Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In Situ Charakterystyka uwodnionych białek w wodzie za pomocą SALVI i ToF-SIMS

7.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53708

⸱

15 lutego 2016

 ,  ,  ,  , 
1Fundamental & Computational Sciences Directorate, Pacific Northwest National Laboratory, 2Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ta praca przedstawia protokół postępowania z cieczą i wprowadzania próbki do mikrokanału do analizy in situ spektrometrii mas jonów wtórnych biomolekuł białkowych w roztworze wodnym w czasie przelotu.

Streszczenie

Ta praca demonstruje charakterystykę in situ biomolekuł białkowych w roztworze wodnym przy użyciu Systemu do Analizy na Granicy Faz Cieczy Próżni (SALVI) i spektrometrii mas jonów wtórnych (ToF-SIMS) w czasie przelotu. Film białkowy fibronektyny został unieruchomiony na membranie z azotku krzemu (SiN), która tworzy obszar wykrywania Salvi. Podczas analizy ToF-SIMS przeprowadzono trzy tryby analizy, w tym spektrometrię mas o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, obrazowanie dwuwymiarowe (2D) i profilowanie głębokości. Widma masowe uzyskano zarówno w trybie dodatnim, jak i ujemnym. Woda dejonizowana była również analizowana jako próbka referencyjna. Nasze wyniki pokazują, że film fibronektyny w wodzie ma wyraźniejsze i silniejsze piki klastrów wodnych w porównaniu z samą wodą. Charakterystyczne piki fragmentów aminokwasów można również zaobserwować w widmach uwodnionego białka ToF-SIMS. Wyniki te pokazują, że adsorpcja cząsteczek białek na powierzchni może być po raz pierwszy badana dynamicznie przy użyciu SALVI i ToF-SIMS w środowisku ciekłym.

Wprowadzenie

Nawodnienie jest kluczowe dla struktury,1 konformacji,2i aktywności biologicznej3 białek. Białka bez otaczających je cząsteczek wody nie miałyby żywotnej aktywności biologicznej. W szczególności cząsteczki wody oddziałują z powierzchnią i wewnętrzną strukturą białek, a różne stany uwodnienia białek sprawiają, że takie interakcje są różne. 4 Interakcja białek z powierzchniami stałymi jest podstawowym zjawiskiem, które ma implikacje w nanotechnologii, biomateriałach i procesach inżynierii tkankowej. Badania od dawna wskazują, że zmiany konformacyjne mogą wystąpić, gdy białko napotyka powierzchnię. ToF-SIMS został przewidziany jako technika, która ma potencjał do badania granicy faz białko-ciało stałe. 5-7 Ważne jest, aby zrozumieć hydratację białek na powierzchniach ciał stałych, co potencjalnie zapewnia fundamentalne zrozumienie mechanizmu ich struktury, budowy i aktywności biologicznej.

Jednak główne techniki analizy powierzchni są w większości oparte na próżni i bezpośrednie zastosowania do badań cieczy lotnych są trudne ze względu na szybkie parowanie lotnej cieczy w środowisku próżniowym. Opracowaliśmy kompatybilny z próżnią interfejs mikroprzepływowy, System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI), aby umożliwić bezpośrednie obserwacje powierzchni cieczy i oddziaływań ciecz-ciało stałe przy użyciu spektrometrii mas jonów wtórnych w czasie przelotu (ToF-SIMS). 8-11 Unikalne aspekty obejmują: 1) okno detekcji to otwór o średnicy 2-3 μm, umożliwiający bezpośrednie obrazowanie powierzchni cieczy, 2) napięcie powierzchniowe służy do utrzymywania cieczy w otworze oraz 3) SALVI jest przenośny między wieloma platformami analitycznymi. Pytania z dnia 11,12

SALVI składa się z membrany z azotku krzemu (SiN) jako obszaru detekcji i mikrokanału wykonanego z polidimetylosiloksanu (PDMS). Jest wytwarzany w czystym pomieszczeniu, a produkcja i kluczowe czynniki projektowe zostały szczegółowo opisane w poprzednich dokumentach i patentach. 8-12 Zastosowania ToF-SIMS jako narzędzia analitycznego zademonstrowano przy użyciu różnych roztworów wodnych i złożonych mieszanin cieczy, z których niektóre zawierały nanocząstki. 13-17 W szczególności płynny ToF-SIMS SALVI umożliwia dynamiczne sondowanie granicy faz ciecz-ciało stałe żywych układów biologicznych (tj. biofilmów), pojedynczych komórek i granicy faz ciało stałe-elektrolit, otwierając nowe możliwości badań fazy skondensowanej in situ, w tym cieczy, przy użyciu ToF-SIMS. Jednak obecna konstrukcja nie pozwala jeszcze na interakcje gaz-ciecz. To jest kierunek rozwoju na przyszłość. SALVI został po raz pierwszy wykorzystany do zbadania uwodnionego filmu białkowego w tej pracy.

Fibronektyna to powszechnie stosowany dimer białkowy, składający się z dwóch prawie identycznych monomerów połączonych parą wiązań dwusiarczkowych,18 który jest dobrze znany ze swojej zdolności do wiązania komórek. 19,20 Wybrano go jako system modelowy, aby zilustrować, że uwodniony film białkowy może być dynamicznie badany przy użyciu płynnego podejścia SALVI ToF-SIMS. Roztwór białkowy wprowadzono do mikrokanału. Po inkubacji przez 12 godzin, na tylnej stronie błony SiN utworzył się uwodniony film białkowy. Woda dejonizowana (DI) była używana do wypłukania kanału po wprowadzeniu białka. Informacje zebrano z uwodnionych cząsteczek białka fibronektyny w mikrokanaliku SALVI przy użyciu dynamicznego ToF-SIMS. Woda DI była również badana jako kontrola w celu porównania z wynikami uzyskanymi z uwodnionej cienkiej warstwy fibronektyny. Zaobserwowano wyraźne różnice między uwodnionym filmem białkowym a wodą demineralizowaną. Prace te pokazują, że adsorpcję białek na powierzchni w środowisku ciekłym można badać przy użyciu nowatorskiego podejścia SALVI i ciekłego ToF-SIMS. Protokół wideo ma na celu dostarczenie wskazówek technicznych dla osób, które są zainteresowane wykorzystaniem tego nowego narzędzia analitycznego do różnych zastosowań SALVI z ToF-SIMS i zredukowanie niepotrzebnych błędów w obsłudze cieczy, a także akwizycji i analizie danych ToF-SIMS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Czyszczenie i sterylizacja mikrokanału SALVI

  1. Sterylizacja mikrokanalików w SALVI
    1. Pobrać 2 ml wodnego roztworu 70% etanolu do strzykawki, połączyć strzykawkę z końcówką wlotową SALVI i powoli wstrzyknąć 1 ml płynu w ciągu 10 minut. Wyjąć strzykawkę po zakończeniu wstrzyknięcia. Następnie podłącz wlot i wylot SALVI za pomocą złącza z polieteroeteroketonu (PEEK). Alternatywnie użyj pompy strzykawkowej, aby przeprowadzić tę samą procedurę. Na przykład ustaw prędkość przepływu na 100 μl/min.
    2. Utrzymuj mikrokanał SALVI wypełniony 70% roztworem etanolu w temperaturze pokojowej przez 4 godziny.
  2. Wprowadź wodę dejonizowaną (DI) do SALVI
    1. Pobrać 2 ml wysterylizowanej wody demineralizowanej do strzykawki, połączyć strzykawkę z wlotem SALVI i powoli wstrzyknąć 1 ml płynu w ciągu 10 minut. Wyjąć strzykawkę i podłączyć wlot i wylot SALVI za pomocą złączki PEEK. Alternatywnie można użyć pompy strzykawkowej, jak wspomniano w kroku 1.1.1.

2. Unieruchomienie filmu białkowego w SALVI

  1. Unieruchomienie filmu białkowego w SALVI
    1. Pobrać 2 ml roztworu fibronektyny (10 μg/ml w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem, PBS) do strzykawki, połączyć strzykawkę z wlotem SALVI, powoli wstrzyknąć 1 ml płynu w ciągu 10 minut, wyjąć strzykawkę i połączyć wlot i wylot SALVI za pomocą złączki PEEK.
    2. Inkubować SALVI wypełniony roztworem fibronektyny w czystym naczyniu hodowlanym, trzymać naczynie w okapie w temperaturze pokojowej przez 12 godzin.
    3. Pobrać 2 ml wysterylizowanej wody demineralizowanej do strzykawki i połączyć strzykawkę z wlotem leku SALVI. Powoli wstrzyknąć 1 ml wody w ciągu 10 minut, wyjąć strzykawkę i podłączyć wlot i wylot SALVI.
      Uwaga: Jeśli jest wyposażony w mikroskop świetlny, sprawdź SALVI pod mikroskopem, aby upewnić się, że membrana SiN jest nienaruszona przed analizą ToF-SIMS. Teraz urządzenie SALVI jest gotowe do analizy ToF-SIMS.

3. Zainstaluj SALVI w komorze ToF-SIMS Loadlock

Uwaga: Rękawice powinny być noszone przez cały czas podczas obsługi urządzenia SALVI i instalowania go na scenie ToF-SIMS, aby uniknąć potencjalnych zanieczyszczeń podczas analizy powierzchni.

  1. Zamontuj SALVI na scenie
    1. Połóż stolik ToF-SIMS na płaskiej i czystej powierzchni. Umieść urządzenie SALVI na stoliku z płytką krzemową i membraną SiN skierowanymi do góry. Zamocuj SALVI za pomocą czterech metalowych clampelementy i wkręć metalowe elementy przytrzymujące róg urządzenia w metalową płytkę za pomocą czterech.
    2. Delikatnie zwiń rurkę PFTE podłączoną do kanału mikroprzepływowego. Użyj czterech metalowych elementów i czterech, aby przytrzymać sztywną część. Upewnij się, że urządzenie jest umieszczone na otwartej przestrzeni na stoliku SIMS, tak aby nie zakłócało pierwotnej wiązki jonów podczas analizy. Dodatkowe zdjęcia i ilustracje przedstawiające produkcję i instalację SALVI są dostępne w poprzednich publikacjach. 8,9,11
  2. Zamontuj Puchar Faradaya na scenie
    1. Zamocuj kubek Faradaya na scenie za pomocą.
  3. Załaduj stolik do komory ToF-SIMS Loadlock
    1. Otwórz zamek ładunkowy ToF-SIMS, przytrzymaj i ustaw stolik poziomo na platformie załadowczej, a następnie zamknij drzwi blokady ładunku.

4. Akwizycja danych ToF-SIMS

  1. Włączyć pompę próżniową i upewnić się, że w komorze loadlock zostanie osiągnięte odpowiednie podciśnienie (np. rzędu 10-6 mbar lub Torr).
  2. Przenieś SALVI do komory głównej, gdy próżnia ustabilizuje się po około 30 minutach.
    Uwaga: Podciśnienie powinno być niższe niż podciśnienie 5 x 10-6 mbar w komorze głównej podczas zbierania danych. W przeciwnym razie wyższe podciśnienie wskazuje na nieszczelność w systemie Salvi.
  3. Dostosuj pierwotną wiązkę jonów i analizator ToF-SIMS z rozdzielczością przestrzenną około 400 nm zgodnie z zaleceniami producenta. Prąd wiązki pierwotnej wynosi 1 200 pA, a czas cyklu wynosi 30 μs w trybie DC.
    Uwaga: Ten proces jest w dużej mierze zgodny z zaleceniami producenta.
  4. Znajdź kanał mikroprzepływowy za pomocą mikroskopu optycznego. Użyj optycznego centrum obrazu jako odniesienia i wyrównaj je tak, aby było spójne z wtórnym środkiem obrazu jonów.
  5. Przed każdym pomiarem należy użyć wiązki 1 KeV O2+ (~40 nA) do skanowania w oknie SiN z obszarem 500 x 500μm2 przez ~15 sekund w celu usunięcia zanieczyszczeń powierzchniowych. Użyj również pistoletu do powodzi elektronowej, aby skompensować ładunek powierzchniowy podczas wszystkich pomiarów. Na tym etapie użyj automatycznej funkcji pistoletu powodziowego w trybie domyślnym.
  6. Wybierz tryb dodatni lub ujemny przed pobraniem danych. Użyj wiązki 25 keV Bi3+ jako głównej wiązki jonów we wszystkich pomiarach.
    Uwaga: Kroki są podobne dla dodatnich i ujemnych przyrostów danych. Ze względu na interes przestrzeni tryb dodatni jest szczegółowo opisany tutaj.
    1. Profilowanie głębokości
      1. Zeskanuj wiązkę Bi3+ na okrągłym obszarze o średnicy ~2 μm z rozdzielczością 32 pikseli na 32 piksele.
      2. Aby zminimalizować czas potrzebny do przebicia membrany SiN, należy użyć wiązki Bi3+ o dużej szerokości impulsu (tj. 180 nsec, prąd wiązki ~1,0 pA w czasie cyklu 100 μs). Intensywność jonów wtórnych reprezentatywnych dla powierzchni cieczy wzrasta po osiągnięciu przebicia. Czas przebijania waha się od 300 s do 500 s, w zależności od partii membrany SiN.
        Uwaga: Różnica ta wydaje się być związana z partią membran SiN nabytych zgodnie z naszym doświadczeniem. Jednak czas przebijania tak naprawdę nie ma wpływu na analizę danych.
      3. Po przebiciu membrany SiN utrzymuj ten sam prąd przez około 200 sekund, aby uzyskać wystarczające dane do rekonstrukcji obrazu 2D.
      4. Zmniejsz szerokość impulsu do 80 ns w celu zbierania danych w celu uzyskania widm z lepszą rozdzielczością masy. Kontynuuj tę akwizycję przez około 200 sekund. Dane widma pokazane na rysunku 1 pochodzą z tego obszaru.
    2. Obrazowanie 2D i widma masowe
      1. Zbieraj obrazowanie 2D i dane widm masowych w tym samym czasie podczas pomiaru danych profilowania głębokości. Instrument ToF-SIMS zapisuje wszystkie informacje o każdym miejscu podczas eksperymentu. Dane są wyświetlane w różnych oknach (FPanel - Spectra, FPanel - Profile i FPanel - Obrazy osobno) cyfrowego oprogramowania sterującego. Rozsądnie sprawdzaj dane w każdym panelu podczas pozyskiwania danych.

5. Analiza danych ToF-SIMS

Uwaga: Analiza danych jest początkowo wykonywana za pomocą instrumentalnego oprogramowania IonToF ToF-SIMS.

  1. Otwórz oprogramowanie analityczne SIMS (Measurement Explorer), a następnie kliknij odpowiednio przyciski "profiles", "widma" i "obraz", aby przetworzyć profil głębokości, widmo m/z i dane obrazu.
  2. Otwórz pliki danych z rozszerzeniem ".ita".
  3. Wybierz interesujące nas szczyty, wpisz nazwę gatunku w polu "jon" i oznacz je różnymi kolorami w widmach. Użyj kółka przewijania myszy, aby przeciągnąć wzdłuż osi x. Użyj Ctrl i kółka przewijania, aby dostosować wysokości i szerokości szczytów. Litera "L" przełącza między trybami liniowym i logarytmicznym wzdłuż osi y.
  4. Przeprowadź rekonstrukcję danych przed wzorcowaniem masy. W przeciwnym razie trudno jest wybrać odstępy między pikami na etapie wzorcowania masy.
    1. Wybierz interesujące Cię dane profilowania głębokości i zrekonstruuj widma zgodnie z szeregami czasowymi profilu głębokości.
    2. Kliknij przycisk rekonstrukcji. W oknie "Rozpocznij rekonstrukcję" wpisz interesujący Cię zakres skanowania. Kliknij "OK", aby zrekonstruować dane profilu głębokości.
  5. Wykonaj wzorcowanie masy. Naciśnij "F3", aby otworzyć okno "kalibracja masy". Wybierz piki do kalibracji na podstawie konkretnej próbki. 21 W tej pracy należy zastosować następujące piki: CH3+ (m/z 15), H3O+ (m/z 19), C2H5+ (m/z 29), H5O2+ (m/z 37), C3H7+ (m/z 43), H7O3+ (m/z 55), H9O4+ (m/z 71), H11O5+ (m/z 99) i H13O6+ (M/Z 109) dla trybu dodatniego. Dla trybu ujemnego należy użyć następujących pików: CH- (m/z 13), O- (m/z 16), OH- (m/z 17),C2H- (m/z 25), C3H- (m/z 37) i C4H- (m/z 49).
    1. Wybierz szczyt, upewnij się, że strzałka w dół jest skierowana na szczyt w lewym dolnym rogu okna. Kliknij ten pik i wpisz nazwę piku w oknie "kalibracja masy", kliknij "Dodaj", a interesujący nas jon zostanie uwzględniony w kalibracji masy.
    2. Na koniec kliknij przycisk "Skalibruj ponownie". Sprawdź, czy obszary pików znajdują się we właściwych miejscach zgodnie z ich stosunkiem masy do ładunku. W menu "Widmo" wybierz i kliknij "Zastosuj kalibrację masy" do "Wszystkie widma" lub "Wybrane widma", w zależności od przeprowadzanej analizy.
  6. Ponieważ do analizy próbki konieczna jest selekcja pików, należy określić charakterystyczne piki próbki zgodnie z literaturą lub innymi wcześniejszymi ustaleniami. Porównaj intensywność interesujących nas pików w widmach m/z. W razie potrzeby dodaj nowe szczyty lub usuń bezużyteczne szczyty z listy szczytów.
    1. Dodaj szczyty. Kliknij szczyt, znajdź czerwone linie w lewym dolnym oknie. Przytrzymaj "Ctrl", przewiń mysz w poziomie, aby zdefiniować szerokość szczytu, co automatycznie dodaje szczyt do listy szczytów. Innym sposobem dodania piku jest wybranie piku w głównym oknie widma, a następnie kliknięcie przycisku "dodaj szczyt" nad oknem. Jeśli jest wiele szczytów do dodania, w menu "Widmo" wybierz "szukaj szczytów", sprawdź powiązane specyfikacje w nowo otwartym oknie, a następnie dodaj piki w razie potrzeby.
    2. Aby wyeksportować listę szczytów, w menu "Lista szczytów" wybierz "Zapisz..." listę szczytów w formacie "itmil". Użyj Ctrl i lewego przycisku, aby przeciągnąć wzdłuż spektrum. W oknie widm wybierz interesujący Cię pik i przeciągnij dwie linie przerywane w żądane miejsca.
    3. Aby zaimportować listę szczytów, w menu "Lista interwałów masowych" wybierz "Importuj...", zlokalizuj istniejący plik z listą szczytów o rozszerzeniu ". ITPL". Kliknij "Otwórz".
    4. Aby użyć listy szczytów "itmil", w menu "Lista interwałów masowych" kliknij "Otwórz...", znajdź plik, a następnie kliknij "Otwórz".
  7. Stosowanie listy wartości szczytowych w celu dalszej analizy danych. W lewym dolnym rogu okna "Spectra" znajduje się okno o nazwie "Lista interwałów masowych". Zaimportowana lista szczytów jest wyświetlana tutaj.
    1. Kliknij prawym przyciskiem myszy plik z listą pików, który ma być używany, zastosuj go do "aktywnego spektrum" lub "wszystkich widm".
  8. Wyświetlanie profilów danych. W oknie "Profil" użyj litery "M", aby dopasować do okna (pełny zakres) i litery "N", aby dopasować do osi y. Użyj Ctrl i kółka przewijania, aby dostosować szerokość profilu. Możesz też użyć znaków "/" i "*" na tablicy, aby zmienić zakres i wysokość osi y.
  9. Eksport danych do dalszego kreślenia za pomocą innego oprogramowania graficznego po wstępnej analizie.
    1. Aby wyeksportować profil głębokości, w oknie "Profil" kliknij menu "Plik", następnie wybierz "Eksportuj", a następnie wybierz "Zapisz jako" plik ".txt".
    2. Aby wyeksportować plik widma m/z, w oknie "Spectra" kliknij menu "Plik", następnie wybierz "Eksportuj", a następnie wybierz "Zapisz jako" plik ".txt".
    3. Aby wyeksportować plik obrazu, w oknie "Obraz" wydrukuj zrzut ekranu i zapisz jako plik obrazu.

6. Wykresy i prezentacja danych ToF-SIMS

Uwaga: Użyj narzędzia graficznego, aby wykreślić dane po przetworzeniu danych SIMS za pomocą oprogramowania instrumentalnego.

  1. Użyj narzędzia graficznego, aby zaimportować dane.
  2. Wykonaj wykres, używając m/z jako osi x i intensywności piku jako osi y, aby pokazać zrekonstruowane widmo. Przykład przedstawiono na rysunku 1.
  3. Utwórz wykres, używając czasu rozpylania jako osi x i intensywności szczytu jako osi y, aby pokazać zrekonstruowany profil głębokości szeregów czasowych. Przykład przedstawiono na rysunku 2.
  4. Połącz zrekonstruowane obrazy 2D o różnych m/z i utwórz matrycę, aby pokazać mapowanie jonów. Przykład przedstawiono na rysunku 2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiono kilka reprezentatywnych wyników, aby zademonstrować zalety proponowanego protokołu. Dzięki zastosowaniu interfejsu mikroprzepływowego SALVI, pierwotna wiązka jonów (Bi3+) może bezpośrednio bombardować uwodnioną warstwę fibronektyny w wodzie DI. W ten sposób można skutecznie uzyskać chemiczne mapowanie molekularne powierzchni cieczy.

Rysunek 1a oraz 1b przedsta...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

SALVI to interfejs mikroprzepływowy, który umożliwia dynamiczną analizę powierzchni cieczy i granicy faz ciecz-ciało stałe za pomocą przyrządów opartych na próżni, takich jak ToF-SIMS i skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM). Ze względu na zastosowanie małych apertur do naświetlania cieczy bezpośrednio w próżni, SALVI nadaje się do wielu precyzyjnie skoncentrowanych technik spektroskopii i obrazowania bez żadnych modyfikacji; 22 Przenośność i wszechstronność mikrofluidyki sprawiają, że jest to prawdziwa mult...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni funduszowi LDRD Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) Chemical Imaging Initiative-Laboratory Directed Research and Development (CII-LDRD) and Materials Synthesis and Simulation across Scales (MS3) za wsparcie. Dostęp instrumentalny został zapewniony za pośrednictwem projektu naukowego o tematyce naukowej W. R. Wileya Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL). EMSL jest krajowym obiektem naukowym sponsorowanym przez Biuro Badań Biologicznych i Środowiskowych (BER) w PNNL. Autorzy dziękują Panu Xiao Sui, Panu Yuanzhao Dingowi i Pani Juan Yao za korektę manuskryptu i udzielenie przydatnych informacji zwrotnych. PNNL jest obsługiwany przez Battelle dla DOE na podstawie umowy DE-AC05-76RL01830.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ToF-SIMSIONTOFTOF. Rozdzielczość SIMS 5: >10 000 m/Δ m dla rozdzielczości masowej; >4 000 m/Δ m dla wysokiej rozdzielczości przestrzennej 
System do analizy na styku cieczy i próżni (SALVI)Pacific Northwest NationalLaboratory N/ASALVI to unikalne, samodzielne, przenośne narzędzie analityczne, które po raz pierwszy umożliwia instrumentom naukowym opartym na próżni, takim jak spektrometria mas jonów wtórnych czasu przelotu (ToF-SIMS), analizowanie powierzchni cieczy w ich naturalnym stanie na poziomie molekularnym.
PEEK UnionValcoZU1TPKdo podłączenia wlotu i wylotu SALVI
5-osiowy stolik na próbkęIONTOFN/AStage jest wykonany samodzielnie do montażu SALVI w ToF-SIMS
Barnstead Nanopure Water Purification SystemThermo Fisher ScientificD11921ROpure LP Moduł filtracji odwróconej osmozy (D2716)
StrzykawkaBD3096591 ml
PipetaThermo Fisher Scientific21-377-821Zakres: 100 do 1 000 ml
Końcówka do pipetyNeptune2112.96.BS1 000 µ l
Probówka wirówkowaCorning43079115 ml
FibronektynaSigma-AldrichF11411 mg/ml
EtanolThermo Fisher ScientificS25310A95% denaturowany
Gibco PBSThermo Fisher Scientific10010-023pH 7,4

Bibliografia

  1. Tompa, K., Bokor, M., Verebelyi, T., Tompa, P. Water rotation barriers on protein molecular surfaces. Chem. Phys. 448, 15-25 (2015).
  2. Maruyama, Y., Harano, Y. Does water drive protein folding? Chem. Phys. Lett. 581, 85-90 (2013).
  3. Chaplin, M. Opinion - Do we underestimate the importance of water in cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7 (11), 861-866 (2006).
  4. Zhang, L., et al. Mapping hydration dynamics around a protein surface. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (47), 18461-18466 (2007).
  5. Xia, N., May, C. J., McArthur, S. L., Castner, D. G. Time-of-flight secondary ion mass spectrometry analysis of conformational changes in adsorbed protein films. Langmuir. 18 (10), 4090-4097 (2002).
  6. Gray, J. J. The interaction of proteins with solid surfaces. Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (1), 110-115 (2004).
  7. Wagner, M. S., Horbett, T. A., Castner, D. G. Characterization of the structure of binary and ternary adsorbed protein films using electron spectroscopy for chemical analysis, time-of-flight secondary ion mass spectrometry, and radiolabeling. Langmuir. 19 (5), 1708-1715 (2003).
  8. Yang, L., Yu, X. -Y., Zhu, Z., Iedema, M. J., Cowin, J. P. Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and and ToF-SIMS. Lab Chip. 11 (15), 2481-2484 (2011).
  9. Yang, L., Yu, X. -Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques. J. Vac. Sci. Technol. A. 29 (6), 061101(2011).
  10. Yu, X. -Y., Yang, L., Zhu, Z. H., Cowin, J. P., Iedema, M. J. Probing aqueous surfaces by ToF-SIMS. LC GC N. Am. (Oct), 34-38 (2011).
  11. Yu, X. -Y., Yang, L., Cowin, J., Iedema, M., Zhu, Z. Systems and methods for analyzing liquids under vacuum. US patent. , 8,555,710 B2 (2013).
  12. Yu, X. -Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ. US patent. , 20,140,038,224 A1 (2014).
  13. Yang, L., Zhu, Z., Yu, X. -Y., Thevuthasan, S., Cowin, J. P. Performance of a microfluidic device for in situ ToF-SIMS analysis of selected organic molecules at aqueous surfaces. Anal. Methods. 5 (10), 2515-2522 (2013).
  14. Yang, L., et al. In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces. Surf. Interface Anal. 46 (4), 224-228 (2014).
  15. Hua, X., et al. In situ molecular imaging of hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS. Analyst. 139 (7), 1609-1613 (2014).
  16. Hua, X., et al. Two-dimensional and three-dimensional dynamic imaging of live biofilms in a microchannel by time-of-flight secondary ion mass spectrometry. Biomicrofluidics. 9 (3), 031101(2015).
  17. Liu, B., et al. In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS. Lab Chip. 14 (5), 855-859 (2014).
  18. Pankov, R., Yamada, K. M. Fibronectin at a glance. J. Cell Sci. 115 (20), 3861-3863 (2002).
  19. Pierschbacher, M. D., Hayman, E. G., Ruoslahti, E. Location of the cell-attachment site in fibronectin with monoclonal antibodies and proteolytic fragments of the molecule. Cell. 26 (2), 259-267 (1981).
  20. Engvall, E., Ruoslahti, E. Binding of soluble form of fibroblast surface protein, fibronectin, to collagen. Int. J. Cancer. 20 (1), 1-5 (1977).
  21. Green, F. M., Gilmore, I. S., Seah, M. P. TOF-SIMS: Accurate mass scale calibration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (4), 514-523 (2006).
  22. Yu, X. -Y., Liu, B., Yang, L. Imaging liquids using microfluidic cells. Microfluid. Nanofluid. 15 (6), 725-744 (2013).
  23. Shi, H., Lercher, J. A., Yu, X. -Y. Sailing into uncharted waters: recent advances in the in situ monitoring of catalytic processes in aqueous environments. Catal. Sci. Technol. 5 (6), 3035-3060 (2015).
  24. Deleu, M., Crowet, J. M., Nasir, M. N., Lins, L. Complementary biophysical tools to investigate lipid specificity in the interaction between bioactive molecules and the plasma membrane: A review. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1838 (12), 3171-3190 (2014).
  25. Kraft, M. L., Klitzing, H. A. Imaging lipids with secondary ion mass spectrometry. Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Biol. Lipids. 1841 (8), 1108-1119 (2014).
  26. Gilmore, I. S. SIMS of organics-Advances in 2D and 3D imaging and future outlook. J. Vac. Sci. Technol. A. 31 (5), 050819(2013).
  27. Muramoto, S., et al. ToF-SIMS Analysis of Adsorbed Proteins: Principal Component Analysis of the Primary Ion Species Effect on the Protein Fragmentation Patterns. J. Phys. Chem. C. 115 (49), 24247-24255 (2011).
  28. Brüning, C., Hellweg, S., Dambach, S., Lipinsky, D., Arlinghaus, H. F. Improving the interpretation of ToF-SIMS measurements on adsorbed proteins using PCA. Surf. Interface Anal. 38 (4), 191-193 (2006).
  29. Gustavsson, J., et al. Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensor applications. J. Mater. Sci.-Mater. Med. 19 (4), 1839-1850 (2008).
  30. Deng, J., Ren, T. C., Zhu, J. Y., Mao, Z. W., Gao, C. Y. Adsorption of plasma proteins and fibronectin on poly(hydroxylethyl methacrylate) brushes of different thickness and their relationship with adhesion and migration of vascular smooth muscle cells. Regen Biomater. , 17-25 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

film z fibronektynyciek y interfejs pr niowyspektrometria mas jon w wt rnych czasu przelotuspektrometria mas o rozdzielczo ci przestrzennejobrazowanie dwuwymiaroweprofilowanie g boko ciowe
In Situ Charakterystyka uwodnionych białek w wodzie za pomocą SALVI i ToF-SIMS
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.