Kwantyfikacja w wysokiej rozdzielczości akumulacji krystalicznej celulozy w korzeniach rzodkiewnika w celu monitorowania specyficznych tkankowo modyfikacji ściany komórkowej

Summary

Krystaliczna celuloza jest ważnym składnikiem ściany komórkowej roślin. Jednak jego kwantyfikacja w rozdzielczości komórkowej jest technicznie trudna. W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie technologii światła spolaryzowanego i przekrojów korzeniowych w celu uzyskania informacji o składzie ściany komórkowej w rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Abstract

Komórki roślinne są otoczone ścianą komórkową, której skład decyduje o ich ostatecznym rozmiarze i kształcie. Ściana komórkowa składa się ze złożonej matrycy zawierającej polisacharydy, które obejmują mikrofibryle celulozy, które tworzą zarówno struktury krystaliczne, jak i łańcuchy celulozowe o organizacji amorficznej. Orientacja włókien celulozowych i ich stężenia dyktują właściwości mechaniczne ogniwa. Do określania poziomów celulozy krystalicznej stosuje się kilka metod, z których każda ma zarówno zalety, jak i ograniczenia. Niektórzy potrafią rozróżnić proporcje regionów krystalicznych w całkowitej celulozie. Są one jednak ograniczone do analiz całych narządów, w których brakuje informacji czasoprzestrzennych. Inne, opierające się na obrazowaniu na żywo, są ograniczone przez użycie nieprecyzyjnych barwników. W tym miejscu przedstawiamy czuły system oparty na spolaryzowanym świetle do specyficznej kwantyfikacji względnego opóźnienia światła, reprezentujący akumulację krystalicznej celulozy w przekrojach korzeni Arabidopsis thaliana. W tej metodzie zachowana jest rozdzielczość komórkowa i dane anatomiczne, co umożliwia bezpośrednie porównania między różnymi tkankami tworzącymi rosnący korzeń. Podejście to otwiera nowy wymiar analityczny, rzucając światło na związek między składem ściany komórkowej, zachowaniem komórek i wzrostem całych narządów.

Introduction

Roślinna ściana komórkowa jest dynamiczną strukturą. Rosnące komórki są otoczone pierwotną ścianą komórkową, której organizacja umożliwia ekspansję komórek. Komórki, które przestają rosnąć, pozostawiają sztywniejszą ścianę wtórną, która zwiększa mechaniczne podparcie rośliny. Obie ściany komórkowe składają się z mikrowłókien celulozy osadzonych w matrycy polisacharydów o różnych strukturach (np. hemicelulozie i pektynie), które różnią się w zależności od etapu rozwoju i tkanek^1,2. Celuloza jest syntetyzowana jako łańcuchy (1,4)-β-D-glukanu, które są ściśle ustawione, tworząc mikrofibrylę struktury krystalicznej. Celuloza amorficzna odnosi się do regionów, w których łańcuchy glukanu są mniej uporządkowane. Stosunek między domenami krystalicznymi i amorficznymi jest jednym z parametrów, o których uważa się, że wpływają na właściwości mechaniczne ściany komórkowej, zapewniając odpowiednio wytrzymałość mechaniczną i charakterystykę lepkosprężystości³. Opracowano kilka metod wykrywania i ilościowego określania dwóch form ułożenia celulozy, wśród nich dyfrakcja promieniowania rentgenowskiego i polaryzacja krzyżowa/magiczny kąt wirowania ciała stałego NMR⁴. Dyfrakcję promieniowania rentgenowskiego można wykorzystać do określenia proporcji krystalicznych i amorficznych domen celulozy w próbce⁵. Alternatywna metoda wykorzystuje frakcjonowanie zawartości ściany komórkowej na materiał nierozpuszczalny w kwasach i rozpuszczalny w kwasach, w celu rozróżnienia odpowiednio celulozy krystalicznej i amorficznej lub innych polimerów. W tym podejściu włączenie znakowanej glukozy ([¹⁴C] glukozy) stosuje się do ilościowego określenia celulozy^6,7. Metody te wymagają w najlepszym razie dużych ilości materiału roślinnego do analiz całych narządów, a zatem są niewystarczająco wrażliwe na specyficzne dla tkanek zmiany w strukturze ściany komórkowej. Wizualizację mikrowłókien celulozy w rozdzielczości komórkowej można uzyskać w badaniach obrazowania na żywo w połączeniu z barwnikami fluorescencyjnymi^8,9, które mogą zidentyfikować zmiany w orientacji mikrowłókien celulozy. Jednak barwniki te nie są używane do oznaczania ilościowego, nie są specyficzne dla celulozy krystalicznej i mogą zakłócać normalną strukturę ściany komórkowej⁸. Polscope to technika obrazowania, która opiera się na zdolności celulozy krystalicznej do rozszczepiania wiązek światła i opóźniania części światła¹⁰. Opóźnienie światła jest najsilniejsze w przypadku mikrofibryli, które leżą prostopadle do kierunku rozchodzenia się światła. W przypadku mikrowłókien o podobnej orientacji, im wyższy stopień krystaliczności, tym większa unieruchomienie światła¹¹. W związku z tym polscope jest używany do badania zarówno względnych poziomów, jak i orientacji mikrowłókien celulozy.

Korzenie wykazują liniowy wzrost, podczas którego komórki pochodzące z niszy komórek macierzystych, na końcu korzenia, przechodzą serię podziałów komórkowych, zanim gwałtownie się rozrosną¹². Komórki tworzące korzeń rozszerzają się w sposób jednokierunkowy (anizotropowy), zgodnie z dyktatem małocząsteczkowych hormonów sygnalizacyjnych, które wpływają na właściwości ściany komórkowej¹³. Zróżnicowane reakcje na hormony, w czasie i przestrzeni, dostarczają środków do zapewnienia zrównoważonego wzrostu^narządów14. W związku z tym analiza struktury ściany komórkowej w wysokiej rozdzielczości może dostarczyć ważnych informacji niezbędnych do lepszego zrozumienia związku między specyficznymi dla typu komórek reakcjami na wzrost całego narządu. W niniejszym artykule przedstawiamy implementację polscope do badania specyficznej tkankowo akumulacji celulozy krystalicznej w korzeniach rzodkiewnika, obserwowanej w wysokiej jakości przekrojach anatomicznych. Metoda ta ujawniła niedawno specyficzną dla typu komórki akumulację krystalicznej celulozy w odpowiedzi na przestrzenne zaburzenia aktywności hormonalnej¹⁵.

Protocol

1. Wzrost roślin

1. Sterylizuj nasiona powierzchniowo.
   1. Sterylizuj nasiona (do 30 mg) metodą mokrą lub suchą. Na przykład, w przypadku metody sterylizacji na sucho, dodać 1 ml lodowatego HCl 37% w 50 ml wybielacza, w szklanej zlewce w zamkniętym eksykatorze przez co najmniej 4 godziny i do nocy. Wykonaj ten krok w okapie chemicznym.
2. Rozłóż sterylne nasiona na talerzach z 0,8% agarem roślinnym w 0,5x pożywce Murashige & Skoog (MS). Owiń talerze Parafilm lub porowatą taśmą i przykryj folią aluminiową.
3. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C przez 1 - 4 dni, aby zapewnić równomierne kiełkowanie.
4. Przenieś płytki do komory wzrostowej odpowiedniej do uprawy sadzonek Arabidopsis. Umieść płytki pionowo, aby utrzymać wzrost korzeni na wierzchu podłoża agarowego i zapobiec penetracji.
5. Przenieś sadzonki do utrwalacza 7 dni po wykiełkowaniu (DAG).

2. Fiksacja

1. Przygotować 50 ml roztworu Richardsona, łącząc równe objętości 1% boraksu (czynnika buforowego), 1% błękitu metylenowego i 1% lazuru (barwniki histologiczne) w podwójnie destylowanej wodzie. Przed użyciem przefiltrować przez napędzany strzykawką filtr PVDF 0,22 μm.
2. Przygotować 50 ml utrwalacza: 1,25% aldehydu glutarowego w 0,05 M kakodylan sodu (środek buforujący).
   Uwaga: Materiały te są toksyczne i należy się z nimi obchodzić w kapturze chemicznym.
3. Dodać 100 μl roztworu Richardsona (patrz 2.1) do roztworu utrwalającego (patrz 2.2) w celu uzyskania końcowego roztworu utrwalającego.
4. Oznacz każde zagłębienie na płytce 6-dołkowej odpowiednią nazwą próbki.
5. Umieścić 2-3 ml końcowego roztworu utrwalającego (patrz 2.3) w studzienkach, tak aby sadzonki po przeniesieniu były całkowicie pokryte płynem.
6. Ostrożnie przenieś za pomocą kleszczy do 10 sadzonek do każdej studzienki. Uszczelnij płytki za pomocą Parafilm. Przechowywać w temperaturze 4 °C, w ciemności, przez co najmniej jedną noc, do tygodnia.

3. Odwodnienie

1. Odwodnić sadzonki. Przenieś je między studzienkami nowych 6-dołkowych płytek, zawierających rosnące stężenia etanolu, jak podano tutaj: 10% etanol przez 15 minut; 30% etanolu przez 15 min; 50% etanolu przez 15 min; 70% etanolu przez 15 min; 85% etanolu przez 15 min; 95% etanolu przez 15 min; 95% etanolu w temperaturze 4 °C, przez noc, minimum. Z sadzonkami należy obchodzić się, ostrożnie chwytając je za liścienie, najlepiej za pomocą plastikowych kleszczy.

4. Infiltracja

1. Przygotować podłoże infiltracyjne. Wymieszaj zawartość 1 torebki aktywatora zestawu historesin z 50 ml płynnego zestawu żywicy podstawowej w małej szklanej butelce. Mieszaj z magnesem przez 20 minut. Pożywkę infiltracyjną można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.
2. Oznaczyć każdą studzienkę nowej płytki 6-dołkowej odpowiednią nazwą próbki i napełnić 2-3 ml pożywki infiltracyjnej.
3. Przenieś sadzonki z 95% roztworu etanolu do podłoża infiltracyjnego za pomocą kleszczy. Upewnij się, że sadzonki są całkowicie pokryte podłożem.
4. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 4 dni, aby zapewnić maksymalną penetrację tkanek roślinnych.

5. Przygotowanie bloku

1. Umieść małe etykiety, oznaczone ołówkiem z nazwą próbki, w każdym dołku form do zatapiania.
2. Przygotować pożywkę do zatapiania, dodając 1 ml utwardzacza do 15 ml pożywki infiltracyjnej (patrz 4.1). Nie próbuj przygotowywać objętości mniejszej niż 15 ml, aby uniknąć problemów z polimeryzacją.
3. Wypełnij połowę każdej studzienki w formie 200 μl podłoża do zatapiania i przykryj kawałkiem folii przyciętym do kształtu formy, ale do rozmiaru o 1 mm większego z każdej strony. Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 2 godziny, aby umożliwić polimeryzację. Nie przekraczać 5 godzin.
4. Przygotować dodatkową porcję podłoża do zatapiania (patrz ppkt 5.2) i przechowywać na lodzie, aby uniknąć polimeryzacji podczas układania wierzchołków korzeni w formie.
5. Odetnij każdą końcówkę korzenia pod lunetą preparacyjną za pomocą skalpela i bardzo ostrożnie ustaw ją: pionowo dla przekrojów poprzecznych lub poziomo dla przekroju wzdłużnego, w odległości około 2 - 3 mm od obrzeża formy. Całkowicie napełnij formę roztworem blokującym i przykryj folią nad głową. Należy pamiętać, że roztwór blokujący nieznacznie się skurczy po polimeryzacji.
6. Przechowywać w temperaturze pokojowej przez co najmniej 2 godziny.
7. Aby wysuszyć bloki, umieść je w pudełku z suchym żelem krzemionkowym i pozostaw co najmniej na noc w temperaturze pokojowej.

6. Podział na sekcje

1. Przygotuj szklane noże ze szklanych prętów za pomocą nożownika. Użyj szklanych noży do cięcia tkanek. Pokrój szklany pręt w kwadrat, a następnie przetnij kwadrat po przekątnej, aby uzyskać dwa noże, za pomocą diamentowego narzędzia do nacinania.
2. Cięcie bloków na plastry o szerokości 2 - 3 μm za pomocą maszyny do cięcia. Umieść plastry na szkiełku podstawowym na kropelkach wody destylowanej i umieść szkiełko na bloku grzewczym ustawionym na małe ciepło (50 - 60 °C), aż woda odparuje.

7. Przygotowanie preparatu do mikroskopu polaryzacyjnego

1. Rozcieńczyć roztwór Richardsona (patrz 2.1) do 0,2% pierwotnego roztworu i użyć 1 ml do przykrycia plastrów. Umieść na bloku grzewczym na 5 sekund, a następnie umyj wodą destylowaną.
2. Wysuszyć szkiełko na gorącej płycie. Obserwuj pod lunetą sekcyjną i zaznacz tył szkiełka markerem, aby wskazać położenie interesujących nas wycinków, aby ułatwić ich późniejszą identyfikację pod mikroskopem.
3. Dodać 100 μl podłoża montażowego i przykryć szkiełkiem nakrywkowym.

8. Akwizycja obrazu

1. Zakryte szkiełko zawierające sekcje korzeniowe należy umieścić pod mikroskopem świetlnym wyposażonym w system Polscope odpowiedni do uzyskiwania informacji o opóźnieniu oraz polaryzator/interferencyjny filtr optyczny (Rysunek 1 A-D).
2. Wybierz powiększenie, które umożliwia wyraźną wizualizację całej próbki (np. 40X w tym badaniu) i ustaw ostrość mikroskop na pustym polu, które zawiera przekrój bloku, ale nie ma przekroju głównego. Spróbuj znaleźć czysty obszar bez skaz. Użyj tego regionu, aby ustawić tło.
3. Ustaw parametry systemu obrazowania i oprogramowania: Ustaw zakres na 17 nm. Zastosuj "Automatyczną ekspozycję" i uzyskaj obraz tła z pustego pola (patrz 8.2). W każdym eksperymencie używany jest jeden obraz tła.

9. Analiza Polscope orientacji mikrofibryli celulozy

1. Analiza przekrojów podłużnych.
   1. Umieścić szkiełko zawierające przekroje podłużne pod mikroskopem i uzyskać jego obraz opóźnienia. Ustaw ostroskop na interesującym Cię wycinku korzenia. Podaj nową nazwę pliku.
   2. Przechwyć obraz abrio (obraz z informacją o opóźnieniu) przez okno "Live Abrio". Pamiętaj, aby uchwycić przekrój zawierający ścianę komórkową, którą można zidentyfikować po barwionej celulozie biegnącej wzdłuż obwodu komórki, jak pokazano na rysunku 2C.
2. Analiza obrazu.
   1. Kliknij dwukrotnie odpowiedni obraz w stosie obrazów. Wybierz "Orientacja Pseudo kolor" w zakładce "Ustawienia wyświetlania".
   2. Aby oszacować kąt mikrofibryli celulozy, dopasuj odpowiedni odcień ściany komórkowej do odcienia na kole kolorów.
      UWAGA: Koło kolorów na rysunku 2C odbija powolną oś światła leżącą wzdłuż mikrofibryli, która wskazuje kierunek wzdłuż długiej osi mikrofibryli. Kąt mikrowłókien celulozowych to kąt wskazywany przez kolor i długą oś komórki. Na przykład wydłużająca się komórka we wstawce ma kolor niebieskozielony, nachylony o około 90° do długiej osi komórek.
   3. Aby określić ilościowo średni kąt mikrofibrylowy w ścianie komórkowej, użyj narzędzia "Opóźnienie i znacznik azymutu" z paska narzędzi oprogramowania. Wybierając narzędzie, wskaż i kliknij obszar zainteresowania w uzyskanym obrazie.
      UWAGA: Spowoduje to wyświetlenie kątów (azymutu) w stopniach (Rysunek 2C).
   4. W alternatywnym oprogramowaniu do analizy obrazu w świetle spolaryzowanym o otwartym dostępie, wtyczkę "Pol-Analyzer" z menu wtyczek. W nowo otwartym oknie wybierz zakładkę "Birefringence" i otwórz, a następnie zapisz plik tła i plik obrazu.
   5. W oknie obrazu wybierz "Specyfikacje" i dostosuj "Rozmiar piksela ROI" (użyj 5 pikseli w tym badaniu). W oknie "Specyfikacje" wybierz opcję "pokaż wartości w tabeli wyników".
   6. Użyj narzędzia Wielokąt, aby oznaczyć obszar zainteresowania w oknie obrazu. Wybierz "Linie orientacyjne", aby uzyskać orientację mikrofibrylu celulozy.
      UWAGA: Spowoduje to wyświetlenie kątów (azymutu) w stopniach.
      UWAGA: Średni kąt obliczony jedną z dwóch metod należy następnie znormalizować do położenia sekcji głównej wzdłuż suwaka. Aby skorygować odchylenie od poziomego położenia całego odcinka korzenia wzdłuż szkiełka, określ ilościowo średni kąt mikrofibrylowy ściany komórkowej flankującej komórkę wzdłuż jej długiej osi (tj. prostopadłej do przekroju i wzdłuż osi wzrostu korzenia, rysunek 2C). Kąt ten wynosi 180°, gdy sekcja korzeniowa jest dokładnie ustawiona wzdłuż suwaka. Aby obliczyć kąt mikrofibryli, odejmij średni zmierzony kąt mikrofibrylowy flankującej ściany komórkowej od 180°. Dodaj uzyskaną różnicę do średniego zmierzonego kąta mikrofibryli ściany komórkowej, która leży płasko na szkiełku.

10. Analiza Polscope akumulacji celulozy krystalicznej

1. Użyj przekrojów poprzecznych (poprzecznych). Należy zauważyć, że akumulację celulozy krystalicznej można porównać między komórkami tylko wtedy, gdy ich mikrofibryle celulozy są ustawione pod podobnym kątem (jak określono w 9).
2. Kliknij dwukrotnie odpowiedni obraz w stosie obrazów. Wybierz "Pseudo kolor" w zakładce "Ustawienia wyświetlania".
3. Do pomiaru opóźnienia. Powiększ obraz. Wybierz "Region" i zaznacz wszystkie regiony zainteresowania. Przejdź do zakładki "pomiary" i "Kopiuj do schowka" wszystkie wartości.
   1. Przenieś dane do Excela i wyodrębnij wymagane informacje (średni obszar opóźnienia). Normalizacja danych.
      UWAGA: Aby uwzględnić różnice w grubości między plasterkami, należy wyrazić wartości względem określonej krawędzi ściany komórkowej na slajdzie. Aby znormalizować, podziel średnią opóźnienie odpowiadającą ścianie komórkowej będącej przedmiotem zainteresowania przez średnią opóźnienie innej ściany komórkowej na tym samym obrazie. Na przykład zewnętrzna ściana komórkowa naskórka została znormalizowana do wewnętrznej ściany komórkowej kory mózgowej w naszym badaniu.
4. Powtórz pomiary dla co najmniej 3 odcinków na korzeń, przy czym co najmniej 3 pierwiastki na próbkę.

Results

Badamy wpływ specyficznych dla typu komórek odpowiedzi na brasinosteroidy (BRs), używając korzenia Arabidopsis jako wzorcowego narządu^15-17. Kiedy receptor BR BRI1 jest skierowany, w tle mutanta bri1, do podzbioru komórek naskórka zwanych komórkami niewłosymi (ryc. 2A, B), hamuje jednokierunkową ekspansję komórek sąsiednich komórek i wzrost całych korzeni¹⁵. Przeprowadzono analizę Polscope, aby ujawnić mechanizm leżący u podstaw teg...

Discussion

W tym miejscu przedstawiono metodę oznaczania akumulacji celulozy krystalicznej w różnych tkankach tworzących korzenie rzodkiewnika , przy zachowaniu informacji anatomicznej. W związku z tym stanowi on dodatkowy krok w kierunku zrozumienia procesów wzrostu roślin w rozdzielczości komórkowej. Metoda ta może być również stosowana do badania dodatkowych gatunków roślin i organów.

Podczas stosowania tej metody należy wziąć pod uwagę kilka punktów. Po pierwsze, akumulacja celulozy krystali...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Murashige & Skoog (MS)	Duchefa	M0221
Boraks	LOBA CHEMIE	6038
Błękit metylenowy	Sigma	M-9140
Filtr
	MILLEX-GV
Aldehyd glutarowy	EMS	16220
Kakodylan sodu	Sigma	C-0250
Zestaw Leica historesin	Leica	7022 18 500
formy do zatapiania	Agar Scientific	AGG3530
film 100 µ P.P.C.			folia górna
Nożyce	LKB	7800
Ultratome III	LKB	8800	Ultratome
Shandon immumount	Mikroskop średnioświetlny z montażem	Thermo	9990402
	Nikon	Eclipse 80i
Abrio System obrazowania	CRI	Abrio Oprogramowanie
Abrio V2.2 Oprogramowanie		CRI	Abrio V2.2
Oprogramowanie do analizy obrazu w świetle spolaryzowanym z otwartym dostępem	OPS	OpenPolScope	http://www.openpolscope.org/