Method Article

Opracowanie i walidacja ilościowej metody PCR do diagnostyki herpeswirusa koniowatego-2 w płynach oddechowych

DOI:

10.3791/53672

⸱

March 17th, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1LABÉO Frank Duncombe, 2Unité de Risques Microbiens (U2RM, EA 4655), Normandy University, 3Hippolia Foundation

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i walidacji ilościowej metody PCR używanej do wykrywania i kwantyfikacji DNA EHV-2 w płynach oddechowych koni. Protokół walidacji EHV-2 qRT-PCR obejmuje trzyczęściową procedurę: opracowanie, scharakteryzowanie samego testu qRT-PCR oraz scharakteryzowanie całej metody analitycznej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisuje ilościową metodę RT-PCR do wykrywania i oznaczania ilościowego EHV-2 w płynach oddechowych koni zgodnie z normą NF U47-600. Po etapie rozwoju i pierwszej walidacji przeprowadzono dwa odrębne etapy charakterystyki zgodnie z normą AFNOR: (a) charakterystykę samego testu qRT-PCR oraz (b) charakterystykę całej metody analitycznej. Walidacja całej metody analitycznej obejmowała przedstawienie wszystkich etapów między ekstrakcją kwasów nukleinowych a końcową analizą PCR.

Walidacja całej metody jest bardzo ważna dla wykrywania wirusów za pomocą qRT-PCR, aby uzyskać dokładne określenie obciążenia genomu wirusa. Ponieważ etap ekstrakcji jest głównym źródłem utraty materiału biologicznego, można go uznać za główne źródło błędu kwantyfikacji między jednym protokołem a drugim. Z tego powodu norma AFNOR NF-U-47-600 zaleca uwzględnienie zakresu rozcieńczenia plazmidu przed etapem ekstrakcji. Ponadto granice oznaczalności zależą od źródła, z którego wirus jest ekstrahowany. Wyniki obciążenia genomem wirusa, które są wyrażone w jednostkach międzynarodowych (j.m.), są łatwiejsze do wykorzystania w celu porównania wyników między różnymi laboratoriami.

Ta nowa metoda charakterystyki qRT-PCR powinna ułatwić harmonizację prezentacji i interpretacji danych między laboratoriami.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Herpeswirus-2 (EHV-2) bierze udział w zespole oddechowym, z potencjalnymi objawami klinicznymi, takimi jak wydzielina z nosa, zapalenie gardła i obrzęk węzłów chłonnych1-3. Podejrzewa się również, że wirus ten jest związany ze słabą wydajnością koni, co może mieć znaczący i negatywny wpływ ekonomiczny na przemysł konny2.

Do tej pory złotym standardem wykrywania gamma-EHV (γ-EHV) była metoda hodowli komórkowych. Pierwszą niedogodnością tej procedury był brak dyskryminacji między EHV-2 a innymi γ-EHV (np. EHV-5). Drugą niedogodnością był powolny rozwój procesu cytopatycznego, który trwa od 12 do 28 dni, aby objawić się4,5.

Opracowanie zweryfikowanej i znormalizowanej ilościowej metody reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) pomoże w szybkim wykryciu wirusa, rozróżnieniu między EHV-2 i EHV-5 oraz zbadaniu związku między obciążeniem genomu wirusa a chorobą dzięki aspektowi kwantyfikacji.

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) została opisana po raz pierwszy w 1986 roku przez Mullisa6 i wkrótce stanie się nowym złotym standardem w większości dziedzin diagnostyki biologicznej (człowiek, środowisko i weterynaria). Ta metoda, która opiera się na amplifikacji części genomu patogenów, ma wiele zalet: swoistość, czułość i szybkość. Co więcej, ryzyko zanieczyszczenia amplikonem zmniejszyło się od czasu pojawienia się qRT-PCR i zapewnienia jakości7. Niemniej jednak uznanie PCR za nowy złoty standard metody wymagało czegoś więcej niż tylko poprawy danych dotyczących wydajności, ale także wykazania kontroli etapów rozwoju i walidacji całej metody bez pogorszenia wydajności w czasie.

Pierwsze narzędzia molekularne używane do wykrywania EHV-2 były czasochłonne i obejmowały niespecyficzną amplifikację za pomocą zagnieżdżonego PCR, a następnie sekwencjonowanie8. Genami docelowymi dla wirusów opryszczki były polimeraza kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) i pakowanie DNA9. Jednak zagnieżdżony PCR wiąże się z wysokim ryzykiem zanieczyszczenia amplikonami. Od tego czasu konwencjonalne testy PCR zostały zaprojektowane w celu amplifikacji genu podobnego do interleukiny 10 lub genu glikoproteiny B, poddanego przeglądowi w 2009 r.2. Niedawno opisano charakterystykę PCR w czasie rzeczywistym w celu oznaczania ilościowego EHV-210, ale nie było dostępnych danych dotyczących walidacji całej metody, w tym procesu ekstrakcji.

W tym protokole, procedury rozwoju i walidacji są opisane dla ilościowej metody PCR do wykrywania i kwantyfikacji DNA EHV-2 w płynach oddechowych koni zgodnie z normą Association française de normalisation (AFNOR) NF U47-6003,11,12, która jest francuskim przedstawicielem w międzynarodowym komitecie normalizacyjnym. Norma ta szczegółowo opisuje "Wymagania i zalecenia dotyczące wdrażania, rozwoju i walidacji weterynaryjnego PCR w metodzie analizy zdrowia zwierząt"11,12, zgodnie z NF EN ISO/CEI 17025, 200513 oraz zaleceniami OIE (Światowa Organizacja Zdrowia Zwierząt) 201014. Protokół walidacji EHV-2 qRT-PCR obejmuje trzyczęściową procedurę: (a) opracowanie testu qRT-PCR, (b) scharakteryzowanie samego testu qRT-PCR oraz (c) scharakteryzowanie całej metody analitycznej (od ekstrakcji kwasów nukleinowych z próbki biologicznej do analizy PCR).

Charakterystyka testu qRT-PCR i całej metody analitycznej obejmuje definicję dwóch granic: granicy wykrywalności (LOD) i granicy oznaczalności (LOQ). LOD95% PCR reprezentuje najniższą liczbę kopii kwasu nukleinowego na jednostkę objętości, którą można wykryć w 95% wszystkich przypadków. LOQ95% PCR reprezentuje najmniejszą ilość kopii kwasów nukleinowych, jaką można określić biorąc pod uwagę niepewności.

Ta metoda qRT-PCR pozwala na precyzyjne wykrycie i szybkie określenie ilościowe EHV-2 w płynach oddechowych. Co więcej, metoda ta może być stosowana w innych laboratoriach w celu zapewnienia ustandaryzowanej procedury i jako ogólny szablon do opracowywania innych nowych testów qRT-PCR.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga: Zapoznaj się ze wszystkimi różnymi krokami, które są zilustrowane na rysunku 1.

1. Ekstrakcja kwasów nukleinowych

Uwaga: Wykonaj ekstrakcję pod wyciągiem, aby ograniczyć zanieczyszczenie dróg oddechowych kwasami nukleinowymi. Dołącz ekstrakcyjną kontrolę ujemną za pomocą wody uzdatnionej DEPC, aby upewnić się, że żaden z odczynników nie jest zanieczyszczony niepożądanym DNA.

  1. Ekstrahować kwasy nukleinowe z próbki biologicznej zgodnie z wcześniej opisanym protokołem15 i protokołem producenta.
    1. Dodać 140 μl próbki biologicznej do 560 μl roztworu do lizy (bufor AVL) i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 560 μl etanolu. Nanieść pierwsze 630 μl tego roztworu (próbka + roztwór do lizy + etanol) do kolumny krzemionkowej i odwirówki.
    2. Pozostałe 630 μl tego roztworu nanieść na tę samą kolumnę krzemionkową i wirówkę. Następnie przemyć kolumnę 500 μl 2 różnych płuczących (AW1 i AW2).
  2. Eluować kwas nukleinowy za pomocą 50 μl buforu elucyjnego (bufor AVE) i równoważyć do temperatury pokojowej. Zamknij nakrętkę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 minutę. Wirować przy 6 000 g przez 1 min.

2. Procedura amplifikacji

  1. Przygotować 22,5 μl mieszaniny reakcyjnej dla każdej reakcji. Dodać 12,5 μl wzorcowej mieszanki PCR, x μl 20 μM startera do przodu, x μl 20 μM startera odwrotnego, y μl 10 μM sondy i z μl ultraczystej wody zgodnie z wymaganiami, aby osiągnąć 22,5 μl (objętości x, y i z uzyskuje się po miareczkowaniu, zob. sekcje 3.2.3 i 3.2.6).
  2. Podwielokrotność 22,5 μl odpowiedniej mieszaniny reakcyjnej do każdej studzienki reakcyjnej na płytce 96-dołkowej.
    Uwaga: Należy dołączyć kontrole ujemne dla ekstrakcji i PCR, aby upewnić się, że żaden z odczynników nie jest zanieczyszczony niepożądanym DNA.
  3. Dodać 2,5 μl próbki, 2,5 μl ekstrakcyjnej kontroli ujemnej, 2,5 μl kontroli ujemnej PCR i 2,5 μl próbki dodatniej (szczep referencyjny lub plazmid) do odpowiedniego dołka reakcyjnego. Po rozprowadzeniu przykryj płytkę samoprzylepną uszczelką płytkową. Odwirować płytkę przez 10 sekund w temperaturze 6 000 g.
  4. Umieść płytkę w systemie Real-Time PCR. Wybierz szablon dla układu testu i rozpocznij przebieg. Użyj ustawienia programu PCR: 10 minut w temperaturze 95 °C, a następnie 45 cykli po 15 sekund w temperaturze 95 °C i 1 minuta w temperaturze 60 °C (Tabela 1).
  5. Przenieś surowe dane z systemu Real-Time PCR do arkusza kalkulacyjnego. Ustaw próg na wykresach amplifikacji powyżej linii podstawowej i w obszarze wzrostu wykładniczego, aby uzyskać cykl progowy dla każdej próbki. Wykreśl każdy zestaw standardów punktowych jako krzywą standardową, aby uzyskać liniowość. Oblicz liczbę kopii dla różnych próbek na podstawie krzywej standardowej.

3. Opracowanie ilościowego RT-PCR

Uwaga: Opracowanie testu qRT-PCR wymaga szczepów referencyjnych, specyficznego miareczkowanego plazmidu i różnych kontroli, co pociąga za sobą miareczkowanie starterów i sondy.

  1. Test wstępny
    1. Zaprojektuj podkłady i sondy z określonym oprogramowaniem zgodnie z poprzednimi zaleceniami16.
    2. Ekstrahować szczepy referencyjne zgodnie z opisem w sekcji 1.
    3. Amplifikować zgodnie z opisem w sekcji 2 za pomocą 900 nM dla końcowego stężenia starterów i 250 nM dla końcowego stężenia sondy. Przeanalizować sygnał zgodnie z opisem w sekcji 2.5.
    4. W tym samym czasie należy przeprowadzić amplifikację DNA szczepów referencyjnych (zgodnie z opisem w sekcji 3.1.3) bez sond. Sekwencjonować amplikony otrzymane metodą Sangera17,18. Przeanalizuj sekwencje, uruchamiając nukleotyd BLAST19.
  2. Miareczkowanie starterów i sondy
    1. Przygotować 3 różne mieszaniny o końcowym stężeniu sondy 250 nM i o różnych stężeniach końcowych starterów do przodu i do tyłu (50 nM/50 nM, 300 nM/300 nM, 900 nM/900 nM) dla 3 powtórzeń próbki dodatniej i kontroli ujemnej. Do każdej mieszaniny dodać taką samą odpowiednią objętość 20 μM startera do przodu i 20 μM startera wstecznego (0,25 μl w celu uzyskania stężenia końcowego 50 nM, 1,5 μl w celu uzyskania stężenia końcowego 300 nM lub 4,5 μl w celu uzyskania stężenia końcowego 900 nM), 50 μl mieszaniny głównej PCR, 2,5 μl sondy 10 μM i ultraczysta woda zgodnie z wymaganiami, aby osiągnąć 90 μl.
    2. Wykonaj procedurę amplifikacji zgodnie z opisem w sekcji 2.
    3. Wybierz najlepsze warunki, aby uzyskać najwyższy poziom wzmocnienia, najwcześniejszy próg cyklu (Ct) i najlepszą powtarzalność między 3 warunkami. Określić najlepsze stężenie i odpowiadającą mu objętość x μl starterów do przodu i do tyłu.
    4. Przygotować 5 różnych mieszanin dla 4 próbek (3 powtórzenia próbki dodatniej i kontrola ujemna) z 5 różnymi stężeniami końcowymi sondy (50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM). Do każdej mieszaniny dodać x μl 20 μM startera do przodu i x μl 20 μM startera odwrotnego (uprzednio oznaczonego w sekcji 3.2.3), 50 μl głównej mieszanki PCR, odpowiednią objętość sondy 10 μM (0,5 μl w celu uzyskania stężenia 50 nM, 1 μl w celu uzyskania stężenia 100 nM, 1,5 μl w celu uzyskania stężenia 150 nM, 2 μl w celu uzyskania stężenia 200 nM lub 2,5 μl w celu uzyskania stężenia 250 nM) i ultraczysta woda w zależności od potrzeb do osiągnięcia 90 μl.
    5. Wykonaj procedurę amplifikacji zgodnie z opisem w sekcji 2.
    6. Wybierz najlepsze warunki, aby uzyskać najwyższy poziom wzmocnienia, najwcześniejszy próg cyklu (Ct) i najlepszą powtarzalność między 5 warunkami. Określ najlepsze stężenie i odpowiednią objętość y μl dla sondy.

4. Charakterystyka ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)

Uwaga: Po etapie rozwoju i określeniu najlepszych warunków do użycia, etap charakterystyki PCR obejmuje specyficzność, granicę wykrywalności, zakres liniowości i granicę kwantyfikacji qRT-PCR.

  1. Przygotowanie i miareczkowanie plazmidu
    1. Zamów komercyjny plazmid zawierający odpowiedni fragment docelowego genu DNA wybranego do PCR (w tym protokole nukleotydy 2081-2381 genu glikoproteiny B EHV-2, patrz tabela 1).
      Uwaga: Aby ograniczyć ryzyko zanieczyszczenia dróg oddechowych syntetycznym DNA, należy przeprowadzić seryjne rozcieńczenia plazmidów pod wyciągiem wyciągowym w oddzielnym pomieszczeniu i pracować z rozcieńczonym DNA podczas wszystkich etapów procedury rozwoju i walidacji.
    2. Ponownie zawiesić plazmid w ultraczystej wodzie, aby przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 50 ng/ml. Odwirować i krótko odwirować roztwór podstawowy plazmidu.
      Uwaga: Określić rzeczywiste stężenie roztworu podstawowego plazmidu po ponownym zawieszeniu w celu obliczenia liczby kopii plazmidu.
    3. Dodać 1 μl plazmidu do spektrofotometru. Odczytaj gęstość optyczną (OD) przy 230 nm, 260 nm i 280 nm. Odczytać stężenie DNA w oprogramowaniu spektrofotometru (OD, 260 nm).
    4. Oblicz liczbę kopii plazmidu, używając liczby Avogadro (NA) i wzoru:
      Liczba kopii/μl = (NA [plazmid w ng/μl])/(długość plazmidu x 109 x średnia waga pary zasad) = (6,022 x 1023 x [plazmid])/(długość plazmidu x 109 x 660)
  2. Badanie swoistości (inkluzywności i wyłączności) qRT-PCR
    1. Przetestuj inkluzywność systemu PCR. Wybierz próbki DNA z dodatnim wynikiem EHV-2, wcześniej scharakteryzowane przez sekwencjonowanie (ustalony status pozytywny).
    2. Wykonaj procedurę amplifikacji zgodnie z opisem w sekcji 2.
    3. Przeanalizować dane PCR dla każdej próbki zgodnie z opisem w sekcji 2.5. Należy sprawdzić obecność krzywej wykładniczej dla wszystkich próbek wybranych w sekcji 4.2.1 i potwierdzić włączenie PCR.
    4. Należy zbadać wyłączność systemu PCR przy użyciu ekstraktów DNA z patogenów o genetycznym podobieństwie do celu (w tym przypadku innych herpeswirusów koniowatych, takich jak EHV-1, EHV-4, EHV-3, EHV-5 i herpeswirus opryszczki azjatyckiej-5, jak opisano w tabeli 2) oraz innych czynników chorobotwórczych związanych z chorobami układu oddechowego gospodarza (w tym przypadku wirusa zapalenia tętnic koni, wirusa grypy koni, Coxiella burnetii, Rhodococcus equi, Streptococcus equi, Streptococcus equi zooepidemicus, Chlamydophila abortus i Klebsiella pneumoniae, zob. tabela 2).
    5. Wykonaj procedurę amplifikacji zgodnie z opisem w sekcji 2.
    6. Przeanalizować dane PCR dla każdej próbki zgodnie z opisem w sekcji 2.5. Sprawdzić, czy nie ma krzywej wykładniczej dla wszystkich próbek wybranych w sekcji 4.2.4, aby potwierdzić wyłączność PCR.
  3. Granica wykrywalności qRT-PCR
    1. Rozlej 90 μl ultraczystej wody do 6 probówek.
    2. Wykonaj 6 dziesięciokrotnych seryjnych rozcieńczeń plazmidu, aby celować w strefę redukcji (utrata detekcji Ct). Przenieść 10 μl z roboczego rozcieńczenia plazmidu do probówki z 90 μl ultraczystej wody. Odwirować i krótko odwirować probówkę. Powtarzać krok 4.3.2 do momentu, gdy ostatnia probówka w seryjnym rozcieńczeniu otrzyma plazmid.
    3. Przeprowadzić amplifikację 6 dziesięciokrotnych seryjnych rozcieńczeń plazmidu, jak opisano w sekcji 2.
    4. Określić strefę redukcji emisji: strefę między ostatnim rozcieńczeniem plazmidu dającym sygnał dodatni a pierwszym rozcieńczeniem bez wykrycia (zob. rysunek 2).
    5. Aby rozpocząć 6 podwójnych seryjnych rozcieńczeń, należy wybrać ostatnie rozcieńczenie plazmidu, które daje sygnał dodatni (patrz sekcja 4.3.4).
      Uwaga: Wykonaj 3 niezależne próby, aby określić granicę wykrywalności qRT-PCR (LOD95% PCR)
    6. Dozuj 25 μl ultraczystej wody do 6 probówek.
    7. Wykonaj 6 dwukrotnych seryjnych rozcieńczeń plazmidu. Przenieść 25 μl z roboczego rozcieńczenia plazmidu, jak określono w ppkt 4.3.5, do probówki z 25 μl ultraczystej wody. Odwirować i krótko odwirować probówkę. Powtarzać krok 4.3.7 do momentu, gdy ostatnia probówka w seryjnym rozcieńczeniu otrzyma plazmid.
    8. Przeprowadzić amplifikację 6 dwukrotnych seryjnych rozcieńczeń plazmidu, jak opisano w sekcji 2. Powtórzyć kroki od 4.3.7 do 4.3.8 dwukrotnie, aby uzyskać 3 próby z 8 powtórzeniami (24 powtórzeniami) każdego z 6 dziesięciokrotnych seryjnych rozcieńczeń plazmidu.
      Uwaga: Granica wykrywalności qRT-PCR (LOD95% PCR) jest zdefiniowana jako najniższa liczba kopii DNA na jednostkę objętości, która jest wykrywana w 95% przypadków.
    9. Obliczyć liczbę dodatnich kontrprób z 24 kontrprób dla każdego poziomu stężenia plazmidu.
    10. Określ poziom95% PCR na poziomie LOD. LOD95% PCR to poziom, który powoduje wykrycie 23 dodatnich kontrprób z 24 powtórzeń.
  4. Zakres liniowości i granica oznaczalności qRT-PCR
    Uwaga: Wykonać 4 niezależne próby z 6 dziesięciokrotnymi seryjnymi rozcieńczeniami plazmidu, aby upewnić się, że najniższe stężenie użyte w zakresie odpowiada LOD95% PCR określonemu wcześniej w 4.3.10.
    1. Dozuj 45 μl ultraczystej wody do 6 probówek.
    2. Rozpocząć 6 dziesięciokrotnych seryjnych rozcieńczeń ze stężeniem roboczego rozcieńczenia plazmidu odpowiadającym 107 LOD95% PCR.
    3. Wykonaj 6 dziesięciokrotnych seryjnych rozcieńczeń plazmidu. Przenieść 5 μl z roboczego rozcieńczenia plazmidu (oznaczonego w ppkt 4.4.2) do probówki z 45 μl ultraczystej wody. Odwirować i krótko odwirować probówkę. Powtarzać krok 4.4.3 do momentu, gdy ostatnia probówka w seryjnym rozcieńczeniu otrzyma plazmid.
    4. Amplifikować 6 dziesięciokrotnych seryjnych rozcieńczeń plazmidu, jak opisano w sekcji 2.
    5. Prześledź regresję liniową y = ax + b z a dla nachylenia i b dla punktu przecięcia (rysunek 3).
    6. Obliczyć wydajność wzmocnienia (E) od nachylenia a krzywej wzorcowej (patrz 4.4.5) za pomocą równania:
      Wzór na wydajność \( E(\%) = (10^{-\frac{1}{a}} - 1) \times 100 \); reprezentacja matematyczna..
      Powtórz kroki od 4.4.1 do 4.4.6 trzykrotnie.
      Uwaga: Wydajność amplifikacji reprezentuje wielkość wzrostu produktu PCR po każdym cyklu. Idealna reakcja osiąga sprawność bliską 100%. W praktyce E (%) wynosiło od 75% do 125%. Wyższe E może wskazywać na amplifikację produktów niespecyficznych lub błąd pipetowania w rozcieńczeniu szeregowym. Niższe E może również wskazywać na błąd pipetowania w rozcieńczeniu seryjnym, złą konstrukcję startera lub nieoptymalne warunki reakcji.
    7. Oblicz odchylenie (tabela 3). Sprawdź dla każdego poziomu plazmidu, czy bezwzględna wartość odchylenia jest mniejsza niż krytyczna wartość odchylenia (0,25 log10). Określ średnie odchylenie i niepewności liniowości (ULINi) dla każdego poziomu plazmidu (Tabela 3), aby ocenić wydajność regresji liniowej dla EHV-2 qPCR (Figura 4). U LINi jest niepewnością liniowości wyznaczoną dla każdego poziomu plazmidu i obliczoną na podstawie odchylenia standardowego (SD'i) i średniego odchylenia. Określić łączną niepewność liniowości (ULIN) EHV-2 qPCR określoną wzorem:
      Równanie równowagi statycznej, wykres przedstawiający obliczanie niepewności ULIN ze wzorem sumującym.
      Uwaga: Akceptacja błędu systematycznego jest określana przez laboratorium (na ogół odchylenie bezwzględne 0,25 log10) i odpowiada różnicy między najniższą wartością a najwyższą wartością 0,5 log10 (ilość mierzona w logarytmie10 numer kopii). Wartość ULIN może pomóc w porównaniu wydajności qPCR z różnych laboratoriów.
    8. Określić granicę oznaczalności qRT-PCR (LOQPCR): LOQPCR jest najniższym stężeniem z odchyleniem 0,25 log10 stosowanym dla zakresu liniowości (tabela 3).

5. Charakterystyka całej metody analitycznej (od ekstrakcji DNA do wyniku qRT-PCR)

Uwaga: Charakterystyka całej metody polega na walidacji wszystkich kroków niezbędnych do uzyskania danych qRT-PCR (tj. od ekstrakcji DNA z próbki oddechowej (patrz sekcja 1) do amplifikacji i kwantyfikacji celu (patrz sekcja 2)).

  1. Ustalić zgodność między liczbą kopii w reakcji PCR a liczbą kopii obecnych w próbce biologicznej o wzorze:
    Równanie do obliczania liczby kopii PCR; formuła wyrażająca kwantyfikację DNA..
    Metoda PCR, tekst "kopie/PCR" podkreślający analizę ilościową w badaniach genetycznych. to liczba kopii plazmidu w reakcji PCR, Formuła równania objętościowego PCR, koncepcja edukacyjna z biologii molekularnej, zwięzła wizualizacja. to objętość próbki dodanej do mieszanki PCR w celu amplifikacji, Równanie równowagi statycznej ΣFx=0; tekst formuły naukowej; Użytek edukacyjny. to objętość buforu AVE użytego do elucji kwasów nukleinowych, a Wzór na ekstrakcję objętości w równowadze statycznej, pokazany na schemacie naukowym do użytku edukacyjnego. to objętość wyekstrahowanej próbki.
  2. Zbadanie czułości i swoistości całej metody analitycznej
    Uwaga: W tej sekcji wykorzystywane są tylko znane próbki dodatnie (lub ujemne) na obecność EHV-2.
    1. Zbadaj "czułość" metody qRT-PCR, analizując próbki dodatnie dla celu (EHV-2).
      1. Wybrać próbki DNA z dodatnim wynikiem EHV-2, wcześniej scharakteryzowane (status pozytywny).
      2. Wyekstrahować kwas nukleinowy zgodnie z opisem w sekcji 1. Wykonaj procedurę amplifikacji zgodnie z opisem w sekcji 2.
      3. Określ liczbę rzeczywiście dodatnich próbek (dodatnie próbki, które są dodatnie w tym RT-PCR) i liczbę wyników fałszywie ujemnych (znane dodatnie próbki, które są ujemne w tym RT-PCR).
    2. Zbadaj "specyficzność" metody qRT-PCR, analizując próbki ujemne
      1. Wybierz próbki DNA z ujemnym wynikiem EHV-2 (status negatywny).
      2. Wyekstrahować kwas nukleinowy zgodnie z opisem w sekcji 1. Wykonaj procedurę amplifikacji zgodnie z opisem w sekcji 2.
      3. Określ liczbę rzeczywistych wyników ujemnych (próbki ujemne, o których wiadomo, że są ujemne w tym RT-PCR) i liczbę wyników fałszywie dodatnich (znane próbki ujemne, które są dodatnie w tym RT-PCR).
    3. Obliczyć »czułość diagnostyczną« (Se) i »swoistość diagnostyczną« (Sp) całej metody (tabela 4) w następujący sposób: Se = liczba wyników rzeczywiście dodatnich/(liczba wyników rzeczywiście dodatnich + wyniki fałszywie ujemne) i Sp = liczba wyników rzeczywiście ujemnych/(liczba wyników rzeczywiście ujemnych + wyniki fałszywie dodatnie) (zob. tabela 4).
    4. Obliczyć 95% przedział ufności dla czułości i swoistości całej metody za pomocą wzoru na zależność Greinera i Gardnera12,20:
      Wzór na margines błędu, e=1,96√[θ(1-θ)/n], równanie obliczeń statystycznych.
      gdzie e jest błędem szacowanym, θ jest Se (lub Sp), a n liczbą analizowanych próbek.
      Uwaga: W przypadku niewielkiej liczby próbek należy skorzystać z tabeli Schwartza zgodnie z normą AFNOR12 w celu obliczenia 95% przedziału ufności dla czułości i swoistości całej metody.
  3. Przygotowanie ujemnego materiału surowcowego do charakterystyki całej metody analitycznej
    UWAGA: Aby określić granice wykrywalności i kwantyfikacji całej metody (metoda LOD imetoda LOQ), należy dodać znane stężenia plazmidu do próbek biologicznych, o których wiadomo, że są wolne od celu (w tym przypadku EHV-2). Próbki te, wraz z ilościowo oznaczonym plazmidem, stanowią dodatnie wzorce, za pomocą których określasię metodę LOD imetodę LOQ.
    1. Potwierdzić brak celu (EHV-2) w próbkach biologicznych użytych do skonstruowania dodatnich wzorców.
      1. Wybierz różne znane ujemne próbki biologiczne.
      2. Pobrać próbki biologiczne zgodnie z opisem w sekcji 1. Wykonaj procedurę amplifikacji zgodnie z opisem w sekcji 2.
      3. Potwierdź brak celu przez brak sygnału PCR w tych próbkach.
        Uwaga: Użyj tego samego ujemnego materiału źródłowego dla wszystkich kroków między 5.4 a 5.5.
    2. Zebrać różne próbki ujemne, aby uzyskać 15 ml ujemnego materiału źródłowego (objętość niezbędna do pełnej walidacji). Dozuj 135 μl tego ujemnego surowca do 100 probówek. Probówki należy przechowywać w temperaturze +4 °C lub -80 °C przez długi czas.
  4. Granica wykrywalności całej metody analitycznej
    1. Określić strefę redukcji emisji dla całej metody.
      1. Dozuj 45 μl ultraczystej wody do 6 probówek.
      2. Wykonaj 6 dziesięciokrotnych seryjnych rozcieńczeń plazmidu. Przenieść 5 μl z roboczego rozcieńczenia plazmidu odpowiadającego 107 LOD95% PCR (jak określono w sekcji 4.3.10) do probówki z 45 μl ultraczystej wody. Odwirować i krótko odwirować probówkę. Powtarzać krok 5.4.1.2 do momentu, gdy ostatnia probówka w seryjnym rozcieńczeniu otrzyma plazmid.
      3. Przenieść 5 μl z każdego rozcieńczenia plazmidu do 2 probówek ze 135 μl ujemnego materiału źródłowego, aby otrzymać 2 kontrpróby dla 6 dodatnich wzorców. Wirować i krótko odwirować.
      4. Przeprowadzić ekstrakcję 2 powtórzeń dla 6 dodatnich wzorców, jak opisano w sekcji 1. Wykonaj procedurę amplifikacji zgodnie z opisem w sekcji 2.
      5. Określ strefę redukcji: strefę między ostatnim stężeniem plazmidu dającego sygnał dodatni a pierwszym stężeniem, które nie wykazuje żadnego sygnału.
    2. Granica wykrywalności metody (metoda LOD) wyznaczona na podstawie 2 niezależnych prób
      Uwaga: Wykonaj 2 niezależne próby, aby określić granicę wykrywalności całej metody (metoda LOD).
      1. Rozpocząć 6 podwójnych seryjnych rozcieńczeń od roboczego rozcieńczenia plazmidu, które jest 4 razy bardziej skoncentrowane niż ostatnie stężenie plazmidu, które dało sygnał dodatni (patrz punkt 5.4.1.5).
      2. Nalej 25 μl ultraczystej wody do 6 probówek.
      3. Wykonaj 5 dwukrotnych seryjnych rozcieńczeń plazmidu. Przenieść 25 μl z roboczego rozcieńczenia plazmidu (jak określono w ppkt 5.4.2.1) do probówki z 25 μl ultraczystej wody. Odwirować i krótko odwirować probówkę. Powtarzać krok 5.4.2.3 do momentu, gdy ostatnia probówka w seryjnym rozcieńczeniu otrzyma plazmid.
      4. Przenieść 5 μl z każdego rozcieńczenia plazmidu do 4 probówek ze 135 μl ujemnego materiału źródłowego, aby uzyskać 4 powtórzenia 5 dodatnich wzorców. Zwirować i krótko odwirować probówki.
      5. Przeprowadzić ekstrakcję 4 powtórzeń dla 5 dodatnich wzorców, jak opisano w sekcji 1. Wykonaj procedurę amplifikacji zgodnie z opisem w sekcji 2.
      6. Powtórzyć kroki od 5.4.2.1 do 5.4.2.5 jeden raz, aby uzyskać 8 powtórzeń dla każdego poziomu stężenia plazmidu.
      7. Policz liczbę dodatnich kontrprób z 8 kontrprób dla każdego poziomu stężenia plazmidu.
      8. Określmetodę LOD. Metoda LOD jest ostatnim poziomem, przy którym 8 z 8 kontrprób jest dodatnich (jak opisano w sekcji 5.4.2.7).
  5. Zakres liniowości i granica oznaczalności całej metody analitycznej
    Uwaga: Aby określić granicę oznaczalności całej metody (metoda LOQ), należy dodać znane stężenia plazmidu do próbek biologicznych, o których wiadomo, że są wolne od celu (w tym przypadku EHV-2). Próbki te stanowią dodatnie wzorce do określeniametody LOQ.
    1. Dozuj 45 μl ultraczystej wody do 6 probówek.
    2. Wykonaj 6 dziesięciokrotnych seryjnych rozcieńczeń plazmidu. Przenieść 5 μl z roboczego rozcieńczenia plazmidu odpowiadającegometodzie 107 LOD (jak określono w ppkt 5.4.2.8) do probówki z 45 μl ultraczystej wody. Odwirować i krótko odwirować probówkę. Powtarzać krok 5.5.2 do momentu, gdy ostatnia probówka w seryjnym rozcieńczeniu otrzyma plazmid.
    3. Przenieść 5 μl z każdego rozcieńczenia plazmidu do 2 probówek zawierających 135 μl materiału o ujemnych zasobach biologicznych, aby otrzymać 2 powtórzenia 6 dodatnich wzorców. Wirować i krótko odwirować.
    4. Przeprowadzić ekstrakcję 2 powtórzeń dla 6 dodatnich wzorców, jak opisano w sekcji 1. Wykonaj procedurę amplifikacji zgodnie z opisem w sekcji 2. Powtórz kroki od 5.5.1 do 5.5.4 trzykrotnie.
    5. Zdefiniowanie profilu dokładności w celu oceny i walidacji ilościowej skuteczności metody.
      1. Określ granice dopuszczalności całej metody dla laboratorium. W tym protokole limity akceptowalności są zdefiniowane jako ± 0,75 Log10 przez LABéO Frank Duncombe.
      2. Dla jednej próby należy prześledzić pierwszą regresję liniową y = ax + b (a jest nachyleniem, a b jest punktem przecięcia) z jedną powtórzoną wartością Ct odpowiadającą każdej szacowanej wartości krzywej standardowej. Za pomocą tej pierwszej regresji liniowej oblicz eksperymentalną wartość liczby kopii dla powtórzeń wartości Ct użytych dla tej pierwszej krzywej standardowej. Powtórzyć krok 5.5.5.2 z drugimi powtórzeniami wartości Ct, aby uzyskać drugą regresję liniową i obliczyć wartość doświadczalną liczby kopii dla drugich powtórzeń wartości Ct użytych dla drugiej krzywej wzorcowej.
      3. Powtórzyć krok 5.5.5.2 z drugą i trzecią próbą.
      4. Obliczyć granice precyzji, poprawności i dokładności dla każdego poziomu plazmidu zgodnie z NF U47-600-212.
      5. Należy utworzyć arkusz kalkulacyjny w celu zestawienia informacji dla wszystkich punktów standardowych (5.5.5.4) i utworzyć profil dokładności z wcześniej zdefiniowanymi granicami dopuszczalności w ppkt 5.5.5.1 oraz poprawnością danych wraz z dolną i górną granicą dokładności obliczoną w ppkt 5.5.5.4 (rysunek 5).
    6. Określićmetodę LOQ: odpowiada ona najniższemu stężeniu krzywej wzorcowej o poprawności 0,75 log10, stosowanej dla zakresu liniowości obliczonego w ppkt 5.5.5.5.
  6. Ocena powtarzalności i odtwarzalności
    Uwaga: Należy sprawdzić powtarzalność i odtwarzalność, stosując stosunek odchylenia standardowego do średniej z powtórzonych pomiarów (współczynnik zmienności lub CV = odchylenie standardowe/średnia).
    1. Oceń powtarzalność całej metody przez 1 analityka:
      1. Wybierz 3 próbki biologiczne z 3 różnymi ładunkami genomu wirusa (wcześniej testowane na przykład w PCR).
      2. Ekstrahować 8 powtórzeń z 3 próbek, jak opisano w sekcji 1. Wykonaj procedurę amplifikacji zgodnie z opisem w sekcji 2.
      3. Obliczyć średnią i odchylenie standardowe wartości Ct pobranej dla każdej próbki.
      4. Obliczyć CV w teście wewnątrztestowym, korzystając ze wzoru CV = odchylenie standardowe/średnia.
    2. Oceń odtwarzalność całej metody przez 3 analityków:
      1. Wybierz 3 próbki biologiczne z 3 różnymi ładunkami genomu wirusa (wcześniej testowane na przykład w PCR)
      2. Pobrać 2 powtórzenia z 3 próbek wybranych w ppkt 5.6.2.1 (zgodnie z opisem w sekcji 1). Wykonaj procedurę amplifikacji zgodnie z opisem w sekcji 2. Powtórz kroki 5.6.2.2 przez 2 niezależnych analityków.
      3. Obliczyć średnią i odchylenie standardowe wartości Ct pobranej dla każdej próbki.
      4. Obliczyć CV między testami, korzystając ze wzoru CV = odchylenie standardowe/średnia.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ilościowa metoda RT-PCR, opisana powyżej, została wdrożona do wykrywania i ilościowego oznaczania herpeswirusa-2 w płynach oddechowych. Rysunek 1 przedstawia schematyczny schemat przepływu pracy dla opracowania i walidacji ilościowej metody RT-PCR zgodnie z normą AFNOR NF U47-600. Specyficzność starterów i sond została zweryfikowana podczas stopniowego opracowywania PCR. Tylko szczepy EHV-2 były amplifikowane w tym systemie. Następnie należało scharakteryzować działanie qRT-PCR.

Po pierwsze, aby oszacowaćLOD PCR, przeprowadzono 6-krotne seryjne rozcieńczenie w celu ustalenia strefy redukcji (Rysunek 2). W tym przykładzie wykonano 6 dziesięciokrotnych seryjnych rozcieńczeń między 10-5 a 10-10 (od 26 000 do 0,26 kopii/2,5 μl próbki) w celu oszacowaniaLOD PCR. Strefa redukcji emisji znajduje się między rozcieńczeniami 10-9 i 10-10 (między 2,6 a 0,26 kopii/2,5 μl próbki). Aby określić wartość LODPCR w tym przypadku, w tej strefie redukcji wykonano 6 dwukrotnych seryjnych rozcieńczeń plazmidu między 5,2 a 0,16 kopii/2,5 μl próbki. Wartość LODPCR wyniosła 2,6 kopii/2,5 μl próbki.

Aby określić zakres liniowości i LOQPCR, wartość LODPCR została użyta do rozpoczęcia zakresu 6 dziesięciokrotnych seryjnych rozcieńczeń, od 2,6 (LODPCR) do 260 000 kopii/2,5 μl próbki. Rycina 3 ilustruje regresję liniową dla EHV2 qRT-PCR z jednego badania. Wydajność regresji liniowej (rysunek 4) jest weryfikowana czterokrotnie przy użyciu obliczeń opisanych w tabeli 3. Obliczenia są wykonywane w celu zdefiniowania zakresu liniowości zgodnie z kryteriami bezwzględnej wartości odchyleniai ≤0,25 log10, niezależnie od poziomu i obciążenia plazmidem. W tym przypadku zakres liniowości wynosił od 2,6 do 260 000 kopii/2,5 μl próbki. LOQPCR jest najniższym stężeniem w zakresie liniowości (tj. w tym przypadku 2,6 kopii/2,5 μl próbki). ULIN określono na 0,12 log10 w zakresie 2,6-260 000 kopii/2,5 μl DNA.

Po opracowaniu (Rysunek 1, niebieski) i scharakterystyzowaniu qRT-PCR (Rysunek 1, żółty), norma AFNOR NF U47-600 zaleca scharakteryzowanie całej metody analitycznej od ekstrakcji DNA do qRT-PCR (Rysunek 1, pomarańczowy). Czułość i swoistość diagnostyczną obliczono w sposób opisany w Tabeli 4. Ilościowe wyniki całej metody analitycznej qRT-PCR oceniono i zwalidowano z profilem dokładności (ryc. 5).

Ten protokół, który wykorzystuje najnowocześniejszą technologię molekularną, pozwolił nam wykryć i określić ilościowo obciążenie genomu wirusa EHV-2 w 172 próbkach wymazów z nosa pobranych od koni z zaburzeniami oddychania i/lub klinicznym podejrzeniem infekcji. Częstość występowania EHV-2 w próbkach terenowych (biologicznych) wynosiła 50% (86/172) w tej populacji. Analizy ilościowe wykazały, że ładunki genomu wirusa EHV-2 były znacznie wyższe u młodych koni, a repartycja ładunków genomu wirusa zmniejszała się wraz z wiekiem (ryc. 6). W niniejszym badaniu najwyższe obciążenie genomem wirusa EHV-2 (1,9 x10 11 kopii / ml) wykryto u źrebiąt (ryc. 6).

Diagram procesu qRT-PCR przedstawiający projekt startera, czułość, swoistość i etapy walidacji metody.
Rysunek 1: Schemat przepływu pracy dla rozwoju (niebieski), charakterystyka ilościowego RT-PCR (żółty) oraz charakterystyka całej metody analitycznej od ekstrakcji DNA do qRT-PCR (pomarańczowy) zgodnie z normą AFNOR NF U47-600-2. Wykres przepływu pracy wznawia różne etapy rozwoju, charakterystykę ilościowego RT-PCR oraz charakterystykę całej metody analitycznej od ekstrakcji DNA do qRT-PCR. Dla każdego kroku wykres przepływu pracy wskazuje liczbę wymaganych przebiegów, rozcieńczenia do wykonania oraz liczbę wymaganych analityków. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wykres krzywych amplifikacji PCR w czasie rzeczywistym; Kwantyfikacja DNA; analiza progów cyklu.
Rysunek 2: Określenie strefy redukcji emisji z reprezentatywnymi wynikami z krzywych PCR w czasie rzeczywistym uzyskanych z 6 dziesięciokrotnymi seryjnymi rozcieńczeniami plazmidu. Aby oszacować strefę redukcji, wykonuje się 6 dziesięciokrotnych seryjnych rozcieńczeń między 10-5 (26 000 kopii/2,5 μl próbki) i 10-10 (0,26 kopii/2,5 μl próbki). Strefa redukcji emisji znajduje się między rozcieńczeniami 10-9 (2,6 kopii/2,5 μl próbki) i 10-10 (0,26 kopii/2,5 μl próbki). W tym przypadku w tej strefie redukcji wykonano 6 dwukrotnych seryjnych rozcieńczeń plazmidu w celu oznaczenia LOD 95% PCR, między 5,2 a 0,16 kopii/2,5 μl próbki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wykres kwantyfikacji PCR, próg cyklu a kopia plazmidu; Zawiera równanie trendu liniowego.
Rysunek 3: Regresja liniowa dla EHV2 qRT-PCR. Liniowość badań ilościowych to zdolność do generowania wyników, które są proporcjonalne do stężenia celu obecnego w określonym zakresie. Można to modelować za pomocą regresji liniowej (y = ax + b) między odpowiedzią instrumentalną (próg cyklu lub Ct) a logarytmem ilości celu (liczba kopii docelowych/próbka 2,5 μl). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wykres odchylenia kwantyfikacji plazmidu, przedstawiający średnie odchylenie w stosunku do poziomów plazmidu log10 ze słupkami błędu.
Rysunek 4: Wydajność regresji liniowej EHV-2 qPCR. Odchylenie średnie reprezentuje średnią różnicę między zmierzoną ilością plazmidu (Średnia danych próbki, słupek Xi, reprezentacja symboliczna, analiza statystyczna, notacja wzoru.) a teoretyczną ilością plazmidu (x'i) dla każdego poziomu plazmidu. Pionowe słupki reprezentują niepewność liniowości (ULINi) określoną wzorem
Wzór na niepewność U_LINI=2√(SD_i^2+średnia.odchylenie^2), analiza danych statystycznych.
gdzie SD'i jest odchyleniem standardowym zmierzonej ilości plazmidu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wykres odchylenia plazmidu EHV2; analizuje odchylenie bezwzględne w funkcji poziomu plazmidu (Log10) z granicami ufności.
Rysunek 5: Profile dokładności oparte na wynikach walidacji metody EHV-2 qRT-PCR. Zielona linia (kółka) reprezentuje poprawność danych (błąd systematyczny lub stronniczość). Granice dopuszczalności są określane przez laboratorium na ± 0,75 log10 (linie przerywane). Dolne i górne granice dokładności określono dla każdego poziomu obciążenia plazmidem na podstawie średniego odchylenia ± dwukrotności odchylenia standardowego danych niezawodności (czerwone linie). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wykres punktowy obciążenia genomu wirusa EHV2 przedstawiający grupy wiekowe z markerami analizy statystycznej.
Rycina 6: Kwantyfikacja ładunków genomu wirusa EHV-2 w zależności od wieku. Rozkład obciążenia genomu wirusa EHV-2 wykryty w próbkach wymazów z nosa jest reprezentowany dla różnych grup wiekowych. Linie poziome reprezentują medianę wartości w ramach odchylenia standardowego (m = miesiące). * Znacząco różni się w zależności od ANOVA z testem post-hoc Newmana-Keulsa (p <0,05). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Gen docelowyStartery, sekwencje sondy i plazmidu (5'-3')Pozycja nukleotydówRozmiar produktu (nukleotydy)Warunki cyklu termicznegoOdwołania
EHV2 gB
(HQ247755.1)		Naprzód: GTGGCCAGCGGGGTGTTC 2113-21307895 °C 5 min11
Odwrotny: CCCCCAAAGGGATTYTTGAA2189-217095 °C 15 s45 cykli
Sonda: FAM-CCCTCTTTGGGAGCATAGTCTCGGGG-MGB2132-215760 °C 1 min
Plazmid:
ACCTGGGCACCATAGGCAAGGTGGTGGTCA
ATGTGGGGAGGGTGTTCTCCCTCTTTG
GGAGCATAGTCTCGGGGGGGATAAGCTTTTT
CAAAAATCCCTTTGGGGGCATGCTGCTCATA
GTCCTCATCATAGCCGGGGTAGTGGTGGTG
TACCTGTTTATGACCAGGTCCAGGAGCATAT
ACTCTGCCCCCATTAGAATGCTCTACCCCGG
GGTGGAGAGCGGCCCAGGAGCCGGGGG
CGCACCCGGTGTCAGAAGACCAAATCAGGA
ACATCCTGATGGGAATGCACCAATTTCAG		2081-2381

Tabela 1: Sekwencje starterów, sond i pozytywnych kontroli syntetycznego DNA użyte w tym protokole. Sekwencja plazmidu (dodatniego syntetycznego DNA) odpowiada pozycjom nukleotydów 2081-2381 sekwencji EHV2gB (HQ247755.1). Konstrukcja starterów i sond zastosowanych w tym protokole została uzyskana przy użyciu specjalnego oprogramowania.

PATOGENYOdniesienie (początek)Liczba szczepówWyniki
EHV-2
EHV-2VR701 (ATCC)20Pozytywny
20 próbek (pobranie FDL)
EHV-5KD05 (GERC)20Negatywny
20 próbek (pobranie FDL)
EHV-3VR352 (ATCC)2Negatywny
T934 WSV (GERC)
EHV-1Szczep Kentucky Ky A (ATCC)3Negatywny
2 próbki (pobranie FDL)
EHV-4VR2230 (ATCC)1Minus
Herpeswirus opryszczki asinine AHV5Kolekcja FDL1Minus
Wirus grypy koni A/equine/Jouars/4/2006 (H3N8)1Negatywny
(Numer dostępu JX091752)
Wirus zapalenia tętnic koniVR796 (ATCC)cyfra arabskaMinus
Rhodococcus equi (Różeniec górski)Kolekcja FDL1Minus
Streptococcus equi subsp. ZooepidemicusKolekcja FDL1Minus
Streptococcus equi subsp. equiKolekcja FDL1Minus
Coxiella burnetii (Coxiella burnetii) ADI-142-100 (adiagen)1Minus
Chlamydophila abortus (Chlamydophila abortus)ADI-211-50 (adiagen)1Minus
Klebsiella pneumoniaeKolekcja FDL1Minus

Tabela 2: Analityczna specyficzność qRT-PCR dla EHV-2.

Ilościowa analiza danych PCR; Tabela z równaniami dla odchylenia, średniego odchylenia i obliczeń wydajności.
Tabela 3: Obliczanie odchylenia i niepewności liniowości (na podstawie NF U47-600-212). Dla każdej próby wyniki regresji liniowej (y = ax + b) są walidowane przy użyciu tabeli, gdzie y jest uzyskanym progiem cyklu; a oznacza uzyskane nachylenie; x jest poziomem plazmidu, a b jest punktem przecięcia. i to poziom plazmidu (i waha się od 1 do k poziomów); k jest liczbą użytych poziomów plazmidu (np. k = 6 w tej tabeli); j jest próbą (j waha się od 1 do I próby); I jest liczbą prób, składającą się z 3 do 6 prób (np. I = 4 w tej tabeli). xi jest szacowaną ilością plazmidu dla każdego poziomu plazmidu i. x'i jest teoretyczną ilością plazmidu otrzymaną za pomocą równania x'i = log10(xi) dla każdego poziomu plazmidu i. Podczas każdej próby j próg cyklu uzyskany dla każdego poziomu plazmidu i jest obliczany za pomocą regresji liniowej yi,j =a jxi,j + bj. Równanie dla zmiennej modelu statystycznego X-hat sub i, j to ilość plazmidu zmierzona podczas badania j. Błądsystematyczny i to różnica obserwowana między zmierzoną ilością plazmidu a teoretyczną ilością plazmidu dla każdej próby i każdego poziomu plazmidu. Wykres równowagi statycznej, ΣFx=0, ΣFy=0, wektory sił, siły ciała swobodnego, analiza mechaniczna. to średnia wartość Symbol równania: x̂ij używany w analizie statystycznej; Zazwyczaj spotykane w modelowaniu danych. przez każdy poziom plazmidu i; SD'i jest odchyleniem standardowym mierzonej wielkości Równanie estymacji zmiennej, oznaczone symbolem x̂ij, stosowane w analizie statystycznej. dla każdego poziomu plazmidu i; Odchylenie średniej jest średnią odchyleniai; ULINi jest niepewnością liniowości wyznaczoną dla każdego poziomu plazmidu i obliczoną na podstawie SD'i i średniego odchylenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rzeczywisty status próbki
PlusMinus
Wyniki uzyskane całą metodąPlusRP (naprawdę pozytywny)FP (wynik fałszywie dodatni)
MinusFN (wynik fałszywie ujemny)RN (rzeczywista wartość ujemna)
łącznyRP+FNFP+RN
Se = RP/(RP+FN)Sp = RN/(RN+FP)

Tabela 4: Obliczanie czułości diagnostycznej (Se) i swoistości (Sp) całej metody. Do obliczenia przedziału ufności przy 95% czułości i swoistości całej metody wykorzystano tablicę Schwartza, jak opisano w NF U47-600-2.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Od 2000 roku PCR w czasie rzeczywistym zastępuje techniki złotego standardu (metody hodowli komórkowych i bakterii) w coraz większej liczbie laboratoriów. Wdrożenie tej techniki jest stosunkowo łatwe. Jednak walidacja metod laboratoryjnych jest niezbędna do molekularnego wykrywania i kwantyfikacji patogenów w celu zapewnienia dokładnych, powtarzalnych i wiarygodnych danych.

Ponieważ etap ekstrakcji jest głównym źródłem utraty materiału biologicznego, można go uznać za główne źródło błędu kwantyfikacji między jednym protokołem a drugim. W związku z tym utworzenie standardowej krzywej plazmidu DNA podczas qRT-PCR, opisywane głównie w literaturze, wskazuje na obciążenie genomem wirusa, ale nie uwzględnia etapu ekstrakcji.

Opis strategii de novo dla całego procesu walidacji metody w normie AFNOR NF U47-600-2 stanowi znaczący postęp w tej dziedzinie. Jak pokazano w tej pracy dla EHV-2 u koni lub innych u pszczół21, wymaga to wyraźnego rozróżnienia między etapem rozwoju a etapem walidacji z charakterystyką PCR i charakterystyką całej metody. Jednym z ograniczeń w tym interesującym podejściu jest to, że każda zmiana w protokole będzie skutkowała obowiązkiem ponownej walidacji całego procesu, co może być bardzo kosztowne. Ograniczenie to zostało również podkreślone przez fakt, że granice oznaczania ilościowego zależą od źródła, z którego wirus jest ekstrahowany (np . płyny oddechowe, narządy, krew lub mocz). W rzeczywistości każda matryca ma inną specyfikę w swojej charakterystyce fizykochemicznej i ważne jest, aby niezależnie zdefiniować każdą inną matrycę używaną do wykrywania i kwantyfikacji wirusa za pomocą qRT-PCR. W ten sposób ładunek genomu wirusa w każdej próbce biologicznej można dokładniej określić ilościowo na podstawie ekstrakcji. Charakterystyka uwzględnia również model termocyklera i w przypadku, gdy zastosowanie wcześniej dobrze scharakteryzowanej metody (np. metody EHV-2 qPCR opisanej w tym artykule) wymaga nowego typu maszyny w laboratorium macierzystym lub innym laboratorium, należy potwierdzić działanie tego urządzenia. Potwierdzenie wykonania testu qPCR jest warunkiem wstępnym dla wszystkich testów wprowadzanych do laboratorium. Zwykle osiąga się to poprzez analizę próbki referencyjnej o znanych właściwościach. Taka kontrola jest warunkiem wstępnym i jest uważana za obowiązkową zgodnie z wymogami normy NF 47-600-1 AFNOR w celu walidacji skuteczności qPCR (LOD, LOQ efficiency) i solidności całej metody (LOD, LOQ). Nie tylko na etapie opracowywania i charakteryzowania, ale także w przypadku stosowania w badaniach lub do celów diagnostycznych, czynniki ryzyka mogą być identyfikowane i dobrze kontrolowane, aby zapewnić standaryzację protokołu. Szczególną uwagę należy zwrócić na odpowiednie wyszkolenie personelu, wysoko wykwalifikowany personel, kontrolę jakości stosowanych materiałów eksploatacyjnych i ich przechowywania, kontrolę bezpośrednich warunków środowiskowych oraz świadomość warunków metrologicznych, które mogą mieć wpływ na działanie przyrządów naukowych biorących udział w badaniu. Wykorzystanie próbek referencyjnych do porównań międzylaboratoryjnych mogłoby również pomóc w kontrolowaniu niepewności. W ten sposób można ułatwić porównywanie danych między laboratoriami. Międzylaboratoryjne badania biegłości są bowiem niezbędne do oceny i potwierdzenia odtwarzalności metody.

Wyniki obciążenia genomem wirusa, które są wyrażone w jednostkach międzynarodowych (IU) analizowanej matrycy biologicznej (IU: kopie/ml dla płynów lub kopie/g dla tkanek) są łatwiejsze do wykorzystania w celu porównania wyników między różnymi laboratoriami. Wszystkie wyniki powyżej granicy oznaczalności są wyrażone w kopiach/ml, a wynik między LOD a LOQ przyjmuje się jako niekwantyfikowalny wynik dodatni. Przedstawienie w ten sposób danych kwantyfikacyjnych genomu jest bardziej zgodne z procesem analiz (amplifikacji genomu). W rzeczywistości w eksperymentach z hodowlami komórkowymi ekspresja wiremii przez TCID50 (mediana dawki infekcyjnej w hodowli tkankowej) zależy od charakteru komórek i szczepów wirusa. Każda linia szczepów ma swoją unikalną kinetykę infekcji, a niektóre wirusy, takie jak EHV-2, mogą potrzebować kilku dni, zanim pojawi się pierwszy efekt cytopatogenny.

Podsumowując, ta nowa metoda charakterystyki qRT-PCR powinna ułatwić harmonizację prezentacji i interpretacji danych między laboratoriami. Będzie to bardzo przydatne w przypadku potencjalnych nowych zastosowań qRT-PCR w przyszłości, takich jak ustalenie wartości odcięcia dla deklaracji statusu choroby, a nie tylko obecności lub braku patogenu.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Sophie Castagnet i Nadii Doubli-Bounoua za ich wsparcie techniczne. Prace te uzyskały wsparcie finansowe ze strony Rady Generalnej Calvadosu oraz za zgodą Regionu Dolna Normandia i rządu francuskiego (CPER 2007-2013; projekt R25 p3). Autorzy pragną podziękować ekspertom grupy AFNOR, a w szczególności Jean-Philippe'owi Buffereau i Ericowi Dubois.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AB-1900 naturalny kolor ABgene 96 dołków Dutsher16924
Folia samoprzylepna qPCR Absolute Dutsher16629Folia samoprzylepna używana do uszczelniania płytki przed biegiem qRT-PCR
Mikroprobówki 0,5 ml, z listwą przypodłogową, nakrętkiDutsher039258
Etanol 98%SodiproSAF322941000
Podkłady EurofinsNa zamówienie
Technologie żywotnościsondyzamówienie niestandardowe
PlazmidEurofinsZamówienie
QIAamp  Mini zestaw wirusa RNA
(zawierający: kolumnę QIAamp Mini, bufor AVL ,  Bufor AW1, bufor AW2, bufor AVE, probówki zbiorcze) 		Qiagen52906AVL: wstępne rozgrzanie 5 min przy 72 stopniach; C
Sekwencjonowanie metodą SangeraEurofinsNa zamówienie
Taqman Universal PCR Master MixLife Technologies4364340
Roztwór buforowy Tris-EDTASanta Cruzsc-296653A
Spektrofotometr NanoDrop 2000cThermoscientificND-2000C
StepOnePlus Systemy PCR w czasie rzeczywistymTechnologie życia4376600Podgrzewanie 15 min 
na niestandardoweBufor

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brault, S. A., et al. The immune response of foals to natural infection with equid herpesvirus-2 and its association with febrile illness. Vet.Immunol.Immunopathol. 137 (1-2), 136-141 (2010).
  2. Fortier, G., Van Erck, E., Pronost, S., Lekeux, P., Thiry, E. Equine gammaherpesviruses: pathogenesis, epidemiology and diagnosis. Vet.J. 186 (2), 148-156 (2010).
  3. Hue, E. S., et al. Detection and quantitation of equid gammaherpesviruses (EHV-2, EHV-5) in nasal swabs using an accredited standardised quantitative PCR method. J Virol.Methods. 198 (1), 18-25 (2014).
  4. Diallo, I. S., et al. Multiplex real-time PCR for the detection and differentiation of equid herpesvirus 1 (EHV-1) and equid herpesvirus 4 (EHV-4). Vet.Microbiol. 4 (1-3), 93-103 (2007).
  5. Williams, K. J., et al. Equine multinodular pulmonary fibrosis: a newly recognized herpesvirus-associated fibrotic lung disease. Vet.Pathol. 44 (6), 849-862 (2007).
  6. Mullis, K., et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol. 51 (1), 263-273 (1986).
  7. EPA Office of Water (4607). EPA-815-B-04-001. Quality Assurance/Quality Control Guidance for Laboratories Performing PCR Analyses on Environmental Samples. , (2004).
  8. Telford, E. A., et al. Equine herpesviruses 2 and 5 are gamma-herpesviruses. Virology. 195 (2), 492-499 (1993).
  9. Fortier, G., et al. Identification of equid herpesvirus-5 in respiratory liquids: A retrospective study of 785 samples taken in 2006-2007. Vet.J. 182 (2), 346-348 (2009).
  10. Brault, S. A., Bird, B. H., Balasuriya, U. B., MacLachlan, N. J. Genetic heterogeneity and variation in viral load during equid herpesvirus-2 infection of foals. Vet.Microbiol. 147 (3-4), 253-261 (2011).
  11. Association Francaise de Normalisation. NFU 47-600-1. Animal health analysis methods-PCR-Part 1: Requirements and recommandations for the implementation of veterinary PCR. , (2015).
  12. Association Francaise de Normalisation. NFU 47-600-2. Animal health analysis methods-PCR-Part 2: Requirements and recommendations for the development and the validation of veterinary PCR. , (2015).
  13. ISO. EN ISO-CEI 17025. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories. , (2005).
  14. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2010. Chapter1.1.1.4/ 5. Principles and Methods of Validation of Diagnostic Assay for Infectious Diseases. , This thoroughly revised chapter replaces Chapter 1.1.4 Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases and Chapter 1.1.5 Validation and quality control of polymerase chain reaction methods used for the diagnosis of infectious diseases from the sixth edition of the OIE Terrestrial Manual (2009).
  15. Apaza, S., et al. Detection and genogrouping of noroviruses from children's stools by Taqman One-step RT-PCR. J Vis.Exp. (65), e3232(2012).
  16. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis.Exp. (63), e3998(2012).
  17. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol.Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  18. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  19. NCBI. BLAST Homepage and Selected Search Pages. Introducing the BLAST homepage and form elements/functions of selected search pages. , (2015).
  20. Greiner, M., Gardner, I. A. Application of diagnostic tests in veterinary epidemiologic studies. Prev.Vet Med. 45 (1-2), 43-59 (2000).
  21. Blanchard, P., Regnault, J., Schurr, F., Dubois, E., Ribiere, M. Intra-laboratory validation of chronic bee paralysis virus quantitation using an accredited standardised real-time quantitative RT-PCR method. J Virol.Methods. 180 (1-2), 26-31 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Equid Herpesvirus 2Quantitative PCRRespiratory FluidsNucleic Acid ExtractionReal Time PCRSerial DilutionsLimit of DetectionViral Load QuantificationAFNOR NF U47 600Equine Respiratory Disease

Related Articles