Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Naprzemiennie reagujące na pole magnetyczne hybrydowe mikrożele żelatynowe do kontrolowanego uwalniania leków

9.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53680

⸱

13 lutego 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Kent State University, 2Liquid Crystal Institute, Kent State University, 3Chemical Physics Interdisciplinary Program, Kent State University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy łatwą metodę wytwarzania biodegradowalnej platformy uwalniania leków na bazie żelatyny, która reaguje magnetotermicznie. Udało się to osiągnąć poprzez włączenie superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza i poli(N-izopropylacyloamidu-ko-akrylamidu) do sferycznej mikrosieci żelatynowej usieciowanej za pomocą genipiny, w połączeniu z systemem aplikacji zmiennego pola magnetycznego.

Streszczenie

Magnetycznie reagujące nano/mikro-inżynieryjne biomateriały, które umożliwiają ściśle kontrolowane dostarczanie leków na żądanie, zostały opracowane jako nowe typy inteligentnych miękkich urządzeń do zastosowań biomedycznych. Chociaż wiele systemów dostarczania leków reagujących magnetycznie wykazało skuteczność zarówno w badaniach klinicznych in vitro, jak i w zastosowaniach przedklinicznych in vivo, ich zastosowanie w warunkach klinicznych jest nadal ograniczone ze względu na ich niewystarczającą biokompatybilność lub biodegradowalność. Ponadto wiele z istniejących platform opiera się na wyrafinowanych technikach ich wytwarzania. Niedawno zademonstrowaliśmy wytwarzanie biodegradowalnego, termoczułego mikrożelu na bazie żelatyny poprzez fizyczne uwięzienie łańcuchów poli(N-izopropylacrylamidu-ko-akrylamidu) jako drobnego składnika w trójwymiarowej sieci żelatyny. W tym badaniu przedstawiamy łatwą metodę wytwarzania biodegradowalnej platformy uwalniania leków, która umożliwia magnetotermicznie wyzwalane uwalnianie leku. Udało się to osiągnąć dzięki zastosowaniu superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza i polimerów reagujących na ciepło w koloidalnych mikrożelach na bazie żelatyny, w połączeniu z systemem aplikacji zmiennego pola magnetycznego.

Wprowadzenie

Systemy dostarczania leków reagujące na bodźce, które umożliwiają ściśle kontrolowane dostarczanie leków w odpowiedzi na bodźce endogenne lub egzogenne (np. temperaturę lub pH), były intensywnie badane jako nowe typy inteligentnych miękkich urządzeń do dostarczania leków. Hydrożele w mikroskali są szeroko stosowane jako platforma dostarczania leków, ponieważ nadają kontrolowane i zrównoważone profile uwalniania leków, a także regulowane właściwości chemiczne i mechaniczne1-3. W szczególności mikrożele koloidalne wykazują wiele zalet jako nośnik dostarczania leków ze względu na ich szybką reakcję na bodźce zewnętrzne i odpowiednią możliwość wstrzykiwania do miejscowej tkanki w minimalnie inwazyjny sposób4. Poli(N-izopropyloakrylaamid) (pNIPAM) lub jego kopolimery są szeroko stosowane w syntezie mikrożeli reagujących na ciepło poprzez szczepienie pNIPAM biodegradowalnymi/biokompatybilnymi polimerami, w tym żelatyną, chitozanem, kwasem alginianowym lub kwasem hialuronowym5,6, w których przemiana fazowa charakterystyczna dla pNIPAM w dolnej temperaturze krytycznej roztworu (LCST) może być wykorzystana jako wyzwalacz uwalniania leku7. Niedawno zademonstrowaliśmy wytwarzanie biodegradowalnego, termoresponsywnego mikrożelu na bazie żelatyny poprzez włączenie łańcuchów poli(N-izopropylacrylamidu-ko-akrylamidu) [p(NIPAM-co-AAm)] jako drobnego składnika w trójwymiarowych sieciach żelatynowych8. Mikrożel żelatyna/p(NIPAM-co-AAm) wykazywał regulowane pęcznienie w zależności od wzrostu temperatury, co dodatnio korelowało z uwalnianiem albuminy surowicy bydlęcej (BSA).

W ciągu ostatnich kilku lat podjęto coraz większe wysiłki w celu opracowania magnetycznie reagującej platformy dostarczania leków, która może wywołać uwalnianie leku w sposób na żądanie9,10. Podstawowa zasada syntezy magnetycznie reagującej platformy dostarczania leków wykorzystuje charakterystykę superparamagnetycznych nanocząstek (MNP) do generowania ciepła, gdy otrzymują one zmienne pole magnetyczne o wysokiej częstotliwości (AMF), które wyzwala uwalnianie leku wrażliwego na temperaturę. Jest to obiecujące rozwiązanie dla przyszłych zastosowań klinicznych, ponieważ system ten może celować głęboko w tkankę, umożliwia nieinwazyjne i zdalnie kontrolowane uwalnianie leku oraz może być połączony z leczeniem hipertermią i systemem obrazowania metodą rezonansu magnetycznego10-12. Do takich platform należą: (1) hybrydowe cząstki mikrożelu MNP/pNIPAM 13-15 oraz (2) makroskopowe rusztowania hydrożelowe zawierające unieruchomione MNP16-18. Platformy mikrożelowe na bazie pNIPAM wykazały precyzyjnie dostrajaną reakcję na bodźce magnetotermiczne w zakresie przemian fazowych. Jednak nadal polegają na złożonych i wyrafinowanych technikach wytwarzania, a stosowanie polimerów pNIPAM o wysokiej zawartości może być potencjalnie cytotoksyczne dla komórek19, co może ograniczać ich zastosowania in vivo. Rusztowania makroskopowe wykazują stosunkowo powolną reakcję na bodźce zewnętrzne i wymagają inwazyjnego przeszczepu chirurgicznego w porównaniu z mikrożelami koloidalnymi.

Emulgacja wody w oleju była standardową metodą wytwarzania submilimetrowych lub mikrometrowych cząsteczek żelu20. Na granicy faz woda-olej emulsji cząstka mikrożelu tworzy kulisty kształt dzięki minimalizacji energii powierzchniowej kropli wody pod wpływem mechanicznej siły ścinającej. Metoda ta pozwala na wytwarzanie dużej ilości wodnych kulistych kropelek żelu w prostej procedurze wytwarzania i została z powodzeniem zastosowana do wytwarzania mikrożeli na bazie żelatyny do zastosowań związanych z podawaniem leków21-23.

Tutaj prezentujemy łatwą metodę syntezy magnetofmalnie reagujących mikrożeli na bazie żelatyny do aplikacji leków poprzez zastosowanie metody emulgowania woda w oleju. Udało się to osiągnąć poprzez fizyczne włączenie MNP tlenku żelaza i łańcuchów p (NIPAM-co-AAm) jako drugorzędnego składnika w sferycznej sieci żelatynowej w mikroskali, która jest kowalencyjnie usieciowana przez genipinę sieciującą pochodzenia naturalnego, w połączeniu z systemem aplikacji zmiennego pola magnetycznego wysokiej częstotliwości (AMF).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uwaga: Ogólny proces wytwarzania mikrożeli żelatynowych reagujących na pole magnetyczne jest zilustrowany na rysunku 1A.

1. Przygotowanie roztworów i zawiesin

  1. Przygotować sieciujący roztwór genipiny (1% w/v) rozpuszczając 20 mg genipiny w 2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (1x PBS; pH 7,4). Roztworu należy przemieszać wirem i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C na 2 godziny, aby całkowicie rozpuścić roztwór.
  2. Przygotować roztwór środka powierzchniowo czynnego, rozpuszczając 20 mg poli(glikolu etylenowego)-poli(glikolu propylenowego)-poli(glikolu etylenowego) (Mw = 2,900 Da; określanego jako L64) w 200 ml PBS do stężenia 100 ppm.
  3. Przygotować 15% (w/v) roztwór żelatyny, rozpuszczając 64,5 mg żelatyny w 0,43 ml PBS. Zwirować roztwór i umieścić go w łaźni wodnej o temperaturze 37 oC, aż osiągnie fazę zolową, w której roztwór stanie się płynny. Następnie zmieszaj roztwór żelatyny 2-3 razy, aby zapewnić jednorodność próbki.
  4. Przygotowanie roztworu p(NIPAM-co-AAm)/MNPs z lekiem modelowym (BSA):
    1. Rozpuść 10,75 mg hydrofilowych MNP w 0,43 ml PBS, a następnie rozpuść 12,9 mg p(NIPAM-co-AAm) w zawiesinie MNP, aby uzyskać stężenie na poziomie 3% (w/v). Zwiększone stężenie p(NIPAM-co-AAm) można wykorzystać do osiągnięcia zwiększonego zachowania mikrożeli przy pęcznieniu.
    2. Stosować teksańsko-czerwoną sprzężoną albuminę surowicy bydlęcej (TR-BSA; Mw ~66 kDa) jako lek modelowy. Rozpuścić 0,5 mg TR-BSA w mieszaninie p(NIPAM-co-AAm)/MNPs.
  5. Przygotować mieszaniny roztworu żelatyny/p(NIPAM-co-AAm)/MNPs/BSA (0,86 ml), dodając mieszaninę p(NIPAM-co-AAm)/MNPs (0,43 ml) do roztworu żelatyny (0,43 ml), a następnie dokładnie je zwirować, aby uzyskać jednorodną mieszaninę. W ten sposób stężenia polimerów i MNP stają się połową stężeń początkowych w mieszaninie końcowej.

2. Emulgacja

  1. Wlać 15 ml oleju silikonowego [polidimetylosiloksan (lepkość 350 cSt)] do czystej i sterylnej zlewki.
  2. Natychmiast dodać przygotowane mieszaniny wodne roztworu żelatyny/p(NIPAM-co-AAm)/MNPs/BSA (0,86 ml) do oleju silikonowego i zemulgować mieszaninę wodną w fazie olejowej, mieszając mieszadłem magnetycznym przy 900 obr./min w temperaturze 30 oC przez 30 min.

3. Żelowanie i przenoszenie mikrokropelek do roztworu wodnego

  1. Przenieść emulsję (~16 ml) ze zlewki do probówki o pojemności 50 ml.
  2. Schłodzić probówkę przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu żelowania mikrokropelek w oleju.
  3. Napełnić probówkę przygotowanym roztworem L64 (w temperaturze 4 oC) do 50 ml i energicznie wstrząsnąć probówką. Możliwe, że część środków powierzchniowo czynnych L64 znajdzie się w mikrożelach.
  4. Wirować probówkę przez 20 minut przy 2 300 x g w temperaturze 4 oC.
  5. Regularnie sprawdzaj, czy z boku rurki nie ma osadu cząstek żelu. Jeśli cząstki nie są widoczne, wirować przez kolejne 20 minut z tą samą prędkością i temperaturą. Przystąpić do ostrożnego usuwania supernatantu, nie naruszając osadu utworzonego na wewnętrznej ściance probówki.
  6. Powtórz kroki od (3.3) do (3.5) jeszcze raz. Za każdym razem należy przenieść próbkę do nowej probówki, aby uniknąć włączenia kropelek oleju do zawiesiny mikrożelu. Po tym etapie należy upewnić się, że w zawiesinie próbki nie ma środków powierzchniowo czynnych ani kropelek oleju. Jednak powtarzające się etapy separacji mogą prowadzić do utraty materiałów początkowych.

4. Sieciowanie kowalencyjne mikrożeli

  1. Dodać 2 ml roztworu genipiny (przygotowanego w sekcji 1) do osadu cząstek żelu i dobrze je wymieszać, wirując roztwór.
  2. Szybko przenieś rurkę z zawiesiną do łaźni wodnej w temperaturze 23 oC, aby zainicjować kowalencyjną reakcję sieciowania w żądanym czasie sieciowania (np. 5 - 120 min).
  3. Po usieciowaniu należy natychmiast usunąć nadmiar środków sieciujących, wyrzucając roztwór genipiny, ponownie zawieszając mikrożele w PBS i odwirowując probówkę przez 20 minut w temperaturze 2 300 x g (4 oC). W razie potrzeby ostrożnie rozdrobnić uformowany osad za pomocą końcówki pipety. Ten etap mycia można powtórzyć do 3 razy, jeśli genipin nadal pozostaje w roztworze.
  4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić mikrożele w PBS o pożądanej gęstości (np. 5 × 106 mikrożeli/ml), zliczając liczbę za pomocą hemocytometru.
  5. W przypadku obserwacji mikroskopowych należy umieścić zawiesinę mikrożelu w przestrzeni między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnić granicę szkiełka nakrywkowego żywicą epoksydową.

5. Zastosowanie zmiennego pola magnetycznego do wyzwalania uwalniania leku

  1. Umieść probówkę z żądanym stężeniem mikrożeli w środowisku wodnym w komorze cewek magnetycznych. W razie potrzeby włóż światłowodową sondę temperatury do rury, aby monitorować zmiany temperatury mediów podczas aplikacji AMF.
  2. Stosować AMF o wysokiej częstotliwości (>100 kHz) przy określonym natężeniu pola (>5 kA/m) i przez określony czas. Po zastosowaniu AMF odwirować probówkę z próbką przez 20 minut w temperaturze 2,273 x g (4 oC) i zebrać supernatant w celu ilościowego określenia ilości TR-BSA uwolnionego z mikrożelu do otaczających pożywek za pomocą spektrofotometrii. Długości fal wzbudzenia i emisji dla Texas Red wynoszą odpowiednio 584 nm i 612 nm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przy prawidłowym przeprowadzeniu protokołu otrzymane mikrzele powinny charakteryzować się dobrze zdefiniowaną sferyczną morfologią i dyspersyjnością koloidalną, a ich średnice powinny mieścić się w zakresie od 5 μm do 20 μm (Rycina 1B i C). Do potwierdzenia prawidłowego enkapsulowania MNPs lub leków (w tej badaniu BSA) wewnątrz mikrzele można użyć fluorescencyjnych MNPs lub fluorescencyjnego BSA (Rycina 1D). Otrzymane mikrzele są stabilne i mogą być przec...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana tutaj technologia stanowi dowód słuszności koncepcji wykorzystania hybryd nanocząstek i mikrożeli do magnetotermicznie wyzwalanego uwalniania leków. Udało się to osiągnąć poprzez fizyczne uwięzienie MNP i łańcuchów p(NIPAM-co-AAm) w trójwymiarowej sieci żelatynowej w mikroskali usieciowanej za pomocą genipiny. Platforma reagująca na pole magnetyczne była wystarczająca do wytworzenia ciepła w mikrożelu w odpowiedzi na zdalnie zastosowany AMF, który z kolei spowodował uwolnienie modelowego leku, BSA.

<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Farris Family Innovation Award i NIH 1R01NR015674-01 do MK. Autorzy dziękują Josepowi Nayfachowi (Qteris, Inc) za dostarczenie systemu generatora elektromagnetycznego, a także za konsultacje techniczne. Autorzy dziękują również Huan Yan (LCI & Chemical Physics Interdisciplinary Program, Kent State University) za jej asystentów technicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ŻelatynaSigma-Aldrich, MO, USAG2500Żelatyna typu A,
skóra świń poli(N-izopropylacrylamid-koakrylamid) Sigma-Aldrich, MO, USA738727MW = 20 000, LCST = 34 - 38 ° C
Olej silikonowySigma-Aldrich, MO, USA378372Lepkość 350 cSt
Pluoronic L64Sigma-Aldrich, MO, StanyZjednoczone 435449poli(glikol etylenowy)-blok-poli(glikol propylenowy)-blok-poli(glikol etylenowy)
genipinTimTec LLC, DE, USAST080860 MW = 226,23
Nanocząstki magnetyczne (MNP)Micromod Inc, Niemcy79-00-102nanomag-D-spio, 100 nm
TR-BSALife Technologies, Nowy Jork USAA23017Albumina z surowicy bydlęcej (BSA), koniugat Texas Red

Bibliografia

  1. Langer, R. Biomaterials in drug delivery and tissue engineering: one laboratory's experience. Acc. Chem. Res. 33, 94-101 (2000).
  2. Rivest, C. M., Morrison, D., Ni, B., Rubib, J., Yadav, V., Mahdavi, A., Karp, J., Khademhosseini, A. Microscale hydrogels for medicine and biology: synthesis, characteristics and applications. J Mech Mater Struct. 2, 1103-1119 (2007).
  3. Kawaguchi, H. Thermoresponsive microhydrogels: preparation, properties and applications. Polym. Int. 63, 925-932 (2014).
  4. Vinogradov, S. V. Colloidal microgels in drug delivery applications. Curr. Pharm. Des. 12, 4703-4712 (2006).
  5. Liechty, W. B., Kryscio, D. R., Slaughter, B. V., Peppas, N. A. Polymers for drug delivery systems. Annu Rev Chem Biomol Eng. 1, 149-173 (2010).
  6. Kumari, A., Yadav, S. K., Yadav, S. C. Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems. Colloids Surf. B Biointerfaces. 75, 1-18 (2010).
  7. Shibayama, M., Tanaka, T. Volume Phase-Transition and Related Phenomena of Polymer Gels. Adv Polym Sci. 109, 1-62 (1993).
  8. Sung, B., Kim, C., Kim, M. H. Biodegradable colloidal microgels with tunable thermosensitive volume phase transitions for controllable drug delivery. J Colloid Interface Sci. 450, 26-33 (2015).
  9. Kumar, C. S., Mohammad, F. Magnetic nanomaterials for hyperthermia-based therapy and controlled drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 63, 789-808 (2011).
  10. Mura, S., Nicolas, J., Couvreur, P. Stimuli-responsive nanocarriers for drug delivery. Nat. Mater. 12, 991-1003 (2013).
  11. Kong, S. D., et al. Magnetic field activated lipid-polymer hybrid nanoparticles for stimuli-responsive drug release. Acta biomaterialia. 9, 5447-5452 (2013).
  12. Hayashi, K., et al. Magnetically responsive smart nanoparticles for cancer treatment with a combination of magnetic hyperthermia and remote-control drug release. Theranostics. 8, 834-844 (2014).
  13. Suzuki, D., Kawaguchi, H. Stimuli-sensitive core/shell template particles for immobilizing inorganic nanoparticles in the core. Colloid Polym Sci. 284, 1443-1451 (2006).
  14. Bhattacharya, S., Eckert, F., Boyko, V., Pich, A. Temperature-, pH-, and magnetic-field-sensitive hybrid microgels. Small. 3, 650-657 (2007).
  15. Wong, J. E., Gaharwar, A. K., Muller-Schulte, D., Bahadur, D., Richtering, W. Dual-stimuli responsive PNiPAM microgel achieved via layer-by-layer assembly: Magnetic and thermoresponsive. J Colloid Interf Sci. 324, 47-54 (2008).
  16. Zhao, X., et al. Active scaffolds for on-demand drug and cell delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 67-72 (2011).
  17. Xu, F., et al. Release of magnetic nanoparticles from cell-encapsulating biodegradable nanobiomaterials. ACS nano. 6, 6640-6649 (2012).
  18. Li, Y. H., et al. Magnetic Hydrogels and Their Potential Biomedical Applications. Adv Funct Mater. 23, 660-672 (2013).
  19. Cooperstein, M. A., Canavan, H. E. Assessment of cytotoxicity of (N-isopropyl acrylamide) and poly(N-isopropyl acrylamide)-coated surfaces. Biointerphases. 8, 19(2013).
  20. Jorgensen, L., Moeller, E. H., van de Weert, M., Nielsen, H. M., Frokjaer, S. Preparing and evaluating delivery systems for proteins. Eur J Pharm Sci. 29, 174-182 (2006).
  21. Holland, T. A., Tabata, Y., Mikos, A. G. In vitro release of transforming growth factor-beta 1 from gelatin microparticles encapsulated in biodegradable, injectable oligo(poly(ethylene glycol) fumarate) hydrogels. J Control Release. 91, 299-313 (2003).
  22. Liang, H. C., Chang, W. H., Lin, K. J., Sung, H. W. Genipin-crosslinked gelatin microspheres as a drug carrier for intramuscular administration: in vitro and in vivo studies. J Biomed Mater Res. Part A. 65, 271-282 (2003).
  23. Solorio, L., Zwolinski, C., Lund, A. W., Farrell, M. J., Stegemann, J. P. Gelatin microspheres crosslinked with genipin for local delivery of growth factors. J Tissue Eng Regen Med. 4, 514-523 (2010).
  24. Regmi, R., et al. Hyperthermia controlled rapid drug release from thermosensitive magnetic microgels. J Mater Chem. 20, 6158-6163 (2010).
  25. Kim, M. H., et al. Magnetic nanoparticle targeted hyperthermia of cutaneous Staphylococcus aureus infection. Ann Biomed Eng. 41, 598-609 (2013).
  26. Ivkov, R., et al. Application of high amplitude alternating magnetic fields for heat induction of nanoparticles localized in cancer. Clin Cancer Res. 11, 7093s-7103s (2005).
  27. Huang, S., Fu, X. Naturally derived materials-based cell and drug delivery systems in skin regeneration. J Control Release. 142, 149-159 (2010).
  28. Malafaya, P. B., Silva, G. A., Reis, R. L. Natural-origin polymers as carriers and scaffolds for biomolecules and cell delivery in tissue engineering applications. Adv. Drug Deliv. Rev. 59, 207-233 (2007).
  29. Shah, R., Kim, J., Agresti, J., Weitz, D., Chu, L. Fabrication of monodisperse thermosensitive microgels and gel capsules in microfluidic devices. Soft Matter. 4, 2303-2309 (2008).
  30. Hoare, T., et al. Magnetically triggered nanocomposite membranes: a versatile platform for triggered drug release. Nano letters. 11, 1395-1400 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikrożele reagujące na pole magnetycznemikrożele na bazie żelatynysuperparamagnetyczne nanocząstki tlenku żelazauwięzienie kopolimeru PNIPAMemulsyfikacja w układzie woda w olejusieciowanie genipinąilościowe oznaczanie uwalniania lekudetekcja spektrofotometrycznaanaliza morfologii mikrożeli
Naprzemiennie reagujące na pole magnetyczne hybrydowe mikrożele żelatynowe do kontrolowanego uwalniania leków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.