317 (2009).
  11. Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267(2009).
  12. Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).
  13. Hershko, A. Y., et al. Mast Cell Interleukin-2 Production Contributes to Suppression of Chronic Allergic Dermatitis. Immunity. 35 (4), 562-571 (2011).
  14. Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17 (36), (2010).
  15. Tabatabaei, M., et al. Isolation and partial characterization of human amniotic epithelial cells: The effect of trypsin. Avicenna J Med. Biotechnol. 6 (1), 10-20 (2014).
  16. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
  17. Gu, D., Fan, Q., Xie, J. Cell population analyses during skin carcinogenesis. J. Vis. Exp. (78), e50311(2013).
  18. Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803(2014).
  19. Martinov, T., et al. Contact hypersensitivity to oxazolone provokes vulvar mechanical hyperalgesia in mice. PloS one. 8 (10), e78673(2013).
  20. Katsares, V., et al. A Rapid and Accurate Method for the Stem Cell Viability Evaluation: The Case of the Thawed Umbilical Cord Blood. Lab. Med. 40 (9), 557-560 (2009).
  21. Thomas, M. L., Lefrançois, L. Differential expression of the leucocyte-common antigen family. Immunol. Today. 9 (10), 320-326 (1988).
  22. Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., Albina, J. E. Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice. J. Leukoc. Biol. 83 (1), 64-70 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Leukocyty naciekaj ce sk rtrawienie enzymatyczneseparacja w gradiencie g sto citrawienie kolagenaz Danaliza cytometrycznadysocjacja sk ry mysiejizolacja kom rek hematopoetycznychnieci g y gradient g sto cimetoda wykluczania trypan b kitukom rki CD45 dodatnie

Powiązane artykuły