Method Article

Analiza ilościowa ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii w zarodkach myszy przed implantacją

DOI:

10.3791/53654

⸱

February 22nd, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Developmental Biology Program, Sloan Kettering Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia metodę przeprowadzania ilościowej, jednokomórkowej analizy in situ ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii u mysich zarodków przedimplantacyjnych. Opisano procedury niezbędne do pobierania blastocyst, wykrywania białek metodą immunofluorescencyjną w całości montowanej, obrazowania próbek pod mikroskopem konfokalnym oraz segmentacji jądrowej i analizy obrazu.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia metodę przeprowadzania ilościowych, jednokomórkowych analiz in situ ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii u mysich zarodków przedimplantacyjnych. Opisano procedury niezbędne do pobrania zarodków, immunofluorescencji, obrazowania pod mikroskopem konfokalnym oraz segmentacji i analizy obrazu. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie ekspresji wielu markerów jądrowych i współrzędnych przestrzennych (XYZ) wszystkich komórek w zarodku. Wykorzystuje on MINS, oprogramowanie do segmentacji obrazów opracowane specjalnie do analizy obrazów konfokalnych zarodków preimplantacyjnych i kolonii embrionalnych komórek macierzystych (ESC). MINS przeprowadza nienadzorowaną segmentację jądrową w wymiarach X, Y i Z i generuje informacje o położeniu komórki w przestrzeni trójwymiarowej, a także o poziomach fluorescencji jądrowej dla wszystkich kanałów przy minimalnym udziale użytkownika. Chociaż protokół ten został zoptymalizowany pod kątem analizy obrazów zarodków myszy w stadium preimplantacji, można go łatwo dostosować do analizy dowolnych innych próbek wykazujących dobry stosunek sygnału do szumu i tam, gdzie wysoka gęstość jądrowa stanowi przeszkodę dla segmentacji obrazu (np. analiza ekspresji kolonii embrionalnych komórek macierzystych (ESC), różnicowanie komórek w hodowli, zarodki innych gatunków lub stadiów itd.).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embrion myszy przed implantacją jest paradygmatem do badania powstawania i utrzymywania pluripotencji in vivo, a także modelem do badania specyfikacji losu komórki i nabłonkowania de novo u ssaków. Etapy preimplantacyjne rozwoju ssaków poświęcone są ustaleniu trzech linii komórkowych tworzących blastocystę, a mianowicie pluripotencjalnego epiblastu - który daje początek większości tkanek somatycznych i komórek rozrodczych - oraz dwóch linii pozaembrionalnych, trofektodermy (TE) i pierwotnej endodermy (PrE) (ryc. 1A) 1,2. Protokół ten opisuje procedury (1) pobierania i utrwalania zarodków myszy w fazie preimplantacji, (2) p....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczenie etyczne: Wszystkie prace nad zwierzętami, w tym hodowla, hodowla i składanie ofiar, zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IACUC), protokół #03-12-017.

1. Pobieranie zarodków

Uwaga: Wszystkie prace ze zwierzętami muszą być zatwierdzone przez władze instytucjonalne i lokalne oraz zgodne z lokalnymi i instytucjonalnymi zasadami.

  1. Połącz dziewiczą samicę myszy z płodnym samcem o pożądanych genotypach.
    Uwaga: W przypadku tworzenia naturalnych kojarzeń, wybór samic w fa....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby ułatwić interpretację i prezentację danych, należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić zarodków podczas pobierania i manipulacji, aby można było przeanalizować wszystkie komórki i ich względne położenie. Rycina 2A - D pokazuje przykłady nienaruszonych blastocyst w różnych stadiach z rozszerzoną jamą. W przypadku wystąpienia uszkodzenia należy zachować szczególną ostrożność podczas analizy i interpretacji wyników.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy protokół opisuje metodę przeprowadzania analizy ilościowej immunofluorescencji w całości na zarodkach myszy w stadium preimplantacyjnym. Po solidnym protokole immunofluorescencji 22 następuje obrazowanie konfokalne o wysokiej rozdzielczości i całej rozdzielczości oraz segmentacja obrazu za pomocą dostosowanego do potrzeb oprogramowania 4. Chociaż wybór protokołu immunofluorescencji nie jest krytyczny, uważamy, że ten przedstawiony tutaj 22 jest szybki, niezawodny i zapewnia soli.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Stefano Di Talia, Alberto Puliafito, Venkatraman Seshan i Panagiotis Xenopoulos, za wkład w przetwarzanie, analizę i reprezentację danych, Berenice Plusa za pomoc w projektowaniu protokołu immunofluorescencji i testowania przeciwciał oraz członkom laboratorium Hadjantonakis za komentarze na temat manuskryptu i rozwoju tego protokołu. Prace w naszym laboratorium są wspierane przez National Institutes of Health R01-HD052115 i R01-DK084391 oraz przez NYSTEM N13G-236.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Pobieranie zarodków
sonda do sprawdzania zatyczekKleszcze RobozRS-9580
Nożyczki chirurgiczneRobozRS-4978
Fisher13-678-20C
ustnikSigmaA5177
Dłuższa gumowa rurkaFisher14-178-2AA     
M2MilliporeMR-015-D FHM
MilliporeMR-024-D
Kwaśny roztwór Tyrode'aMiliporaMR-004-D
Penicylina/StreptomycynaGibco15140
Albumina surowicy bydlęcej SigmaA9647
Płytki 4-dołkoweNunc/Thermo-Fisher12-566-300     
Immunofluorescencja
96-dołkowa U-dolna płytkaFisher14-245-73
Triton X-100SigmaT8787
GlicynaSigmaG7403
Surowica koniaSigmaH0146
Przeciwciała pierwotneStężenie
CDX2BiogenexAM392-5M1:200
GATA6R& DAF17001:100
GATA4Santa Cruzsc-90531:100, 10 min utrwalenie
GATA4Santa Cruzsc-12371:100, Utrwalenie O/N
SOX17R& DAF19241:100
NanogReproCELLRCAB0002P-F1:500
OCT4Santa Cruzsc-52791:100, 10 min do utrwalenia O/N
DAB2BDBD-6104641:200
Przeciwciała drugorzędoweLife TechnologiesRóżne1:500
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570
Obrazowanie
35 mm naczynia ze szklanym dnemMatTekP35G-1.5-14-C
Segmentacja
Komputer z 64-bitowym systemem operacyjnymnie dotyczySprawdź minimalne wymagania systemowe na http://katlab-tools.org i w Lou et al., (2014) Stem Cell Reports
MATLAB (oprogramowanie)Mathworksn/a
MINS (oprogramowanie)Darmowynie dotyczyhttp://katlab-tools.org
Szklane pipety Pasteura Roboz RS-5910 Wstępnie zmontowana rurka aspiratora i Windows

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Saiz, N., Plusa, B. Early cell fate decisions in the mouse embryo. Reproduction. 145 (3), R65-R80 (2013).
  2. Schrode, N., Xenopoulos, P., Piliszek, A., Frankenberg, S., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein Expression AnalysisMouse Preimplantation EmbryosConfocal Microscopy ImagingImage Segmentation AnalysisMINS Software ToolNuclear Marker QuantificationImmunofluorescence ProtocolEmbryo Collection ProcedureBlastocyst Isolation MethodSingle Cell Resolution

Related Articles