Analiza ilościowa ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii w zarodkach myszy przed implantacją

Summary

Ten protokół przedstawia metodę przeprowadzania ilościowej, jednokomórkowej analizy in situ ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii u mysich zarodków przedimplantacyjnych. Opisano procedury niezbędne do pobierania blastocyst, wykrywania białek metodą immunofluorescencyjną w całości montowanej, obrazowania próbek pod mikroskopem konfokalnym oraz segmentacji jądrowej i analizy obrazu.

Abstract

Ten protokół przedstawia metodę przeprowadzania ilościowych, jednokomórkowych analiz in situ ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii u mysich zarodków przedimplantacyjnych. Opisano procedury niezbędne do pobrania zarodków, immunofluorescencji, obrazowania pod mikroskopem konfokalnym oraz segmentacji i analizy obrazu. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie ekspresji wielu markerów jądrowych i współrzędnych przestrzennych (XYZ) wszystkich komórek w zarodku. Wykorzystuje on MINS, oprogramowanie do segmentacji obrazów opracowane specjalnie do analizy obrazów konfokalnych zarodków preimplantacyjnych i kolonii embrionalnych komórek macierzystych (ESC). MINS przeprowadza nienadzorowaną segmentację jądrową w wymiarach X, Y i Z i generuje informacje o położeniu komórki w przestrzeni trójwymiarowej, a także o poziomach fluorescencji jądrowej dla wszystkich kanałów przy minimalnym udziale użytkownika. Chociaż protokół ten został zoptymalizowany pod kątem analizy obrazów zarodków myszy w stadium preimplantacji, można go łatwo dostosować do analizy dowolnych innych próbek wykazujących dobry stosunek sygnału do szumu i tam, gdzie wysoka gęstość jądrowa stanowi przeszkodę dla segmentacji obrazu (np. analiza ekspresji kolonii embrionalnych komórek macierzystych (ESC), różnicowanie komórek w hodowli, zarodki innych gatunków lub stadiów itd.).

Introduction

Embrion myszy przed implantacją jest paradygmatem do badania powstawania i utrzymywania pluripotencji in vivo, a także modelem do badania specyfikacji losu komórki i nabłonkowania de novo u ssaków. Etapy preimplantacyjne rozwoju ssaków poświęcone są ustaleniu trzech linii komórkowych tworzących blastocystę, a mianowicie pluripotencjalnego epiblastu - który daje początek większości tkanek somatycznych i komórek rozrodczych - oraz dwóch linii pozaembrionalnych, trofektodermy (TE) i pierwotnej endodermy (PrE) (ryc. 1A) ^1,2. Protokół ten opisuje procedury (1) pobierania i utrwalania zarodków myszy w fazie preimplantacji, (2) przeprowadzania immunofluorescencji w celu znakowania białek będących przedmiotem zainteresowania, (3) przeprowadzania obrazowania całościowego przy użyciu mikroskopu konfokalnego z możliwością przekroju z oraz (4) wykonywania segmentacji jądrowej obrazów konfokalnych i późniejszych ilościowych analiz obrazu. Potok ten umożliwia bezstronny pomiar poziomów białek w celu przypisania tożsamości komórek w celu scharakteryzowania subpopulacji komórek in situ. Protokół ten można przeprowadzić w ciągu zaledwie 3-4 dni dla pojedynczego miotu (zwykle do 10 zarodków myszy), od pobrania zarodka do analizy danych (ryc. 1B). Jednoczesna analiza kilku miotów zwiększyłaby obciążenie czasowe związane z obrazowaniem i analizą danych, wydłużając w ten sposób ogólną długość protokołu.

Embrion myszy w stadium preimplantacyjnym jest eksperymentalnie łatwym do opanowania systemem, który, biorąc pod uwagę jego mały rozmiar i stereotypową morfologię ³, dobrze nadaje się do obrazowania procesów komórkowych w całości z rozdzielczością pojedynczej komórki. Aby przeprowadzić bezstronną, systemową analizę statystycznie istotnej liczby zarodków, pożądany jest zautomatyzowany proces analizy ilościowej. Jednak ze względu na wysoką gęstość jądrową wewnętrznej masy komórkowej (ICM) blastocysty (Figura 1A, 2D), konwencjonalne platformy segmentacji obrazu nie zapewniają wystarczającej dokładności, aby ustanowić zautomatyzowany lub półautomatyczny przepływ pracy. Z drugiej strony, ręczna segmentacja, choć dokładna, nie pozwala na przetwarzanie dużych kohort komórek i zarodków, ani nie nadaje się do powtarzalnego, bezstronnego określania tożsamości komórek - co jest szczególnie ważne podczas badania etapów rozwojowych, w których wzorce ekspresji markerów nie zostały w pełni rozwiązane (np. nie wykazują binarnego rozkładu w populacji). Niedawno opracowaliśmy i przeprowadziliśmy walidację metody segmentacji obrazu dostosowanej do zarodków myszy w fazie preimplantacji oraz do embrionalnych komórek macierzystych myszy (ESC), która osiąga wysoką dokładność, wymagając przy tym minimalnego wkładu użytkownika ^4-8.

Przedstawiony tutaj potok analizy obraca się wokół narzędzia do segmentacji obrazów opartego na MATLAB, Modular Interactive Nuclear Segmentation (MINS) ⁴. MINS przeprowadza nienadzorowaną segmentację jądrową na dużych partiach konfokalnych stosów Z po ustaleniu przez użytkownika minimalnej liczby właściwości obrazu, przy użyciu graficznego interfejsu użytkownika (GUI) (Tabela 1) ⁴. Linia ta okazała się skuteczna w generowaniu wysokoprzepustowych danych dotyczących ekspresji białek i lokalizacji komórek zarówno w zarodkach typu dzikiego, eksperymentalnie leczonych i modyfikowanych genetycznie oraz w EKM ^5-7. W niniejszym protokole opisano zastosowanie MINS do segmentacji obrazów zarodków w fazie preimplantacyjnej. Przykłady działania MINS na ESC znajdują się w ^4,7. Zautomatyzowany etap segmentacji jądrowej znacznie zmniejsza obciążenie czasowe procesu identyfikacji komórki, podczas gdy pomiary przestrzenne i intensywności fluorescencji pozwalają na bezstronne określenie tożsamości komórek i wygenerowanie trójwymiarowych map domen ekspresji genów i pozycji komórki w zarodku (ryc. 1C). Co więcej, skalowalność tego przepływu pracy sprawia, że ma on zastosowanie do analizy poszczególnych miotów przez duże kohorty zarodków poddanych obliczeniu eksperymentalnie lub zarodków o różnym pochodzeniu genetycznym ^5,6. MINS jest dostępny bezpłatnie pod adresem http://katlab-tools.org (oprogramowanie wymaga licencji MATLAB).

Żadne podejście opracowane do tej pory nie pozwala na generowanie tak szczegółowych danych na temat ekspresji białek i lokalizacji komórek w mysich zarodkach preimplantacyjnych. Wszystkie dotychczasowe próby ilościowego określenia tego typu danych ograniczały się do ręcznego określania i ilościowego określania liczby komórek dla różnych populacji w zarodku (całkowicie ręcznie lub wspomaganie programowe) ^9-19. Podejście to (z wykorzystaniem oprogramowania MINS) zostało dostosowane i przetestowane na mysich zarodkach przedimplantacyjnych i ESC; Niemniej jednak oczekuje się, że jego wydajność w innych systemach o dużej gęstości jądrowej, choć jeszcze nieprzetestowana, będzie równoważna.

Protocol

Oświadczenie etyczne: Wszystkie prace nad zwierzętami, w tym hodowla, hodowla i składanie ofiar, zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IACUC), protokół #03-12-017.

1. Pobieranie zarodków

Uwaga: Wszystkie prace ze zwierzętami muszą być zatwierdzone przez władze instytucjonalne i lokalne oraz zgodne z lokalnymi i instytucjonalnymi zasadami.

1. Połącz dziewiczą samicę myszy z płodnym samcem o pożądanych genotypach.
   Uwaga: W przypadku tworzenia naturalnych kojarzeń, wybór samic w fazie rui cyklu estralnego zwiększa szanse na kopulację w pożądanym dniu. W przypadku wywołania superowulacji należy zapoznać się z protokołami opisanymi w ^{punkcie 20}.
2. Sprawdź rano obecność czopa dopochwowego za pomocą sondy. Najlepiej zrobić to przed południem (12:00), ponieważ korki kopulacyjne gubią się w ciągu dnia. Weźmy pod uwagę południe wykrycia czopa pochwowego w dniu embrionalnym (E)0,5.
3. W pożądanym dniu i czasie rozwoju zarodkowego rozgrzać M2 lub pożywkę do płukania (FHM) do temperatury RT lub, najlepiej, 37 ºC. Uwaga: Do płukania i obchodzenia się z zarodkami można użyć zarówno M2, jak i FHM. Gdy nie są używane, przechowuj te podłoża w temperaturze 4 ºC. Oszacuj użycie ~2 ml pożywki na każdą macicę.
4. Rozmrozić zamrożony 4% paraformaldehyd (PFA) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) lub przygotować świeży roztwór. Oszacuj 500 μl 4% roztworu PFA na dołek płytki 4-dołkowej. Przymocuj jedną ściółkę do każdego dołka 4-dołkowej płytki. Uwaga: Alternatywnie do utrwalania i przechowywania zarodków można użyć płytki 96-dołkowej. Jeśli używasz płytki 96-dołkowej, użyj 100 μl roztworu PFA na studzienkę.
5. Wyciągnij szklaną pipetę Pasteura za pomocą otwartego ognia, aby narysować kapilarny koniec na końcówce.
6. Składanie ofiar przez zwichnięcie szyjki macicy lub wdychanie CO₂ lub zgodnie z wymogami lokalnych i instytucjonalnych przepisów. Często pożądane jest potwierdzenie eutanazji zwierzęcia przez zwichnięcie szyjki macicy.
7. Spryskaj brzuch zwierzęcia 70% etanolem, aby zminimalizować wypadanie włosów i wykonaj nacięcie brzucha, najpierw przez skórę, a następnie przez ścianę ciała (otrzewną), aby odsłonić wnętrzności.
   Uwaga: Poniższe kroki opisują procedurę pobierania blastocyst z macicy ciężarnej samicy myszy na dowolnym etapie między E3.25 a E4.5 (ryc. 1A). Protokoły pobierania zarodków przedimplantacyjnych wcześniejszych niż E3.25 znajdują się w ^{punkcie 20}.
8. Zlokalizuj macicę i usuń ze zwierzęcia. Trzymając szyjkę macicy za pomocą kleszczy, przeciąć szyjkę macicy i delikatnie pociągnąć, aby rozciągnąć oba rogi macicy.
9. Odetnij tłuszcz z macicy, uważając, aby nie przebić ściany macicy. Można to łatwo zrobić w momencie usuwania, gdy jest nadal przyczepiony do ciała zwierzęcia, ponieważ macica może być rozciągnięta. Alternatywnie można to zrobić później, pod mikroskopem preparacyjnym, w RT PBS. Bardziej szczegółowy protokół dotyczący sekcji macicy znajduje się w Protokołach 5 i 8 ²⁰
10. Przeciąć nad jajowodami, poniżej jajników, aby uwolnić całą macicę, umieścić na szalce Petriego i przykryć PBS.
    Uwaga: Ten krok pozwala również na wypłukanie nadmiaru krwi lub innych zanieczyszczeń z macicy, co ułatwia późniejsze pobranie blastocysty.
11. Oddziel oba rogi macicy, przecinając proksymalny koniec po obu stronach szyjki macicy i wyrzuć szyjkę macicy. Oddziel każdy jajowód od macicy, przecinając go poniżej łączącego je przesmyku (ryc. 1A). Przenieś oba rogi do kropli pożywki manipulacyjnej (M2 lub FHM) w celu pobrania zarodków i manipulacji.
12. Pod mikroskopem preparacyjnym wypłukać blastocysty z macicy do pożywki, wtłaczając 0,5 - 1 ml M2 lub FHM przez każdy róg macicy z ujścia szyjki macicy. Należy użyć strzykawki o pojemności 1 ml z igłą podskórną. Uwaga: Igłę można stępić za pomocą kamienia do pilnika, aby uniknąć rozerwania macicy, chociaż nie jest to krytyczne. Szczegółowy schemat płukania macicy można znaleźć w²¹.
13. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego zlokalizuj blastocysty, które zostaną rozproszone po całej kropli pożywki. Odczekaj do 1-2 minut, aż blastocysty opadną na dno naczynia po spłukaniu. Za pomocą sterowanej ustami, szklanej pipety Pasteura z końcówką kapilarną, zbierz wszystkie blastocysty i przenieś do świeżej kropli pożywki.
14. Wypłucz blastocysty, przesuwając je przez 2 - 3 krople świeżego M2 lub FHM. Przenoszenie zarodków w grupach po 5 - 10 blastocyst na raz.
    Uwaga: Przenoszenie większych grup w tym samym czasie przyspieszy ten proces, ale zwiększy również szanse na przypadkową utratę wielu zarodków. Jeśli nie są przeszkolone w używaniu pipet sterowanych doustnie, przed rozpoczęciem eksperymentu należy rozważyć praktykowanie manipulacji i transferu zarodków.
15. Usunąć Zona Pellucida (ZP) z niewylężonych blastocyst (zwykle
16. Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z obnażonymi blastocystami, ponieważ bardzo łatwo przylegają one do powierzchni szklanych i plastikowych. Pożywka manipulacyjna zawiera 4 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w celu zapobieżenia przyczepieniu, ale kwasowe Tyrode's lub PBS nie zawierają, dlatego w celu zmniejszenia ryzyka uszkodzenia lub utraty zarodków nie należy pobierać więcej niż 2 - 5 obnażonych blastocyst na raz podczas manipulowania nimi w PBS wolnym od BSA lub surowicy lub kwaśnym Tyrode's.
    Uwaga: Alternatywnie, przed użyciem pokryj szklaną pipetę 1% BSA, aby zmniejszyć przyleganie zarodków do powierzchni szkła.

Pokryj dno każdej studzienki 4-dołkowej płytki do hodowli tkankowej cienką warstwą 1% agaru, 0,9% NaCl, aby zapobiec przywieraniu zarodków do plastiku. Alternatywnie, dodać 4 mg/ml BSA do PBS (PBS-BSA).

Napełnij jedną studzienkę powlekanej 4-dołkowej płytki do hodowli tkankowej 500 μl RT PBS (lub PBS-BSA), a drugą studzienkę 500 μl 4% PFA w PBS.

Przepłukać blastocysty w RT PBS i utrwalić w 4% PFA w PBS przez 10 minut w RT. Przenieść do PBS (lub PBS-BSA) po utrwaleniu.

Jeżeli zarodki nie mają być natychmiast przetwarzane, przykryć PBS zawierający zarodki warstwą oleju mineralnego, aby zapobiec parowaniu (prowadzącemu do wysuszenia próbki) i przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C.
Uwaga: Można stosować różne metody i czasy utrwalania w zależności od eksperymentu, epitopów będących przedmiotem zainteresowania i przeciwciał, które mają być użyte. Niezależnie od wybranej metody, należy zachować spójność we wszystkich równoważnych eksperymentach, aby ułatwić późniejsze porównanie wyników barwienia.
Uwaga: Punkt pauzy: Zarodki mogą być przechowywane w temperaturze 4 ºC w PBS przez okres do kilku tygodni przed przejściem do następnego etapu. Upewnij się, że PBS jest sterylny i/lub dodaj 100 j./ml penicyliny + 100 μg/ml streptomycyny (Pen-Strep), aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu (szczególnie w przypadku stosowania PBS-BSA), jeśli przewidujesz dłuższe przechowywanie.

2. Immunofluorescencja

1. Przeprowadź immunofluorescencję przy użyciu dowolnego protokołu, który został wcześniej przetestowany i okazał się niezawodny dla immunofluorescencji całej góry. Uwaga: Zalecamy te opisane w ^{punktach 22} i ¹¹. W niniejszym artykule zostaną opisane te pierwsze. Niezależnie od wybranej metody, należy zachować spójność we wszystkich równoważnych eksperymentach, aby ułatwić porównanie wyników barwienia.
2. Użyj elastycznej, poliwinylowej, przezroczystej, 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U, aby przeprowadzić sekwencyjne etapy protokołu immunofluorescencji. Napełnij każdą studzienkę 50 - 100 μl roztworu i przenieś zarodki z jednego roztworu do drugiego za pomocą pipety doustnej w kształcie litery L. Uwaga: Takie podejście minimalizuje użycie odczynników i ułatwia śledzenie etapów, a także równoległe barwienie kilku grup eksperymentalnych.
   1. Opcjonalnie: Pokryj dno studzienek cienką warstwą 1% agaru, 0,9% NaCl, aby zapobiec przywieraniu zarodków do plastiku. Nie należy dodawać BSA do roztworów immunofluorescencyjnych.
3. Przygotuj centralę PBX (0,1% Triton X-100 w PBS). Jeśli przewidujesz wyniki kilku eksperymentów immunofluorescencyjnych, przygotuj 50 ml PBX i przechowuj w temperaturze 4 ºC między eksperymentami.
4. Przygotować roztwór permeabilizacyjny (0,5% Triton X-100, 100mM glicyny w PBS). Przygotować 1 ml (lub inną wymaganą ilość) świeżego roztworu przepuszczalnego do każdego eksperymentu.
5. Przygotować roztwór blokujący (2% surowica końska (HS) lub 20% płodowa surowica bydlęca (FBS) z Pen-Strep w PBS). Przygotować 10 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C między eksperymentami.
   1. Nie zaobserwowano różnic między którymkolwiek z tych rodzajów surowicy, jednak należy konsekwentnie wybierać roztwór blokujący stosowany w równoważnych eksperymentach.
6. Płukać utrwalone zarodki przez 5 minut w RT w centrali PBX (~100 μl).
7. Przepuszczalność zarodków przez 5 min w temperaturze pokojowej w roztworze do przepuszczalności (~100 μl).
8. Płukać zarodki przez 5 min w RT w centrali PBX (~100 μl).
9. Zablokuj zarodki na 30 minut do 1 godziny w temperaturze pokojowej w ~100 μl roztworu blokującego. Przykryj roztwór warstwą oleju mineralnego, aby zapobiec parowaniu, lub przechowywać w wilgotnej komorze.
   Uwaga: Zarodki mogą być blokowane przez okres do O/N w temperaturze 4 ºC bez zauważalnej poprawy lub szkody w porównaniu z 30-minutowymi krokami blokowania.
10. Inkubować zarodki O/N w temperaturze 4 ºC w pierwszorzędowym przeciwciałie/przeciwciałach rozcieńczonych w roztworze blokującym (~100 μl). Przykryj roztwór warstwą oleju mineralnego, aby zapobiec parowaniu lub przechowuj w wilgotnej komorze.
    1. Wcześniej określić optymalne rozcieńczenie dla każdego przeciwciała pierwszorzędowego. Zapoznaj się z sekcją Dyskusja i Materiały, aby zapoznać się z przetestowanymi rozcieńczeniami wielu przeciwciał.
11. Po inkubacji O/N płukać zarodki 3x po 5 minut w RT w PBX (~100 μl).
12. Zablokuj zarodki na 30 minut do 1 godziny w temperaturze pokojowej w ~100 μl roztworu blokującego. Przykryj roztwór warstwą oleju mineralnego, aby zapobiec parowaniu lub przechowuj w wilgotnej komorze.
13. Inkubować zarodki przez 1 do 2 godzin w temperaturze 4 ºC w drugorzędowym przeciwciałie/przeciwciałach rozcieńczonych w 4 μg/ml w ~100 μl roztworu blokującego. Przykryj roztwór warstwą oleju mineralnego, aby zapobiec parowaniu lub przechowuj w wilgotnej komorze.
14. Płucz zarodki 2x po 5 minut w RT w centrali PBX.
15. Przenieś zarodki do preferowanego barwienia DNA. W przypadku stosowania Hoechst 33342 rozcieńczyć do 5 μg/ml w PBS. Przykryj roztwór warstwą oleju mineralnego, aby zapobiec parowaniu, lub przechowywać w wilgotnej komorze.
    Uwaga: Punkt pauzy: Jeśli zarodki nie są obrazowane natychmiast, można je przechowywać do kilku tygodni w roztworze do barwienia jądrowego. W takim przypadku upewnij się, że PBS jest sterylny i/lub dodaj Pen-Strep lub azydek sodu, aby zapobiec rozwojowi bakterii i skażeniu.

3. Obrazowanie konfokalne

Uwaga: Indywidualne konfiguracje mikroskopu konfokalnego będą wymagały dostosowania określonych parametrów akwizycji do istniejącego systemu i oprogramowania. Jednak poniższa sekcja zawiera zestaw ogólnych zasad, których należy przestrzegać, a które powinny mieć zastosowanie do każdej danej instalacji.

1. Za pomocą cienkiej pipety do ust przygotuj mikrokrople PBS lub roztworu barwnika jądrowego na szklanej powierzchni naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm i przykryj olejem mineralnym. Alternatywnie należy użyć zwykłego szkiełka nakrywkowego z silikonowymi separatorami, aby uniknąć uszkodzenia zarodków i przykryć szklanym szkiełkiem mikroskopowym. Uwaga: W przypadku stosowania zwykłego szkiełka nakrywkowego zarodki nie mogą być następnie ponownie ustawione lub odzyskane w celu genotypowania, dlatego zdecydowanie zalecamy stosowanie naczyń ze szklanym dnem.
2. Umieść zarodki w mikrokroplach i ułóż je w spójny sposób, najlepiej z osią wnęki ICM równoległą do powierzchni szkła. Ustaw naczynie na uchwycie mikroskopu. Uwaga: Obrazy uzyskane za pomocą laserowych skaningowych mikroskopów konfokalnych cierpią z powodu utraty intensywności fluorescencji związanej z osią Z. W związku z tym spójność układu jest ważna dla porównania intensywności między równoważnymi regionami na różnych zarodkach.
3. Ustal parametry referencyjne z wykorzystaniem zarodków typu dzikiego, które nie zostały poddane żadnemu zabiegowi, który mógłby zmienić ekspresję genów.
   1. Pozyskiwanie obrazów przy użyciu obiektywu o dużym powiększeniu (tj. 40X lub wyższym) w celu uzyskania danych, które ułatwią dokładną segmentację za pomocą narzędzia MINS ⁴.
      Uwaga: Użycie zoomu cyfrowego w obiektywie 20-krotnym nie zapewni obrazów o rozdzielczości odpowiedniej do segmentacji za pomocą funkcji MINS. Należy również zwrócić uwagę na odległość roboczą (WD) obiektywu, ponieważ powinna ona być wystarczająca, aby umożliwić uzyskanie stosu Z, który obejmuje całą blastocystę, dlatego zwykle konieczny jest długi obiektyw WD (~130 - 150 μm). Obrazy pokazane na rysunkach 2 - 4 zostały uzyskane przy użyciu obiektywu zanurzeniowego 40X/NA 1,30 z olejkiem o odległości roboczej 210 μm.
   2. Użyj najniższej mocy wyjściowej lasera, która zapewnia silny stosunek sygnału do szumu bez wybielania fluoroforów.
   3. Dostosuj wzmocnienie i przesunięcie, aby uzyskać najszerszy zakres dynamiki bez prześwietlania próbki. Naświetlanie obrazów w taki sposób, aby obejmowały większość lub cały zakres skali szarości, ułatwi wykrycie niewielkich różnic w intensywności między obrazami.
   4. Użyj małego (1 μm) kroku Z, ponieważ rozdzielczość osi Z ma kluczowe znaczenie dla dokładnej segmentacji za pomocą MINS.
      Uwaga: Wymiary XY nie mają wpływu na proces segmentacji jądrowej, a jedynie na rozmiar pliku obrazu. Ogólnie rzecz biorąc, 512 x 512 pikseli to wystarczająca rozdzielczość XY do obrazów o jakości publikacji bez uszczerbku dla miejsca na dysku twardym.
   5. Krok krytyczny: Utrzymuj spójne parametry obrazowania w ramach i między sesjami obrazowania tego samego eksperymentu, aby móc porównywać próbki.
4. Obrazowanie serii zarodków:
   1. Obrazuj spójne grupy (mioty, eksperymenty) podczas jednej sesji, gdy tylko jest to możliwe.
   2. Utrzymuj spójność parametrów w ramach sesji obrazowania i między nimi dla powtórzeń tego samego eksperymentu.
   3. Obrazuj zarodki w całej osi Z, aby uchwycić każdą komórkę.
      Uwaga: W razie potrzeby genotypowanie zarodka można wykonać po obrazowaniu, jak opisano w ^{punkcie 23}. Potrzeba zagnieżdżonego PCR musi zostać określona empirycznie i będzie zależeć od locus do analizy i użytych starterów.
5. Upewnij się, że jesteś w stanie dopasować zarodki do obrazów retrospektywnie.

4. Analiza obrazu i wstępne przetwarzanie danych

1. Pobierz i zainstaluj MINS ⁴ z http://katlab-tools.org (wymagana licencja MATLAB).
2. Wykonaj segmentację obrazu:
   1. Postępuj zgodnie z graficznym interfejsem użytkownika (GUI) programu MINS, aby załadować obraz lub stos konfokalny z dysku twardego, wykryć jądra i podzielić obraz na segmenty. Załaduj cały stos Z surowych danych wygenerowanych przez mikroskop (.lsm, .lif, .oif itp.). Patrz Tabela 2, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat każdego kroku i instrukcje znajdujące się na http://katlab-tools.org i⁴. Po zakończeniu wyświetl wynik każdego kroku, klikając odpowiedni przycisk "Widok". Żółty znacznik nad przyciskiem oznacza operację w toku, zielony znacznik oznacza operację zakończoną.
      Uwaga: MINS obecnie nie obsługuje plików .czi, sekwencji .tiff ani plików wielopozycyjnych - każdy stos Z musi być niezależnym plikiem.
   2. Po zadowalającej segmentacji należy zachować utworzony rurociąg, aby można go było wykorzystać bezpośrednio dla innych zarodków lub miotów.
3. Segmentacja w trybie wsadowym:
   Uwaga: Pojedyncze pliki można dzielić pojedynczo. Biorąc jednak pod uwagę, że zarodki w miocie lub eksperymencie są na ogół w porównywalnym stadium, MINS może zastosować proces segmentacji utworzony dla pojedynczego obrazu do grupy z nich bez nadzoru.
   1. W menu Uruchamianie w trybie wsadowym kliknij "Dodaj pliki" i załaduj wszystkie pliki do przetworzenia jednocześnie. Uwaga: Do kolejki segmentacji można dodawać pliki z różnych źródeł.
   2. Kliknij "Rozpocznij uruchamianie w trybie wsadowym" i poczekaj, aż oprogramowanie przetworzy pliki. Uwaga: Dane wyjściowe segmentacji zostaną zapisane w tym samym katalogu, w którym znajdowały się oryginalne pliki.
4. Ocena segmentacji i ręczna korekta
   Uwaga: MINS segmentuje obrazy z bardzo dużą dokładnością (>85%), jednak jakość barwienia i obrazowania, a także stadium zarodka mogą mieć wpływ na wydajność MINS. Ogólnie rzecz biorąc, im większa gęstość jądrowa w zarodku, tym bardziej prawdopodobne jest, że wystąpią błędy segmentacji (ryc. 2D, 3). W związku z tym dokładność segmentacji powinna być oceniana dla każdej próbki i w razie potrzeby ręcznie korygowana. Zazwyczaj występują dwa rodzaje błędów: nadmierna segmentacja i niedostateczna segmentacja.
   1. Rozwiązywanie problemu nadmiernej segmentacji:
      1. Zidentyfikuj wyniki fałszywie dodatnie - pęcherzyki apoptotyczne (ryc. 3A a, b, d, gwiazdki) lub inne elementy, które nie są nienaruszonymi jądrami, ale które mogły zostać zidentyfikowane jako takie przez MINS.
         Uwaga: Ogólnie rzecz biorąc, takie fałszywe alarmy mają mniejszy rozmiar niż rzeczywiste jądra i w większości przypadków można je łatwo zidentyfikować i posortować w arkuszu kalkulacyjnym. Jednak badanie wzrokowe jest zdecydowanie zalecane, ponieważ często jądra mogą być tylko częściowo podzielone na segmenty, co skutkuje mniejszą, ale prawidłową objętością segmentowaną (ryc. 3A b, grot strzałki).
      2. Usuń odpowiednie rekordy dla wyników fałszywie dodatnich z pliku *statistics.csv. Zachowaj oryginalny plik *statistics.csv do wykorzystania w przyszłości i edytuj tylko jego kopię.
      3. Jeśli jądro zostało nadmiernie podzielone na segmenty i przedstawione jako 2 lub więcej jąder (rysunek 3A c, strzałka i groty strzałek), albo połącz zapisy, uśredniając ich poziom intensywności, albo, jeśli jest podobny, zachowaj jeden z zapisów dla tej komórki i odrzuć resztę.
   2. Rozwiązywanie problemu niedostatecznej segmentacji:
      1. Zidentyfikuj zdarzenia, w których MINS nie wykrył granicy między dwoma lub więcej jądrami i w konsekwencji podzielił je na segmenty jako pojedyncze jądro (Rysunek 3A d, strzałka i 3B). Uwaga: Stwarza to problem dla dokładnego zliczania komórek, ale co ważniejsze, dla ilościowego określenia poziomów białka, ponieważ zmierzone poziomy będą średnią komórek, które zostały błędnie połączone i które mogą należeć do różnych linii.
      2. Zidentyfikuj zdarzenia, w których MINS nie wykrył jądra w ogóle.
      3. W takich przypadkach (4.4.2.1 i 4.4.2.2) zmierz średnie poziomy szarości dla każdego kanału w komórkach podsegmentowanych lub niepodzielonych na segmenty za pomocą alternatywnego narzędzia, takiego jak ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/), i zastąp błędny rekord prawidłowymi poziomami. Zachowaj oryginalny plik *statistics.csv do wykorzystania w przyszłości i edytuj tylko jego kopię. Aby to zrobić za pomocą ImageJ, wykonaj następujące kroki:
         1. Otwórz odpowiedni stos wielokanałowy w ImageJ i zaimportuj odpowiedni plik *overlaid.tiff wygenerowany przez MINS jako stos wirtualny ("Plik" > "Importuj" > "Stos wirtualny TIFF...").
         2. Znajdź przyśrodkowy odcinek jądra podsegmentowanego lub niesegmentowanego.
         3. Za pomocą narzędzia do zaznaczania odręcznego obrysuj obwód jądra podsegmentowanego lub niesegmentowanego na kanale barwienia DNA.
         4. Naciśnij Crl+M (Cmd+M na komputerze Macintosh) lub przejdź do menu Analizuj i wybierz opcję "Zmierz". Ta akcja spowoduje zarejestrowanie średniej wartości szarości dla zarysowanego obszaru i wyświetlenie jej w nowym oknie. Przejdź do "Analizuj" > "Ustaw pomiary..." i upewnij się, że wybrana jest opcja "Średnia wartość szarości". Wybierz dowolne inne parametry, które mają być mierzone.
         5. Używając tego samego obszaru opisanego w kroku 4.4.2.3.3, powtórzyć pomiar dla każdego z kanałów fluorescencyjnych będących przedmiotem zainteresowania. Wyniki zostaną dołączone do poprzedniego w oknie "Wyniki" pomiarów.
         6. Uzyskane pomiary służą do zastępowania błędnych rekordów w pliku *statistics.csv. Jeśli jądro nie zostało podzielone na segmenty, wstaw nowy wiersz, przypisz mu nowy identyfikator komórki i wprowadź wartości uzyskane w ImageJ pod odpowiednią kolumną dla każdego kanału. Ta komórka nie będzie miała współrzędnych przestrzennych (wartości X, Y i Z). Jeśli jądro zostało podsegmentowane, zduplikuj jego wiersz, przypisz różne identyfikatory komórek do każdej nowej komórki i wprowadź wartości uzyskane w ImageJ pod odpowiednią kolumną. W takim przypadku obie komórki będą miały wspólne współrzędne przestrzenne.
            Uwaga: Jeśli ma być analizowany rozkład przestrzenny, zalecamy wykluczenie współrzędnych XYZ tych komórek, ponieważ będą się one nakładać. W tym celu, tworząc nowe rekordy, przypisz im identyfikatory komórek, które można łatwo odróżnić od oryginalnych (na przykład liczby niecałkowite).
   3. Naciąć dzielące się komórki. Uwaga: MINS wykrywa zarówno jądra mitotyczne, jak i międzyfazowe, ale nie może ich rozróżnić.
      1. Jeśli jądra mitotyczne mają być rozpatrywane oddzielnie w analizie, należy je ręcznie ocenić i dodać te informacje do pliku danych. Aby zarejestrować komórki mitotyczne, dodaj nową zmienną (kolumnę) do pliku danych *statistics.csv i przypisz różne wartości jądrom mitotycznym i interfazowym.
5. Wstępne przetwarzanie danych.
   Uwaga: Po skorygowaniu arkuszy kalkulacyjnych pod kątem nadmiernej i niedostatecznej segmentacji są one gotowe do analizy. Proces analizy i prezentacji danych będzie zależał od konkretnego eksperymentu. Poniżej znajduje się jednak kilka ogólnych przekształceń danych, które zalecamy przeprowadzić przed analizą:
   1. Przekształć wartości intensywności fluorescencji w ich logarytm lub pierwiastek kwadratowy, aby zmniejszyć rozproszenie danych. Pomaga to również w wizualizacji, ponieważ surowe dane mają tendencję do koncentrowania się w pobliżu osi wykresu (patrz rysunek 4B, C).
   2. Skoryguj tłumienie fluorescencji związane z Z:
      Uwaga: Intensywność fluorescencji w obrazach laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej zmniejsza się, im głębiej na osi Z znajduje się wycinek (Rysunek 4E, F).
      1. Jeśli jeden z epitopów wykrytych w próbkach jest wszechobecnym i jednorodnie wyrażonym markerem jądrowym porządkowania, znormalizuj intensywność fluorescencji innych epitopów, dzieląc ich wartości w każdej komórce przez odpowiednią wartość markera porządkowego.
      2. W przypadku braku takiego markera referencyjnego należy skompensować utratę fluorescencji związaną z Z w następujący sposób:
         1. Wykreśl wartości każdego markera (oś Y wykresu) nad pozycją Z (oś X wykresu), aby zobrazować spadek intensywności względem Z - wykreśl razem wartości dla wszystkich kontrolnych zarodków typu dzikiego (Rysunek 4F).
         2. Dopasuj model liniowy (krzywą regresji) do wykresu uzyskanego w poprzednim kroku (wartości intensywności powyżej Z) dla każdego markera (rysunek 4F).
         3. Skoryguj wszystkie wartości dla każdego znacznika, używając następującego wzoru:
            log(wartość oryginalna) + Z * nachylenie modelu (rysunek 4D, G).
            Uwaga: Konkretne kroki w celu wykonania tej korekty będą zależeć od używanego oprogramowania analitycznego (R, MATLAB itp.). W przypadku korzystania z języka R uruchom następującą formułę, aby dopasować model liniowy do danych:
            >lm(log(kanał)~Z, dane = ramka danych)
            gdzie >kanał jest kanałem fluorescencji, który ma zostać skorygowany, Z jest współrzędną Z, a ramka danych jest tabelą zawierającą wszystkie wartości dla pożądanego zarodka (zarodków) (plik *statistics.csv wygenerowany przez MINS lub jego modyfikację).
            Uwaga: Dane wyjściowe powyższej formuły będą miały następujący format:
            (Przechwycenie) Z
            4.76373 -0.01947
            gdzie, wartość Z jest nachyleniem linii regresji dla tego zbioru danych, która to wartość bezwzględna powinna być użyta do modyfikacji pierwotnej wartości za pomocą wzoru podanego w 4.5.2.2.3 (zob. przykład na rysunku 4G).

Results

Aby ułatwić interpretację i prezentację danych, należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić zarodków podczas pobierania i manipulacji, aby można było przeanalizować wszystkie komórki i ich względne położenie. Rycina 2A - D pokazuje przykłady nienaruszonych blastocyst w różnych stadiach z rozszerzoną jamą. W przypadku wystąpienia uszkodzenia należy zachować szczególną ostrożność podczas analizy i interpretacji wyników.

Discussion

Niniejszy protokół opisuje metodę przeprowadzania analizy ilościowej immunofluorescencji w całości na zarodkach myszy w stadium preimplantacyjnym. Po solidnym protokole immunofluorescencji ²² następuje obrazowanie konfokalne o wysokiej rozdzielczości i całej rozdzielczości oraz segmentacja obrazu za pomocą dostosowanego do potrzeb oprogramowania ⁴. Chociaż wybór protokołu immunofluorescencji nie jest krytyczny, uważamy, że ten przedstawiony tutaj ²² jest szybki, niezawodny i zapewnia soli...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pobieranie zarodków
sonda do sprawdzania zatyczek	Kleszcze Roboz	RS-9580
Nożyczki chirurgiczne	Roboz	RS-4978
	Fisher	13-678-20C
ustnik	Sigma	A5177
Dłuższa gumowa rurka	Fisher	14-178-2AA
M2	Millipore	MR-015-D FHM
	Millipore	MR-024-D
Kwaśny roztwór Tyrode'a	Milipora	MR-004-D
Penicylina/Streptomycyna	Gibco	15140
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	A9647
Płytki 4-dołkowe	Nunc/Thermo-Fisher	12-566-300
Immunofluorescencja
96-dołkowa U-dolna płytka	Fisher	14-245-73
Triton X-100	Sigma	T8787
Glicyna	Sigma	G7403
Surowica konia	Sigma	H0146
Przeciwciała pierwotne			Stężenie
CDX2	Biogenex	AM392-5M	1:200
GATA6	R& D	AF1700	1:100
GATA4	Santa Cruz	sc-9053	1:100, 10 min utrwalenie
GATA4	Santa Cruz	sc-1237	1:100, Utrwalenie O/N
SOX17	R& D	AF1924	1:100
Nanog	ReproCELL	RCAB0002P-F	1:500
OCT4	Santa Cruz	sc-5279	1:100, 10 min do utrwalenia O/N
DAB2	BD	BD-610464	1:200
Przeciwciała drugorzędowe	Life Technologies	Różne	1:500
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
Obrazowanie
35 mm naczynia ze szklanym dnem	MatTek	P35G-1.5-14-C
Segmentacja
Komputer z 64-bitowym systemem operacyjnym		nie dotyczy	Sprawdź minimalne wymagania systemowe na http://katlab-tools.org i w Lou et al., (2014) Stem Cell Reports
MATLAB (oprogramowanie)	Mathworks	n/a
MINS (oprogramowanie)	Darmowy	nie dotyczy	http://katlab-tools.org