Artykuł metodologiczny

Opracowanie i walidacja ilościowej metody PCR do diagnostyki herpeswirusa koniowatego-2 w płynach oddechowych

31.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53672

⸱

17 marca 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1LABÉO Frank Duncombe, 2Unité de Risques Microbiens (U2RM, EA 4655), Normandy University, 3Hippolia Foundation

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i walidacji ilościowej metody PCR używanej do wykrywania i kwantyfikacji DNA EHV-2 w płynach oddechowych koni. Protokół walidacji EHV-2 qRT-PCR obejmuje trzyczęściową procedurę: opracowanie, scharakteryzowanie samego testu qRT-PCR oraz scharakteryzowanie całej metody analitycznej.

Streszczenie

Protokół opisuje ilościową metodę RT-PCR do wykrywania i oznaczania ilościowego EHV-2 w płynach oddechowych koni zgodnie z normą NF U47-600. Po etapie rozwoju i pierwszej walidacji przeprowadzono dwa odrębne etapy charakterystyki zgodnie z normą AFNOR: (a) charakterystykę samego testu qRT-PCR oraz (b) charakterystykę całej metody analitycznej. Walidacja całej metody analitycznej obejmowała przedstawienie wszystkich etapów między ekstrakcją kwasów nukleinowych a końcową analizą PCR.

Walidacja całej metody jest bardzo ważna dla wykrywania wirusów za pomocą qRT-PCR, aby uzyskać dokładne określenie obciążenia genomu wirusa. Ponieważ etap ekstrakcji jest głównym źródłem utraty materiału biologicznego, można go uznać za główne źródło błędu kwantyfikacji między jednym protokołem a drugim. Z tego powodu norma AFNOR NF-U-47-600 zaleca uwzględnienie zakresu rozcieńczenia plazmidu przed etapem ekstrakcji. Ponadto granice oznaczalności zależą od źródła, z którego wirus jest ekstrahowany. Wyniki obciążenia genomem wirusa, które są wyrażone w jednostkach międzynarodowych (j.m.), są łatwiejsze do wykorzystania w celu porównania wyników między różnymi laboratoriami.

Ta nowa metoda charakterystyki qRT-PCR powinna ułatwić harmonizację prezentacji i interpretacji danych między laboratoriami.

Wprowadzenie

Herpeswirus-2 (EHV-2) bierze udział w zespole oddechowym, z potencjalnymi objawami klinicznymi, takimi jak wydzielina z nosa, zapalenie gardła i obrzęk węzłów chłonnych1-3. Podejrzewa się również, że wirus ten jest związany ze słabą wydajnością koni, co może mieć znaczący i negatywny wpływ ekonomiczny na przemysł konny2.

Do tej pory złotym standardem wykrywania gamma-EHV (γ-EHV) była metoda hodowli komórkowych. Pierwszą niedogodnością tej procedury był brak dyskryminacji między EHV-2 a innymi γ-EHV (np. EHV-5). Drugą niedogodnością był powolny rozwój procesu cytopatycznego, który trwa od 12 do 28 dni, aby objawić się4,5.

Opracowanie zweryfikowanej i znormalizowanej ilościowej metody reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) pomoże w szybkim wykryciu wirusa, rozróżnieniu między EHV-2 i EHV-5 oraz zbadaniu związku między obciążeniem genomu wirusa a chorobą dzięki aspektowi kwantyfikacji.

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) została opisana po raz pierwszy w 1986 roku przez Mullisa6 i wkrótce stanie się nowym złotym standardem w większości dziedzin diagnostyki biologicznej (człowiek, środowisko i weterynaria). Ta metoda, która opiera się na amplifikacji części genomu patogenów, ma wiele zalet: swoistość, czułość i szybkość. Co więcej, ryzyko zanieczyszczenia amplikonem zmniejszyło się od czasu pojawienia się qRT-PCR i zapewnienia jakości7. Niemniej jednak uznanie PCR za nowy złoty standard metody wymagało czegoś więcej niż tylko poprawy danych dotyczących wydajności, ale także wykazania kontroli etapów rozwoju i walidacji całej metody bez pogorszenia wydajności w czasie.

Pierwsze narzędzia molekularne używane do wykrywania EHV-2 były czasochłonne i obejmowały niespecyficzną amplifikację za pomocą zagnieżdżonego PCR, a następnie sekwencjonowanie8. Genami docelowymi dla wirusów opryszczki były polimeraza kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) i pakowanie DNA9. Jednak zagnieżdżony PCR wiąże się z wysokim ryzykiem zanieczyszczenia amplikonami. Od tego czasu konwencjonalne testy PCR zostały zaprojektowane w celu amplifikacji genu podobnego do interleukiny 10 lub genu glikoproteiny B, poddanego przeglądowi w 2009 r.2. Niedawno opisano charakterystykę PCR w czasie rzeczywistym w celu oznaczania ilościowego EHV-210, ale nie było dostępnych danych dotyczących walidacji całej metody, w tym procesu ekstrakcji.

W tym protokole, procedury rozwoju i walidacji są opisane dla ilościowej metody PCR do wykrywania i kwantyfikacji DNA EHV-2 w płynach oddechowych koni zgodnie z normą Association française de normalisation (AFNOR) NF U47-6003,11,12, która jest francuskim przedstawicielem w międzynarodowym komitecie normalizacyjnym. Norma ta szczegółowo opisuje "Wymagania i zalecenia dotyczące wdrażania, rozwoju i walidacji weterynaryjnego PCR w metodzie analizy zdrowia zwierząt"11,12, zgodnie z NF EN ISO/CEI 17025, 200513 oraz zaleceniami OIE (Światowa Organizacja Zdrowia Zwierząt) 201014. Protokół walidacji EHV-2 qRT-PCR obejmuje trzyczęściową procedurę: (a) opracowanie testu qRT-PCR, (b) scharakteryzowanie samego testu qRT-PCR oraz (c) scharakteryzowanie całej metody analitycznej (od ekstrakcji kwasów nukleinowych z próbki biologicznej do analizy PCR).

Charakterystyka testu qRT-PCR i całej metody analitycznej obejmuje definicję dwóch granic: granicy wykrywalności (LOD) i granicy oznaczalności (LOQ). LOD95% PCR reprezentuje najniższą liczbę kopii kwasu nukleinowego na jednostkę objętości, którą można wykryć w 95% wszystkich przypadków. LOQ95% PCR reprezentuje najmniejszą ilość kopii kwasów nukleinowych, jaką można określić biorąc pod uwagę niepewności.

Ta metoda qRT-PCR pozwala na precyzyjne wykrycie i szybkie określenie ilościowe EHV-2 w płynach oddechowych. Co więcej, metoda ta może być stosowana w innych laboratoriach w celu zapewnienia ustandaryzowanej procedury i jako ogólny szablon do opracowywania innych nowych testów qRT-PCR.

Protokół

Uwaga: Należy odnieść się do wszystkich poszczególnych etapów przedstawionych na Rysunku 1.

1. Izolacja kwasów nukleinowych

Uwaga: Ekstrakcję należy przeprowadzić pod dygestorium, aby ograniczyć zanieczyszczenie dróg oddechowych kwasami nukleinowymi. Należy uwzględnić ujemną kontrolę ekstrakcji z wodą traktowaną DEPC, aby upewnić się, że żaden z odczynników nie jest zanieczyszczony niepożądanym DNA.

  1. Wyizoluj kwasy nukleinowe z próbki biologicznej zgodnie z wcześniej opisanym protokołem15 oraz instrukcją producenta.
    1. Dodaj 140 µl próbki biologicznej do 560 µl roztworu lizującego (bufor AVL) i inkubuj przez 10 min w temperaturze pokojowej. Dodaj 560 µl etanolu. Nanieś pierwsze 630 µl tego roztworu (próbka+roztwór lizujący+etanol) na kolumnę krzemionkową i odwiruj w wirówce.
    2. Nanieś pozostałe 630 µl tego roztworu na tę samą kolumnę krzemionkową i odwiruj. Następnie przemyj kolumnę 500 µl z dwóch różnych buforów płuczących (AW1 i AW2).
  2. Eluuj kwasy nukleinowe za pomocą 50 µl buforu eluującego (bufor AVE) i doprowadź do temperatury pokojowej. Zamknij nakrętkę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 min. Odwiruj przy 6,000 g przez 1 min.

2. Procedura amplifikacji

  1. Przygotować 22,5 µl mieszaniny reakcyjnej dla każdej reakcji. Dodać 12,5 µl master mixu do PCR, x µl startera forward o stężeniu 20 µM, x µl startera reverse o stężeniu 20 µM, y µl sondy o stężeniu 10 µM oraz z µl wody ultrapurej zgodnie z zapotrzebowaniem, aby osiągnąć objętość 22,5 µl (objętości x, y i z są wyznaczane po miareczkowaniu, patrz sekcje 3.2.3 i 3.2.6).
  2. Nanieść 22,5 µl odpowiedniej mieszaniny reakcyjnej do każdego dołka reakcyjnego na płytce 96-dołkowej.
    Uwaga: Należy uwzględnić kontrole negatywne dla ekstrakcji i dla PCR, aby upewnić się, że żaden z odczynników nie jest zanieczyszczony niepożądanym DNA.
  3. Dodać 2,5 µl próbki, 2,5 µl kontroli negatywnej ekstrakcji, 2,5 µl kontroli negatywnej PCR oraz 2,5 µl próbki pozytywnej (szczep referencyjny lub plazmid) do odpowiednich dołków reakcyjnych. Po rozdzieleniu przykryć płytkę szczelną folią do płytek. Wirować płytkę przez 10 s przy 6,000 g.
  4. Umieścić płytkę w systemie Real-Time PCR. Wybrać szablon układu testu i uruchomić pomiar. Zastosować następujące ustawienia programu PCR: 10 min w 95 °C, a następnie 45 cykli obejmujących 15 s w 95 °C i 1 min w 60 °C (Tabela 1).
  5. Przenieść surowe dane z systemu Real-Time PCR do arkusza kalkulacyjnego. Ustawić próg (threshold) na wykresach amplifikacji powyżej linii bazowej i w obrębie regionu wzrostu wykładniczego, aby uzyskać cykl progowy dla każdej próbki. Wykreślić zestaw standardów jako krzywą wzorcową w celu uzyskania liniowości. Obliczyć liczbę kopii dla poszczególnych próbek na podstawie krzywej wzorcowej.

3. Opracowanie ilościowej RT-PCR

Uwaga: Opracowanie testu qRT-PCR wymaga szczepów referencyjnych, specyficznego miareczkowanego plazmidu oraz różnych kontroli i wiąże się z miareczkowaniem starterów i sondy.

  1. Test wstępny
    1. Zaprojektować startery i sondy przy użyciu specjalistycznego oprogramowania zgodnie z wcześniejszymi zaleceniami16.
    2. Wyizolować szczepy referencyjne zgodnie z opisem w sekcji 1.
    3. Przeprowadzić amplifikację zgodnie z opisem w sekcji 2, stosując stężenie końcowe starterów 900 nM oraz stężenie końcowe sondy 250 nM. Przeanalizować sygnał zgodnie z opisem w sekcji 2.5.
    4. Jednocześnie przeprowadzić amplifikację DNA szczepów referencyjnych (zgodnie z opisem w sekcji 3.1.3) bez użycia sond. Sekwencjonować uzyskane amplikony metodą Sangera17,18. Przeanalizować sekwencje, wykonując analizę nucleotide BLAST19.
  2. Miareczkowanie starterów i sondy
    1. Przygotować 3 różne mieszaniny ze stężeniem końcowym sondy 250 nM oraz różnymi stężeniami końcowymi starterów forward i reverse (50 nM/50 nM, 300 nM/300 nM, 900 nM/900 nM) dla 3 powtórzeń próbki pozytywnej i kontroli negatywnej. Do każdej mieszaniny dodać taką samą odpowiednią objętość startera forward 20 µM i startera reverse 20 µM (0,25 µl dla uzyskania stężenia końcowego 50 nM, 1,5 µl dla uzyskania stężenia końcowego 300 nM lub 4,5 µl dla uzyskania stężenia końcowego 900 nM), 50 µl PCR master mix, 2,5 µl sondy 10 µM oraz wodę ultrapure w ilości niezbędnej do osiągnięcia objętości 90 µl.
    2. Przeprowadzić procedurę amplifikacji zgodnie z opisem w sekcji 2.
    3. Wybrać optymalne warunki zapewniające najwyższy poziom amplifikacji, najniższy próg cyklu (Ct) oraz najlepszą powtarzalność spośród 3 testowanych warunków. Określić optymalne stężenie i odpowiadającą mu objętość x µl starterów forward i reverse.
    4. Przygotować 5 różnych mieszanin dla 4 próbek (3 powtórzenia próbki pozytywnej i kontrola negatywna) z 5 różnymi stężeniami końcowymi sondy (50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM). Do każdej mieszaniny dodać x µl startera forward 20 µM i x µl startera reverse 20 µM (wyznaczonych wcześniej w sekcji 3.2.3), 50 µl PCR master mix, odpowiednią objętość sondy 10 µM (0,5 µl dla uzyskania stężenia 50 nM, 1 µl dla uzyskania stężenia 100 nM, 1,5 µl dla uzyskania stężenia 150 nM, 2 µl dla uzyskania stężenia 200 nM lub 2,5 µl dla uzyskania stężenia 250 nM) oraz wodę ultrapure w ilości niezbędnej do osiągnięcia objętości 90 µl.
    5. Przeprowadzić procedurę amplifikacji zgodnie z opisem w sekcji 2.
    6. Wybrać optymalne warunki zapewniające najwyższy poziom amplifikacji, najniższy próg cyklu (Ct) oraz najlepszą powtarzalność spośród 5 testowanych warunków. Określić optymalne stężenie i odpowiadającą mu objętość y µl dla sondy.

4. Charakterystyka ilościowej polimerazy łańcuchowej w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)

Uwaga: Po etapie optymalizacji i wyznaczeniu najlepszych warunków, etap charakterystyki PCR obejmuje swoistość, granicę wykrywalności, zakres liniowości oraz granicę oznaczalności qRT-PCR.

  1. Przygotowanie i miareczkowanie plazmidu
    1. Zamów komercyjny plazmid zawierający odpowiedni fragment DNA genu docelowego wybranego do PCR (w niniejszym protokole są to nukleotydy 2081-2381 genu glikoproteiny B EHV-2, patrz Tabela 1).
      Uwaga: Aby ograniczyć ryzyko kontaminacji dróg oddechowych syntetycznym DNA, należy przeprowadzać seryjne rozcieńczenia plazmidów pod wyciągiem w osobnym pomieszczeniu oraz używać rozcieńczonego DNA podczas wszystkich etapów procedury opracowania i walidacji.
    2. Resuspend plazmid w wodzie ultrapurej, aby przygotować roztwór stokowy o stężeniu 50 ng/ml. Roztwór stokowy plazmidu wymieszaj w wortexie, a następnie krótko odwiruj w wirówce.
      Uwaga: Należy oznaczyć rzeczywiste stężenie roztworu zapasu plazmidu po resuspensji w celu obliczenia liczby kopii plazmidu.
    3. Dodaj 1 µl plazmidu do spektrofotometru. Odczytaj gęstość optyczną (OD) przy 230 nm, 260 nm i 280 nm. Odczytaj stężenie DNA z oprogramowania spektrofotometru (OD, 260 nm).
    4. Oblicz liczbę kopii plazmidu, korzystając z liczby Avogadra (NA) oraz wzór:
      Liczba kopii/µl = (NA [plazmid w ng/µl])/(długość plazmidu x 109 x średnia masa pary zasad) = (6,022 x 1023 x [plazmid])/(długość plazmidu x 109 x 660)
  2. Badanie specyficzności (inkluzywności i ekskluzywności) qRT-PCR
    1. Należy przetestować inkluzywność systemu PCR. Należy wybrać próbki DNA dodatnie pod kątem EHV-2, wcześniej scharakteryzowane poprzez sekwencjonowanie (ustalony status dodatni).
    2. Przeprowadzić procedurę amplifikacji zgodnie z opisem w sekcji 2.
    3. Przeanalizuj dane z reakcji PCR dla każdej próbki zgodnie z opisem w sekcji 2.5. Sprawdź obecność krzywej wykładniczej dla wszystkich próbek wybranych w sekcji 4.2.1 i potwierdź inkluzywność badania PCR.
    4. Przetestuj wyłączność układu PCR, wykorzystując ekstrakty DNA z patogenów o podobieństwie genetycznym do celu (w tym przypadku innych herpeswirusów koniowatych, takich jak EHV-1, EHV-4, EHV-3, EHV-5 oraz herpeswirusa osłów-5, zgodnie z opisem w Tabela 2) oraz inne patogeny wywołujące choroby układu oddechowego gospodarza (w tym przypadku wirus zapalenia tętnic koni, wirus grypy koni, Coxiella burnetii, Rhodococcus equi, Streptococcus equi equi, Streptococcus equi zooepidemicus, Chlamydophila abortus i Klebsiella pneumoniae, patrz Tabela 2).
    5. Należy przeprowadzić procedurę amplifikacji zgodnie z opisem w sekcji 2.
    6. Przeanalizuj dane PCR dla każdej próbki zgodnie z opisem w sekcji 2.5. Sprawdź brak krzywej wykładniczej dla wszystkich próbek wybranych w sekcji 4.2.4, aby potwierdzić ekskluzywność reakcji PCR.
  3. Granica wykrywalności qRT-PCR
    1. Odmierzyć 90 µl ultraczystej wody do 6 probówek.
    2. Wykonaj 6 dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych plazmidu, aby wyznaczyć strefę zaniku (utratę detekcji Ct). Przenieś 10 µl z roboczego rozcieńczenia plazmidu do probówki z 90 µl wody ultrazczystej. Próbkę w probówce krótko wymieszać na wortexie, a następnie krótko odwirować. Powtarzać krok 4.3.2 do momentu, aż plazmid zostanie przeniesiony do ostatniej probówki w serii rozcieńczeń.
    3. Przeprowadzić amplifikację 6 dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych plazmidu zgodnie z opisem w sekcji 2.
    4. Wyznacz strefę zahamowania: obszar między ostatnim rozcieńczeniem plazmidu wykazującym sygnał dodatni a pierwszym rozcieńczeniem, w którym nie stwierdzono obecności (patrz Rysunek 2).
    5. Aby rozpocząć 6 dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych, należy wybrać ostatnie rozcieńczenie plazmidu, które daje sygnał dodatni (patrz rozdział 4.3.4).
      Uwaga: Należy przeprowadzić 3 niezależne próby w celu określenia granicy wykrywalności (LOD) qRT-PCR.PCR 95%)
    6. Odmiarzyć 25 µl ultraczystej wody do 6 probówek.
    7. Wykonaj 6 dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych plazmidu. Przenieś 25 µl z roboczego rozcieńczenia plazmidu, wyznaczonego w sekcji 4.3.5, do probówki z 25 µl wody ultrapure. Próbówkę wymieszać na vortexie i krótko odwirować. Powtarzać krok 4.3.7, aż do momentu przeniesienia plazmidu do ostatniej próbówki w serii rozcieńczeń.
    8. Przeprowadź amplifikację 6 dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych plazmidu zgodnie z opisem w sekcji 2. Powtórz kroki od 4.3.7 do 4.3.8 dwukrotnie, aby uzyskać 3 próby z 8 powtórzeniami (łącznie 24 powtórzenia) dla każdego z 6 dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych plazmidu.
      Uwaga: Granica wykrywalności qRT-PCR (LOD95% PCR) definiuje się jako najniższą liczbę kopii DNA w jednostce objętości, która jest wykrywana w 95% przypadków.
    9. Oblicz liczbę pozytywnych powtórzeń z 24 powtórzeń dla każdego poziomu stężenia plazmidu.
    10. Wyznaczenie granicy wykrywalności (LOD)95% PCRGranica wykrywalności (LOD)95% PCR jest to poziom, który skutkuje wykryciem 23 powtórzeń dodatnich z 24 powtórzeń.
  4. Zakres liniowości i granica oznaczalności qRT-PCR
    Uwaga: Należy przeprowadzić 4 niezależne próby z 6 dziesięciokrotnymi rozcieńczeniami seryjnymi plazmidu, aby upewnić się, że najniższe stężenie zastosowane w zakresie odpowiada granicy wykrywalności (LOD).95% PCR wyznaczono wcześniej w punkcie 4.3.10.
    1. Odmierzyć 45 µl wody ultrazczystej w 6 probówkach.
    2. Przygotuj 6 dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych, rozpoczynając od stężenia roboczego plazmidu odpowiadającego wartości 107 granica wykrywalności95% Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR).
    3. Przeprowadź 6 dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych plazmidu. Przenieś 5 µl z roboczego rozcieńczenia plazmidu (wyznaczonego w sekcji 4.4.2) do probówki z 45 µl wody ultrapure. Krótko wymieszać próbkę na vortexie i odwirować w wirówce. Powtarzać krok 4.4.3, aż do momentu, gdy ostatnia probówka w rozcieńczeniu szeregowym otrzyma plazmid.
    4. Przeprowadź amplifikację 6 dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych plazmidu zgodnie z opisem w sekcji 2.
    5. Wyznacz regresję liniową y = ax + b z a dla nachylenia i b dla punktu przecięcia (Rysunek 3).
    6. Obliczanie wydajności amplifikacji (E) na podstawie nachylenia krzywej a krzywej standardowej (patrz 4.4.5) przy użyciu równania:
      Równanie do obliczania procentowej wydajności, E(%)= (10^(1/a) -1) × 100..
      Powtórz kroki od 4.4.1 do 4.4.6 trzykrotnie.
      Uwaga: Efektywność amplifikacji określa przyrost ilości produktu PCR po każdym cyklu. W reakcji idealnej efektywność jest bliska 100%. W praktyce wartość E (%) mieści się w przedziale od 75% do 125%. Wyższa wartość E może wskazywać na amplifikację produktów niespecyficznych lub błąd pipetowania podczas rozcieńczeń seryjnych. Niższa wartość E może również wskazywać na błąd pipetowania podczas rozcieńczeń seryjnych, niewłaściwy dobór starterów lub nieoptymalne warunki reakcji.
    7. Oblicz błąd systematyczny (Tabela 3). Dla każdego poziomu plazmidu należy zweryfikować, czy bezwzględna wartość odchylenia jest mniejsza od krytycznej wartości odchylenia (0,25 log10). Wyznacz błąd systematyczny średni oraz niepewności liniowości (ULINi) dla każdego poziomu plazmidu (Tabela 3) w celu oceny wydajności regresji liniowej dla qPCR EHV-2 (Rycina 4). U LINi czy niepewność liniowości jest określana dla każdego z nich i poziom plazmidu obliczony z odchylenia standardowego (SD (odchylenia standardowe)) oraz średnie odchylenie (mean bias). Wyznacz łączną niepewność liniowości (ULIN) qPCR dla EHV-2 wyznaczonej według wzoru:
      Równanie propagacji błędów; schemat z formułą obliczania wariancji i niepewności, ΣULINi²/k.
      Uwaga: Dopuszczalne obciążenie jest określone przez laboratorium (zazwyczaj obciążenie bezwzględne 0,25 log10) i odpowiadają różnicy między najniższą a najwyższą wartością wynoszącej 0,5 log10 (ilość mierzona w log)10 liczba kopii). ULIN wartość ta może pomóc w porównaniu wydajności qPCR z różnych laboratoriów.
    8. Wyznaczenie granicy oznaczalności (LOQ) metody qRT-PCRPCR): LOQ (granica oznaczalności)PCR jest najniższym stężeniem przy błędzie systematycznym wynoszącym 0,25 log10 wykorzystany do zakresu liniowości (Tabela 3).

5. Charakterystyka pełnej metody analitycznej (od ekstrakcji DNA do wyniku qRT-PCR)

Uwaga: Charakterystyka całej metody polega na walidacji wszystkich etapów niezbędnych do uzyskania danych qRT-PCR (t.j. od ekstrakcji DNA z próbki z dróg oddechowych (patrz sekcja 1) do amplifikacji i kwantyfikacji celu (patrz sekcja 2)).

  1. Ustal zależność między liczbą kopii w reakcji PCR a liczbą kopii obecnych w próbce biologicznej za pomocą wzoru:
    Wzór na kwantyfikację PCR, równanie pokazujące obliczanie liczby kopii na mL przy użyciu stosunków objętości..
    Proces amplifikacji PCR, schemat tekstu równania, analiza kopii/PCR, narzędzie badań genetycznych to liczba kopii plazmidu w reakcji PCR, Wzór na objętość PCR, Vol_PCR, do analizy genów; klucz w konfiguracji eksperymentalnej, badania edukacyjne. to objętość próbki dodanej do mieszaniny PCR w celu amplifikacji, Koncepcja chromatografii, termin "Volelution" pokazujący wpływ objętości rozpuszczalnika na elucję. to objętość buforu AVE użytego do elucji kwasów nukleinowych, a Równanie objętości ekstrakcji w kontekście naukowym, ilustrujące wzór w materiale badawczym lub edukacyjnym. to objętość wyekstrahowanej próbki.
  2. Badanie czułości i swoistości całej metody analitycznej
    Uwaga: W tej sekcji stosuje się wyłącznie próbki o znanym statusie dodatnim (lub ujemnym) pod kątem EHV-2.
    1. Zbadaj „czułość” metody qRT-PCR, analizując próbki dodatnie pod kątem celu (EHV-2).
      1. Wybierz próbki DNA dodatnie pod kątem EHV-2, wcześniej scharakteryzowane (status dodatni).
      2. Wyekstrahuj kwasy nukleinowe zgodnie z opisem w sekcji 1. Przeprowadź procedurę amplifikacji zgodnie z opisem w sekcji 2.
      3. Określ liczbę wyników prawdziwie dodatnich (próbki dodatnie, które są dodatnie w tym teście RT-PCR) oraz liczbę wyników fałszywie ujemnych (znane próbki dodatnie, które są ujemne w tym teście RT-PCR).
    2. Zbadaj „swoistość” metody qRT-PCR, analizując próbki ujemne
      1. Wybierz próbki DNA ujemne pod kątem EHV-2 (status ujemny).
      2. Wyekstrahuj kwasy nukleinowe zgodnie z opisem w sekcji 1. Przeprowadź procedurę amplifikacji zgodnie z opisem w sekcji 2.
      3. Określ liczbę wyników prawdziwie ujemnych (próbki ujemne, które są znane jako ujemne w tym teście RT-PCR) oraz liczbę wyników fałszywie dodatnich (znane próbki ujemne, które są dodatnie w tym teście RT-PCR).
    3. Oblicz „czułość diagnostyczną” (Se) i „swoistość diagnostyczną” (Sp) całej metody (Tabela 4) w następujący sposób: Se = liczba prawdziwie dodatnich/(liczba prawdziwie dodatnich + fałszywie ujemnych) oraz Sp = liczba prawdziwie ujemnych/(liczba prawdziwie ujemnych + fałszywie dodatnich) (patrz Tabela 4).
    4. Oblicz 95% przedział ufności dla czułości i swoistości całej metody za pomocą wzoru relacji Greinera i Gardnera12,20:
      Wzór na wielkość próby do obliczania marginesu błędu; równanie statystyczne; przedział ufności.
      gdzie e to szacowany błąd, θ to Se (lub Sp), a n liczba analizowanych próbek.
      Uwaga: Dla małej liczby próbek należy użyć tabeli Schwartza zgodnie z normą AFNOR12, aby obliczyć 95% przedział ufności dla czułości i swoistości całej metody.
  3. Przygotowanie ujemnego materiału referencyjnego do charakterystyki całej metody analitycznej
    UWAGA: Aby określić granice wykrywalności i oznaczalności całej metody (LODMethod oraz LOQMethod), dodaj znane stężenia plazmidu do próbek biologicznych, o których wiadomo, że są wolne od celu (w tym przypadku EHV-2). Próbki te, wraz z ilościowo określonym plazmidem, stanowią standardy dodatnie, służące do wyznaczenia LODMethod i LOQMethod.
    1. Potwierdź brak celu (EHV-2) w próbkach biologicznych użytych do przygotowania standardów dodatnich.
      1. Wybierz różne, znane ujemne próbki biologiczne.
      2. Wyekstrahuj próbki biologiczne zgodnie z opisem w sekcji 1. Przeprowadź procedurę amplifikacji zgodnie z opisem w sekcji 2.
      3. Potwierdź brak celu poprzez brak sygnału PCR w tych próbkach.
        Uwaga: Używaj tego samego ujemnego materiału referencyjnego we wszystkich krokach od 5.4 do 5.5.
    2. Połącz różne próbki ujemne, aby uzyskać 15 ml ujemnego materiału referencyjnego (objętość niezbędna do pełnej walidacji). Rozdziel 135 µl tego ujemnego materiału referencyjnego do 100 probówek. Przechowuj probówki w temperaturze +4 °C lub -80 °C w przypadku długotrwałego przechowywania.
  4. Granica wykrywalności całej metody analitycznej
    1. Wyznacz strefę zaniku sygnału całej metody.
      1. Rozdziel 45 µl wody ultrapurej do 6 probówek.
      2. Wykonaj 6 dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych plazmidu. Przenieś 5 µl z roboczego rozcieńczenia plazmidu odpowiadającego 107 LOD95% PCR (wyznaczonego w sekcji 4.3.10) do probówki z 45 µl wody ultrapurej. Wymieszaj na wortexie i krótko odwiruj probówkę. Powtarzaj krok 5.4.1.2, aż plazmid zostanie dodany do ostatniej probówki w serii rozcieńczeń.
      3. Przenieś 5 µl z każdego rozcieńczenia plazmidu do 2 probówek zawierających 135 µl ujemnego materiału referencyjnego, aby uzyskać 2 powtórzenia dla 6 standardów dodatnich. Wymieszaj na wortexie i krótko odwiruj.
      4. Wykonaj ekstrakcję 2 powtórzeń dla 6 standardów dodatnich zgodnie z opisem w sekcji 1. Przeprowadź procedurę amplifikacji zgodnie z opisem w sekcji 2.
      5. Wyznacz strefę zaniku: obszar między ostatnim stężeniem plazmidu dającym sygnał dodatni a pierwszym stężeniem, które nie wykazuje sygnału.
    2. Granica wykrywalności metody (LOD Method) wyznaczona w 2 niezależnych próbach
      Uwaga: Przeprowadź 2 niezależne próby, aby wyznaczyć granicę wykrywalności całej metody (LODMethod).
      1. Rozpocznij 6 dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych z roboczego rozcieńczenia plazmidu, które jest 4-krotnie bardziej skoncentrowane niż ostatnie stężenie plazmidu dające sygnał dodatni (patrz sekcja 5.4.1.5).
      2. Rozdziel 25 µl wody ultrapurej do 6 probówek.
      3. Wykonaj 5 dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych plazmidu. Przenieś 25 µl z roboczego rozcieńczenia plazmidu (wyznaczonego w sekcji 5.4.2.1) do probówki z 25 µl wody ultrapurej. Wymieszaj na wortexie i krótko odwiruj probówkę. Powtarzaj krok 5.4.2.3, aż plazmid zostanie dodany do ostatniej probówki w serii rozcieńczeń.
      4. Przenieś 5 µl z każdego rozcieńczenia plazmidu do 4 probówek z 135 µl ujemnego materiału referencyjnego, aby uzyskać 4 powtórzenia dla 5 standardów dodatnich. Wymieszaj na wortexie i krótko odwiruj probówki.
      5. Wykonaj ekstrakcję 4 powtórzeń dla 5 standardów dodatnich zgodnie z opisem w sekcji 1. Przeprowadź procedurę amplifikacji zgodnie z opisem w sekcji 2.
      6. Powtórz kroki 5.4.2.1 do 5.4.2.5 raz, aby uzyskać 8 powtórzeń dla każdego poziomu stężenia plazmidu.
      7. Policz liczbę dodatnich powtórzeń z 8 powtórzeń dla każdego poziomu stężenia plazmidu.
      8. Wyznacz LODMethod. LODMethod to ostatni poziom, na którym 8 z 8 powtórzeń jest dodatnich (zgodnie z opisem w sekcji 5.4.2.7).
  5. Zakres liniowości i granica oznaczalności całej metody analitycznej
    Uwaga: Aby wyznaczyć granicę oznaczalności całej metody (LOQMethod), dodaj znane stężenia plazmidu do próbek biologicznych, o których wiadomo, że są wolne od celu (w tym przypadku EHV-2). Próbki te stanowią standardy dodatnie do wyznaczenia LOQMethod.
    1. Rozdziel 45 µl wody ultrapurej do 6 probówek.
    2. Wykonaj 6 dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych plazmidu. Przenieś 5 µl z roboczego rozcieńczenia plazmidu odpowiadającego 107 LODMethod (wyznaczonego w sekcji 5.4.2.8) do probówki z 45 µl wody ultrapurej. Wymieszaj na wortexie i krótko odwiruj probówkę. Powtarzaj krok 5.5.2, aż plazmid zostanie dodany do ostatniej probówki w serii rozcieńczeń.
    3. Przenieś 5 µl z każdego rozcieńczenia plazmidu do 2 probówek z 135 µl ujemnego biologicznego materiału referencyjnego, aby uzyskać 2 powtórzenia dla 6 standardów dodatnich. Wymieszaj na wortexie i krótko odwiruj.
    4. Wykonaj ekstrakcję 2 powtórzeń dla 6 standardów dodatnich zgodnie z opisem w sekcji 1. Przeprowadź procedurę amplifikacji zgodnie z opisem w sekcji 2. Powtórz kroki 5.5.1 do 5.5.4 trzykrotnie.
    5. Zdefiniuj profil dokładności w celu oceny i walidacji parametrów ilościowych metody.
      1. Zdefiniuj granice akceptowalności całej metody dla laboratorium. W niniejszym protokole granice akceptowalności zostały określone jako ± 0,75 Log10 przez LABéO Frank Duncombe.
      2. Dla jednej próby wyznacz pierwszą regresję liniową y = ax+ b (a to nachylenie, a b to punkt przecięcia) z jednym powtórzeniem wartości Ct odpowiadającym każdej szacowanej wartości krzywej wzorcowej. Na podstawie tej pierwszej regresji liniowej oblicz eksperymentalną wartość liczby kopii dla powtórzeń wartości Ct użytych do tej pierwszej krzywej wzorcowej. Powtórz krok 5.5.5.2 z drugimi powtórzeniami wartości Ct, aby uzyskać drugą regresję liniową i obliczyć eksperymentalną wartość liczby kopii dla drugich powtórzeń wartości Ct użytych do drugiej krzywej wzorcowej.
      3. Powtórz krok 5.5.5.2 dla drugiej i trzeciej próby.
      4. Oblicz granice precyzji, prawdziwości i dokładności dla każdego poziomu plazmidu zgodnie z NF U47-600-212.
      5. Stwórz arkusz kalkulacyjny w celu zestawienia informacji dla wszystkich punktów wzorcowych (5.5.5.4) i stwórz profil dokładności z wcześniej zdefiniowanymi granicami akceptowalności w 5.5.5.1 oraz prawdziwością danych wraz z dolną i górną granicą dokładności obliczoną w 5.5.5.4 (Rysunek 5).
    6. Wyznacz LOQMethod: odpowiada to najniższemu stężeniu krzywej wzorcowej o prawdziwości 0,75 log10, stosowanemu dla zakresu liniowości obliczonego w 5.5.5.5.
  6. Ocena powtarzalności i odtwarzalności
    Uwaga: Sprawdź powtarzalność i odtwarzalność, korzystając ze stosunku odchylenia standardowego do średniej pomiarów powtórzonych (współczynnik zmienności, lub CV = odchylenie standardowe/średnia).
    1. Oceń powtarzalność całej metody wykonaną przez 1 analityka:
      1. Wybierz 3 próbki biologiczne o 3 różnych ładunkach genomu wirusowego (np. wcześniej przebadane metodą PCR).
      2. Wyekstrahuj 8 powtórzeń dla 3 próbek zgodnie z opisem w sekcji 1. Przeprowadź procedurę amplifikacji zgodnie z opisem w sekcji 2.
      3. Oblicz średnią i odchylenie standardowe wartości Ct zebranych dla każdej próbki.
      4. Oblicz wewnątrzseryjny CV za pomocą wzoru CV = odchylenie standardowe/średnia.
    2. Oceń odtwarzalność całej metody wykonaną przez 3 analityków:
      1. Wybierz 3 próbki biologiczne o 3 różnych ładunkach genomu wirusowego (np. wcześniej przebadane metodą PCR)
      2. Wyekstrahuj 2 powtórzenia dla 3 próbek wybranych w 5.6.2.1 (zgodnie z opisem w sekcji 1). Przeprowadź procedurę amplifikacji zgodnie z opisem w sekcji 2. Kroki 5.6.2.2 powtórz 2 niezależnych analityków.
      3. Oblicz średnią i odchylenie standardowe wartości Ct zebranych dla każdej próbki.
      4. Oblicz międzyseryjny CV za pomocą wzoru CV = odchylenie standardowe/średnia.

Wyniki

Opisana powyżej metoda ilościowej RT-PCR została wdrożona w celu wykrywania i oznaczania ilościowego wirusa herpes koni typu 2 (EHV-2) w płynach z dróg oddechowych. Rysunek 1 przedstawia schematyczny wykres przebiegu prac nad opracowaniem i walidacją metody ilościowej RT-PCR zgodnie z normą AFNOR NF U47-600. Specyficzność starterów i sond została zweryfikowana podczas etapowego opracowywania procedury PCR. W tym systemie amplifikowano wyłącznie szczepy EHV-2. Następnie należało scharakteryzować wydajność metody qRT-PCR.

W pierwszej kolejności, w celu oszacowania LODPCR, wykonano 6 dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych, aby wyznaczyć strefę wygasania (Ryc. 2). W tym przykładzie, w celu oszacowania LODPCR, przygotowano 6 dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych w zakresie od 10-5 do 10-10 (od 26 000 do 0,26 kopii/2,5 µl próbki). Strefa wygasania znajduje się pomiędzy rozcieńczeniami 10-9 a 10-10 (między 2,6 a 0,26 kopii/2,5 µl próbki). Aby w tym przypadku wyznaczyć wartość LODPCR , w obrębie tej strefy wygasania wykonano 6 dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych plazmidu w zakresie od 5,2 do 0,16 kopii/2,5 µl próbki. Wartość LODPCR wyniosła 2,6 kopii/2,5 µl próbki.

Aby określić zakres liniowości oraz LOQPCR, wartość LODPCR została wykorzystana jako punkt wyjścia dla serii 6 rozcieńczeń dziesięciokrotnych, w zakresie od 2,6 (LODPCR) do 260 000 kopii/2,5 µl próbki. Rycina 3 przedstawia regresję liniową dla qRT-PCR EHV2 z jednego badania. Parametry regresji liniowej (Rycina 4) zostały zweryfikowane w czterech powtórzeniach przy użyciu obliczeń opisanych w Tabeli 3. Obliczenia przeprowadzono w celu zdefiniowania zakresu liniowości zgodnie z kryterium wartości bezwzględnej Biasi ≤0,25 log10, niezależnie od poziomu i obciążenia plazmidowego. W tym przypadku zakres liniowości mieścił się między 2,6 a 260 000 kopii/2,5 µl próbki. LOQPCR to najniższe stężenie w zakresie liniowości (t.j. w tym przypadku 2,6 kopii/2,5 µl próbki). ULIN określono na poziomie 0,12 log10 w zakresie 2,6-260 000 kopii/2,5 µl DNA.

Po opracowaniu (Rycina 1, kolor niebieski) i charakterystyce qRT-PCR (Rycina 1, kolor żółty), norma AFNOR NF U47-600 zaleca charakterystykę całej metody analitycznej, od ekstrakcji DNA po qRT-PCR (Rycina 1, kolor pomarańczowy). Czułość i swoistość diagnostyczną obliczono zgodnie z opisem w Tabeli 4. Wydajność ilościowa całej metody analitycznej qRT-PCR została oceniona i zwalidowana za pomocą profilu dokładności (Rycina 5).

Niniejszy protokół, wykorzystujący najnowocześniejszą technologię molekularną, pozwolił nam wykryć i określić ilość kopii genomu wirusa EHV-2 w 172 próbkach wymazów z nozdrzy pobranych od koni z zaburzeniami oddechowymi i/lub klinicznym podejrzeniem infekcji. Częstość występowania EHV-2 w próbkach terenowych (biologicznych) w tej populacji wyniosła 50% (86/172). Analizy ilościowe wykazały, że ładunek genomu wirusa EHV-2 był znacznie wyższy u młodych koni, a rozkład ładunków genomu wirusa malał wraz z wiekiem (Rycina 6). W niniejszym badaniu najwyższy ładunek genomu wirusa EHV-2 (1.9 x 1011 kopii/ml) stwierdzono u źrebiąt (Rycina 6).

Schemat procesu qRT-PCR przedstawiający opracowanie, charakterystykę i walidację; metody obejmują LOD i LOQ.
Rysunek 1: Schemat blokowy opracowania (kolor niebieski), charakterystyki ilościowej RT-PCR (kolor żółty) oraz charakterystyki całej metody analitycznej od ekstrakcji DNA do qRT-PCR (kolor pomarańczowy) zgodnie z normą AFNOR NF U47-600-2. Schemat blokowy podsumowuje poszczególne etapy opracowania, charakterystyki ilościowej RT-PCR oraz charakterystyki całej metody analitycznej od ekstrakcji DNA do qRT-PCR. Dla każdego etapu schemat określa liczbę wymaganych serii pomiarowych, rozcieńczenia do wykonania oraz liczbę wymaganych analityków. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres amplifikacji PCR, qRn w funkcji cyklu, przedstawiający kwantyfikację DNA z obszarem zaniku i próbką ujemną.
Rycina 2: Wyznaczenie obszaru zaniku na podstawie reprezentatywnych wyników krzywych PCR w czasie rzeczywistym uzyskanych dla 6 dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych plazmidu. Aby oszacować obszar zaniku, przygotowano 6 dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych w zakresie od 10-5 (26 000 kopii/2,5 µl próbki) do 10-10 (0,26 kopii/2,5 µl próbki). Obszar zaniku znajduje się pomiędzy rozcieńczeniami 10-9 (2,6 kopii/2,5 µl próbki) a 10-10 (0,26 kopii/2,5 µl próbki). W tym przypadku w obrębie tego obszaru zaniku wykonano 6 dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych plazmidu, aby wyznaczyć LOD 95% PCR, pomiędzy 5,2 a 0,16 kopii/2,5 µl próbki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Krzywa standardowa PCR, równanie y=-3.34x+36.94, R²=0.999, wykres progu cyklu (Ct) w funkcji logarytmu plazmidu.
Rycina 3: Regresja liniowa dla qRT-PCR EHV2. Liniowość badania ilościowego to zdolność do generowania wyników proporcjonalnych do stężenia celu w określonym zakresie. Można ją modelować za pomocą regresji liniowej (y = ax + b) pomiędzy odpowiedzią aparaturową (próg cyklu lub Ct) a logarytmem ilości celu (liczba kopii celu/2.5 µl próbki). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres poziomu plazmidu w funkcji średniego błędu systematycznego; słupki błędów wskazują zmienność danych w analizie edycji genów.
Rycina 4: Wyniki regresji liniowej qPCR dla EHV-2. Średni błąd systematyczny reprezentuje średnią różnicę między zmierzoną ilością plazmidu (Symbol średniej z kreską nad Xi, reprezentujący średnią statystyczną w matematyce.) a teoretyczną ilością plazmidu (x'i) dla każdego poziomu plazmidu. Pionowe słupki reprezentują niepewność liniowości (ULINi) wyznaczoną według wzoru
Wzór na niepewność, U_LINI=2√(SD'i²+mean.bias²), równanie matematyczne.
gdzie SD'i to odchylenie standardowe zmierzonej ilości plazmidu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres bezwzględnego obciążenia w funkcji poziomu plazmidu EHV2 (Log₁₀), przedstawiający zmienność danych i linie trendu.
Rycina 5: Profile dokładności opracowane na podstawie wyników walidacji metody qRT-PCR dla EHV-2. Zielona linia (kółka) reprezentuje prawdziwość danych (błąd systematyczny, czyli obciążenie). Granice akceptowalności zostały zdefiniowane przez laboratorium na poziomie ± 0.75 Log10 (linie przerywane). Dolne i górne granice dokładności zostały określone dla każdego poziomu zawartości plazmidu jako średnie obciążenie ± dwukrotność odchylenia standardowego danych niezawodności (linie czerwone). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres porównawczy ładunku wirusowego EHV2 z analizą statystyczną w grupach wiekowych koni; wyniki eksperymentu.
Rycina 6: Ilościowe oznaczenie ładunków genomu wirusa EHV-2 w zależności od wieku. Przedstawiono rozkład ładunku genomu wirusa EHV-2 wykrytego w próbkach wymazów z nosa dla różnych grup wiekowych. Linie poziome reprezentują wartości mediany wraz z odchyleniem standardowym (m = miesiące). * Różnica istotna statystycznie w analizie ANOVA z testem post-hoc Newmana-Keulsa (p <0.05). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Gen docelowySekwencje starterów, sondy i plazmidu (5'-3')Pozycja nukleotyduWielkość produktu (nukleotydy)Warunki cyklu termicznegoBibliografia
EHV2 gB
(HQ247755.1)		Forward: GTGGCCAGCGGGGTGTTC 2113-21307895 °C 5 min11
Odwrócona sekwencja: AAGTTYTT AGGGAAACCCCC2189-217095 °C 15 s45 cykli
Sonda: FAM-CCCTCTTTGGGAGCATAGTCTCGGGG-MGB2132-215760 °C 1 min
Plazmid:
ACCTGGGCACCATAGGCAAGGTGGTGGTCA
ATGTGGCCAGCGGGGTGTTCTCCCTCTTTG
GGAGCATAGTCTCGGGGGTGATAAGCTTTTT
CAAAAATCCCTTTGGGGGCATGCTGCTCATA
GTCCTCATCATAGCCGGGGTAGTGGTGGTG
TACCTGTTTATGACCAGGTCCAGGAGCATAT
ACTCTGCCCCCATTAGAATGCTCTACCCCGG
GGTGGAGAGGGCGGCCCAGGAGCCGGGCG
CGCACCCGGTGTCAGAAGACCAAATCAGGA
ACATCCTGATGGGAATGCACCAATTTCAG		2081-2381

Tabela 1: Sekwencje starterów, sond oraz pozytywnych syntetycznych kontroli DNA użytych w tym protokole. Sekwencja plazmidu (pozytywnej syntetycznej kontroli DNA) odpowiada pozycjom nukleotydowym 2081-2381 sekwencji EHV2gB (HQ247755.1). Projekt starterów i sond użytych w tym protokole został opracowany przy użyciu specjalistycznego oprogramowania.

PATOGENYReferencja (pochodzenie)Liczba szczepówWYNIKI
EHV-2
EHV-2VR701 (ATCC)20Dodatnie
20 próbek (kolekcja FDL)
EHV-5KD05 (GERC)20Ujemne
20 próbek (kolekcja FDL)
EHV-3VR352 (ATCC)2Ujemne
T934 WSV (GERC)
EHV-1Szczep Kentucky Ky A (ATCC)3Ujemne
2 próbki (kolekcja FDL)
EHV-4VR2230 (ATCC)1Ujemne
Herpesvirus osłów AHV5Kolekcja FDL1Ujemne
Wirus grypy koni A/equine/Jouars/4/2006 (H3N8)1Ujemne
(Numer dostępu JX091752)
Wirus arteritis koniVR796 (ATCC)2Ujemne
Rhodococcus equiKolekcja FDL1Ujemne
Streptococcus equi subsp. ZooepidemicusKolekcja FDL1Ujemne
Streptococcus equi subsp. equiKolekcja FDL1Ujemne
Coxiella burnetii ADI-142-100 (Adiagene)1Ujemne
Chlamydophila abortusADI-211-50 (Adiagene)1Ujemne
Klebsiella pneumoniaeKolekcja FDL1Ujemne

Tabela 2: Specyficzność analityczna qRT-PCR dla EHV-2.

Analiza wydajności PCR; równania, wzory i tabela statystyczna do analizy DNA i oceny błędu systematycznego.
Tabela 3: Obliczanie błędu systematycznego (bias) i niepewności liniowości (adaptowano z NF U47-600-212). Dla każdej próby parametry regresji liniowej (y = ax+b) są walidowane przy użyciu tabeli, gdzie y to uzyskany próg cyklu (cycle threshold); a to uzyskany nachylenie; x to poziom plazmidu, a b to punkt przecięcia z osią rzędnych. i oznacza poziom plazmidu (i przyjmuje wartości od 1 do k poziomów); k to liczba użytych poziomów plazmidu (np. k = 6 w tej tabeli); j to próba (j przyjmuje wartości od 1 do I prób); I to liczba prób, mieszcząca się w przedziale od 3 do 6 (np. I = 4 w tej tabeli). xi to szacowana ilość plazmidu dla każdego poziomu plazmidu i. x'i  to teoretyczna ilość plazmidu uzyskana za pomocą równania x'i = log10(xi) dla każdego poziomu plazmidu i. Podczas każdej próby j próg cyklu uzyskany dla każdego poziomu plazmidu i jest obliczany za pomocą regresji liniowej yi,j = ajxi,j + bj. Oznaczenie zmiennej statystycznej x̂ᵢⱼ, stosowane w równaniach statystycznych, oznacza wartości szacowane. to zmierzona ilość plazmidu podczas próby j. Biasi to różnica zaobserwowana między zmierzoną ilością plazmidu a teoretyczną ilością plazmidu dla każdej próby i każdego poziomu plazmidu. Symbol matematyczny wektora, oznaczenie estymatora średniej, schemat edukacyjny. to wartość średnia z Równanie zmiennej statystycznej \( \hat{x}_{i,j} \); stosowane w analizie danych i modelach predykcyjnych. dla każdego poziomu plazmidu i; SD'i to odchylenie standardowe zmierzonej ilości Symbol równania dla szacowania xi,j w analizie statystycznej. dla każdego poziomu plazmidu i; Mean bias to średnia z Biasi; ULINi to niepewność liniowości określona dla każdego poziomu plazmidu i, obliczona z SD'i oraz mean bias. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.

Rzeczywisty stan próbki
DodatniUjemny
Wyniki uzyskane przy zastosowaniu pełnej metodyDodatniRP (prawdziwie dodatni)FP (wynik fałszywie dodatni)
Negatywnywynik fałszywie ujemny (FN)RN (prawdziwie ujemny)
SumaRP+FNFP+RN
Se = RP/(RP+FN)Sp = RN/(RN+FP)

Tabela 4: Obliczenie czułości diagnostycznej (Se) i swoistości (Sp) całej metody. Do obliczenia 95% przedziału ufności dla czułości i swoistości całej metody, zgodnie z opisem w NF U47-600-2, wykorzystano tabelę Schwartza.

Dyskusja

Od 2000 roku PCR w czasie rzeczywistym zastępuje techniki złotego standardu (metody hodowli komórkowych i bakterii) w coraz większej liczbie laboratoriów. Wdrożenie tej techniki jest stosunkowo łatwe. Jednak walidacja metod laboratoryjnych jest niezbędna do molekularnego wykrywania i kwantyfikacji patogenów w celu zapewnienia dokładnych, powtarzalnych i wiarygodnych danych.

Ponieważ etap ekstrakcji jest głównym źródłem utraty materiału biologicznego, można go uznać za główne źródło błędu kwantyfikacji między jednym protokołem a drugim. W związku z tym utworzenie standardowej krzywej plazmidu DNA podczas qRT-PCR, opisywane głównie w literaturze, wskazuje na obciążenie genomem wirusa, ale nie uwzględnia etapu ekstrakcji.

Opis strategii de novo dla całego procesu walidacji metody w normie AFNOR NF U47-600-2 stanowi znaczący postęp w tej dziedzinie. Jak pokazano w tej pracy dla EHV-2 u koni lub innych u pszczół21, wymaga to wyraźnego rozróżnienia między etapem rozwoju a etapem walidacji z charakterystyką PCR i charakterystyką całej metody. Jednym z ograniczeń w tym interesującym podejściu jest to, że każda zmiana w protokole będzie skutkowała obowiązkiem ponownej walidacji całego procesu, co może być bardzo kosztowne. Ograniczenie to zostało również podkreślone przez fakt, że granice oznaczania ilościowego zależą od źródła, z którego wirus jest ekstrahowany (np . płyny oddechowe, narządy, krew lub mocz). W rzeczywistości każda matryca ma inną specyfikę w swojej charakterystyce fizykochemicznej i ważne jest, aby niezależnie zdefiniować każdą inną matrycę używaną do wykrywania i kwantyfikacji wirusa za pomocą qRT-PCR. W ten sposób ładunek genomu wirusa w każdej próbce biologicznej można dokładniej określić ilościowo na podstawie ekstrakcji. Charakterystyka uwzględnia również model termocyklera i w przypadku, gdy zastosowanie wcześniej dobrze scharakteryzowanej metody (np. metody EHV-2 qPCR opisanej w tym artykule) wymaga nowego typu maszyny w laboratorium macierzystym lub innym laboratorium, należy potwierdzić działanie tego urządzenia. Potwierdzenie wykonania testu qPCR jest warunkiem wstępnym dla wszystkich testów wprowadzanych do laboratorium. Zwykle osiąga się to poprzez analizę próbki referencyjnej o znanych właściwościach. Taka kontrola jest warunkiem wstępnym i jest uważana za obowiązkową zgodnie z wymogami normy NF 47-600-1 AFNOR w celu walidacji skuteczności qPCR (LOD, LOQ efficiency) i solidności całej metody (LOD, LOQ). Nie tylko na etapie opracowywania i charakteryzowania, ale także w przypadku stosowania w badaniach lub do celów diagnostycznych, czynniki ryzyka mogą być identyfikowane i dobrze kontrolowane, aby zapewnić standaryzację protokołu. Szczególną uwagę należy zwrócić na odpowiednie wyszkolenie personelu, wysoko wykwalifikowany personel, kontrolę jakości stosowanych materiałów eksploatacyjnych i ich przechowywania, kontrolę bezpośrednich warunków środowiskowych oraz świadomość warunków metrologicznych, które mogą mieć wpływ na działanie przyrządów naukowych biorących udział w badaniu. Wykorzystanie próbek referencyjnych do porównań międzylaboratoryjnych mogłoby również pomóc w kontrolowaniu niepewności. W ten sposób można ułatwić porównywanie danych między laboratoriami. Międzylaboratoryjne badania biegłości są bowiem niezbędne do oceny i potwierdzenia odtwarzalności metody.

Wyniki obciążenia genomem wirusa, które są wyrażone w jednostkach międzynarodowych (IU) analizowanej matrycy biologicznej (IU: kopie/ml dla płynów lub kopie/g dla tkanek) są łatwiejsze do wykorzystania w celu porównania wyników między różnymi laboratoriami. Wszystkie wyniki powyżej granicy oznaczalności są wyrażone w kopiach/ml, a wynik między LOD a LOQ przyjmuje się jako niekwantyfikowalny wynik dodatni. Przedstawienie w ten sposób danych kwantyfikacyjnych genomu jest bardziej zgodne z procesem analiz (amplifikacji genomu). W rzeczywistości w eksperymentach z hodowlami komórkowymi ekspresja wiremii przez TCID50 (mediana dawki infekcyjnej w hodowli tkankowej) zależy od charakteru komórek i szczepów wirusa. Każda linia szczepów ma swoją unikalną kinetykę infekcji, a niektóre wirusy, takie jak EHV-2, mogą potrzebować kilku dni, zanim pojawi się pierwszy efekt cytopatogenny.

Podsumowując, ta nowa metoda charakterystyki qRT-PCR powinna ułatwić harmonizację prezentacji i interpretacji danych między laboratoriami. Będzie to bardzo przydatne w przypadku potencjalnych nowych zastosowań qRT-PCR w przyszłości, takich jak ustalenie wartości odcięcia dla deklaracji statusu choroby, a nie tylko obecności lub braku patogenu.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Sophie Castagnet i Nadii Doubli-Bounoua za ich wsparcie techniczne. Prace te uzyskały wsparcie finansowe ze strony Rady Generalnej Calvadosu oraz za zgodą Regionu Dolna Normandia i rządu francuskiego (CPER 2007-2013; projekt R25 p3). Autorzy pragną podziękować ekspertom grupy AFNOR, a w szczególności Jean-Philippe'owi Buffereau i Ericowi Dubois.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AB-1900 naturalny kolor ABgene 96 dołków Dutsher16924
Folia samoprzylepna qPCR Absolute Dutsher16629Folia samoprzylepna używana do uszczelniania płytki przed biegiem qRT-PCR
Mikroprobówki 0,5 ml, z listwą przypodłogową, nakrętkiDutsher039258
Etanol 98%SodiproSAF322941000
Podkłady EurofinsNa zamówienie
Technologie żywotnościsondyzamówienie niestandardowe
PlazmidEurofinsZamówienie
QIAamp  Mini zestaw wirusa RNA
(zawierający: kolumnę QIAamp Mini, bufor AVL ,  Bufor AW1, bufor AW2, bufor AVE, probówki zbiorcze) 		Qiagen52906AVL: wstępne rozgrzanie 5 min przy 72 stopniach; C
Sekwencjonowanie metodą SangeraEurofinsNa zamówienie
Taqman Universal PCR Master MixLife Technologies4364340
Roztwór buforowy Tris-EDTASanta Cruzsc-296653A
Spektrofotometr NanoDrop 2000cThermoscientificND-2000C
StepOnePlus Systemy PCR w czasie rzeczywistymTechnologie życia4376600Podgrzewanie 15 min 
na niestandardoweBufor

Bibliografia

  1. Brault, S. A., et al. The immune response of foals to natural infection with equid herpesvirus-2 and its association with febrile illness. Vet.Immunol.Immunopathol. 137 (1-2), 136-141 (2010).
  2. Fortier, G., Van Erck, E., Pronost, S., Lekeux, P., Thiry, E. Equine gammaherpesviruses: pathogenesis, epidemiology and diagnosis. Vet.J. 186 (2), 148-156 (2010).
  3. Hue, E. S., et al. Detection and quantitation of equid gammaherpesviruses (EHV-2, EHV-5) in nasal swabs using an accredited standardised quantitative PCR method. J Virol.Methods. 198 (1), 18-25 (2014).
  4. Diallo, I. S., et al. Multiplex real-time PCR for the detection and differentiation of equid herpesvirus 1 (EHV-1) and equid herpesvirus 4 (EHV-4). Vet.Microbiol. 4 (1-3), 93-103 (2007).
  5. Williams, K. J., et al. Equine multinodular pulmonary fibrosis: a newly recognized herpesvirus-associated fibrotic lung disease. Vet.Pathol. 44 (6), 849-862 (2007).
  6. Mullis, K., et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol. 51 (1), 263-273 (1986).
  7. EPA Office of Water (4607). EPA-815-B-04-001. Quality Assurance/Quality Control Guidance for Laboratories Performing PCR Analyses on Environmental Samples. , (2004).
  8. Telford, E. A., et al. Equine herpesviruses 2 and 5 are gamma-herpesviruses. Virology. 195 (2), 492-499 (1993).
  9. Fortier, G., et al. Identification of equid herpesvirus-5 in respiratory liquids: A retrospective study of 785 samples taken in 2006-2007. Vet.J. 182 (2), 346-348 (2009).
  10. Brault, S. A., Bird, B. H., Balasuriya, U. B., MacLachlan, N. J. Genetic heterogeneity and variation in viral load during equid herpesvirus-2 infection of foals. Vet.Microbiol. 147 (3-4), 253-261 (2011).
  11. Association Francaise de Normalisation. NFU 47-600-1. Animal health analysis methods-PCR-Part 1: Requirements and recommandations for the implementation of veterinary PCR. , (2015).
  12. Association Francaise de Normalisation. NFU 47-600-2. Animal health analysis methods-PCR-Part 2: Requirements and recommendations for the development and the validation of veterinary PCR. , (2015).
  13. ISO. EN ISO-CEI 17025. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories. , (2005).
  14. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2010. Chapter1.1.1.4/ 5. Principles and Methods of Validation of Diagnostic Assay for Infectious Diseases. , This thoroughly revised chapter replaces Chapter 1.1.4 Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases and Chapter 1.1.5 Validation and quality control of polymerase chain reaction methods used for the diagnosis of infectious diseases from the sixth edition of the OIE Terrestrial Manual (2009).
  15. Apaza, S., et al. Detection and genogrouping of noroviruses from children's stools by Taqman One-step RT-PCR. J Vis.Exp. (65), e3232(2012).
  16. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis.Exp. (63), e3998(2012).
  17. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol.Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  18. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  19. NCBI. BLAST Homepage and Selected Search Pages. Introducing the BLAST homepage and form elements/functions of selected search pages. , (2015).
  20. Greiner, M., Gardner, I. A. Application of diagnostic tests in veterinary epidemiologic studies. Prev.Vet Med. 45 (1-2), 43-59 (2000).
  21. Blanchard, P., Regnault, J., Schurr, F., Dubois, E., Ribiere, M. Intra-laboratory validation of chronic bee paralysis virus quantitation using an accredited standardised real-time quantitative RT-PCR method. J Virol.Methods. 180 (1-2), 26-31 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekstrakcja kwas w nukleinowychPCR w czasie rzeczywistymrozcie czenia seryjnegranica wykrywalno cioznaczanie miana wirusaAFNOR NF U47 600choroby uk adu oddechowego koni
Opracowanie i walidacja ilościowej metody PCR do diagnostyki herpeswirusa koniowatego-2 w płynach oddechowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.