Artykuł metodologiczny

Inicjowanie różnicowania w unieśmiertelnionych multipotencjalnych komórkach progenitorowych uszu

DOI:

10.3791/53692

⸱

2 stycznia 2016

 ,  ,  ,  , 
1Cell Biology & Neuroscience, Rutgers University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecne protokoły utrzymania nieśmiertelnych, multipotencjalnych komórek progenitorowych (iMOP) i różnicowania otycznego są otyczne. Zwrócono uwagę na warunki hodowli i markery molekularne, które wskazują na różnicowanie w nabłonek czuciowy i neurony zwojowe spirali (SGN).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) lub embrionalnych komórek macierzystych (ESC) do terapii zastępowania komórek jest bardzo obiecujące. Szereg ograniczeń, w tym niska wydajność i niejednorodne populacje zróżnicowanych komórek, utrudnia postęp terapii komórkami macierzystymi. Stworzono ograniczoną losem, unieśmiertelnioną, multipotencjalną linię progenitorową uszu (iMOP), aby ułatwić skuteczne różnicowanie dużej liczby funkcjonalnych komórek rzęsatych i spiralnych neuronów zwojowych (SGN) do terapii wymiany komórek ucha wewnętrznego. Wychodząc od zdysocjowanych hodowli pojedynczych komórek iMOP, opisano protokoły promujące wyjście z cyklu komórkowego i różnicowanie poprzez wycofanie podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF). Znaczny spadek komórek proliferujących po wycofaniu bFGF potwierdzono za pomocą testu proliferacji komórek EdU. Równocześnie ze spadkiem proliferacji, pomyślne różnicowanie skutkowało ekspresją markerów molekularnych i zmianami morfologicznymi. Barwienie immunologiczne Cdkn1b (p27KIP) i Cdh1 (E-kadheryna) w otosferach pochodzących z iMOP zastosowano jako wskaźnik różnicowania w nabłonek czuciowy ucha wewnętrznego, podczas gdy barwienie immunologiczne Cdkn1b i Tubb3 (neuronal β-tubulina) zastosowano do identyfikacji neuronów pochodzących z iMOP. Wykorzystanie komórek iMOP stanowi ważne narzędzie do zrozumienia decyzji dotyczących losu komórek podejmowanych przez progenitory neurosensoryczne ucha wewnętrznego i pomoże w opracowaniu protokołów generowania dużej liczby komórek rzęsatych pochodzących z iPSC lub ESC oraz SGN. Metody te przyspieszą wysiłki na rzecz generowania komórek otycznych do terapii zastępczych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Narządy ucha wewnętrznego, ślimak, łagiewka, woreczek i trzy kanały półkoliste, pośredniczą w zdolności słyszenia i utrzymywania równowagi. W ślimaku komórki rzęsate przekształcają dźwięki w sygnały elektryczne, które są przekazywane do neuronów zwojowych spirali (SGN). SGN uruchamiają potencjały czynnościowe w celu propagacji sygnałów nerwowych przez obwód słuchowy. Mutacje genetyczne, leki ototoksyczne i narażenie na głośne dźwięki przyczyniają się do śmierci komórek rzęsatych i SGN, co prowadzi do utraty słuchu1-4. Raz utracone komórki nie są zastępowane. Zastosowanie iPSC i ESC do generowania powstających komórek rzęsatych (SGN) jest bardzo obiecujące w terapiach wymiany komórek ucha wewnętrznego5-8. Ogromny postęp wykazał, że pluripotencjalne komórki macierzyste i progenitorzy pochodzący z ucha wewnętrznego mogą różnicować się w komórki rzęsate i SGN na różnych etapach dojrzałości. Zarodkowe komórki macierzyste ssaków (ESC) i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) mogą być wykorzystywane do generowania funkcjonalnych komórek rzęsatych i SGN9-11. Wykazano również, że komórki macierzyste i komórki progenitorowe pochodzące z ucha wewnętrznego ssaków tworzą komórki rzęsate i neurony o właściwościach ich komórkowych odpowiedników in vivo 12-16.

Użycie iPSC lub pochodzących z ESC komórek progenitorowych do zastąpienia utraconych komórek rzęsatych i SGN wymaga efektywnego różnicowania. Niewłaściwe różnicowanie lub ciągła proliferacja wszczepionych komórek progenitorowych pochodzących z łodygi w uchu wewnętrznym może pogorszyć funkcję ucha wewnętrznego i stwarzać ryzyko rakotwórcze, takie jak powstawanie potworniaków w uchu wewnętrznym17. Istnieje wyraźna potrzeba opracowania warunków hodowli i zrozumienia różnicowania komórek progenitorowych. Jedną ze strategii rozwoju tych metod jest podsumowanie decyzji dotyczących losu komórek podjętych przez neurosensoryczne komórki progenitorowe podczas rozwoju ucha wewnętrznego. Protokoły, które zapobiegają proliferacji i kierują komórki progenitorowe do komórek rzęsatych lub SGN, pomogą poprawić bezpieczeństwo i skuteczność terapii zastępczych.

Podczas rozwoju, ucho wewnętrzne zaczyna się od pogrubienia powierzchni ektodermy w ograniczonym obszarze między rombomerami 5 i 6, aby stać się platkodem otycznym. Gdy plakod uszny wrasta w miseczkę uszną, zbiór komórek w przedniej części miseczki usznej powoduje powstanie domeny neuronalno-sensorycznej (NSD), która zawiera prekursory komórek rzęsatych i neuronów ucha wewnętrznego18. Badania mapowania losu u myszy, kurczaków i danio pręgowanego, u których rozwija się ucho wewnętrzne, sugerują istnienie wielu populacji neurosensorycznych komórek progenitorowych, które dają początek czuciowym komórkom rzęsatym, otaczającym komórkom podporowym i neuronom otycznym19-22. Czynnik transkrypcyjny grupy o wysokiej mobilności, Sox2, został zaangażowany w specyfikację komórek czuciowych i wykorzystany jako marker dla komórek progenitorowych ucha wewnętrznego23,24. Mutacje hipomorficzne, które obniżają poziom ekspresji Sox2 w uchu wewnętrznym, powodują utratę komórek rzęsatych, komórek podporowych i SGN w ślimaku25,26.

Aby badać komórki progenitorowe otyczne poddawane decyzjom o losie komórki, wcześniej ustalono linię komórkową z ograniczonym losem, uwiecznioną multipotencjalną linię komórek progenitorowych ślimaka z ekspresją Sox2. Komórki iMOP pierwotnie pochodziły z embrionalnego ślimaka E12.5-13.5 i były zakażone retrowirusem c-Myc27. Komórki iMOP mogą stale namnażać się jako komórki tworzące kolonie, znane jako otosfery i mają zdolność różnicowania się w komórki rzęsate, komórki podporowe i SGN27. Zrozumienie zdolności komórek iMOP do różnicowania się w odrębne linie genetyczne pozwala na zastosowanie tych odkryć do efektywnego generowania komórek rzęsatych pochodzących z iPSC lub ESC oraz SGN. Skuteczne protokoły różnicowania otworzą nowe możliwości terapii zastępczej w chorobach ucha wewnętrznego, które są oporne na konwencjonalne metody leczenia. Kluczową kwestią w generowaniu komórek otycznych za pomocą hodowli komórkowej in vitro jest posiadanie markerów różnicowania, które pomagają określić, czy komórki ulegają różnicowaniu. Cdkn1b (p27 KIP) był szeroko stosowany jako wczesny marker różnicowania w rozwijającym się uchu wewnętrznym, jednak ekspresja Cdkn1b w komórkach iMOP i jego korelacja z różnicowaniem nie zostały zbadane. W pracy opisano aktualne warunki hodowli oraz sposób, w jaki ekspresja Cdkn1b koreluje z innymi markerami różnicowania iMOP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Utrzymanie samoodnawiania się w komórkach IMOP

  1. Przygotować pożywki hodowlane iMOP: DMEM/F12, 1X suplement B27, 25 μg/ml karbenecyliny i 20 ng/ml bFGF. Przygotować 50 ml pożywki hodowlanej iMOP za pomocą sterylnych odczynników. Rozgrzej 49 ml DMEM/F12 w stożkowym 50 ml w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    1. Rozmrozić 50X suplement B27 i wysterylizować 100 mg/ml podwielokrotności karbecyliny przez 5 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Rozmrozić 100 μg/ml podwielokrotności bFGF w temperaturze pokojowej. Dodać 1 ml 50X B27, 10 μl 100 μg/ml bFGF i 12,5 μl 100 mg/ml karbenecyliny do DMEM/F12.
  2. Użyć 3 ml pożywki w naczyniu do hodowli tkanek o średnicy 60 mm do hodowli komórek iMOP. Dodawaj świeże pożywki do kultur co drugi dzień, podwajając objętość pożywki. Upewnij się, że stężenie bFGF nie spadnie poniżej 5 ng/ml.
    1. Hodowla komórek iMOP w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Przejście komórek po 5 - 7 dniach w hodowli, jak podano w poniższych krokach. Przenieść kulturę do stożka o pojemności 15 ml za pomocą końcówki do pipety o pojemności 10 ml.
  3. Wykonać 1 mM EDTA w HBSS, rozcieńczając 0,1 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 w 50 ml HBSS. Wstępnie ogrzany 1 mM EDTA wykonany w HBSS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  4. Zbierać komórki przez sedymentację grawitacyjną lub odwirowanie przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. W celu sedymentacji grawitacyjnej umieścić stożkowy pojemnik o pojemności 15 ml zawierający kultury w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 5–10 minut. Po tym czasie obserwuj, jak otosfery zbierają się na dnie stożkowego 15 ml.
    UWAGA: Nadmierna siła odśrodkowa może spowodować uszkodzenie komórek.
  5. Ostrożnie odessać zużytą pożywkę za pomocą pipety aspirującej o pojemności 2 ml, nie naruszając osadu komórkowego. Dodać 0,5 ml wstępnie podgrzanego 1 mM ROZTWORU EDTA HBSS do osadu komórkowego. Za pomocą pipety P1000 delikatnie pipetować w górę i w dół 2-3 razy. Umieścić stożkowy w temperaturze 37 °C i inkubować przez <5 minut, aby ułatwić dysocjację na pojedyncze komórki.
  6. Delikatnie zamieszaj roztwór komórkowy, aby określić, czy otosfery są zdysocjowane. Jeśli żadne otosfery nie osadzają się na dnie stożka, komórki są dysocjowane. Czas inkubacji może się różnić.
    UWAGA: Długotrwała inkubacja z EDTA spowoduje nadmierną śmierć komórki.
  7. Usunąć komórki z temperatury 37 °C, dodać 2 ml pożywki w celu zneutralizowania i rozcieńczenia EDTA. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać rozcieńczony EDTA za pomocą pipety aspirującej o pojemności 2 ml i dodać 5 ml 1X PBS w celu przepłukania komórek.
  8. Odwiruj komórki w dół przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odessaj 1X PBS za pomocą pipety aspirującej 2 ml. Ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety P1000 w 0,5 ml pożywki hodowlanej iMOP, delikatnie pipetując w górę i w dół 2-3 razy.
  9. Zlicz komórki za pomocą mikroprzepływowego licznika cząstek z odpowiednimi kasetami28. Zlewająca się płytka komórek iMOP będzie zawierała ~6 X106 komórek. Rozcieńczyć komórki w stosunku 1:100 w pożywce i dodać 75 ul roztworu komórkowego do kasety w celu liczenia. Płytka 1 x 106 komórek w naczyniu o średnicy 6 cm w pożywce hodowlanej iMOP (rozcieńczenie ~1:10). Przejazd iMOP co 5 - 7 dni.
    UWAGA: Komórki, które tworzą duże otosfery lub przyczepiają się do dna naczynia do hodowli tkankowej, będą się różnicować. Komórki umrą również, jeśli kultury będą nadmiernie zlewające się.

2. Zamrażanie i rozmrażanie komórek IMOP

  1. Przygotować syntetyczne podłoże do zamrażania przez rozmrożenie i wyrównanie roztworu do temperatury 4 °C przed zamrożeniem komórek.
  2. Zbierz komórki z 6-centymetrowego naczynia z konfluentami komórek iMOP. Użyj pipety o pojemności 10 ml i przenieś komórki (~6 - 8 x 106 komórek) do stożkowego 15 ml.
  3. Zbierać komórki przez sedymentację grawitacyjną lub odwirowanie przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Jeśli otosfery są małe, komórki nie osiądą przez sedymentację grawitacyjną. Opcjonalnie: Policz komórki, korzystając z kroku 1.9, aby określić łączną liczbę komórek.
  4. Odessać zużyte podłoże za pomocą pipety aspirującej o pojemności 2 ml, pozostawiając luźne osady komórkowe.
  5. Dodać 0,25 ml syntetycznego podłoża do zamrażania, aby zawiesić komórki o gęstości ~5 x 105 do 3 x 106 komórek/ml. Delikatnie pipetować komórki za pomocą pipety P1000. Przenieść zawiesinę komórek do fiolek kriogenicznych za pomocą pipety P1000 z końcówką z filtrem o pojemności 1 ml.
  6. Umieścić fiolki w bezalkoholowym pojemniku do zamrażania i umieścić pojemnik do zamrażania w temperaturze -80 °C, aby zmniejszyć temperaturę o 1 °C na minutę, aż temperatura osiągnie -80 °C.
  7. W celu długotrwałego przechowywania komórek należy przenieść fiolki do fazy gazowej zbiornika magazynującego ciekły azot. Aby rozmrozić komórki do hodowli, należy zrównoważyć fiolkę kriogeniczną zawierającą zamrożone komórki w temperaturze -80 °C.
  8. Wstępnie ogrzej pożywkę hodowlaną iMOP w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  9. Zamrożoną fiolkę należy szybko rozmrozić, obracając dno fiolki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Dodać 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej iMOP do rozmrożonych komórek, gdy zniknie ostatni kryształek lodu. Przenieść komórki do stożkowego podłoża o pojemności 15 ml i dodać dodatkowe 4 ml pożywki hodowlanej iMOP
  10. Obracać stożek o pojemności 15 ml przez 5 minut przy 200 x g i odessać zużyte podłoże. Zawiesić komórki w 2 ml pożywki hodowlanej iMOP i komórki płytki w naczyniu o średnicy 6 cm. Inkubować kultury w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w celu ekspansji.

3. Różnicowanie komórek IMOP w nabłonek czuciowy

  1. Przygotować 50 ml pożywki do różnicowania nabłonka sensorycznego iMOP: DMEM/F12, 1X suplement B27, 25 μg/ml karbenecyliny. Przygotować 50 ml pożywki do różnicowania nabłonka czuciowego iMOP. Rozgrzej 49 ml DMEM/F12 w stożkowym 50 ml w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Rozmrozić 50 razy więcej suplementu B27 i 100 mg/ml porcji karbenecyliny przez 5 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Dodać 1 ml 50X B27 i 12,5 μl 100 mg/ml karbenecyliny do DMEM/F12.
  2. Aby zebrać, zdysocjować, ponownie zawiesić i policzyć komórki, powtórz kroki 1.4-1.9
  3. Płytka 1 x 106 komórek w naczyniu o średnicy 6 cm w dniu -3 przy użyciu pożywki hodowlanej iMOP. W dniu 0 przenieść kultury za pomocą pipety o pojemności 10 ml do stożkowego 15 ml. Zebrać otosfery przez sedymentację grawitacyjną, jak podano w kroku 1.6. Odessać zużyte podłoże za pomocą pipety aspiracyjnej o pojemności 2 ml i pozostawić otosfery na dnie stożka.
  4. Delikatnie dodać 2 ml pożywki do różnicowania nabłonka czuciowego. Przenieść otosfery do naczynia o średnicy 6 cm za pomocą pipety o dużym otworze i pojemności 10 ml.
    UWAGA: Mechaniczne ścinanie spowodowane ostrym pipetowaniem może spowodować dysocjację komórek od otosfer
    5. .
  5. Co drugi dzień dodawać 2 ml świeżej pożywki do różnicowania nabłonka sensorycznego do hodowli. W razie potrzeby komórki można pobrać przez sedymentację grawitacyjną i wymienić pożywki.
  6. Zebrać otosfery w dniu 10, przenosząc je do stożkowego o pojemności 15 ml i pozwalając otosferom na osadzenie się, jak podano w kroku 1.6. Odessać zużyte podłoże za pomocą pipety aspirującej o pojemności 2 ml i pozostawić otosfery w spokoju.
  7. Utrwal otosfery poprzez inkubację w 4% formaldehydzie w 1X PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór formaldehydu, przemyj otosfery buforem płuczącym (1X PBS zawierający 0,1% TritonX-100) przed inkubacją w buforze blokującym (1X PBS zawierający 10% normalnej surowicy koziej i 0,1% Triton X-100) przez 1 godzinę.
    1. Zastąp bufor i inkubuj próbki w buforze blokującym rozcieńczonym przeciwciałem. Inkubować w temperaturze 4 °C. Przemyć próbki 1X PBS zawierającym 0,1% Triton X-100, poddać otosferę barwieniu immunologicznemu27. Przenieś otosfery do 1X PBS i umieść otosfery w pożywkach montażowych na szkiełku podstawowym za pomocą pipety P1000. Nałożyć szkiełko nakrywkowe na próbkę i pozostawić podłoże montażowe do wyschnięcia w temperaturze 4 °C.
  8. Uzyskuj obrazy epifluorescencyjne za pomocą odwróconego mikroskopu wyposażonego w 16-bitową kamerę CCD i obiektyw zanurzeniowy z olejkiem 20X 0,75 lub 40X 1,3 NA. Zbieraj fluorescencję z różnych kanałów kolorystycznych za pomocą podanych długości fal (wzbudzenie i emisja): niebieski (377 ± 25 nm/447 ± 30 nm), zielony (475 ± 25 nm/540 ± 25 nm), czerwony (562 ± 20 nm/ i 625 ± 20 nm) oraz podczerwony (628 ± 20 nm/ i 692 ± 20 nm).

4. Testowanie Włączenie EdU

  1. W dniu -3 umieść 1 x 106 komórek iMOP w naczyniu o średnicy 6 cm. Trzy dni później, w dniu 0, zbierz, zdysocjuj, ponownie zawieś i policz komórki, powtarzając kroki 1,4-1,9.
  2. Płytka 2,5 x 105 komórek w pożywce hodowlanej iMOP i 5 x 105 komórek w pożywce różnicującej nabłonek czuciowy w różnych dołkach naczynia 6-dołkowego.
  3. Określ procent komórek w fazie S przez inkorporację EdU w dniu 3 za pomocą testu inkorporacji EdU
    1. Dodać materiał EdU bezpośrednio do kultur iMOP, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μM EdU w pożywkach hodowlanych.
    2. Inkubować EdU w kulturach iMOP przez 2 godziny i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Zbieranie, dysocjacja i zbieranie komórek Powtórz kroki 1.4-1.9. Dodaj 4% formaldehydu w 1X PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby utrwalić komórki. Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć roztwór formaldehydu i odpowiednio zutylizować.
    3. Oznaczyć jądra komórek za pomocą Hoechst i włączonego EdU zielonym barwnikiem fluorescencyjnym azydku zgodnie z protokołem producenta.
      UWAGA: Wszystkie prania są wykonywane z 1X PBS, 3% BSA i 0,1% Tween 20. Umyj komórki dwukrotnie 1X PBS.
    4. Zamontuj komórki na szkiełku za pomocą odczynnika zapobiegającego blaknięciu i umieść 1,5 szklanki nakrywkowej na próbce. Uzyskaj obrazy fluorescencyjne znakowanych komórek za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej.

5. Różnicowanie neuronów pochodzących z IMOP

  1. Przygotuj 50 ml pożywki różnicującej neurony: pożywki neuropodstawne, 1X suplement B27, 2 mM L-glutamina. Rozmrażaj butelkę z 50X B27 i 200 mM L-Glutaminą w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 5 minut. Dodaj 1 ml 50X B27 i 0,5 ml 200 mM L-Glutaminy do 48,5 ml pożywki Neurobase.
  2. Pokryj szkło nakrywkowe, umieszczając 12 mm okrągłe szkiełka nakrywkowe 1,5 szklanego na sterylnej płytce o długości 10 cm i dodaj 70% EtOH do płytki, aby wysterylizować i oczyścić szkiełka nakrywkowe.
  3. Delikatnie potrząśnij szkiełkami nakrywkowymi, aby upewnić się, że są pokryte etanolem. Pozostaw płytkę na 10 minut w temperaturze pokojowej. Opłucz szkiełka nakrywkowe 3 razy sterylnym 1X PBS, aby wypłukać pozostały etanol. Spłucz szkiełko nakrywkowe raz sterylnym H20, aby wypłukać pozostały 1X PBS.
  4. Odessać H20 za pomocą pipety zasysającej o pojemności 2 ml i pozostawić szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia. Wystawić szkiełka nakrywkowe na działanie promieniowania UV w kapturze do hodowli tkankowych przez 15 minut. Szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w sterylnym miejscu, jeśli nie zostaną natychmiast użyte.
  5. Umieścić jedno okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm w każdym dołku naczynia z 24 dołkami. Delikatnie potrząśnij talerzem, aby upewnić się, że szkiełka nakrywkowe leżą płasko na dnie studzienki.
  6. Rozmrozić 2 mg/ml roztworu podstawowego poli-D-lizyny w temperaturze pokojowej i rozcieńczyć do stężenia 10 μg/ml poli-D-lizyny w 1X PBS. Dodać 0,25 ml 10 ug/ml poli-D-lizyny do studzienek. Pozostawić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 1 godzinę.
  7. Umyj studzienki 3 razy sterylnym 1X PBS. Rozmrozić 10 mg/ml roztworu podstawowego lamininy w temperaturze pokojowej i rozcieńczyć do 10 μg/ml w 1X PBS. Dodać 0,25 ml roztworu roboczego 10 μg/ml lamininy do pojedynczego dołka w 24-dołkowym naczyniu. Inkubować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Odessać roztwór lamininy za pomocą pipety aspirującej o pojemności 2 ml.
  8. Przemyć szkiełko nakrywkowe 3 razy za pomocą 1X PBS, dodając 1 ml 1X PBS za pomocą pipety P1000 i usuwając 1X PBS przez zasysanie pipetą 2 ml. Pozostaw 1X PBS z ostatniego mycia w studzience, aż komórki będą gotowe do platerowania. Zainicjuj różnicowanie neuronów poprzez zbieranie, dysocjację i liczenie komórek w krokach 1.4-1.9.Płytka 1 x 106 komórek w 6 cm naczyniu w dniu -3.
  9. W dniu 0 zbierz, zdysocjuj i policz komórki, powtarzając 1,4-1,9. Zasiać 1 x 105 - 1,5 x 105 komórek iMOP w 0,5 ml wstępnie podgrzanej pożywki różnicującej neurony na studzienkę w naczyniu z 24 dołkami. Odsysaj i dodawaj do kultur wstępnie ogrzane pożywki różnicujące neurony co drugi dzień.
  10. Napraw neurony pochodzące z iMOP w 4% formaldehydzie przez 15 minut w RT w dniu 7. Usuń roztwór formaldehydu, przepłucz neurony pochodzące z iMOP buforem do płukania (1X PBS zawierający 0,1% TritonX-100) przed inkubacją w buforze blokującym (1X PBS zawierający 10% normalnej surowicy koziej i 0,1% Triton X-100) przez 1 godzinę.
    1. Zastąp bufor i inkubuj próbki w buforze blokującym rozcieńczonym przeciwciałem. Inkubować w temperaturze 4 °C. Przemyć próbki 1X PBS zawierającym 0,1% komórek Triton X-100 do barwienia immunologicznego27. Umyj szkło nakrywkowe 1X PBS przed umieszczeniem na nośniku montażowym. Poczekaj, aż nośnik montażowy wyschnie w temperaturze 4 °C przed uzyskaniem obrazów epifluorescencji, jak podano w kroku 3.8.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wycofanie bFGF zmniejsza proliferację w komórkach IMOP

Aby zmniejszyć zdolność proliferacyjną komórek iMOP i zainicjować różnicowanie komórek iMOP, bFGF został wycofany z hodowli. Aby potwierdzić, że wycofanie czynnika wzrostu zmniejsza proliferację, inkorporację EdU zastosowano jako test proliferacji. Porównano odsetek komórek, które zawierały EdU z otosfer hodowanych za pomocą pożywek hodowlanych iMOP (zawiera...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monitorowanie kultur IMOP

Opisano protokół utrzymania samoodnawiania się i promowania różnicowania nowej linii komórkowej iMOP oraz uwzględniono dodatkowe formaty posiewu (Tabela 1). Zwrócono uwagę na kilka krytycznych kroków, które pomagają w rutynowej ekspansji i różnicowaniu komórek iMOP. Podobnie jak hodowle pluripotencjalnych komórek macierzystych, komórki iMOP teoretycznie mają nieokreśloną długość życia. Aby zapewnić prawidłowe utrzymanie linii komórkow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca była częściowo wspierana przez Duncan and Nancy MacMillan Faculty Development Chair Endowment Fund (K.Y.K.), Busch Biomedical Research Grant (K.Y.K.) oraz Rutgers Faculty Development Grant (K.Y.K.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CoolCell LX Bezalkoholowe pojemniki do zamrażania komórekBioCisionBCS-405
(2 ml) Corning
o grubości 1,5 (okrągłe 12 mm)Nauki o mikroskopii elektronowej72230-01
DMEM/F12Life Technologies11320-082
Neurobasal MediumLife Technologies21103
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) pH 7.4Life Technologies10010-023
Hank's Zrównoważony roztwór soli (HBSS)Life Technologies14025-092
Suplement B27 (50X) Serum FreeLife Technologies17504-044Przechowywany jako 1 ml porcji
L-glutaminy (200 mM) Life Technologies25030-081Przechowywany jako 5 ml porcji
Natural Mouse LamininLife Technologies23017-015Przechowywany jako 1 mg/ml podwielokrotności
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Life TechnologiesC10337
Synth-A-Freeze Medium do krioprezerwacjiLife TechnologiesA12542-01
Prolong Gold Antifade MountantLife Technologies47743-736Przechowywany jako 10 mg / ml 100 &mikro; l alikwoty
Moxi Z Mini Automatyczny licznik komórekOrflo MXZ001
Kaseta Moxi Z Typ S Orflo MXC002
Rekombinowany mysi czynnik wzrostu fibroblastów, zasadowy (bFGF)Peprotech450-33Zawieszony w 0,1% BSA w H20 i przechowywany jako 20 mg/ml podwielokrotności
Poli-D-lizynaSigmaP7886Ponownie zawieszony w 1X PBS i przechowywany jako 10 mg / ml 100 &mikro; l podwielokrotności
Karbenicylina, sól disodowaThermo Fisher ScientificBP2648-1Zawieszony w 10 mM Hepes pH 7,4 i przechowywany jako 100 mg/ml Podwielokrotności
5 ml pipeta pakowana pojedynczo w miękkiej oprawie (200/opakowanie)Thermo Fisher Scientific1367811D
10 ml pipeta pakowana pojedynczo w miękkiej oprawie (200/opakowanie)Thermo Fisher Scientific1367811E
Płytka 24-dołkowa Biolite poddana działaniu kultur tkankowychThermo Fisher Scientific130188
Płytka 6-dołkowa Biolite poddana działaniu kultur tkankowychThermo Fisher Scientific130184 
Naczynie do hodowli tkankowej 6 cmThermo Fisher Scientific130181 
EMD Millipore Millex Sterylna strzykawka Filtr PVDF Wielkość porów: 0,22 i mu; mThermo Fisher ScientificSLGV033RS
Końcówki do pipet filtrujących TipOne 0,1 - 10 μ l wydłużona końcówka filtraUSA Scientific1120-3810
Końcówki pipet filtra TipOne 1 - 20 μ l końcówka filtraUSA Scientific1120-1810
Końcówki do pipet filtra TipOne 1 - 200 μ l  końcówka filtraUSA Scientific1120-8810
Końcówki do pipet filtracyjnych TipOne 101 - 1000 μ l końcówka filtraUSA Scientific1126-7810
15 ml probówki stożkowe sterylne 20 worków po 25 probówek (500 probówek)USA Scientific1475-0511
Probówki stożkowe 50 ml sterylne 20 worków po 25 probówek (500 probówek)USA Scientific1500-1211
Fiolki kriogeniczne Szkiełko nakrywkowe 430654

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Petit, C., Richardson, G. P. Linking genes underlying deafness to hair-bundle development and function. Nat Neurosci. 12 (6), 703-710 (2009).
  2. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after 'temporary' noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
  3. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
  4. Huth, M. E., Ricci, A. J., Cheng, A. G. Mechanisms of aminoglycoside ototoxicity and targets of hair cell protection. Int J Otolaryngol. 2011, 937861-93 (2011).
  5. Brigande, J. V., Heller, S. Quo vadis, hair cell regeneration? Nat Neurosci. 12 (6), 679-685 (2009).
  6. Groves, A. K. The challenge of hair cell regeneration. Exp Biol Med (Maywood). 235 (4), 434-446 (2010).
  7. Okano, T., Kelley, M. W. Stem cell therapy for the inner ear: recent advances and future directions. Trends Amplif. 16 (1), 4-18 (2012).
  8. Ronaghi, M., Nasr, M., Heller, S. Concise review: Inner ear stem cells--an oxymoron, but why? Stem Cells. 30 (1), 69-74 (2012).
  9. Chen, W., et al. Restoration of auditory evoked responses by human ES-cell-derived otic progenitors. Nature. 490 (7419), 278-282 (2012).
  10. Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. , (2013).
  11. Oshima, K., et al. Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell. 141 (4), 704-716 (2010).
  12. Diensthuber, M., Oshima, K., Heller, S. Stem/progenitor cells derived from the cochlear sensory epithelium give rise to spheres with distinct morphologies and features. J Assoc Res Otolaryngol. 10 (2), 173-190 (2009).
  13. Doetzlhofer, A., White, P., Lee, Y. S., Groves, A., Segil, N. Prospective identification and purification of hair cell and supporting cell progenitors from the embryonic cochlea. Brain Res. 1091 (1), 282-288 (2006).
  14. Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).
  15. Martinez-Monedero, R., Yi, E., Oshima, K., Glowatzki, E., Edge, A. S. Differentiation of inner ear stem cells to functional sensory neurons. Dev Neurobiol. 68 (5), 669-684 (2008).
  16. Oshima, K., Senn, P., Heller, S. Isolation of sphere-forming stem cells from the mouse inner ear. Methods Mol Biol. 493, 141-162 (2009).
  17. Nishimura, K., Nakagawa, T., Sakamoto, T., Ito, J. Fates of murine pluripotent stem cell-derived neural progenitors following transplantation into mouse cochleae. Cell Transplant. 21 (4), 763-771 (2012).
  18. Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a008409(2012).
  19. Jiang, H., et al. Lineage analysis of the late otocyst stage mouse inner ear by transuterine microinjection of a retroviral vector encoding alkaline phosphatase and an oligonucleotide library. PLoS One. 8 (7), e69314(2013).
  20. Sapede, D., Dyballa, S., Pujades, C. Cell lineage analysis reveals three different progenitor pools for neurosensory elements in the otic vesicle. J Neurosci. 32 (46), 16424-16434 (2012).
  21. Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132 (7), 1687-1697 (2005).
  22. Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134 (24), 4405-4415 (2007).
  23. Neves, J., Parada, C., Chamizo, M., Giraldez, F. Jagged 1 regulates the restriction of Sox2 expression in the developing chicken inner ear: a mechanism for sensory organ specification. Development. 138 (4), 735-744 (2011).
  24. Mak, A. C., Szeto, I. Y., Fritzsch, B., Cheah, K. S. Differential and overlapping expression pattern of SOX2 and SOX9 in inner ear development. Gene Expr Patterns. 9 (6), 444-453 (2009).
  25. Kiernan, A. E., et al. Sox2 is required for sensory organ development in the mammalian inner ear. Nature. 434 (7036), 1031-1035 (2005).
  26. Puligilla, C., Dabdoub, A., Brenowitz, S. D., Kelley, M. W. Sox2 induces neuronal formation in the developing mammalian cochlea. J Neurosci. 30 (2), 714-722 (2010).
  27. Kwan, K. Y., Shen, J., Corey, D. P. C-MYC transcriptionally amplifies SOX2 target genes to regulate self-renewal in multipotent otic progenitor cells. Stem Cell Reports. 4 (1), 47-60 (2015).
  28. Dittami, G. M., Sethi, M., Rabbitt, R. D., Ayliffe, H. E. Determination of mammalian cell counts, cell size and cell health using the Moxi Z mini automated cell counter. J Vis Exp. (64), (2012).
  29. Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
  30. Furue, M. K., et al. Heparin promotes the growth of human embryonic stem cells in a defined serum-free medium. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (36), 13409-13414 (2008).
  31. Lotz, S., et al. Sustained levels of FGF2 maintain undifferentiated stem cell cultures with biweekly feeding. PLoS One. 8 (2), e56289(2013).
  32. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
  33. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  34. Ruben, R. J. Development of the inner ear of the mouse: a radioautographic study of terminal mitoses. Acta Otolaryngol. , Suppl 220. 1-44 (1967).
  35. Matei, V., et al. Smaller inner ear sensory epithelia in Neurog 1 null mice are related to earlier hair cell cycle exit. Dev Dyn. 234 (3), 633-650 (2005).
  36. Lee, Y. S., Liu, F., Segil, N. A morphogenetic wave of p27Kip1 transcription directs cell cycle exit during organ of Corti development. Development. 133 (15), 2817-2826 (2006).
  37. Chen, P., Segil, N. p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti. Development. 126 (8), 1581-1590 (1999).
  38. Hasson, T., et al. Unconventional myosins in inner-ear sensory epithelia. J Cell Biol. 137 (6), 1287-1307 (1997).
  39. Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, 33(2011).
  40. Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).
  41. Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat Med. 11 (3), 271-276 (2005).
  42. Kim, W. Y., et al. NeuroD-null mice are deaf due to a severe loss of the inner ear sensory neurons during development. Development. 128 (3), 417-426 (2001).
  43. Liu, M., et al. Essential role of BETA2/NeuroD1 in development of the vestibular and auditory systems. Genes Dev. 14 (22), 2839-2854 (2000).
  44. Ma, Q., Anderson, D. J., Fritzsch, B. Neurogenin 1 null mutant ears develop fewer, morphologically normal hair cells in smaller sensory epithelia devoid of innervation. J Assoc Res Otolaryngol. 1 (2), 129-143 (2000).
  45. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
  46. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  47. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  48. Blanchard, J. W., et al. Selective conversion of fibroblasts into peripheral sensory neurons. Nat Neurosci. 18 (1), 25-35 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

R nicowanie kom rek iMOPprotok wycofania bFGFtest proliferacji kom rek EdUimmunobarwienie Cdkn1b Cdh1immunobarwienie Cdkn1b Tubb3tworzenie otosfer metod sedymentacji grawitacyjnejmedium do r nicowania neuronalnegor nicowanie nab onka sensorycznegozast powanie kom rek ucha wewn trznego

Powiązane artykuły