Artykuł metodologiczny

In Situ Charakterystyka uwodnionych białek w wodzie za pomocą SALVI i ToF-SIMS

DOI:

10.3791/53708

⸱

15 lutego 2016

 ,  ,  ,  , 
1Fundamental & Computational Sciences Directorate, Pacific Northwest National Laboratory, 2Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca przedstawia protokół postępowania z cieczą i wprowadzania próbki do mikrokanału do analizy in situ spektrometrii mas jonów wtórnych biomolekuł białkowych w roztworze wodnym w czasie przelotu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca demonstruje charakterystykę in situ biomolekuł białkowych w roztworze wodnym przy użyciu Systemu do Analizy na Granicy Faz Cieczy Próżni (SALVI) i spektrometrii mas jonów wtórnych (ToF-SIMS) w czasie przelotu. Film białkowy fibronektyny został unieruchomiony na membranie z azotku krzemu (SiN), która tworzy obszar wykrywania Salvi. Podczas analizy ToF-SIMS przeprowadzono trzy tryby analizy, w tym spektrometrię mas o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, obrazowanie dwuwymiarowe (2D) i profilowanie głębokości. Widma masowe uzyskano zarówno w trybie dodatnim, jak i ujemnym. Woda dejonizowana była również analizowana jako próbka referencyjna. Nasze wyniki pokazują, że film fibronektyny w wodzie ma wyraźniejsze i silniejsze piki klastrów wodnych w porównaniu z samą wodą. Charakterystyczne piki fragmentów aminokwasów można również zaobserwować w widmach uwodnionego białka ToF-SIMS. Wyniki te pokazują, że adsorpcja cząsteczek białek na powierzchni może być po raz pierwszy badana dynamicznie przy użyciu SALVI i ToF-SIMS w środowisku ciekłym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nawodnienie jest kluczowe dla struktury,1 konformacji,2i aktywności biologicznej3 białek. Białka bez otaczających je cząsteczek wody nie miałyby żywotnej aktywności biologicznej. W szczególności cząsteczki wody oddziałują z powierzchnią i wewnętrzną strukturą białek, a różne stany uwodnienia białek sprawiają, że takie interakcje są różne. 4 Interakcja białek z powierzchniami stałymi jest podstawowym zjawiskiem, które ma implikacje w nanotechnologii, biomateriałach i procesach inżynierii tkankowej. Badania od dawna wskazują, że zmiany konformacyjne mogą wystąpić, gdy białko napotyka powierzchnię. ToF-SIMS został przewidziany ....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Czyszczenie i sterylizacja mikrokanału SALVI

  1. Sterylizacja mikrokanalików w SALVI
    1. Pobrać 2 ml wodnego roztworu 70% etanolu do strzykawki, połączyć strzykawkę z końcówką wlotową SALVI i powoli wstrzyknąć 1 ml płynu w ciągu 10 minut. Wyjąć strzykawkę po zakończeniu wstrzyknięcia. Następnie podłącz wlot i wylot SALVI za pomocą złącza z polieteroeteroketonu (PEEK). Alternatywnie użyj pompy strzykawkowej, aby przeprowadzić tę samą procedurę. Na przykład ustaw prędkość przepływu na 100 μl/min.
    2. Utrzymuj mikrokanał SALVI wypełniony 70% roztworem etanolu w temperaturze pokojowej przez 4 godziny.
  2. Wprowadź wodę dejoniz....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono kilka reprezentatywnych wyników, aby zademonstrować zalety proponowanego protokołu. Dzięki zastosowaniu interfejsu mikroprzepływowego SALVI pierwotna wiązka jonów (Bi3+) może bezpośrednio bombardować uwodnioną warstwę fibronektyny w wodzie DI. W ten sposób można z powodzeniem uzyskać molekularne mapowanie chemiczne powierzchni cieczy.

Rysunek 1a i 1b pokazują .......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SALVI to interfejs mikroprzepływowy, który umożliwia dynamiczną analizę powierzchni cieczy i granicy faz ciecz-ciało stałe za pomocą przyrządów opartych na próżni, takich jak ToF-SIMS i skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM). Ze względu na zastosowanie małych apertur do naświetlania cieczy bezpośrednio w próżni, SALVI nadaje się do wielu precyzyjnie skoncentrowanych technik spektroskopii i obrazowania bez żadnych modyfikacji; 22 Przenośność i wszechstronność mikrofluidyki sprawiają, że jest to prawdziwa mult.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni funduszowi LDRD Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) Chemical Imaging Initiative-Laboratory Directed Research and Development (CII-LDRD) and Materials Synthesis and Simulation across Scales (MS3) za wsparcie. Dostęp instrumentalny został zapewniony za pośrednictwem projektu naukowego o tematyce naukowej W. R. Wileya Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL). EMSL jest krajowym obiektem naukowym sponsorowanym przez Biuro Badań Biologicznych i Środowiskowych (BER) w PNNL. Autorzy dziękują Panu Xiao Sui, Panu Yuanzhao Dingowi i Pani Juan Yao za korektę manuskryptu i udzielenie przydatnych informacji zwrotnych. PNNL jest obsł....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ToF-SIMSIONTOFTOF. Rozdzielczość SIMS 5: >10 000 m/Δ m dla rozdzielczości masowej; >4 000 m/Δ m dla wysokiej rozdzielczości przestrzennej 
System do analizy na styku cieczy i próżni (SALVI)Pacific Northwest NationalLaboratory N/ASALVI to unikalne, samodzielne, przenośne narzędzie analityczne, które po raz pierwszy umożliwia instrumentom naukowym opartym na próżni, takim jak spektrometria mas jonów wtórnych czasu przelotu (ToF-SIMS), analizowanie powierzchni cieczy w ich naturalnym stanie na poziomie molekularnym.
PEEK UnionValcoZU1TPKdo podłączenia wlotu i wylotu SALVI
5-osiowy stolik na próbkęIONTOFN/AStage jest wykonany samodzielnie do montażu SALVI w ToF-SIMS
Barnstead Nanopure Water Purification SystemThermo Fisher ScientificD11921ROpure LP Moduł filtracji odwróconej osmozy (D2716)
StrzykawkaBD3096591 ml
PipetaThermo Fisher Scientific21-377-821Zakres: 100 do 1 000 ml
Końcówka do pipetyNeptune2112.96.BS1 000 µ l
Probówka wirówkowaCorning43079115 ml
FibronektynaSigma-AldrichF11411 mg/ml
EtanolThermo Fisher ScientificS25310A95% denaturowany
Gibco PBSThermo Fisher Scientific10010-023pH 7,4

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tompa, K., Bokor, M., Verebelyi, T., Tompa, P. Water rotation barriers on protein molecular surfaces. Chem. Phys. 448, 15-25 (2015).
  2. Maruyama, Y., Harano, Y. Does water drive protein folding? Chem. Phys. Lett. 581, 85-90 (2013).
  3. Chaplin, M.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

film z fibronektynyciek y interfejs pr niowyspektrometria mas jon w wt rnych czasu przelotuspektrometria mas o rozdzielczo ci przestrzennejobrazowanie dwuwymiaroweprofilowanie g boko ciowe

Powiązane artykuły