Badanie białek związanych z powstającym DNA w komórkach ssaków techniką BrdU-ChIP-Slot-Western

Podsumowanie

W tym protokole opisujemy nowatorską technikę BrdU-ChIP-Slot-Western do badania białek i modyfikacji histonów związanych z nowo zsyntetyzowanym lub powstającym DNA.

Streszczenie

Deacetylazy histonowe 1 i 2 (HDAC1,2) lokalizują się w miejscach replikacji DNA. W poprzednim badaniu, przy użyciu selektywnego inhibitora i genetycznego systemu knockdown, wykazaliśmy nowe funkcje HDAC1,2 w progresji widełek replikacyjnych i utrzymaniu powstającej chromatyny w komórkach ssaków. Dodatkowo zastosowaliśmy technikę BrdU-ChIP-Slot-Western, która łączy immunoprecypitację chromatyny (ChIP) DNA znakowanego bromo-deoksyurydyną (BrdU) z plamą szczelinową i analizami zachodnimi w celu ilościowego pomiaru białek lub modyfikacji histonów związanych z powstającym DNA.

Aktywnie dzielące się komórki zostały potraktowane selektywnym inhibitorem HDAC1,2 lub transfekowane siRNA przeciwko Hdac1 i Hdac2, a następnie nowo zsyntetyzowane DNA zostało oznaczone analogiem tymidyny bromodeoksyurydyną (BrdU). Znakowanie BrdU przeprowadzono w momencie, gdy nie było znaczącego zatrzymania cyklu komórkowego lub apoptozy z powodu utraty funkcji HDAC1,2. Po znakowaniu komórek za pomocą BrdU przeprowadzono immunoprecypitację chromatyny (ChIP) znaczników acetylacji histonów lub remodelera chromatyny za pomocą specyficznych przeciwciał. DNA wejściowe znakowane BrdU i DNA immunoprecypitowane (lub ChIPed) zostały następnie naniesione na błonę przy użyciu techniki plamy szczelinowej i unieruchomione za pomocą promieniowania UV. Ilość powstającego DNA w każdym gnieździe została następnie oceniona ilościowo za pomocą zachodniej analizy z przeciwciałem anty-BrdU. Wpływ utraty funkcji HDAC1,2 na poziomy nowo zsyntetyzowanych znaczników acetylacji histonów związanych z DNA i remodelera chromatyny określono następnie poprzez normalizację sygnału BrdU-ChIP uzyskanego z próbek poddanych działaniu substancji do próbek kontrolnych.

Wprowadzenie

Wadliwa naprawa i/lub replikacja DNA są główną przyczyną niestabilności genomu, która może spowodować śmierć komórki. Pojedyncze nienaprawione pęknięcie podwójnej nici wystarczy, aby spowodować śmierć komórki¹. Organizacja chromatyny jest przejściowo zmieniona zarówno podczas replikacji, jak i naprawy^2,3, a brak utrzymania informacji epigenetycznej podczas tych procesów spowoduje zagrożenie integralności genomu. Utrata funkcji HDAC3 lub HDAC1,2 utrudnia progresję fazy S, replikację i naprawę DNA, prowadząc do stresu genotoksycznego (uszkodzenia DNA) i śmierci komórki^4-9. Jest to zatem praktyczna strategia polegająca na stosowaniu selektywnych inhibitorów HDAC w celu zakłócenia replikacji, naprawy i chromatyny w komórkach nowotworowych oraz spowodowania uszkodzenia DNA, co z kolei może zatrzymać wzrost i selektywnie indukować śmierć komórki w szybko rosnących komórkach rakowych.

Podczas replikacji DNA, chromatyna jest szybko demontowana, a następnie ponownie składana po duplikacji DNA. Nowo zsyntetyzowany histon H4 jest acetylowany przy resztach K5 i K12 (H4K5K12ac), a po osadzeniu na chromatynie są szybko deacetylowane przez deacetylazy histonowe (HDAC)^10,11. Niezdolność komórek do utrzymania powstającej integralności chromatyny przez deacetylację histonów może prowadzić do zapadnięcia się wideł, co z kolei może skutkować uszkodzeniem DNA i śmiercią komórki. Niedawno wykazaliśmy, że selektywne hamowanie HDAC1,2 zwiększa acetylację histonów (H4K5ac, H4K12ac i H4K16ac) i hamuje aktywność remodelera chromatyny SMARCA5 powstającą chromatynę, co koreluje ze zmniejszoną progresją widełek replikacyjnych, zwiększonym zapadaniem się widełek i zwiększonym uszkodzeniem DNA wywołanym stresem replikacyjnym⁶. Tak więc leczenie inhibitorem HDAC może zmienić powstającą strukturę chromatyny, aby bardzo szybko wywołać uszkodzenie DNA i śmierć w komórkach rakowych, ponieważ komórki te szybko się zmieniają i wielokrotnie przechodzą przez fazę S. Dlatego ważne jest, aby zrozumieć, w jaki sposób HDAC regulują acetylację histonów i wiązanie białek w celu utrzymania replikacji DNA w komórkach ssaków.

Aby ilościowo zmierzyć ilość acetylacji histonów i SMARCA5 remodelera chromatyny związanego z powstającym DNA podczas replikacji DNA, opracowaliśmy zmodyfikowany test ChIP o nazwie BrdU-ChIP-Slot-Western. Po immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) pożądanej modyfikacji białka lub histonu, ilość powstającego DNA (znakowanego analogiem tymidyny, BrdU) w próbce ChIP można wykryć za pomocą zachodniej analizy DNA ChIP znakowanego BrdU przeniesionego na błonę za pomocą aparatu Slot Blot. Korzystając z tej techniki, wykazaliśmy, że H4K16ac (znak zaangażowany w pakowanie chromatyny) i członek rodziny ISWI SMARCA5 (SWI/SNF-related matrix-associated matrix-dependent regulator chromatyny) remodeler chromatyny są związane z powstającym DNA w komórkach fazy S⁶. Odkryliśmy również, że powstający znacznik H4K16ac jest deacetylowany przez HDAC1,2 podczas replikacji DNA⁶. H4K16ac hamuje aktywność remodelera chromatyny członka rodziny ISWI SMARCA5¹². W związku z tym, korzystając z techniki BrdU-CHIP-Slot-Western, mogliśmy połączyć funkcje HDAC1,2 w regulacji przebudowy chromatyny podczas replikacji DNA. W związku z tym technika BrdU-ChIP-Slot-Western Blot jest potężnym podejściem do ilościowego pomiaru dynamiki asocjacji i dysocjacji białek lub ich modyfikacji potranslacyjnych, które są związane z powstającym DNA.

Protokół

1. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) po znakowaniu BrdU

1. Hodowla komórek NIH3T3 w obecności selektywnych inhibitorów DMSO lub HDAC1,2, jak opisano wcześniej⁶.
2. Po leczeniu selektywnymi inhibitorami DMSO lub HDAC1,2 dodać BrdU do komórek w sterylnym kapturze do hodowli tkankowej. Inkubować 2 x 10⁶ komórek NIH3T3 posianych w 10 ml pożywki NIH3T3 z końcowym stężeniem 20 μM bromodeoksyurydyny (BrdU) przez 60 minut w sterylnym inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 °C.
3. Sieciowanie białek wewnątrzkomórkowych z DNA poprzez dodanie formaldehydu bezpośrednio do pożywki hodowlanej w końcowym stężeniu 1%. Inkubować 2 x 10⁶ komórek NIH3T3 z formaldehydem w temperaturze pokojowej przez 10 minut na shakerze.
4. Ugasić sieciowanie przez dodanie glicyny do końcowego stężenia 125 mM. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut na wytrząsarce.
5. Usunąć pożywkę i zebrać komórki z PBS w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować komórki w temperaturze 956 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Dwukrotnie przemyć osad komórkowy lodowatym PBS. Usunąć PBS z probówki. Usieciowany osad komórkowy bez PBS (supernatantu) należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
6. Przygotować lizat z usieciowanego osadu komórkowego, dodając 500 μl buforu FA140 (50 mM HEPES KOH pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 i 0,1% deoksycholanu sodu) uzupełniony koktajlem inhibitorów proteazy.
7. Ścinaj chromatynę, sonikując próbki pięć razy z mocą 35% i z 15-sekundowym impulsem, 0,9 sekundy włączeniem i 0,1 sekundy wyłączeniem. Utrzymuj probówki na lodzie po każdej rundzie sonikacji, aby uniknąć podgrzewania próbek.
   1. Sprawdź ścinanie na żelu DNA, ponieważ skuteczność ścinania będzie się różnić w zależności od różnych sonikatorów. Aby sprawdzić sonikację, odwróć sieciowanie, dodając NaCl do stężenia 0,16 M i wykonaj kroki 1.17.1. - 1.22. Uruchom elucję 10 μl DNA na 1,5% żelu agarozowym, aby sprawdzić, czy ścinanie wynosi od 300 do 700 pz ze średnią intensywnością przy 500 pz.
8. Po sonikacji odwirować próbki przez 10 minut w temperaturze 17 949 x g w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do nowej probówki.
   1. Wykonaj oszacowanie białka przy użyciu komercyjnego zestawu do oznaczania białek zgodnie z protokołem producenta. Użyć równej ilości lizatu do ChIP próbek kontrolnych i eksperymentalnych. Ogólnie rzecz biorąc, należy użyć 1 mg całkowitego lizatu na reakcję ChIP.
9. Przygotuj 50% zawiesinę białka A-agarozy za pomocą buforu FA140 zawierającego koktajl inhibitorów proteazy. Dodaj 1/10 objętości koktajlu inhibitorów proteazy. Oblicz potrzebną objętość koralików na podstawie całkowitej liczby próbek.
   1. Umyj kulki białkowe A-agarozy buforem FA140 dwukrotnie, aby usunąć bufor do przechowywania i dodaj równą objętość do buforu FA140 do kulek, aby uzyskać 50% zawiesiny.
   2. Aby usunąć białka, które niespecyficznie wiążą się z kulkami, należy dodać 50 μl 50% zawiesiny białka A-agarozy i inkubować próbki w temperaturze 4 °C ze stałą rotacją od końca do końca w mieszalniku rożna przez 30 minut.
10. Wirować próbki w temperaturze 956 x g w temperaturze 4 °C przez minutę. Zebrać supernatant i przeprowadzić immunoprecypitację, dodając do supernatantu 8 μl przeciwciała H4K16ac lub 5 μl (5 μg) 1 mg/ml SMARCA5 przeciwciała. Inkubować w temperaturze 4 °C O/N ze stałą rotacją od końca do końca w mieszalniku rożenowym.
11. Zachowaj 1/10 ekstraktu do kontroli "wejściowej" i odstaw go na bok w temperaturze -20 °C. Dane wejściowe muszą być odwrotnie usieciowane wraz z próbkami IP.
12. Użyć równej ilości króliczej IgG (5 μl z 1 mg/ml) jako próbki immunoprecypitacji kontroli ujemnej.
13. Następnego dnia dodać 50 μl 50% zawiesiny białkowej A-agarozy do ekstraktu i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C z rotacją.
14. Granulki agarozy osadzać przez odwirowanie przy 956 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C, ostrożnie usunąć supernatant i kolejno przemyć kulki następującymi. W preparatach buforowych należy dodać inhibitory proteazy bezpośrednio przed użyciem.
    1. Przemyć kompleksowym buforem płuczącym o niskiej zawartości soli (FA140; końcowe stężenie 50 mM HEPES KOH pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 i 0,1% deoksycholanu sodu) przez 5 minut w temperaturze 4 °C z rotacją od końca do końca.
    2. Przemywać kompleksowym buforem płuczącym o wysokiej zawartości soli (FA500; końcowe stężenie 50 mM HEPES KOH pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 i 0,1% deoksycholanu sodu) przez 5 minut w temperaturze 4 °C z rotacją od końca do końca.
    3. Przemywać buforem płuczącym LiCl Immune Complex (końcowe stężenie 10 mM Tris-Cl pH 8,0, 250 mM LiCl, 0,5% NP40 i 0,5% deoksycholanu sodu) przez 5 minut w temperaturze 4 °C z obrotem od końca.
15. Po przepłukaniu zgodnie z powyższym opisem dodać 200 μl roztworu elucyjnego (końcowe stężenie 1% SDS i 100 mM wodorowęglanu sodu) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut z rotacją od końca do końca w temperaturze pokojowej.
16. Odwirować próbki przy 956 x g w temperaturze pokojowej i przenieść eluat do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Powtórzyć krok 1.15 z dodatkowymi 200 μl roztworu elucyjnego.
17. Do 400 μl eluatu dodać NaCl do stężenia 0,16 M i dobrze wymieszać.
    1. Ponadto dodać 400 μl roztworu elucyjnego do 10 μl wejściowego, który został odłożony na bok (krok 1.11) i dodać NaCl do stężenia 0,16 M, aby również odwrócić sieciowanie próbek wejściowych. Odwrotne sieciowanie próbek poprzez inkubację w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C przez 5 godzin.
18. Dodać 1 ml 100% EtOH do usieciowanego wstecznie usieciowanego eluatu. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze -80 °C przez 2-3 godziny lub w temperaturze -20 °C O/N. Obracać próbki w temperaturze 17,949 x g przez 15 minut i wyrzucić etanol.
19. Dodaj 800 μl 70% etanolu, aby umyć granulki. Wirować w temperaturze 17 949 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i wyrzucić etanol. Krótko zakręć, aby usunąć resztki etanolu. Próbki należy suszyć na powietrzu w temperaturze 37 °C przez 10 minut w celu usunięcia pozostałości etanolu.
20. Rozpuścić DNA w 90 μl wody wolnej od RNaz i DNaz i dodać 2 μl 10 mg/ml RNazy w końcowym stężeniu 0,2 mg/ml. Inkubować w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 30 min.
21. Dodaj 10 μl 10x bufor proteinazy K (100 mM Tris-Cl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0, 5% SDS). Dobrze wymieszać i dodać 1 μl proteinazy K. Inkubować w temperaturze 42 °C przez 1 godzinę.
22. Oczyść DNA wejściowe i ChIP za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z protokołem producenta i eluuj DNA w 50 μl wody. DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.

2. Analiza plam szczelinowych DNA ChIP

1. Zmierzyć wydajność sygnału wejściowego i DNA ChIP eluowanego w 50 μl wody, jak opisano w kroku 1.22, za pomocą spektrofotometru przy długości fali 280 nm zgodnie z protokołem producenta.
2. Weź równe objętości (50 μl) wejściowego lub immunoprecypitowanego DNA, które mieszczą się w liniowym zakresie wykrywania.
   1. Na przykład, jeśli wejściowy wynik DNA wynosi 1,5 ng/μl, weź 30 μl (lub 45 ng całkowitego DNA) i zwiększ objętość do 50 μl wodą. W przypadku czynnika ChIP należy pobrać całe 50 μl eluatu z kroku 2.1 i przejść do kroku 2.3.
3. Denaturować 50 μl wejściowego lub immunoprecypitowanego DNA przez dodanie 2,5 objętości 0,4 N NaOH, krótko wirować i wirować przez 956 x g przez 10 sekund i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
4. Zneutralizować zdenaturowane DNA przez dodanie 175 μl 1 M Tris-HCl o pH 6,8, wirować, odwirowywać przez 956 x g przez 10 sekund i umieścić próbki na lodzie.
5. Przygotować seryjne rozcieńczenie wejściowego i immunoprecypitowanego DNA do testu Slot Blot, jak opisano poniżej.
   1. Wykonaj kroki 2.3 - 2.4, aby uzyskać całkowitą objętość próbki 350 μl (tj. 50 μl wejścia/ChIP DNA, 125 μl 0,4 N NaOH, 175 μl 1 M Tris-HCl, pH 6,8).
      Uwaga: W powyższym przykładzie 45 ng wejściowego DNA będzie równać się 0,129 ng / μl.
   2. W przypadku wejściowego DNA oznacz trzy probówki jako 100, 50 i 25 i dodaj 100 μl, 50 μl i 25 μl zdenaturowanej i zneutralizowanej próbki DNA. Uzupełnić końcową objętość do 100 μl wodą wolną od nukleaz. W przypadku DNA ChIP oznacz trzy probówki jako 200, 100 i 50 i dodaj 200 μl, 100 μl i 50 μl zdenaturowanej i zneutralizowanej próbki DNA. Uzupełnić końcową objętość do 200 μl wodą wolną od nukleaz.
6. Przytnij membranę do rozmiaru aparatu Slot Blot. Wstępnie zwilż membranę i bibułę w 20x SSC przed i przed dodaniem DNA. Zmontuj je w aparacie Slot Blot zgodnie z protokołem producenta.
7. Odpipetować DNA z kroku 2.5.2 do odpowiednich szczelin. Powoli stosuj podciśnienie, aby wciągnąć DNA na membranę sondy zeta. Zatrzymać próżnię, gdy wszystkie próbki przejdą przez aparat.
   1. Zdemontuj aparat i natychmiast unieruchom DNA na błonie za pomocą środka sieciującego UV. Umieść DNA stroną do góry w sieciowniku UV i użyj ustawienia automatycznego sieciowania w sieciowniku. Postępuj zgodnie z protokołem producenta.
8. Wykryj BrdU na plamie szczelinowej, wykonując western blot.
   1. Zablokuj błonę 5% beztłuszczowym mlekiem w proszku w PBS zawierającym 0,1% Tween-20 (PBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał z błoną.
   2. Dodać pierwszorzędowe przeciwciało anty-BrdU (rozcieńczenie 1:500) rozcieńczone w 1% odtłuszczonym mleku w proszku w PBST i inkubować blot z pierwszorzędowym przeciwciałem przez 3 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce. Przemyć błonę PBST trzy razy po inkubacji przeciwciał pierwotnych.
   3. Dodać sprzężone z HRP drugorzędowe przeciwciało przeciw-mysie do blot (rozcieńczenie 1:5 000) i inkubować w RT przez 1 godzinę. Przemyć membranę PBST trzy razy po inkubacji przeciwciał drugorzędowych.
      UWAGA: Użyj wystarczającej objętości przeciwciał, aby całkowicie pokryć błonę podczas inkubacji przeciwciał pierwszorzędowych i wtórnych.
9. Przygotuj mieszankę ECL i dodaj ją do blot zgodnie z protokołem producenta. Inkubować błonę z mieszanką ECL przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   1. Umieść membranę w kasecie rentgenowskiej, naświetl membranę na film rentgenowski i wywołaj blot zgodnie z protokołem producenta.
   2. Określ ilościowo sygnał uzyskany dla sygnału wejściowego i ChIPed DNA po zeskanowaniu blot za pomocą oprogramowania Image J zgodnie z protokołem producenta. Do oznaczania ilościowego należy użyć sygnału, który znajduje się w liniowym zakresie wykrywania, aby zapewnić dokładność pomiaru.

Wyniki

Aby określić swoistość inhibitorów selektywnych dla HDAC1,2, wykorzystano komórki włókniakowraka Hdac1,2^FL/FL oraz Hdac3^FL/FL. Do usunięcia Hdac1,2 oraz Hdac3 w tych komórkach zastosowano rekombinazę Cre dostarczaną przez adenowirusa (Ad-Cre). Po infekcji komórek Hdac1,2^FL/FL za pomocą Ad-Cre zaobserwowano wyraźny wzrost poziomu H4K5ac. Leczenie komórek z knockoutem Hdac1,2 związka...

Dyskusja

Protokół opisany w tym manuskrypcie jest stosunkowo szybką metodą wykazania obecności białek lub ich form zmodyfikowanych potranslacyjnie w nowo zreplikowanym lub powstającym DNA. Dodatkowo technika ta pozwala na pomiar kinetyki asocjacyjno-dysocjacyjnej białka lub jego zmodyfikowanej formy z powstającym DNA. Technika ta jest komplementarna z elegancką technologią iPOND¹³. W technologii iPOND nowo zsyntetyzowane DNA jest znakowane deoksyurydyną etylową (EdU). Koniugat biotyny jest następnie dodawany do EdU za ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Anty-BrdU (westerny)	BD Biosciences	B555627
Anty-SMARCA5	Abcam	ab3749
Aktywny motyw	anty-H4K16ac	39167
Membrana Zeta-Probe GT	Bio-Rad	162-0197
Formaldehyd		Fisher BP531-500
Białko A agaroza	Milipor	16-156
Rnaza A	Qiagen	19101
Proteinaza K	Sigma	P4850
Zestaw do oczyszczania PCR	Qiagen	28106
Glicyna	Sigma	G7403
Koktajl inhibitorów proteazy	Roche	11836170001
BrdU	Sigma	B9285
IgG królika i nbsp;	Millipore	12-370
HEPES	Sigma	H3375
NaCl	Sigma	S-3014
Triton-X-100	Sigma	93443
NP40	USB Corporation	19628
Deoksycholan sodu	Sigma	D6750
Wodorowęglan sodu	Sigma	S-4019
Etanol	Decon Laboratories	04-355-222
Woda uzdatniona DEPC	Sigma	95284
Tris	Fisher	BP-152-5
EDTA	Invitrogen	15575-020
SDS	Ambion	AM9820
Wodorotlenek sodu	Mallinckrodt GenAR	MAL7772-06
20x SSC	Life Technologies	15557-036
Beztłuszczowe mleko w proszku	Lab Scientific Inc	M0841
ECL	Thermo Fisher	80196
Film rentgenowski	Genesee Sci	30-101
Developer	Konica Minolta	SRX-101A
UV Crosslinker	Stratagene	XLE-1000
Sonicator	Branson Sonifier  Cyfrowy ultradźwiękowy zakłócacz komórek	Model: 450
Wirówka	Eppendorf	Model: 5810R
Łaźnia wodna	Fisher Scientific	Isotemp Model: Spektrofotometr 2322
NanoDrop 1000	ThermoScientific	1000
nbsp;	Schleicher and Schuell Minifold II	44-27570
	Termo Scientific	Series II 3110 Inkubatory CO2 z płaszczem wodnym

Model: Aparat do klotów &Inkubator do hodowli tkankowych