Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie włókien serotoninergicznych w rdzeniu kręgowym myszy techniką CLARITY/CUBIC

10.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53673

⸱

26 lutego 2016

 ,  , 
1Brain Structure and Function Group, Neuroscience Research Australia, 2School of Medical Sciences, The University of New South Wales

W tym artykule

Podsumowanie

Projekcje nadrdzeniowe są ważne dla percepcji bólu i innych zachowań, a włókna serotoninergiczne są jednym z tych systemów włókien. Niniejsze badanie koncentrowało się na zastosowaniu połączonego protokołu CLARITY/CUBIC do rdzenia kręgowego myszy w celu zbadania zakończenia tych włókien serotoninergicznych.

Streszczenie

Długie włókna zstępujące do rdzenia kręgowego są niezbędne do poruszania się, odczuwania bólu i innych zachowań. Wzorzec zakończenia włókien w rdzeniu kręgowym większości tych systemów światłowodowych nie został dokładnie zbadany u żadnego gatunku. Włókna serotoninergiczne, które wystają do rdzenia kręgowego, badano u szczurów i oposów na odcinkach histologicznych, a ich znaczenie funkcjonalne wydedukowano na podstawie wzorca zakończenia włókien w rdzeniu kręgowym. Dzięki opracowaniu technik CLARITY i CUBIC możliwe jest zbadanie tego układu włókien i jego rozmieszczenia w rdzeniu kręgowym, co prawdopodobnie ujawni nieznane wcześniej cechy serotoninergicznych ścieżek nadrdzeniowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół obrazowania włókien serotoninergicznych w rdzeniu kręgowym myszy przy użyciu połączonych technik CLARITY i CUBIC. Metoda polega na perfuzji myszy roztworem hydrożelu i klarowaniu tkanki za pomocą kombinacji odczynników czyszczących. Tkanka rdzenia kręgowego została usunięta w niecałe dwa tygodnie, a późniejsze barwienie immunofluorescencyjne serotoniny zostało zakończone w mniej niż dziesięć dni. Za pomocą wielofotonowego mikroskopu fluorescencyjnego tkankę zeskanowano, a obraz 3D zrekonstruowano za pomocą oprogramowania Osirix.

Wprowadzenie

Projekcje nadrdzeniowe są odpowiedzialne za modulację różnych zachowań, takich jak percepcja bólu. Jedna z wypustek przenoszących informację nocyceptywną zawiera włókna serotoninergiczne, które wywodzą się ze szwu tyłomózgowiowego i przyległych jąder siatkowatych1,2. Badania fizjologiczne i farmakologiczne wykazały zwiększone uwalnianie serotoniny w rogu grzbietowym rdzenia kręgowego po elektrycznej stymulacji jąder szwu w tyłomózgowiu3-5. U szczurów i oposów serotoninergiczne włókna szwiordzeniowe mają gęste zakończenia, nie tylko w rogu grzbietowym6-8, ale także w strefie pośredniej7,9,10, rogu brzusznego7,11, a nawet blaszki 1012,13. Nie ma podobnych badań na myszach. Niniejsze badania miały na celu odwzorowanie wzorca zakończenia włókien serotoninergowych powstających z jąder szwu tyłomózgowiowego i przylegających do nich jąder siatkowatych w rdzeniu kręgowym myszy przy użyciu niedawno opublikowanej metody CLARITY14 i jej modyfikacji - CUBIC15.

Konwencjonalna immunohistochemia fluorescencji lub peroksydazy rdzenia kręgowego wyraźnie pokazuje rozkład włókien serotoninergowych w istocie szarej rdzenia kręgowego w przekrojach o grubości 30-40 μm. Podejście to nie wykazuje jednak ciągłości szlaków włókien serotoninergicznych w istocie białej i ich zabezpieczeń w istocie szarej. Chociaż rekonstrukcja 3D skrawków histologicznych poszerzyła naszą wiedzę na temat dróg włóknistych, nadal wyzwaniem dla histologów i anatomów jest śledzenie pojedynczego odcinka ze względu na niewielkie zniekształcenia w tkance spowodowane cięciem. Aby obejść tę przeszkodę, wielu badaczy opracowało różne protokoły uczynienia całej struktury tkanki przezroczystą i zebrania obrazu niezmienionej tkanki w jednym pliku wideo17-21. Jak dotąd, najbardziej skuteczna jest przezroczysta, wymieniana lipidami, sztywna hybrydyzacja akrylamidu, kompatybilna z obrazowaniem / barwieniem immunologicznym, technika hydrożelu tkankowego (CLARITY), opracowana przez grupę Deisserotha14,15, a także CUBIC, opracowana przez Susaki iwsp. 16. Od czasu opublikowania protokołów wielu badaczy zaczęło używać tych technik do badania różnych aspektów tkanek biologicznych, w tym nie tylko mózgu22-25, ale także serca, nerek, jelit i płuc26,27.

Poprzez utrwalenie rdzenia kręgowego myszy roztworem hydrożelu (CLARITY) i oczyszczenie odczynnikami CUBIC (co jest znacznie szybszą metodą niż ta opisana w oryginalnym protokole CLARITY14,15), blok tkanki rdzenia kręgowego o długości 2-3 mm został usunięty w ciągu dwóch tygodni, a barwienie immunofluorescencyjne dla serotoniny zakończyło się w ciągu ośmiu dni. Wystarczy kombinacja środków chemicznych, aby konwencjonalna immunohistochemia mogła być wykorzystana do stworzenia obrazu poszczególnych odcinków włókien w pliku wideo 3D w ciągu około jednego miesiąca.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Wszystkie procedury z udziałem zwierząt są zgodne z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki (ACEC) na Uniwersytecie Nowej Południowej Walii (zatwierdzony numer ACEC to 14/94A).

1. Przygotowanie przezroczystego rdzenia kręgowego myszy

  1. Przygotowanie lodowatego roztworu hydrożelu
    1. Przygotowanie 16% roztworu paraformaldehydu (PFA)
      1. Dodać 16 g proszku paraformaldehydu do 70 ml wstępnie podgrzanej wody destylowanej (50-55 °C) i mieszać na rozgrzanym mieszadle magnetycznym, aż do rozpuszczenia paraformaldehydu. Uwaga: Nie dopuścić do nagrzania roztworu powyżej 55 °C i należy pamiętać, że paraformaldehyd jest toksyczny.
      2. Przenieść roztwór paraformaldehydu do cylindra i dodać wodę destylowaną do 100 ml. Schłodzić roztwór paraformaldehydu w lodówce o temperaturze 4 °C.
    2. Rozpuścić 125 mg inicjatora VA-044 w 26,25 ml wody destylowanej i schłodzić roztwór w lodówce o temperaturze 4 °C.
    3. Chłodny 5 ml roztworu akrylamidu (40%), 1,25 ml roztworu Bis (2%) (UWAGA: roztwory Bis i akrylamidu są toksyczne, mogą powodować wady genetyczne lub raka), 5 ml 10x PBS, 12,5 ml 16% roztworu PFA i roztwór inicjatora VA-044 na lodzie.
    4. Wymieszaj powyższe roztwory z lodem.
      Uwaga: całkowita objętość wynosi 50 ml.
  2. Perfuzja i pobranie rdzenia kręgowego myszy
    1. Znieczulić mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym ketaminy (80 mg/kg) i ksyliny (5 mg/kg) rozcieńczonych w 0,9% soli fizjologicznej. Dawka dla myszy może być niższa niż dla szczurów.
    2. Na odpowiedniej plastikowej powierzchni w dygestorii przymocuj kończyny myszy z dala od ciała (skuteczna jest taśma klejąca), gdy mysz nie zareaguje na uszczypnięcie skóry stopy.
    3. Przetnij skórę myszy na klatce piersiowej, a następnie na kościstej klatce piersiowej, aby odsłonić serce nożyczkami.
    4. Za pomocą pompy perystaltycznej, z igłą o sile 25 G przymocowaną do końca rurki, włóż igłę do lewej komory serca, odetnij prawy przedsionek, aby stworzyć punkt wyjścia krwi, a następnie rozpocznij płukanie 40 ml 0,9% soli fizjologicznej z szybkością około 10 ml/min.
    5. Po zakończeniu przelej mysz 35 ml lodowatego roztworu hydrożelu.
      Uwaga: perfuzja z prędkością 10 ml/min, aby uniknąć obrzęku tkanki nerwowej.
    6. Naciąć skórę na plecach ostrzem, a następnie usuń mięśnie obok kręgowca. Po przecięciu łuków kręgowych z jednej strony i odwróceniu ich na drugą stronę, wyjmij rdzeń kręgowy z kręgosłupa za pomocą cienkich nożyczek.
  3. Oczyszczanie rdzenia kręgowego myszy
    1. Umieścić rdzeń kręgowy w 15 ml roztworu hydrożelu na noc w temperaturze 4 °C.
    2. Usunąć 10 ml roztworu hydrożelu i wlać resztę roztworu wraz z segmentami rdzenia kręgowego do probówki o pojemności 5 ml. Napełnij probówkę o pojemności 5 ml roztworem hydrożelu, aż do całkowitego napełnienia.
    3. Rozciągnąć mały kawałek parafilmu na górnej części probówki o pojemności 5 ml, a następnie owinąć parafilm wokół szyjki probówki. Uwaga: Upewnij się, że parafilm styka się z roztworem hydrożelu i że między roztworem hydrożelu a parafilmem nie ma pęcherzyków.
    4. Wstaw probówkę o pojemności 5 ml na noc do piekarnika o temperaturze 37 °C. Obserwuj roztwór hydrożelu, aż stanie się żelem.
    5. Wyjmij probówkę o pojemności 5 ml z piekarnika i usuń żel z probówki za pomocą klucza (takiego jak łopatka do pipety o pojemności 1 ml). Usuń żel z tkanki rdzenia kręgowego, przyklejając grubą tkankę do żelu, a następnie usuń grubą tkankę (żel przyklei się do tkanki i dlatego zostanie usunięty przez tkankę).
    6. Po usunięciu żelu z tkanki rdzenia kręgowego, przemyj rdzeń kręgowy 4 razy 1x PBS (pH 7,4) przez 24 godziny na shakerze.
    7. Przygotować CUBIC roztwór czyszczący, rozpuszczając 3,85 g mocznika i 3,85 g N,N,N',N'-tetrakis (2-hydroksypropylo)etylenodiaminy w 5,38 ml wody destylowanej.
      Uwaga: Używane jest gorące mieszadło. Dodać 2,31 g eteru mono-p-izooktylofenylowego glikolu polietylenowego/Triton X-100 do roztworu, gdy będzie klarowny i ostygnie do temperatury pokojowej.
      Uwaga: 10 g tych trzech substancji chemicznych jest przeznaczone dla jednej myszy.
    8. Przeciąć rdzeń kręgowy myszy na segmenty o długości 2-3 mm za pomocą żyletki i umieścić je w 5 ml powyższego roztworu czyszczącego CUBIC. Umieścić na shakerze w piekarniku w temperaturze 37 °C na 3 dni.
    9. Trzy dni później zmień roztwór czyszczący na nowy. Uwaga: powyższy roztwór przygotowuje się przed użyciem.
    10. Dwa do trzech dni później, po odświeżeniu roztworu czyszczącego CUBIC, sprawdź przezroczystość chusteczki na papierze z czcionką 8 liter. Jeśli jest przezroczysty, litery można zobaczyć przez oczyszczoną tkankę. Usuń roztwór klarujący i dodaj 4 ml PBST (0,1% Triton-X100), aby przemyć tkankę 4 razy dziennie (co 6 godzin).

2. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. Segmenty rdzenia kręgowego inkubować w roztworze przeciwciała pierwotnego (antyserotonina, hodowana u królika, rozcieńczana w stosunku 1:100 w PBST) przez 3 dni na wytrząsarce w piecu o temperaturze 37 °C.
  2. Usunąć roztwór przeciwciała i dodać 4 ml PBST (0,1% Triton-X100) w celu przemycia segmentów rdzenia kręgowego 4 razy dziennie (co 6 godzin) w suszarce o temperaturze 37 °C.
  3. Usunąć roztwór PBST i dodać drugorzędowy roztwór przeciwciała (594 sprzężone kozie przeciwciała anty-królicze IgG, rozcieńczone w stosunku 1:100 w PBST) w celu inkubacji tkanki przez 3 dni na wytrząsarce w piecu o temperaturze 37 °C.
  4. Usunąć roztwór przeciwciał drugorzędowych i dodać 4 ml PBST w celu przemycia segmentów rdzenia kręgowego 4 razy dziennie (co 6 godzin) na wytrząsarce w suszarce o temperaturze 37 °C. Następnego dnia tkanka jest gotowa do obrazowania.

3. Obrazowanie

  1. Usuń roztwór PBST i dodaj 4 ml 85% glicerolu, aby wyrównać współczynnik załamania światła tkanki.
  2. Sprawdź przejrzystość tkanki. Gdy będzie czysty w ciągu około 1 godziny, umieść tkankę na dużym, cienkim szkiełku podstawowym, które pasuje do ramy mocującej mikroskopu wielofluorescencyjnego.
  3. Umieść kilka kropli 85% glicerolu obok tkanki rdzenia kręgowego i nakryj ją szkiełkiem nakrywkowym 22 x 50mm2.
    Uwaga: Orientacja rdzenia kręgowego decyduje o tym, jak wygląda obraz.
  4. Umieść szklane szkiełko na ramie mocującej wielofotonowego mikroskopu fluorescencyjnego i przenieś tkankę na ścieżkę światła.
  5. Wybierz linię lasera Helium Neon 594 nm i dostosuj intensywność lasera do optymalnego poziomu, sprawdzając jasność sygnału dodatniego w obrazie na żywo.
  6. Wybierz obszar skanowania tkanki rdzenia kręgowego za pomocą obiektywu 20X (w wodzie, NA 0,7) i przygotuj się do utworzenia stosu z, a głębokość każdego kroku ustaw na 3 μm.
  7. Zeskanuj tkankę od góry do dołu stosu z odpowiednio pod obiektywem 20X, a następnie obiektywem 63X (w oleju, NA 1,4) (rozmiar kroku wynosił 1 μm). Rekonstrukcja filmów 3D za pomocą oprogramowania3D 28.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tej sekcji przedstawiono wyniki barwienia przeciwciałem przeciwko serotoninie w przezroczystym rdzeniu kręgowym myszy, z zastosowaniem kombinacji protokołów CLARITY i CUBIC. Wykazujemy, że włókna serotonergiczne występują we wszystkich blaszkach rdzenia kręgowego, z przewagą w części brzusznej rogu przedniego (Rycina 1, patrz także Wideo 1). Tkanka kontrolna nie wykazała obecności włókien dodatnich (wynik nie został przedstawiony). W rogu przednim, gęst...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany protokół pokazuje, jak obrazować włókna serotoninergiczne w rdzeniu kręgowym myszy za pomocą połączonych technik CLARITY i CABIC. Wprowadza szybszy proces rozliczania w porównaniu z pasywnym protokołem rozliczeń opracowanym przez Cheunga i wsp.14 oraz Tomer i wsp.15 i pozwala na dobre podparcie tkanki rdzenia kręgowego przez hydrożel podczas oczyszczania.

Ważny krok podczas stabilizacji rdzenia kręgowego myszy, jak donoszą Cheung i wsp.<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Australian Research Council Centre of Excellence for Integrative Brain Function (ARC Centre Grant CE140100007), grant projektu NHMRC (#1086643). Prof. George Paxinos jest wspierany przez Senior Principal Research Fellow NHMRC grant (#1043626).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fotoinicjator VA044WakoVA-044/225-02111http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
40% roztwór akrylamiduBio Rad161-0140http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution
2% roztwór Bis BioRad161-0142http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31-
879C-4D63-BA0B-82556A0CCF1D
ParaformaldehydSigma158127http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en®ion=AU
mocznikMerck Millipore66612http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612
N,N,N',N'-tetrakis (2-hydroksypropylo)etylenodiaminaMerck Millipore821940http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940
Triton-X 100Merck Millipore648462http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON®-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462
sacharozaSigmaS0389http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en®ion=AU
przeciwciało serotoninoweMerck MilliporeAB938http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938
kozie przeciwciało anty królicze IgG (H+L) Przeciwciało drugorzędowe, koniugat Alexa Fluor® 594Life Technologies  A-11012https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
mikroskop wielofotonowyLeicaLeica TCS SP5 MP STEDhttp://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/

Bibliografia

  1. Rivot, J. P., Chaouch, A., Besson, J. M. Nucleus raphe magnus modulation of response of rat dorsal horn neurons to unmyelinated fiber inputs: partial involvement of serotonergic pathways. J Neurophysiol. 44 (6), 1039-1057 (1980).
  2. Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. Projections from the brain to the spinal cord in the mouse. Brain Struct Funct. 215 (3-4), 159-186 (2011).
  3. Sorkin, L. S., McAdoo, D. J., Willis, W. D. Raphe magnus stimulation-induced anti-nociception in the cat is associated with release of amino acids as well as serotonin in the lumbar dorsal horn. Brain Res. 618 (1), 95-108 (1993).
  4. Rivot, J. P., Chiang, C. Y., Besson, J. M. Increase of serotonin metabolism within the dorsal horn of the spinal cord during nucleus raphe magnus stimulation, as revealed by in vivo electrochemical detection. Brain Res. 238 (1), 117-126 (1982).
  5. Hentall, I. D., Pinzon, A., Noga, B. R. Spatial and temporal patterns of serotonin release in the rat's lumbar spinal cord following electrical stimulation of the nucleus raphe magnus. Neuroscience. 142 (3), 893-903 (2006).
  6. Bullitt, E., Light, A. R. Intraspinal course of descending serotoninergic pathways innervating the rodent dorsal horn and lamina X. J Comp Neurol. 286 (2), 231-242 (1989).
  7. Jones, S. L., Light, A. R. Termination patterns of serotoninergic medullary raphespinal fibers in the rat lumbar spinal cord: an anterograde immunohistochemical study. J Comp Neurol. 297 (2), 267-282 (1990).
  8. Marlier, L., Sandillon, F., Poulat, P., Rajaofetra, N., Geffard, M., Privat, A. Serotonergic innervation of the dorsal horn of rat spinal cord: light and electron microscopic immunocytochemical study. J Neurocytol. 20 (4), 310-322 (1991).
  9. Morrison, S. F., Gebber, G. L. Axonal branching patterns and funicular trajectories of raphespinal sympathoinhibitory neurons. J Neurophysiol. 53 (3), 759-772 (1985).
  10. Barman, S. M., Gebber, G. L. The axons of raphespinal sympathoinhibitory neurons branch in the cervical spinal cord. Brain Res. 441 (1-2), 371-376 (1988).
  11. Martin, G. F., Cabana, T., Ditirro, F. J., Ho, R. H., Humbertson, A. O. Jr Raphespinal projections in the North American opossum: evidence for connectional heterogeneity. J Comp Neurol. 208 (1), 67-84 (1982).
  12. Bowker, R. M., Westlund, K. N., Coulter, J. D. Origins of serotonergic projections to the lumbar spinal cord in the monkey using a combined retrograde transport and immunocytochemical technique. Brain Res Bull. 9 (1-6), 271-278 (1982).
  13. Watkins, L. R., Griffin, G., Leichnetz, G. R., Mayer, D. J. Identification and somatotopic organization of nuclei projecting via the dorsolateral funiculus in rats: a retrograde tracing study using HRP slow-release gels. Brain Res. 223 (2), 237-255 (1981).
  14. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  15. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  16. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  17. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  18. Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  19. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  20. Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
  21. Ertürk, A., Bradke, F. High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO). Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).
  22. Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. Light microscopy mapping of connections in the intact brain. Trends Cogn Sci. 17 (12), 596-599 (2013).
  23. Spence, R. D., et al. Bringing CLARITY to gray matter atrophy. NeuroImage. 101, 625-632 (2014).
  24. Ando, K., et al. Inside Alzheimer brain with CLARITY: senile plaques, neurofibrillary tangles and axons in 3-D. Acta Neuropathol. 128 (3), 457-459 (2014).
  25. Zhang, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Struct Funct. , (2015).
  26. Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 781(2015).
  27. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  28. Rosset, A., Spadola, L., Ratib, O. OsiriX: an open-source software for navigating in multidimensional DICOM images. J Digit Imaging. 17, 205-216 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Technika CLARITYprzejrzyszczanie tkanekbarwienie immunofluorescencyjnemikroskopia wielofotonowa3D rekonstrukcja obrazuperfuzja hydrogelembarwienie przeciwcia ami
Obrazowanie włókien serotoninergicznych w rdzeniu kręgowym myszy techniką CLARITY/CUBIC
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.