Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Podawanie i wykrywanie śladów białkowych na stawonogach w celu badań nad dyspersją

7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53693

⸱

28 stycznia 2016

 , 
1USDA-ARS, Arid-Land Agricultural Research Center

W tym artykule

Podsumowanie

Białka są często używane do oznaczania stawonogów do badań nad rozprzestrzenianiem się. Przedstawiono metody podawania wewnętrznych i zewnętrznych znaczników białkowych na stawonogach. Przedstawiono również techniki wykrywania znaczników białkowych, zarówno za pomocą pośrednich lub kanapkowych testów immunoenzymatycznych (ELISA).

Streszczenie

Monitorowanie ruchu stawonogów jest często wymagane dla lepszego zrozumienia powiązanej dynamiki populacji, wzorców rozprzestrzeniania się, preferencji roślin żywicielskich i innych interakcji ekologicznych. Stawonogi są zwykle śledzone w naturze poprzez oznaczanie ich unikalnym znakiem, a następnie ponowne zbieranie ich w czasie i przestrzeni, aby określić ich zdolności do rozprzestrzeniania się. Oprócz rzeczywistych znaczników fizycznych, takich jak kolorowy kurz lub farba, różne rodzaje białek okazały się bardzo skuteczne w oznaczaniu stawonogów do badań ekologicznych. Białka mogą być podawane wewnętrznie i/lub zewnętrznie. Białka można następnie wykryć na ponownie schwytanych stawonogach za pomocą specyficznego dla białka testu immunoenzymatycznego (ELISA). Tutaj opisujemy protokoły zewnętrznego i wewnętrznego znakowania stawonogów białkiem. Przedstawiono dwa proste przykłady eksperymentalne: (1) wewnętrzny znacznik białkowy wprowadzony do owada poprzez zapewnienie diety wzbogaconej w białko oraz (2) zewnętrzny znacznik białkowy nałożony miejscowo na owada za pomocą nebulizatora medycznego. Następnie przedstawiamy przewodnik krok po kroku dotyczący metod kanapkowych i pośrednich ELISA stosowanych do wykrywania śladów białkowych na owadach. W tej demonstracji omówiono różne aspekty pozyskiwania i wykrywania markerów białkowych na stawonogach w celu wychwytywania znaczników, uwalniania, wychwytywania znaczników i samowychwytywania znaczników, a także różne sposoby, w jakie procedura znakowania immunologicznego została dostosowana do szerokiej gamy celów badawczych.

Wprowadzenie

Śledzenie ruchu szkodników stawonogów, naturalnych wrogów (parazytoidów i drapieżników) oraz zapylaczy w naturze jest niezbędne do lepszego zrozumienia, jak poprawić usługi ekosystemowe. Kluczowym elementem większości rodzajów badań nad dyspersją jest posiadanie niezawodnej metody znakowania stawonogów będących przedmiotem zainteresowania. Do oznaczania stawonogów użyto różnych materiałów (np. farb, barwników, kolorowych pyłów, znaczników, rzadkich pierwiastków, białek) w celu oceny dynamiki ich populacji, zdolności dyspersyjnych, zachowań żywieniowych i innych interakcji ekologicznych1,2.

Stosowność markera użytego do danego badania rozproszenia będzie zależała od rodzaju prowadzonego badania. Istnieją trzy szerokie kategoryzacje oznaczania stawonogów: (1) znakowanie-uwalnianie-ponowne przechwytywanie (MRR), (2) znakowanie-przechwytywanie i (3) samodzielne przechwytywanie znaków. W przypadku badań typu mark-release-recapture, badacz zazwyczaj oznacza stawonogi zbiorczo w laboratorium i wypuszcza je w centralnym punkcie pola. Stawonogi są następnie ponownie chwytane w różnych odstępach przestrzennych i czasowych za pomocą różnych urządzeń do zbierania (np. siatki do zamiatania, odkurzacza, pułapki lepkiej)3,4,5. Ponownie schwytane okazy są następnie badane pod kątem specyficznego znaku, aby odróżnić wypuszczone od rodzimych osobników. W przypadku badań nad wychwytywaniem znaczników badacz zwykle nanosi znak bezpośrednio w terenie za pomocą sprzętu do opryskiwania (np. opryskiwacza plecakowego, opryskiwacza polowego i dyszowego). Najlepsze markery do badań nad wychwytywaniem znaków są niedrogie i łatwe do zastosowania w siedlisku stawonoga. W przypadku badań nad samodzielnym schwytaniem znaków, badacz zwykle umieszcza znaki na przynęcie stawonogów6,7 lub wejściu do gniazda8. Z kolei stawonóg zaznacza się wewnętrznie, pożerając oznaczoną przynętę lub zewnętrznie, "ocierając się" o znak, gdy wychodzi z gniazda.

Jak wspomniano powyżej, wiele rodzajów znaczników zostało użytych do oznaczania różnych gatunków stawonogówów. Jednak bardzo niewiele z nich jest użytecznych dla wszystkich trzech kategorii badań nad rozproszeniem. Opracowanie procedury znakowania immunologicznego białek było dużym przełomem w znakowaniu owadów. Znakowanie immunologiczne umieszcza etykietę białkową na stawonogach wewnętrznie lub zewnętrznie, która z kolei jest wykrywana przez test immunoenzymatyczny swoisty dla przeciwciał (ELISA). Pierwszymi tego typu markerami białkowymi były immunoglobulina królika (IgG) i IgG/IgY kurczaka9,10. Okazały się one bardzo skutecznymi znakami do badań MRR i self-marker-capture (patrz dyskusja). Niestety, białka IgG/IgY są kosztowne i dlatego nie są praktyczne w badaniach nad wychwytywaniem znaczników i większości rodzajów badań nad samowychwytywaniem znaczników. Następnie opracowano testy ELISA drugiej generacji do wykrywania białek dla białek zawartych w białkach jaj kurzych (albumina), mleku krowim (kazeina) i mleku sojowym (białko inhibitora trypsyny). Każdy test jest bardzo czuły, specyficzny i, co najważniejsze, wykorzystuje białka, które są znacznie tańsze niż białka IgG/IgY11. Białka te okazały się skuteczne w badaniach MRR, wychwytywania znaczników i samowychwytywania znaczników (patrz dyskusja).

W tym artykule opisujemy i pokazujemy, jak przeprowadzić badania laboratoryjne nad retencją śladów białkowych. Takie badania są pierwszą fazą badań potrzebnych do każdego rodzaju badań dyspersji w terenie. W szczególności bardzo ważne jest, aby badacze wiedzieli, jak długo ślad zostanie zachowany na docelowych gatunkach stawonogów przed rozpoczęciem badań terenowych. W tym miejscu opisujemy i pokazujemy, jak wewnętrznie i zewnętrznie znakować owady do badań terenowych MRR, mark-capture i self-mark-capture. Następnie pokazujemy, jak wykrywać obecność znaków za pomocą pośrednich i warstwowych testów ELISA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Procedura znakowania wewnętrznego, retencji i detekcji

  1. Procedura znakowania wewnętrznego
    1. Zebrać interesujące owady (n ≈ 100 osobników) z kolonii laboratoryjnej hodowanej na pożywce sztucznej lub z terenu i podzielić je na dwa czyste pojemniki hodowlane.
    2. Do jednego z pojemników włożyć standardową porcję pożywki 20 ml (nieznakowana kontrola negatywna). Drugą porcję pożywki sztucznej 20 ml uzupełnić 1,0 ml roztworu IgG/IgY z kurczaka o stężeniu 1,0 mg/ml, dokładnie wymieszać i umieścić w drugim pojemniku.
      Uwaga: Jeśli dla badanego owada nie ma dostępnej pożywki sztucznej, znacznik można umieścić na dowolnej pożywce, na której owady te są zazwyczaj utrzymywane (np. fasola szparagowa, jaja ciem, woda, cukier, miód).
    3. Pozostawić owady do wznowienia żerowania na 24 hr.
  2. Procedura sprawdzania retencji znacznika wewnętrznego
    1. Usunąć porcje pożywki z każdego pojemnika i dostarczyć owadom inne źródło pokarmu w celu ich utrzymania przez czas trwania eksperymentu (np. fasolę szparagową).
    2. Codziennie (lub w dowolnym wybranym odstępie czasu) pobierać kohortę (n = 20) owadów z każdej grupy badawczej i natychmiast zamrażać w temperaturze -20 °C.
  3. Procedura testu Sandwich ELISA
    1. Do każdego dołka czystej mikropłytki ELISA dodać 50 µl króliczego przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko kurczemu IgY, rozcieńczonego 1:500 w buforze TBS (Tris buffered saline), i inkubować przez co najmniej 1 hr w temperaturze pokojowej (RT) (uwaga: mikropłytki można inkubować również przez noc O/N w temperaturze 4 °C).
    2. Odlać przeciwciała z płytki i zablokować każdy dołek 300 µl 1,0% roztworu odtłuszczonego mleka w proszku przez 30 min.
    3. W oczekiwaniu na zakończenie poprzednich etapów inkubacji, umieścić zamrożone owady pojedynczo w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,6 ml z 1,0 ml buforu TBS.
    4. Rozetrzeć każdego owada czystym tłuczkiem do pełnej homogenizacji i dodać 100 µl każdej próbki do oddzielnego dołka płytki ELISA. Inkubować próbki w RT przez 1 hr.
    5. Do dołków w pierwszej kolumnie każdej płytki ELISA dodać 100 µl kontroli negatywnej (sam TBS) i pozytywnej (białka jaj w TBS). Dodać również 100 µl kontroli negatywnych z owadów (owady nieznakowane) do 8 dołków w ostatniej kolumnie każdej płytki (Figure 1). Inkubować próbki kontrolne w RT przez 1 hr. Należy pamiętać, że schemat przedstawiony na Figure 1 jest szablonem stosowanym w naszych ustandaryzowanych testach. Rozmieszczenie próbek w dołkach pozostaje do uznania badacza.
    6. Przemyć każdy dołek trzy razy roztworem PBS-tween (phosphate buffered saline-tween), a następnie dodać 50 µl króliczych przeciwciał przeciwko kurczemu IgG/IgY sprzężonych z peroksydazą chrzanową, rozcieńczonych 1:10 000 w 1% roztworze mleka, i inkubować przez 1 hr w RT.
    7. Przemyć każdy dołek trzy razy roztworem PBS-tween i dodać 50 µl substratu TMB (tetrametylobenzydyn) do każdego dołka.
    8. Po 10 min odczytać wartości z dołków za pomocą spektrofotometru do mikropłytek ustawionego na długość fali 650 nm.

Układ mikropłytki dla testu ELISA; próbki, kontrole; analiza danych, ocena wyników immunoanalizy.
Rycina 1. Schemat obrazujący zestandaryzowane oznaczenia dołków stosowane w typowej mikropłytce ELISA z 96 dołkami. Każda płytka zawiera 7 dołków przeznaczonych na kontrole negatywne w soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS), jeden dołek przeznaczony na pozytywną kontrolę białkową (Pos Ctrl), 80 oddzielnych dołków przeznaczonych na odłowione owady (Sample 1…80) oraz 8 dołków przeznaczonych na nieoznaczone (negatywne) kontrole owadów (Neg Ctrl 1…8). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

2. Procedura znakowania zewnętrznego, odłowu i detekcji

  1. Procedura znakowania zewnętrznego
    1. Zebrać interesujące owady (n ≈ 100 osobników) z kolonii laboratoryjnej lub z terenu i umieścić w dwóch plastikowych pojemnikach o pojemności 1,0 L z otworem o średnicy 2,5 cm wykonanym w bocznej ściance każdego pojemnika.
    2. Owady w pierwszym pojemniku spryskać 1,0 ml dH2O (próba kontrolna ujemna) za pomocą nebulizatora medycznego. Owady w drugim pojemniku spryskać 1,0 ml 5,0% roztworu białek jaja kurzego za pomocą nebulizatora medycznego.
    3. Podłączyć wąż nebulizatora do standardowego laboratoryjnego wylotu powietrza, a następnie włożyć wylot nebulizatora do otworu o średnicy 2,5 cm w pojemniku. Następnie stopniowo otwierać dopływ powietrza, aż nebulizator zacznie wytwarzać mgiełkę.
    4. Kontynuować rozpylanie (znakowanie), aż roztwór białek jaj zostanie całkowicie zużyty (ok. 2-5 min).
    5. Usunąć nebulizator i zatkać otwór w plastikowym pojemniku korkiem. Pozostawić owady w RT, aż roztwór całkowicie wyschnie.
  2. Procedura badania trwałości znaku zewnętrznego
    1. Każdą grupę wysuszonych owadów przenieść do osobnego, czystego pojemnika hodowlanego, aby uniknąć dalszej ekspozycji na znacznik.
    2. Do czystych pojemników dodać pokarm i wodę, aby utrzymać owady przy życiu przez cały czas trwania badania.
    3. Codziennie pobierać kohortę (n = 20) owadów z każdej grupy i natychmiast zamrozić w temperaturze -20 °C.
  3. Procedura pośredniego testu ELISA
    1. Zamrożone owady umieścić pojedynczo w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,6 ml i dodać 1,0 ml TBS.
    2. Inkubować próbki przez 1 h na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 120 rpm.
    3. Dodać kontrole ujemne i dodatnie zgodnie z opisem w kroku 1.3.5.
    4. Po inkubacji nanieść pipetą alikwot 100 µl z każdej próbki do jednego z 80 wyznaczonych do próbek dołków na nowej płytce ELISA z 96 dołkami, jak pokazano na Ryc. 1. Inkubować próbki przez 1 h w RT (uwaga: mikropłytki można również inkubować O/N w temperaturze 4 °C).
    5. Przemyć dołki trzykrotnie roztworem PBS-tween, a następnie dodać do każdego dołka 300 µl fosforanu buforu soli z dodatkiem 1% albuminy surowicy bydlęcej (PBS-BSA).
    6. Po 30 min w RT przemyć dwukrotnie roztworem PBS-tween.
    7. Do każdego dołka dodać 50 µl przeciwciał pierwszorzędowych królika przeciwko albuminie jaja, rozcieńczonych 1:8 000 w PBS-BSA-Silwet (0,05%), i inkubować przez 1 h w RT.
    8. Przemyć każdy dołek trzykrotnie roztworem PBS-tween, a następnie dodać 50 µl przeciwciał kozich przeciwko IgG królika sprzężonych z peroksydazą chrzanową, rozcieńczonych 1:2 000 w PBS-BSA-Silwet (0,05%), i inkubować przez 1 h w RT.
    9. Przemyć każdy dołek trzykrotnie roztworem PBS-tween i dodać do każdego dołka 50 µl substratu TMB.
    10. Po 10 min odczytać wartości w dołkach za pomocą spektrofotometru do mikropłytek ustawionego na długość fali 650 nm.

3. Analiza danych

  1. Oblicz średnią wartość absorbancji dla 8 owadów z kontroli negatywnej na każdej płytce ELISA, a następnie oblicz odchylenie standardowe na podstawie połączonych kontrol negatywnych ze wszystkich płytek ELISA w danym badaniu12.
  2. Do średniej uzyskanej dla każdej płytki ELISA dodaj sześciokrotność połączonego odchylenia standardowego, aby wyznaczyć wartość progu dodatniego testu ELISA. Każda próbka owada, dla której wartość absorbancji jest równa lub wyższa od tej wartości, zostaje uznana za dodatnią pod kątem obecności markera białkowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Markowanie wewnętrzne:

Wyniki testu retencji markerów wewnętrznych przedstawiono na Rysunku 2A. Obliczona krytyczna wartość progu dla testu ELISA wyniosła 0,054. Ogólnie (dla wszystkich czterech dat poboru prób łącznie), owady traktowane bez dodatku białka wykazywały konsekwentnie niskie wartości ELISA (x̄ = 0,038 ± 0,002, n = 80). Z kolei wszystkie owady karmione dietą wzbogaconą w bia...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Procedura immunoznakowania białek stawonogów została opisana po raz pierwszy prawie ćwierć wieku temu9. Od tego czasu procedura ta została dostosowana do badania wzorców dyspersji szerokiej gamy stawonogów przy użyciu IgG/IgY podawanych zarówno wewnętrznie, jak i zewnętrznie. Białka te okazały się niezawodnymi markerami dla wielu badanych dotychczas gatunków owadów. Jednakże, jak wspomniano powyżej, głównym ograniczeniem w stosowaniu IgG/IgY jest ich wysoka cena. W konsekwencji IgG/IgY są użyteczne jedynie w b...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wzmianki o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych w tej publikacji służą wyłącznie dostarczeniu konkretnych informacji i nie oznaczają rekomendacji ani poparcia ze strony Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych. USDA jest dostawcą równych szans i pracodawcą.

Podziękowania

Finansowanie zostało zapewnione przez USDA CRIS 5347-22620-021-00D oraz, częściowo, przez Inicjatywę Badań nad Rolnictwem i Żywnością Competitive Grant nr 2011-67009-30141 z Narodowego Instytutu Żywności i Rolnictwa USDA. Jesteśmy wdzięczni za wsparcie techniczne Johanny Nassif. Dziękujemy również Paulowi Bakerowi, Davidowi Hortonowi, Diego Nieto i Frances Sivakoff za udostępnienie niektórych zdjęć użytych na rysunku 3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pojemnik do przechowywania żywności (do hodowli owadów)Rubbermaid/TupperwareRóżne rozmiaryRóżni producenci i sprzedawcy. Tkanina siatkowa jest przyklejona w oknie
Nebulizator o małej objętości (Micro Mist)Teleflex-Hudson RCI1881Dostępny online oraz w sklepach z artykułami medycznymi. Inne marki też się sprawdzą.
Probówki do mikrowirówek, 1,6 ml z nakrętkąContinental Lab Products4445.XKażdy podobny typ będzie działał. Preferujemy marki, które mają łatwe do otwarcia pokrywy.
Styropianowy pojemnik na probówki do mikrowirówek (siatka 5x20)RPI Corp.145746Ten projekt jest fajny, ponieważ nie zapycha rur.
Dozownik, repeaterEppendorf4982000322Coś podobnego pomoże przyspieszyć dozowanie.
Tłuczki, plastikowe jednorazowe młynki do chusteczek, 1,5 mlKimble Chase749521-1500Dostępne u różnych dostawców. Tłuczki można czyścić i sterylizować w autoklawie w celu ponownego użycia.
Płytki BD Falcon ELISA, 96-dołkowe (płaskie dno)Pipeta BD351172
Ovation, ręczna (20-200 &mikro; l)VistaLab1057-0200 lub 1070-0200Każdy podobny typ będzie działał. Ten model jest ergonomiczny.
Zbiorniki, sterylny odczynnikVistaLab4054-1000Wszystko podobne zadziała.
Pipeta elektroniczna, 8-kanałowa (50-1 200 &mikro; l) (Biohit eLine)Sartorius730391Gdybyś miał wybrać jeden model elektroniczny, ten rozmiar jest najbardziej przydatny.
Pipeta elektroniczna, 8-kanałowa (10-300 i mikro; l) (Biohit eLine)Sartorius730361Wszystko podobne zadziała.
Wielodołkowa podkładka płytkowa (8-pozycyjna, prosta)Sigma-AldrichZ369802 Wszystko podobne będzie działać w przypadku ręcznego mycia płyt.
Czytnik mikropłytek z detekcją absorbancjiUrządzenia molekularneSpectraMax 250Wszystko podobne będzie działać.
Kurczak IgG/IgYStany Zjednoczone BiologicznyI1903-15RDostępne również z innych źródeł
Białka jajSklep spożywczy" Wszyscy biali", " Trzepaczki do jajek", etc.Wymieszaj 5 ml z 95 ml dH2O, aby uzyskać 5% roztwór
Tris (Trizma Base)Sigma-AldrichT15032,42 g/L, aby uzyskać TBS
Chlorek sodu (NaCl)Sigma-AldrichS988829,22 g/L, aby uzyskać TBS i 8,0  g⁠/⁠ L dla PBS
Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4)Sigma-AldrichS08761,14 g/L dla PBS
Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)Sigma-AldrichP56550,2 g/L dla PBS
Chlorek potasu (KCl)Sigma-AldrichP95410,2 g/L dla PBS
Tween 20, Klasa EIASigma-AldrichP1379Dodać 0,5 ml na L do PBS po rozpuszczeniu soli.
PBS z 1% BSASigma-AldrichP3688Mix 1 opakowanie w 1 L dH2O
przeciwciało anty-kurze IgY (IgG) (cała cząsteczka) wytwarzane u królika (1:500)Sigma-AldrichC6409Mix 100 µ l w 50 ml TBS
Mleko w proszku, mleko w proszku lub świeże (1%)SklepWymieszaj 10 g z 1 l dH2O, aby uzyskać 1% roztwór
Przeciwciało anty-IgY (IgG) (cała cząsteczka)-peroksydaza kurczaka wytwarzane u królika (1:10 000)Sigma-AldrichA9046Mix 100 µ l w 1 l 1% mleka
Przeciwciało anty-albuminowe jaja kurzego wytwarzane u królika (1:8 000)Sigma-AldrichC6534Rozcieńczony 125 &mikro; l w 1 l PBS-BSA
Kozia koniugatat anty-króliczej peroksydazy IgG (1:2,000)Sigma-AldrichA6154Rozcieńczyć 0,5 ml w 1 l PBS-BSA, następnie dodać 1,3  ml Silwet
Vac-In-Stuff (Silwet L-77) kopolimer krzemowo-polieterowyLehle SeedsVIS-01Dodaj jako ostatni składnik
TMB Microwell Jednoskładnikowy substrat peroksydazySurModicsTMBW-1000-01
spożywczy

Bibliografia

  1. Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: Current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
  2. Lavandero, B. I., Wratten, S. E., Hagler, J. R., Jervis, M. A. The need for effective marking and tracking techniques for monitoring the movements of insect predators and parasitoids. Int. J. Pest Manage. 50 (3), 147-151 (2004).
  3. Hagler, J. R., Jackson, C. G., Henneberry, T. J., Gould, J. Parasitoid mark-release-recapture techniques: II. Development and application of a protein marking technique for Eretmocerus spp., parasitoids of Bemisia argentifolii. Biocontrol Sci. Techn. 12 (6), 661-675 (2002).
  4. Blackmer, J. L., Hagler, J. R., Simmons, G. S., Henneberry, T. J. Dispersal of Homalodisca vitripennis (Homoptera: Cicadellidae) from a point release site in citrus. Environ. Entomol. 35 (6), 1617-1625 (2006).
  5. Swezey, S. L., Nieto, D. J., Hagler, J. R., Pickett, C. H., Bryer, J. A., Machtley, S. A. Dispersion, distribution and movement of Lygus.spp. (Hemiptera: Miridae) in trap-cropped strawberries. Environ. Entomol. 42 (4), 770-778 (2013).
  6. Hagler, J. R., Baker, P. B., Marchosky, R., Machtley, S. A., Bellamy, D. E. Methods to mark termites with protein for mark-release-recapture and mark-capture studies. Insect. Soc. 56 (2), 213-220 (2009).
  7. Baker, P. B., et al. Utilizing rabbit immunoglobulin G protein for mark-capture studies on the desert subterranean termite, Heterotermes aureus (Synder). Insect. Soc. 57 (2), 147-155 (2010).
  8. Hagler, J. R., Mueller, S., Teuber, L. R., Machtley, S. A., Van Deynze, A. Foraging range of honey bees, Apis mellifera, in alfalfa seed production fields. J. Insect Sci. 11 (1), 1-12 (2011).
  9. Hagler, J. R., Cohen, A. C., Bradley-Dunlop, D., Enriquez, F. J. A new approach to mark insects for feeding and dispersal studies. Environ. Entomol. 21 (1), 20-25 (1992).
  10. Hagler, J. R. Field retention of a novel mark-release-recapture method. Environ. Entomol. 26 (5), 1079-1086 (1997).
  11. Jones, V. P., Hagler, J. R., Brunner, J., Baker, C., Wilburn, T. An inexpensive immunomarking technique for studying movement patterns of naturally occurring insect populations. Environ. Entomol. 35 (4), 827-836 (2006).
  12. Sivakoff, F. S., Rosenheim, J. A., Hagler, J. R. Threshold choice and the analysis of protein marking data in long-distance dispersal studies. Methods Ecol. Evol. 2 (1), 77-85 (2011).
  13. Hagler, J. R., Jackson, C. G. An immunomarking technique for labeling minute parasitoids. Environ. Entomol. 27 (4), 1010-1016 (1998).
  14. Janke, J., et al. Serological marking of Pnigalio agraules (Hymenoptera: Eulophidae) for field dispersal studies. J. Pest Sci. 82 (1), 47-53 (2009).
  15. DeGrandi-Hoffman, G., Hagler, J. R. The flow of incoming nectar through a honey bee (Apis mellifera L.) colony as revealed by a protein marker. Insect. Soc. 47 (4), 302-306 (2000).
  16. Peck, S. L., McQuate, G. T. Ecological aspects of Bactrocera latifrons (Diptera: Tephritidae) on Maui, Hawaii: Movement and host preference. Environ. Entomol. 33 (6), 1722-1731 (2004).
  17. Hagler, J. R., Durand, C. M. A new method for immunologically marking prey and its use in predation studies. Entomophaga. 39 (3), 257-265 (1994).
  18. Hagler, J. R. An immunological approach to quantify consumption of protein-tagged Lygus hesperus by the entire cotton predator assemblage. Biol. Control. 58 (3), 337-345 (2011).
  19. Fournier, V., Hagler, J. R., Daane, K., de Leòn, J., Groves, R. Identifying the predator complex of Homalodisca vitripennis (Hemiptera: Cicadellidae): A comparative study of the efficacy of an ELISA and PCR gut content assay. Oecologia. 157 (4), 629-640 (2008).
  20. Hagler, J. R. Development of an immunological technique for identifying multiple predator--prey interactions in a complex arthropod assemblage. Ann. Appl. Biol. 149 (2), 153-165 (2006).
  21. Mansfield, S., Hagler, J. R., Whitehouse, M. A comparative study of the efficiency of a pest-specific and prey-marking ELISA for detection of predation. Entomol. Exp. Appl. 127 (3), 199-206 (2008).
  22. Buczkowski, G., Wang, C., Bennett, G. Immunomarking reveals food flow and feeding relationships in the eastern subterranean termite, Reticulitermes flavipes (Kollar). Environ. Entomol. 36 (1), 173-182 (2007).
  23. Lundgren, J. G., Saska, P., Honĕk, A. Molecular approach to describing a seed-based food web: The post-dispersal granivore community of an invasive plant. Ecol. Evol. 3 (6), 1642-1652 (2013).
  24. Kelly, J. L., Hagler, J. R., Kaplan, I. Semiochemical lures reduce emigration and enhance pest control services in open-field augmentation. Biol. Control. 71, 70-77 (2014).
  25. Zilnik, G., Hagler, J. R. An immunological approach to distinguish arthropod viviphagy from necrophagy. BioControl. 58 (6), 807-814 (2013).
  26. Irvin, N. A., Hagler, J. R., Hoddle, M. S. Laboratory investigation of triple marking the parasitoid, Gonatocerus ashmeadi (Hymenoptera: Mymaridae) with a fluorescent dye and two animal proteins. Entomol. Exp. App. 143 (1), 1-12 (2011).
  27. Hagler, J. R., Mueller, S., Teuber, L. R., Van Deynze, A., Martin, J. A method for distinctly marking honey bees, Apis mellifera, originating from multiple apiary locations. J. Insect Sci. 11 (143), 1-14 (2011).
  28. Peck, G. W., Ferguson, H. J., Jones, V. P., O'Neal, S. D., Walsh, D. B. Use of a highly sensitive immunomarking system to characterize face fly (Diptera: Muscidae) dispersal from cow pats. Environ. Entomol. 43 (1), 116-122 (2014).
  29. Boina, D. R., Meyer, W. L., Onagbola, E. O., Stelinski, L. L. Quantifying dispersal of Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) by immunomarking and potential impact of unmanaged groves on commercial citrus management. Environ. Entomol. 38 (4), 1250-1258 (2009).
  30. Lewis-Rosenblum, H., Tawari, X. M. S., Stelinski, L. L. Seasonal movement patterns and long-range dispersal of Asian citrus phyllid in Florida citrus. J. Econ. Entomol. 108 (1), 3-10 (2015).
  31. Krugner, R., Hagler, J. R., Groves, R. L., Sisterson, M. S., Morse, J. G., Johnson, M. W. Plant water stress effects on the net dispersal rate of the insect vector, Homalodisca vitripennis (Germar) (Hemiptera: Cicadellidae), and movement of its egg parasitoid, Gonatocerus ashmeadi Girault (Hymenoptera: Mymaridae). Environ. Entomol. 41 (6), 1279-1289 (2012).
  32. Klick, J., et al. Distribution and activity of Drosophila suzukii in cultivated raspberry and surrounding vegetation. Entomol. Exp. App. , (2015).
  33. Basoalto, K., Miranda, M., Knight, A. L., Fuentes-Contreras, E. Landscape analysis of adult codling moth (Lepidoptera: Tortricidae) distribution and dispersal within typical agroecosystems dominated by apple production in Central Chile. Environ. Entomol. 39 (5), 1399-1408 (2010).
  34. Horton, D. R., Jones, V. P., Unruh, T. R. Use of a new immunomarking method to assess movement by generalist predators between a cover crop and tree canopy in a pear orchard. Amer. Entomol. 55 (1), 49-56 (2009).
  35. Swezey, S. L., Nieto, D. J., Pickett, C. H., Hagler, J. R., Bryer, J. A., Machtley, S. A. Spatial density and movement of the Lygus spp. parasitoid Peristenus relictus (Hymenoptera: Braconidae) in organic strawberries with alfalfa trap crops. Environ. Entomol. 43 (2), 363-369 (2014).
  36. Sivakoff, F. S., Rosenheim, J. A., Hagler, J. R. Relative dispersal ability of a key agricultural pest and its predators in an annual agroecosystem. Biol. Control. 63 (3), 296-303 (2012).
  37. Slosky, L. M., Hoffmann, E. J., Hagler, J. R. A comparative study of the retention and lethality of the first and second generation arthropod protein markers. Entomol. Exp. App. 144 (2), 165-171 (2012).
  38. Hagler, J. R., Machtley, S. A., Blackmer, F. A potential contamination error associated with insect protein mark-capture data. Entomol. Exp. App. 154 (1), 28-34 (2015).
  39. Hagler, J. R., Jones, V. P. A protein-based approach to mark arthropods for mark-capture type research. Entomol. Exp. App. 135 (2), 177-192 (2010).
  40. Hagler, J. R., Naranjo, S. E., Machtley, S. A., Blackmer, F. Development of a standardized protein immunomarking protocol for insect mark-capture dispersal research. J. Appl. Entomol. 138 (10), 772-782 (2014).
  41. Hagler, J. R. Variation in the efficacy of several predator gut content immunoassays. Biol. Control. 12 (1), 25-32 (1998).
  42. Clark, M. F., Adams, A. N. Characteristics of microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 34 (3), 475-483 (1977).
  43. Crowther, J. R. The ELISA guidebook. , Humana Press. Totowa, NJ. (2001).
  44. Stimmann, M. W. Marking insects with rubidium: Imported cabbageworm marked in the field. Environ. Entomol. 3 (2), 327-328 (1974).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Znakowanie bia ekrozprzestrzenianie owad wdetekcja ELISAznakowanie wewn trzneznakowanie zewn trzneIgY kurzychbia ko jajawarstwowy test ELISApo redni test ELISAnebulizator medyczny
Podawanie i wykrywanie śladów białkowych na stawonogach w celu badań nad dyspersją
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.