Tutaj przedstawiono protokół izolacji i tworzenia pierwotnych kultur fibroblastów/miofibroblastów (MF) z zamrożonych komórek tkanki żołądka, jelita cienkiego i okrężnicy o fenotypie MF. Komórki te wyrażają CD90, α-SMA i wimentynę. MF mogą być używane do różnych testów funkcjonalnych, w tym aktywności enzymatycznej i produkcji cytokin.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja fibroblastów/miofibroblastów CD 90+ z ludzkich mrożonych próbek przewodu pokarmowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Fibroblasty/miofibroblasty (MF) zyskują coraz większą uwagę ze względu na ich rolę w patogenezie i ich wkład zarówno w gojenie się ran, jak i promowanie mikrośrodowiska guza. Chociaż obecnie istnieje wiele technik izolacji MF z tkanek przewodu pokarmowego (GI), protokół ten wprowadza nowy element izolacji tych komórek zrębu z zamrożonej tkanki. Zamrażanie próbek tkanek przewodu pokarmowego nie tylko pozwala badaczowi na pozyskiwanie próbek od współpracowników na całym świecie, biobanków i dostawców komercyjnych, ale także pozwala na opóźnione przetwarzanie świeżych próbek. Opisany protokół pozwoli konsekwentnie uzyskać charakterystyczne komórki w kształcie wrzeciona z fenotypem MF, które wyrażają markery CD90, α-SMA i wimentynę. Ponieważ komórki te pochodzą z próbek pobranych od pacjentów, zastosowanie komórek pierwotnych przynosi również korzyści ze ścisłego naśladowania MF ze stanów chorobowych, a mianowicie raka i chorób zapalnych jelit. Technika ta została zwalidowana w generowaniu pierwotnych kultur MF żołądka, jelita cienkiego i okrężnicy. Pierwotne hodowle MF mogą być wykorzystywane w szerokim zakresie eksperymentów na przestrzeni wielu pasaży, a ich czystość ocenia się zarówno za pomocą immunocytochemii, jak i analizy cytometrii przepływowej.
Wprowadzenie
Miofibroblasty/fibroblasty (MF) reprezentują obfitą populację komórek w błonie śluzowej przewodu pokarmowego (GI). Te komórki zrębu znajdują się tuż pod nabłonkiem i tworzą połączoną sieć w blaszce właściwej błony śluzowej w jelitach. MF są nie tylko odpowiedzialne za odkładanie się macierzy zewnątrzkomórkowej, ale poprzez regulację parakrynną mogą wpływać na transport elektrolitów, restytucję i funkcję barierową sąsiedniego nabłonka1, 2. Ponadto wykazano, że MF odgrywają kluczową rolę w stanach zapalnych i przebudowie tkanek3, 4. Miofibroblasty są krytyczną częścią mikrośrodowiska guza, gdzie są również znane jako fibroblasty związane z rakiem i przyczyniają się do wzrostu komórek nowotworowych i służą jako nisza dla rakowych komórek macierzystych3. Pojawiające się dane sugerują, że MF mogą również służyć jako lokalne komórki prezentujące antygen. Ponadto MF działają jako ważne regulatory wrodzonych i adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych, wytwarzając różnorodne cytokiny i czynniki wzrostu5.
U zdrowych osób uważa się, że komórki MFs odróżniają się od mezenchymalnych komórek macierzystych i wyrażają na powierzchni swoich komórek mezenchymalny marker, CD903, 5. Komórki te są również dodatnie dla wimentyny, ale ujemne dla markera komórek nabłonkowych i krwiotwórczych, odpowiednio EpCAM i CD45. Sugeruje się, że miofibroblasty są aktywowaną formą fibroblastów i można je odróżnić od nieaktywowanych fibroblastów na podstawie ekspresji α-SMA5.
W ciągu ostatniej dekady opublikowano wiele podejść do izolacji miofibroblastów z ludzkiej błony śluzowej okrężnicy - głównie opartych na metodzie pierwotnie opisanej przez Mahidę i wsp. 5-8. Podczas gdy poszczególne badania opisują procedury izolacji z różnych błon śluzowych jelit, nie opublikowano uniwersalnego protokołu izolacji MF z wielu obszarów przewodu pokarmowego (tj. błony śluzowej żołądka, jelita cienkiego i grubego). Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół został przetestowany i z powodzeniem stosowany dla wszystkich trzech typów tkanek wymienionych powyżej. . Ponadto nie opisano procedur izolacji MF z zamrożonej błony śluzowej przewodu pokarmowego.
Tutaj prezentujemy zoptymalizowaną metodę, która opiera się na trawieniu enzymatycznym, a jednocześnie pozwala na izolację MF błony śluzowej ludzkiego jelita do hodowli i analizy cytometrii przepływowej w świeżo strawionych, jednokomórkowych preparatach błony śluzowej. Technika ta niezawodnie daje kultury pierwotne o fenotypie MF. Co więcej, te same metody można zastosować do izolacji MF z zamrożonych próbek tkanek żołądka i jelita cienkiego. Izolacja miofibroblastów ze świeżej tkanki przewodu pokarmowego została już wcześniej opisana; Jednak wykorzystanie zamrożonych próbek ma wiele zalet. Mianowicie, naukowcy byliby w stanie zbierać i przechowywać tkanki od dowolnej liczby współpracowników z całego świata, którzy mają możliwość wysyłania zamrożonych próbek tkanek. Co więcej, naukowcy mogą uznać, że pobranie wyrzuconych tkanek z sali operacyjnej i/lub sali endoskopii oraz natychmiastowe przetworzenie tkanki w celu izolacji koliduje z ich obecnym harmonogramem eksperymentów. Ponadto, ze względu na nieprzewidywalny charakter operacji, pobranie tkanek może nastąpić bardzo późno w ciągu dnia, co ograniczy czas pozostały do przetworzenia tkanki. Zamrożenie tkanek do późniejszego przetwarzania złagodzi te wyzwania.
Na koniec, te metody zostały z powodzeniem wykorzystane do izolacji miofibroblastów okrężnicy, żołądka i jelita cienkiego w stanach chorobowych takich jak rak jelita grubego i choroby zapalne jelit.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Protokół pobierania odrzuconych tkanek ludzkich od pacjentów chirurgicznych i zakładania kultur pierwotnych został zatwierdzony przez Oddział Medyczny Uniwersytetu Teksańskiego i Instytucjonalne Komisje Rewizyjne Uniwersytetu Nowego Meksyku. Ogólne wymagania dotyczące pobierania próbek tkanek ludzkich opisano poniżej. Należy pamiętać, że ponieważ MF mogą być izolowane z zamrożonych tkanek, biobanki i dostawcy komercyjni są również realnymi opcjami.
1. Uzyskanie tkanki ludzkiej
- Przedłożyć protokół uzyskania ludzkiej tkanki jelita grubego do zatwierdzenia przez instytucjonalną komisję rewizyjną.
- Nawiązanie współpracy z chirurgami ogólnymi i/lub chirurgami jelita grubego w celu pozyskania tkanek ludzkich do badań. Obowiązkowa jest również współpraca z działem patologii, ponieważ będzie on określał tkankę, która nie jest wymagana do diagnozy i może być przeznaczona do badań.
- Poradź patologowi, aby dostarczył tkankę z nowotworu, a następnie ogólnie normalną błonę śluzową co najmniej 5 cm od guza. Natychmiast umieścić próbki w lodowatym podłożu myjącym i umieścić na lodzie. Patolog określi ilość tkanki, którą można bezpiecznie oddać do badań. Minimalna tkanka wymagana do izolacji MF wynosi 1,5mm2.
- Otrzymaną tkankę należy natychmiast wykorzystać do założenia kultur pierwotnych lub zamrozić i umieścić w temperaturze -80 °C w celu przyszłej izolacji.
- W przypadku zamrażania w celu późniejszej izolacji, pokrój tkankę na około 1 - 2 mm2 kawałki, umieść w probówce kriogenicznej z 1 ml pożywki do zamrażania (patrz poniżej) i przechowuj w temperaturze -80 °C. Uwaga: Korzystając z tego protokołu, zaobserwowano pomyślną izolację MF z tkanki zamrożonej przez ponad 4 lata.
2. Przygotuj odczynniki
- Dla roztworu kolagenazy: Przygotuj 100 j./ml kolagenazy I, II i IV w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS) z Ca2+/Mg2+ (patrz tabela materiałów). UWAGA: Stężenie i czystość jednostki aktywnej kolagenazy może się różnić w zależności od dostawcy, co może utrudniać efektywność trawienia tkanek i/lub zachowanie epitopu na powierzchni komórek błony śluzowej. Aby zapobiec tym potencjalnym pułapkom, należy stosować kolagenazę o najwyższym stopniu czystości (≥95%) i przygotować roztwór podstawowy w oparciu o stężenie jednostek aktywnych.
- Przygotować wodny roztwór podstawowy DNazy o stężeniu 10 mg/ml (3,55 UA/mg).
- Przygotuj pożywkę do mycia: (MEM: 89 ml, Antybiotyk-Antybiotyk, 100x: 1 ml; FCS inaktywowany termicznie: 10 ml)
- Przygotuj pożywkę wzrostową fibroblastów: MEM: butelka 500 ml; L-glutamina (200 mM): 5 ml; Aminokwasy endogenne MEM, 100x roztwór: 5 ml; chlorowodorek cyprofloksacyny (10 mg/ml): 570 μl; Antybiotyk-Przeciwgrzybiczy, 100x roztwór: 10 ml; pirogronian sodu (100 mM): 5 ml; Aktywowany termicznie FCS: 50 ml
- Przygotować pożywkę do zamrażania: pożywkę wzrostową fibroblastów (odczynnik 2.4) z dodatkiem 10% sulfotlenku dimetylu (DMSO), a następnie przefiltrować i sterylizować filtrem 0,22 μm.
3. Enzymatycznie trawiona tkanka ludzka
- Jeśli tkanka została zamrożona w pożywce zamrażającej, umieść kriowial w ciepłej (~ 37 °C) wodzie, aż tkanka i podłoże zostaną rozmrożone.
- Na 4 - 5 kawałków chusteczki o średnicy 2 mmnależy przemyć chusteczkę dwukrotnie 10 ml HBSS bez Ca2+/Mg2+.
- Gdy tkanka osiądzie grawitacyjnie, ostrożnie wyrzucić supernatant bez wirowania próbki.
- Dodać 10 ml roztworu kolagenazy do próbki i przenieść mieszaninę tkanka-roztwór do sterylnej probówki wolnej od DNaz/RNaz z wbudowanymi wirnikami do dysocjacji próbki. Użyj kolagenazy do dysocjacji macierzy zewnątrzkomórkowej, która otacza podstawowy aspekt komórek nabłonka i tworzy niekomórkową frakcję właściwej blaszki błony śluzowej.
- Szczelnie zamknij rurkę i przymocuj ją do góry nogami na tulei dysocjatora (np. GentleMAC). Jeśli laboratorium nie ma dostępu do wyżej wymienionego sprzętu, wydłuż czas każdego etapu trawienia, aby uzyskać porównywalne wyniki.
- Uruchom program h_tumor_01, wstępnie ustawiony profil dołączony do maszyny (całkowity czas trwania 36 sekund, z przerywanymi impulsami w zakresie od 1,000 do 4,000 obr./min, z 268 rundami na bieg).
- Po zakończeniu programu odłącz rurkę od dysocjatora.
- Inkubować próbkę przez 45 minut w temperaturze 37 °C przy ciągłym obrocie na wytrząsarce z prędkością 140 obr./min. Uwaga: W przypadku różnych ilości próbek tkanek czas trawienia może być proporcjonalnie skrócony lub wydłużony (tj. większe ilości tkanek mogą wymagać dodatkowego czasu).
- Przymocuj rurkę do góry nogami na tulei dysocjatora.
- Wybierz i uruchom h_tumor_02 Program (całkowity czas trwania 37 sekund, z przerywanymi impulsami w zakresie od 1,000 do 4,000 obr./min, z 235 rundami na bieg).
- Po zakończeniu programu odłącz rurkę od dysocjatora.
- Dodać 50 μl roztworu podstawowego DNazy. Użyj DNAzy do dysocjacji/usunięcia martwych komórek i frakcji DNA szczątków komórkowych, która prowadzi do zlepiania się komórek.
- Inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C przy ciągłym obrocie na wytrząsarce z prędkością 60 obr./min.
- Ponownie przymocuj rurkę do góry nogami na tulei dysocjatora.
- Wybierz i uruchom h_tumor_03 Program (całkowity czas trwania 37 sekund, z przerywanymi impulsami w zakresie od 1,000 do 4,000 obr./min, ze 168 rundami na bieg).
Uwaga: Jeżeli tkanka nie jest całkowicie strawiona, odwirować przy 250 × g przez 10 minut w temperaturze 20 °C, odrzucić supernatant, ponownie zawiesić w 2 ml roztworu do dysocjacji komórek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. - Przepuścić zawiesinę komórkową przez sterylne sitko do komórek o wielkości 70 μm.
- Odwirować zawiesinę komórek w temperaturze 250 × g przez 10 minut w temperaturze 20 °C. Całkowicie odessać supernatant.
- Przepłukać osad komórkowy dwukrotnie 25 ml HBSS bez Ca2+/Mg2+ i odrzucić sklarowany nad osadem.
- Przed ostatnim myciem należy policzyć liczbę komórek za pomocą automatycznego systemu zliczania komórek dostępnego w laboratorium lub ręcznie za pomocą hemocytometru. W przypadku generowania kultur pierwotnych MF należy postępować zgodnie z krokiem 3.19.1, a w przypadku analizy lub sortowania MF za pomocą cytometrii przepływowej należy postępować zgodnie z krokiem 3.19.2.
- W celu izolacji i wzrostu czystej kultury MF (ryc. 1) odrzucić supernatant z ostatniego wirowania, ponownie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej ilości pożywki izolacyjnej fibroblastów potrzebnej do wysiewu do 4 x 106 komórek w 3 ml pożywki na basenie w 6 dołkach, płytkach poddanych działaniu kultur komórkowych. Przejdź do kroku 3.20.
- W celu analizy lub sortowania MF przy użyciu cytometrii przepływowej umieścić maksymalnie 2 x 106 w 2 ml pożywki do izolacji fibroblastów w 24-dołkowej płytce o niskim stopniu wiązania i inkubować O/N w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Ma to na celu przywrócenie epitopów na powierzchni komórki, które mogą być dotknięte procedurą enzymatyczną. Następnie zbierz zawiesinę komórek i policz odzyskane komórki, a następnie przejdź do analizy barwienia immunologicznego i cytometrii przepływowej8.
- Hoduj komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Zmieniaj podłoże co 2 - 3 dni, aż do powstania ~ 80% zlewającej się monowarstwy MF (rysunek 1D-E).
- Komórki pasażowe w kolbach T25 z płytką 6-dołkową w stosunku 1:1 i rosną przez ~ 10 - 14 dni w pożywkach wzrostowych fibroblastów, aby osiągnąć 80 - 100% konfluencji.
- Rozszerz hodowlę przez pasażowanie komórek od komórek T25 do T75 w stosunku 1:2. Gdy komórki osiągną konfluflucję, użyć jednej kolby do analizy izolowanej czystości MF przy użyciu cytometrii przepływowej, jak opisano wcześniej5. Zamrażać lub przepuszczać przez inną kolbę T75 kultury MF w stosunku 1:3,
Uwaga: Po przeanalizowaniu za pomocą cytometrii przepływowej oczekuje się, że MF zrębu błony śluzowej przewodu pokarmowego pochodzenia mezenchymalnego podczas wzrostu w kulturze będzie miał następujący fenotyp: EpCAM-, CD31-, CD45-, wimentyna+, α-SMA+, CD90+.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Stosując ten protokół trawienia enzymatycznego, byliśmy w stanie w sposób powtarzalny izolować i hodować populację MF komórek zrębu śluzówki jelita CD90+ z chirurgicznych preparatów i biopsji przewodu pokarmowego (Rysunek 1). Widoczną proliferację kolonii MF można było zaobserwować od 2. do 5. dnia po wysianiu zawiesiny komórek mononuklearnych na płytki 6-dołkowe (Rysunek 1A-B). Pierwotne hodowle MF osiągają ~ 50 - 70 % konfluencji między 7. a ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Chociaż protokół ten został opracowany wyłącznie do zastosowań badawczych, w świetle rosnącego krytycznego znaczenia komórek zrębu jako potencjalnych biomarkerów prognostycznych raka i celu terapeutycznego, możliwość zamrożenia "funkcjonalnych" próbek biologicznych do późniejszego wykorzystania oferuje znaczącą przewagę. Stanowi to unikalną zaletę dla tworzenia klinicznego repozytorium biologicznego, które może służyć jako dodatkowe narzędzia służące postępowi w rozwoju medycyny spersonalizowanej10, 11. Podobn...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez National Institute of Health (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) oraz Institute for Translational Sciences na University of Texas Medical Branch, a także Clinical and Translational Science Award (8UL1TR000071).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| MEM, 1x | Corning | MT-10-010-CV | |
| Zrównoważony roztwór soli Hanksa | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Pirogronian sodu | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy, 100x | Gibco | 15240-062 | |
| Cyprofloksacyna HCl | Corning | 61-277-RF | |
| L-Glutamina, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| MEM Aminokwasy endogenne | Corning | 25-025-CI | |
| Dimetylosulfotlenek (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Ditiotreitol roztwór (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Cellgro | 46-034-CI | |
| DNAse | Worthington | LS002139 | |
| Kolagenaza z Clostridium histolyticum, typ I | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Kolagenaza z Clostridium histolyticum, typ II | Sigma-Aldrich | C1764 | |
| Kolagenaza z Clostridium histolyticum, typ IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Roztwór do dysocjacji komórek Accumax | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| gentleMACS C Rurki | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Dysocjator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Countess Automatyczny licznik komórek | Invitrogen | C10227 | |
| Sitko do komórek (70 µ m) | Corning | 352350 | |
| PE Mysz anty-ludzka Vimentin | BD Biosciences | 562337 | klon RV202 |
| FITC Monoklonalna antyaktyna, i alfa-mięśnie gładkie | Sigma-Aldrich | F3777 | Klon 1A4 |
| Mysz APC Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 559869 | Klon 5E10 |
Bibliografia
- Yamaguchi, H., et al. Stromal Fibroblasts Mediate Extracellular Matrix Remodeling and Invasion of Scirrhous Gastric Carcinoma Cells. PLoS ONE. 9, e85485(2014).
- Mullan, N., Hughes, K. R., Mahida, Y. R. Primary Human Colonic Myofibroblasts Are Resistant to Clostridium difficile Toxin A-Induced, but Not Toxin B-Induced, Cell Death. Infect Immun. 79, 1623-1630 (2011).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal Cells of the Intestinal Lamina Propria. Annu Rev Physiol. Annu Rev Physiol . 73, 213-237 (2011).
- Latella, G., Sferra, R., Speca, S., Vetuschi, A., Gaudio, E. Can we prevent, reduce or reverse intestinal fibrosis in IBD? Eur Rev Med Pharmacol Sci. 17, 1283-1304 (2013).
- Saada, J. I., et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
- Mahida, Y. R., et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am J Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).
- Roncoroni, L., et al. Isolation and culture of fibroblasts from endoscopic duodenal biopsies of celiac patients. J Transl Med. 7 (40), (2009).
- Pinchuk, I. V., et al. Stromal Cells Induce Th17 during Helicobacter pylori Infection and in the Gastric Tumor Microenvironment. PLoS ONE. 8, e53798(2013).
- Pinchuk, I. V., et al. Monocyte chemoattractant protein-1 production by intestinal myofibroblasts in response to staphylococcal enterotoxin a: relevance to staphylococcal enterotoxigenic disease. J. Immunol. 178, 8097-8106 (2007).
- Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Sem Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
- Valcz, G., Sipos, F., Tulassay, Z., Molnar, B., Yagi, Y. Importance of carcinoma-associated fibroblast-derived proteins in clinical oncology. J. Clin. Pathol. 67, 1026-1031 (2014).
- Minonzio, G., et al. Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69, 211-216 (2014).
- Gargus, M., Niu, C., Shaker, A. Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus. J. Vis. Exp. (95), e52215(2015).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. J. Vis. Exp. (80), e50611(2013).
- Schiller, J. H., Bittner, G. Loss of the Tumorigenic Phenotype with in Vitro, but not in Vivo, Passaging of a Novel Series of Human Bronchial Epithelial Cell Lines: Possible Role of an α5/β1-Integrin-Fibronectin Interaction. Cancer Res. 55, 6215-6221 (1995).
- Augello, A., Kurth, T. B., De Bari, C. Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches. Eur Cell Mater. 20, 121-133 (2010).
- Meller, D., Pires, R. T. F., Tseng, S. C. G. Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures. Br J Ophthalmol. 86, 463-471 (2002).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19, 95-105 (1995).
- Morris, K. T., Nofchissey, R. A., Pinchuk, I. V., Beswick, E. J. Chronic Macrophage Migration Inhibitory Factor Exposure Induces Mesenchymal Epithelial Transition and Promotes Gastric and Colon Cancers. PLoS ONE. 9, e98656(2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
