Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Nowe wskaźniki charakteryzujące wydłużenie embrionalne nicieni Caenorhabditis elegans

5.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53712

⸱

28 marca 2016

 ,  , 
1Department of Chemistry, Pharmaqam, Université du Québec à Montréal

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj szczegółowo opisujemy protokoły specjalnie zaprojektowane do monitorowania wad morfogenicznych, które występują podczas wczesnych i późnych faz wydłużania się embrionalnego nicienia Caenorhabditis elegans. Ostatecznie protokoły te mają na celu identyfikację genów, które regulują te fazy i scharakteryzowanie ich zróżnicowanych wymagań wzdłuż przednio-tylnej osi zarodka.

Streszczenie

Analiza szlaków sygnałowych, które kontrolują zmiany procesów morfogennych podczas rozwoju embrionalnego, wymaga solidnych i czułych wskaźników. Wydłużenie zarodka nicienia Caenorhabditis elegans jest późnym etapem rozwojowym polegającym na wydłużeniu zarodka wzdłuż jego osi podłużnej. Ten etap rozwoju jest kontrolowany przez komunikację międzykomórkową między komórkami podskórnymi a leżącymi poniżej mięśniami ściany ciała. Te mechanizmy sygnalizacyjne kontrolują morfologię komórek podskórnych poprzez przebudowę cytoszkieletu i połączeń komórka-komórka. Pomiar śmiertelności zarodka i zatrzymania rozwoju w stadiach larwalnych, a także zmiana cytoszkieletu i struktur adhezyjnych komórka-komórka w komórkach podskórnych i mięśniowych to klasyczne fenotypy, które są używane od ponad 25 lat do analizy tych szlaków sygnałowych. Ostatnie badania wymagały opracowania nowych wskaźników ukierunkowanych na wczesną lub późną elongację i charakteryzujących defekty morfogenne wzdłuż osi przednio-tylnej zarodka. W tym miejscu udostępniamy szczegółowe protokoły umożliwiające dokładny pomiar długości i szerokości wydłużających się zarodków, a także długości zsynchronizowanych larw. Metody te stanowią użyteczne narzędzia do identyfikacji genów kontrolujących wydłużenie, do oceny, czy geny te kontrolują zarówno wczesne, jak i późne fazy tego etapu i czy są wymagane równomiernie wzdłuż osi przednio-tylnej zarodka.

Wprowadzenie

Przez prawie 50 lat nicień Caenorhabditis elegans stał się potężnym modelem do badania ważnych zagadnień w zakresie rozwoju, neurobiologii, ewolucji, interakcji gospodarz-patogen, itp.1 Siła tego modelu w badaniach nad rozwojem polega na: jego krótkim cyklu życia wynoszącym 3 dni; łatwości, z jaką te zwierzęta mogą być genetycznie zmienione; jego przezroczystości, która umożliwia obserwację przemieszczeń i morfologii komórek w żywych zwierząt i jego rozwój, który jest w większości pozamaciczny. Etapy rozwojowe nicienia obejmują embriogenezę i cztery stadia larwalne (od L1 do L4), po których następuje dorosłość. Podczas rozwoju embrionalnego morfogeneza naskórka przyciągnęła znaczną uwagę ze względu na jej zdolność do lepszego zrozumienia, w jaki sposób komórki nabłonkowe migrują jako grupa, jak reorganizują swoje połączenia i modyfikują swoją indywidualną morfologię, a także ich względne położenie w funkcjonalnym nabłonku. Morfogeneza naskórka dzieli się na cztery etapy: interkalacja grzbietowa polegająca na reorganizacji komórek naskórka grzbietowego, określanych jako tkanka podskórna; zamknięcie brzuszne, polegające na migracji brzusznych komórek podskórnych w kierunku brzusznej linii środkowej, a tym samym na obudowie zarodka monowarstwą komórek nabłonka; Wczesne i późne wydłużenie przekształcające zarodek w kształcie fasoli w larwy robakowate. Po morfogenezie wylęganie się zarodka i larwy L1 zaczynają żerować przy użyciu dostępnych bakterii w swoim bezpośrednim otoczeniu.

Wydłużenie embrionalne jest zatem późną fazą rozwoju embrionalnego. Polega na wydłużeniu zarodka wzdłuż jego osi podłużnej i zmniejszeniu jego średnicy poprzecznej. Wiąże się to z radykalną modyfikacją kształtu komórek podskórnych. Wydłużenie dzieli się na fazę wczesną i późną. Wczesna faza rozpoczyna się na etapie przecinka i kończy się, gdy mięśnie ściany ciała zaczynają się kurczyć w stadium 1,75-krotnym u zarodków typu dzikiego (wt) - co odpowiada zarodkom o długości 1,75 razy w porównaniu z zarodkami niewydłużonymi. Procesy morfogenne zachodzące na tym etapie są napędzane głównie przez obkurczanie się nitkowatych wiązek aktyny (FB) zlokalizowanych na biegunie wierzchołkowym komórek podskórnych, które napędzają ich wydłużenie wzdłuż osi przednio-tylnej zarodka2. Skurcz FB jest kontrolowany przez fosforylację łańcuchów lekkich miozyny przez trzy kinazy: LET-502/ROCK, MRCK-1 i PAK-1 5. Późna faza wydłużenia rozpoczyna się, gdy mięśnie ściany ciała stają się funkcjonalne i zaczynają się kurczyć. Obejmuje sygnalizację mechanotransdukcji z mięśni ściany ciała do komórek grzbietowych i brzusznych podskórnych i kończy się w momencie wyklucia się zwierząt3.

Wady wydłużenia są zazwyczaj charakteryzowane przez procent zwierząt umierających jako zarodki (śmiertelność embrionalna; Emb) oraz te hamujące ich rozwój jako larwy L1 (fenotyp zatrzymania larw; Lva) i jest znacznie krótsza niż wt. Identyfikacja stadium zahamowania rozwoju wymaga obserwacji mikroskopowej martwych zarodków i zatrzymanych larw3-6.

Niedawno pokazano, że kilka genów, takich jak regulator Cdc42/Rac i efektor pix-1 i pak-1, kontrolują procesy morfogenne zarówno podczas wczesnej, jak i późnej elongacji3,7. Niedawno wykazaliśmy również, że procesy morfogenne różnią się wzdłuż osi przednio-tylnej zarodków we wczesnym okresie elongacji37. Odkrycia te skłoniły do opracowania nowych wskaźników ukierunkowanych w szczególności na wczesne i późne etapy elongacji oraz innych wskaźników umożliwiających scharakteryzowanie morfologii zarodków wzdłuż ich osi przednio-tylnej podczas wczesnej elongacji.

Te nowatorskie metody polegają na pomiarze długości zarodków na początku i na końcu wczesnego wydłużenia, a także szerokości ich głów i ogonów. 7 Opracowano również dwa protokoły do pomiaru długości nowo wyklutych larw, zsynchronizowanych w stadiumL1 7.

Skorupki jaj zarodków chronią je przed alkalicznym podchlorynem, podczas gdy larwy, dorosłe osobniki i bakterie obecne w pożywce hodowlanej są rozpuszczane przez leczenie. Zabieg ten jest następnie stosowany do oczyszczania zarodków z niezsynchronizowanej populacji zawierającej większość dobrze odżywionych dorosłych8. Ograniczenie pokarmu służy do synchronizacji nowo wyklutych larw. Pomiar długości tych larw jest następnie wykorzystywany do wykrywania wad wydłużenia. Pomiar ten jest preferowany w stosunku do pomiaru zatrzymanych larw na płytkach hodowlanych, ponieważ larwy, które wykluwają się z nie w pełni wydłużonych zarodków, mogą powrócić do "normalnej długości" podczas karmienia, ale zachowają swój zmniejszony rozmiar po zatrzymaniu w przypadku braku pożywienia.

Tutaj prezentujemy szczegółowe protokoły umożliwiające pomiar długości wydłużających się zarodków, jak również szerokości ich głowy i ogona za pomocą poklatkowej mikroskopii DIC i analizy obrazu (Protokół 1). Udostępniamy również szczegółowe protokoły do pomiaru długości zsynchronizowanych larw za pomocą analizy obrazu (Protokół 2) i cytometrii przepływowej (Protokół 3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Charakterystyka wczesnych wad wydłużenia u zwierząt WT i zmutowanych

  1. Montaż zarodków do mikroskopii Normarski DIC
    1. Przygotuj następujące podłoża i materiał hodowlany:
      1. M9 Bufor rozpuścić 12,8 g/L Na2HPO4•7H2O, 3 g/L KH2PO4, 5 g/L NaCl, 0,25 g/L MgSO4•7H2O w wodzie destylowanej i autoklawie w celu sterylizacji.
      2. Płytki NGM, rozpuścić 3 g/L NaCl, 16 g/L agar, 2,5 g/L baktopeptonu w ddH2O. Autoklaw i dodać 1 mMMgSO4, 1 mM CaCl2, 1 mM buforu fosforanowego i 5 μg/ml cholesterolu. Wlać 6 ml NGM na szalki o średnicy 60 mm. Pozostawić pożywkę do zestalenia się na 24 godziny w temperaturze pokojowej. Dodaj kilka kropli nasyconej kultury bakterii E. coli OP50 wyhodowanych w bulionie Luria (LB). Pozwól bakteriom rosnąć przez 48 godzin i przechowuj płytki w temperaturze 4 °C.
      3. Aby wygenerować wykalek, zamontuj platynowy drut o średnicy 0,01 cala na krótkiej pipecie Pasteura. Przymocuj drut platynowy do końca szklanej pipety, podgrzewając tę końcówkę palnikiem benzenowym. Spłaszcz koniec drutu, aby wytworzyć rodzaj łopaty.
    2. Hoduj szczep robaka na płytkach NGM 60 mm z OP50 w temperaturze 20 °C.
      UWAGA: Allele termowrażliwe mogą wymagać hodowli zwierząt w nieakceptowalnych temperaturach do 25,5 °C. Na talerzach powinno znajdować się wielu młodych dorosłych i nadal dużo pokarmu, aby postępować zgodnie z protokołami.
    3. Umieść szkiełko mikroskopowe między dwoma szkiełkami dystansowymi pokrytymi dwiema warstwami taśmy maskującej (Rysunek 1A).
    4. Przygotować 3% roztwór agarozy (wagowo/objętościowo) w buforze M9, rozpuszczając 0,6 g proszku agarozy w 20 ml buforu M9, ogrzewając w kuchence mikrofalowej przez 30 sekund. Pozostawić roztwór do ostygnięcia przez 5 min.
      UWAGA: Roztwór agarozy można stosować przez kilka dni po stopieniu w kuchence mikrofalowej. Może być również porcjowany i przechowywany w temperaturze 4 °C przez wiele tygodni.
    5. Umieść kroplę gorącego 3% roztworu agarozy na szkiełku podstawowym znajdującym się między dwoma szkiełkami dystansowymi. Unikaj tworzenia się bąbelków.
    6. Szybko przykryj agarozę kolejnym szkiełkiem, jak pokazano na rysunku 1B i delikatnie dociśnij. Górny szkiełko spłaszczy kroplę agarozy i wygeneruje podkładkę o grubości dwóch warstw taśmy maskującej.
    7. Pozwól agarozie zestalić się przez co najmniej 1 minutę w temperaturze pokojowej lub do momentu, gdy zarodki będą gotowe do przeniesienia do podpaski.
    8. Za pomocą kilofa do robaków przenieś 20 do 30 dobrze odżywionych młodych dorosłych z płytki NGM do probówki mikrowirówki zawierającej 400 μl buforu M9.
    9. Pozostawić robaki do osadzania się grawitacyjnie przez około 5 minut i usunąć supernatant za pomocą mikropipety. Ten krok ma na celu usunięcie maksymalnej ilości bakterii zebranych z nicieniami.
    10. Dodać 200 μl buforu M9 do każdej probówki.
    11. Za pomocą pipety Pasteura przenieś zawartość probówki (bufor i nicienie) do szkiełka zegarkowego.
    12. Użyj jednej lub dwóch igieł 25G 5/8", aby przeciąć zwierzęta w środkowej części ciała (między spermateką a sromem).
      UWAGA: Ostrze skalpela może być również używane jako alternatywa dla igieł. Zrób to na nicieniach pływających i może wymagać trochę praktyki. Chodzi o to, aby używać igieł jako nożyczek lub jako noża, w zależności od tego, ile igieł jest używanych. Po rozcięciu zwierząt hermafrodyty uwalniają swoje zarodki do bufora.
    13. Skoncentruj zarodki w środku szkiełka zegarka poprzez wytworzenie okrągłego wiru w cieczy.
    14. Usuń większość M9 ze szkła zegarka za pomocą mikropipety. Pozostaw około 30 μl M9 z zarodkami.
    15. Zdejmij szkiełko zakrywające podkładkę agarozową (Rysunek 1B), zsuwając ją z podkładki.
    16. Przetnij podkładkę żyletką, aby móc całkowicie pokryć ją szkiełkiem nakrywkowym (Rysunek 1C).
    17. Za pomocą pipety Pasteura przenieś wszystkie zarodki (i resztki robaków) na podkładkę agarozową.
    18. Pogrupuj zarodki na środku podpaski za pomocą rzęsy przyklejonej na końcu końcówki używanej do mikropipet o pojemności 200 μl.
    19. Powoli umieść szkiełko nakrywkowe na podkładce, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza, i uszczelnij go.
      UWAGA: Można użyć kilku uszczelniaczy. Używamy gumy do rysowania, którą można znaleźć w sklepach ze sztuką i rękodziełem (zwykle używanej jako guma maskująca do malowania akwareli). Guma ta jest używana, ponieważ jest hydrofilowa i dość szybko krzepnie i nie jest toksyczna dla robaków. Szkiełka mogą być również uszczelnione lakierem do paznokci lub VALAP (mieszanka wazeliny, lanoliny i wosku parafinowego).
    20. Pozostaw gumę do rysowania do wyschnięcia na około 15 minut.
  2. Rejestracja wczesnej elongacji za pomocą czterowymiarowej mikroskopii Normarski DIC
    UWAGA: Celem tego kroku jest zarejestrowanie wczesnego wydłużenia od przecinka do początku późnego wydłużenia - zdefiniowanego jako moment, w którym mięśnie ciała i ściany zaczynają się kurczyć. Dążymy również do tego, aby rejestrować więcej niż jeden zarodek w tym samym czasie. Osiem godzin zapisu jest zwykle wymagane do zarejestrowania wczesnej elongacji dla grupy niezsynchronizowanych zarodków.
    1. Umieść zamontowany szkiełko na stoliku mikroskopu. Upewnij się, że mikroskop jest wyposażony w obiektywy 10X i 60X, a także soczewki DIC, pryzmat, kamerę i oprogramowanie do przechwytywania umożliwiające mikroskopię poklatkową i generowanie stosów Z (zautomatyzowana platforma Z).
      UWAGA: upewnij się, że temperatura w pomieszczeniu mikroskopowym jest stała w zakresie od 20 do 23 °C. Na stoliku mikroskopowym może być wymagana komora grzewczo-chłodząca, zwłaszcza w przypadku stosowania mutantów termoczułych.
    2. Zidentyfikuj grupę zarodków w stadiach premorfogenezy za pomocą obiektywu 10X.
    3. Po zlokalizowaniu zsuń obiektyw 10X i dodaj kroplę olejku zanurzonego na szkiełku.
    4. Korzystając z obiektywu 60X, zidentyfikuj górną i dolną część zarodków, aby ustawić parametry obrazowania Z-stack.
      UWAGA: Nie wahaj się ustawić stosu Z większego niż grubość zarodków. Ustaw odległość między dwiema sąsiednimi płaszczyznami na 0,8 μm. Umożliwi to pokrycie całkowitej głębokości zarodków w 35 do 50 planach Z.
      UWAGA: Jeśli mikroskop zawiera zautomatyzowaną platformę xy, zarodki znajdujące się w różnych miejscach podkładki mogą być rejestrowane jednocześnie. Aby to zrobić, zapisz współrzędne xy każdego miejsca na podkładce, które chcesz przeanalizować w trakcie eksperymentu. Upewnij się, że wybrałeś xy podczas ustawiania parametru nagrywania i postępuj zgodnie z resztą protokołu, jak wskazano. Cienkie cięcie Z zarodka podczas rejestracji nie jest koniecznie wymagane w przypadku pomiarów wyszczególnionych w tym protokole. Rejestrowanie rozwoju embrionalnego zwierząt wt i zmutowanych zwierząt z maksymalną rozdzielczością jest jednak dobrą praktyką w celu zbudowania biblioteki nagrań zdolnych do przeprowadzenia dodatkowych analiz.
    5. Ustaw film poklatkowy z 2-minutowymi przerwami między dwoma akwizycjami trwającymi 8 godz.
      UWAGA: Czas naświetlania będzie zależał od natężenia światła ustawionego dla mikroskopu. Ruch komórek podczas wczesnej elongacji jest bardzo powolny; Czas ekspozycji może wynosić około jednej klatki na sekundę lub mniej. Jeśli zarodki znajdują się we wczesnych stadiach morfogenezy (interkalacja grzbietowa, zamknięcie brzuszne), wczesne wydłużenie zostanie odnotowane w ciągu 1 godziny. Upewnij się, że migawka światła jest zamknięta między każdym akwizycją.
    6. Uruchom pobieranie i zapisz je.
  3. Pomiar wczesnych wad wydłużeniowych za pomocą analizy obrazu
    1. Otwórz oprogramowanie Fiji-ImageJ (v1.48o – http://fiji.sc/Fiji).
    2. W menu wybierz Analizuj/Ustaw pomiary, wybierz Obwód. Dla każdego zarodka dostosuj pasek skali Z, aby skupić się na gardle zarodka, jak pokazano na rysunku 2A. Zapewni to, że skupisz się na środku zarodka.
    3. Aby zmierzyć długość zarodka, dostosuj pasek skali czasu tak, aby zarodek będący przedmiotem zainteresowania znajdował się na początku wczesnego wydłużenia (etap przecinka; Rysunek 2A). Zanotuj czas ("Początek czasu").
    4. Wybierz narzędzie do tworzenia linii podzielonej na segmenty. Narysuj odcinkową linię od czubka pyska zarodka do czubka ogona, podążając za linią środkową zarodka (ryc. 2A). Korzystając z zakładki menu Analizuj/Mierz, uzyskaj długość narysowanej linii ("Początek długości").
    5. Powtórz ten pomiar dla tego samego zarodka pod koniec wczesnego wydłużenia (moment, w którym mięśnie zaczynają się kurczyć). Zanotuj czas ("Time-end") i zmierz długość zarodka ("Length-end"), jak opisano powyżej (Rysunek 2B).
    6. Oblicz czas trwania (D) wydłużenia wczesnego i przyrost długości (L) na tym etapie w następujący sposób:
      D = "Czas-koniec"-"Czas-początek"
      L = "Długość-koniec" -"Długość-początek"
    7. Aby zmierzyć szerokość głowy, dostosuj pasek skali czasowej tak, aby zarodek znajdował się na etapie zainteresowania (etap 1,2-krotny lub koniec wczesnego wydłużenia). Wybierz narzędzie linii prostej. Narysuj poprzeczną (oś grzbietowo-brzuszną) linię środkową głowy. Ten fragment jest najgrubszą częścią zarodka (ryc. 2C). Korzystając z menu Analizuj/Mierz, uzyskaj długość linii odpowiadającą szerokości łba.
    8. W tym samym czasie powtórz ten krok, rysując poprzeczną linię środkową ogona (linia środkowa między zastawką jelitową a końcem ogona; Rysunek 2C) i zmierz go, aby uzyskać szerokość ogona.
      UWAGA: Użyj tego pomiaru, aby porównać zarodki na tym samym etapie w różnych fenotypach. Aby zapewnić powtarzalność tego pomiaru, upewnij się, że znalazłeś miejsce znajdujące się wokół linii środkowej ogona zwierzęcia, które można łatwo rozpoznać z jednego zwierzęcia na drugie.
    9. Aby obliczyć stosunek szerokości głowy do ogona, podziel szerokość głowy przez szerokość ogona.

2. Charakterystyka defektów późnego wydłużenia za pomocą analizy obrazu

  1. Synchronizacja larw L1 za pomocą alkalicznego leczenia podchlorynem
    1. Z niegłodzonej płytki o średnicy 60 mm zawierającej wiele ciężarnych osobników dorosłych, zebrać wszystkie robaki do probówki mikrowirówkowej, zmywając nicienie z płytki 1 ml buforu M9 za pomocą pipety Pasteura.
    2. Nicienie osadzają się w ilości 3 500 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usuwają supernatant za pomocą mikropipety bez naruszania osadu robaka.
    3. Dodać 1 ml roztworu podchlorynu do każdej probówki (0,4 M podchlorynu, 0,5 M NaOH) i wstrząsać przez 3 min.
      UWAGA: Alkaliczny roztwór podchlorynu powinien być świeżo przygotowany, a zarodki w tym roztworze powinny być delikatnie ale stale mieszane, aby zoptymalizować rozpuszczenie dorosłych osobników i natlenienie zarodków. Po 3 minutach mieszania większość dorosłych powinna uwolnić jaja do roztworu.
    4. Wirować przy 3 500 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i szybko usunąć supernatant za pomocą mikropipety bez naruszania osadu.
    5. Przemyć czterokrotnie 1 ml buforu M9, a następnie odwirować przy 3 500 x g przez 3 minuty.
    6. Po czwartym płukaniu usunąć supernatant i ponownie zawiesić jaja w 700 μl buforu M9 bez pipetowania jaj (ponieważ jaja przykleiłyby się do plastikowej końcówki).
    7. Przyklej rurkę do wytrząsarki orbitalnej o średnicy 3 mm umieszczonej w inkubatorze w odpowiedniej temperaturze wzrostu i wstrząsaj z prędkością 600 obr./min przez noc.
  2. Pomiar długości zsynchronizowanych larw
    1. Wirówka zatrzymała larwy L1 w ilości 3 500 x g na 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunęła supernatant. Zawiesić larwy w 100 μl buforu M9 i przenieść je na podkładkę agarozową za pomocą pipety Pasteura (płatki agarozowe należy przygotować zgodnie z opisem w sekcjach 1.1.2-1.1.8). Umieść szkiełko nakrywkowe na podkładce.
      UWAGA: Podkładka nie musi być uszczelniana gumą do tego eksperymentu, który polega na krótkim przyswajaniu.
    2. Użyj 10-krotnego obiektywu i oświetlenia z kontrastem fazowym, aby zmierzyć długość larw, jeśli używana jest kamera o wysokiej rozdzielczości. Zwiększ intensywność światła, aby móc uchwycić obrazy w ciągu kilku milisekund i w konsekwencji uzyskać wyraźny obraz larw (Rysunek 2D).
      UWAGA: Podczas gdy pływające śmieci larw są redukowane przez poduszkę agarozową, nadal się poruszają. Dlatego szybkie nagrywanie jest niezbędne, aby uzyskać wyraźny obraz.
    3. Otwórz Fiji-ImageJ i powtórz krok 1.3.1. Aby zmierzyć długość larw, wybierz narzędzie do tworzenia linii segmentowych. Narysuj odcinkową linię od czubka głowy do czubka ogona, podążając za linią środkową larw (Rysunek 2D, prawy panel).
    4. Korzystając z menu Analizuj/Mierz, uzyskaj długość narysowanej linii odpowiadającą długości larw w mikrometrach.

3. Charakterystyka defektów późnego wydłużenia za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Synchronizuj larwy
    1. Oczyścić zarodki za pomocą alkalicznego podchlorynu, jak opisano w sekcji 2.1, z pełnych 100 mm płytek dobrze odżywionych młodych osobników dorosłych i pozostawić zarodek do wylęgu i zatrzymania L1 w buforze M9 przez 16 do 24 godzin w temperaturze 20 lub 25,5 °C, w zależności od analizowanego szczepu.
      UWAGA: Jedna pełna płytka dobrze odżywionych dorosłych osobników na szczep wystarcza do analizy opisanej poniżej.
  2. Kalibracja sortownika ślimakowego
    UWAGA: Zastosowany tutaj cytometr przepływowy to cytometr przepływu dużych cząstek (zwany dalej sorterem ślimakowym). Sortownik robaków zawiera czerwony laser diodowy o długości fali 670 nm, który znajduje się przed detektorem ekstynkcji. Sortownik ślimakowy zawiera również wieloliniowy laser argonowy do wzbudzenia fluorescencyjnego. Standardowe instrumenty mają trzy fotopowielacze (PMT), detektory fluorescencyjne używane do wykrywania emisji fluorescencji w zielonych, żółtych i czerwonych obszarach widma. W opisanym tutaj protokole TOF zostanie użyty do pomiaru wielkości larw, czerwony kanał zostanie wykorzystany do identyfikacji martwych robaków, które zostaną zabarwione jodkiem propidyny (PI). GP (General Purpose) High Fluorescence Control Particles używane do kalibracji przyrządu i jako kontrola wewnętrzna w naszym eksperymencie wykazują wysoką fluorescencję w kolorze zielonym, żółtym i czerwonym. Będą to jedyne obiekty w analizowanej próbce, w których wykryto wysoką emisję w kanale zielonym, a następnie zostaną zidentyfikowane na podstawie tej cechy.
    UWAGA: Żywe zwierzęta są identyfikowane na podstawie braku fluorescencji w kanale zielonym i czerwonym, a także na podstawie TOF. Emisja autofluorescencyjna z jelita larw nie jest wykrywalna na etapie L1.
    1. Włącz blok laserowy, komputer, sprężarkę i sortownik ślimakowy. Naciśnij przycisk START na otwartym oprogramowaniu sortownika ślimakowego, jak wskazano w instrukcji obsługi przyrządu.
    2. Obserwuj wyskakujące okienko sterowania laserem argonowym. Wybierz tryb RUN i poczekaj, aż moc lasera osiągnie 10 ± 1 mW. Wybierz GOTOWE w oknie sterowania laserem.
    3. Ustawić ciśnienie osłony i próbki odpowiednio na 5,10 ± 0,02 i 5,51 ± 0,01. Poczekaj, aż ciśnienie się wyrówna przez co najmniej 15 minut i kliknij pole wyboru CIŚNIENIE OK.
      UWAGA: Natężenie przepływu zależy od osłony i ciśnienia próbki.
    4. Upewnij się, że wszystkie pęcherzyki obecne w kanalikach przepływu między kubkiem na próbkę a komorą analityczną. Aby to zrobić, kliknij UZYSKAJ i delikatnie przesuwaj kanaliki, aż nie zostaną uzyskane żadne pęcherzyki (jak pokazano w oknie akwizycji).
    5. Ustawienie wszystkich parametrów pomiaru i detekcji fluorescencji i TOF w następujący sposób:
      1. Ustaw skale dla TOF, Ext, Green, Yellow i Red na 256. Ustaw wzmocnienie zgodnie z opisem w Tabeli 1. Ustaw PMT Control na 700 dla zielonego i żółtego oraz na 900 dla czerwonego.
        UWAGA: Dostępne są dwa filtry wzbudzenia (488 nm i 514 nm), które mogą być używane do wzbudzania białka zielonej fluorescencji (GFP) lub białka żółtej fluorescencji (YFP) lub dowolnych fluorochromów wzbudzonych na tych długościach fal za pomocą wieloliniowego lasera argonowego. W komorze filtracyjnej urządzenia należy umieścić odpowiednie filtry. W poniższym eksperymencie użyliśmy filtra 488 nm.
    6. Aby skalibrować sortownik ślimakowy, wybierz opcję "uruchom cząstki kontrolne" w menu narzędzi. Umieść 20 ml 1x GP (General Purpose) High Fluorescence Control Particles w kubku (są to cząstki fluorescencyjne o precyzyjnym rozmiarze, sprzedawane przez producenta cytometrii w celu kalibracji ich przyrządu).
    7. Kliknij przycisk POBIERZ, aby rozpocząć przepływ osłony i próbki.
      UWAGA: Należy spodziewać się średniej związanej z rozkładem cząstek kontrolnych wynoszącym 21 ± 6 oraz współczynnika zmienności wokół tej średniej (C.V.) ≤11. Jeśli CV wynosi >11, a średnia wynosi >27, spróbuj wyczyścić kanaliki, klikając kilka razy przycisk czyszczenia lub przesuwając kanał przepływowy.
  3. Przejęcie Animal TOF
    UWAGA: Światło rozprasza się, gdy obiekt przechodzi w komorze przepływowej między źródłem lasera a detektorem wygaszania. Czas potrzebny do rozproszenia światła przez obiekt latający (czas przelotu, TOF) służy do pomiaru długości osiowej obiektu. Zasięg światła zamaskowanego przez obiekt (ekstynkcja, EXT) jest używany jako miara jego nieprzezroczystości/gęstości optycznej.
    1. Umieścić 10 μl zsynchronizowanego L1 typu dzikiego (wt) w szkiełku zegarkowym i oszacować procent martwych jaj za pomocą mikroskopu preparacyjnego.
      UWAGA: Zsynchronizowany L1 wyświetlający wysokie Emb (wyższe niż 20%) w wt nie powinien być używany do dalszej analizy.
    2. Przenieść zsynchronizowany L1 z mikrowirówki (około 700 μl M9 zawierającego L1) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodać jodek propidyny (PI) o końcowym stężeniu 10 μg/ml (rozcieńczenie 1:100th z roztworu podstawowego o stężeniu 1 mg/ml) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Martwe jaja i larwy zostaną wybarwione za pomocą PI i wykryte jako obiekty silnie fluorescencyjne za pomocą kanału czerwonego.
    3. Dodać 10 ml buforu M9 do rozcieńczenia barwionych populacji. Pobrać 5 ml rozcieńczonych populacji i rozcieńczyć je czterokrotnie, dodając 15 ml M9. Umieścić to rozcieńczenie w kubku na próbkę.
    4. Uruchom przepływ próbki, klikając przycisk ACQUIRE (pobierz) i obserwuj natężenie przepływu.
      UWAGA: Aby uzyskać dokładny pomiar, natężenie przepływu powinno utrzymywać się w zakresie od 15 do 25 obiektów/sek.
    5. W razie potrzeby dostosuj ilość zwierząt w kubku, aby osiągnąć pożądane natężenie przepływu.
      UWAGA: Natężenie przepływu zależy od stałego ciśnienia (osłony i próbki), jak wskazano w ppkt 3.2.3 oraz od stężenia larw w kubku. Jeśli natężenie przepływu jest wyższe niż 25 obiektów/s, dodaj trochę bufora do kubka. Jeśli wartość jest mniejsza niż 15 obiektów/s, dodaj do kubka skoncentrowany L1 (z kroku 3.3.3).
    6. Po osiągnięciu odpowiedniego stężenia obiektu oceń objętość w filiżance i dodaj 1/4 tej objętości do roztworu High Fluorescent GP Control Particles 4x.
    7. Dostosuj parametr bramkowania i sortowania. Aby to zrobić, kliknij "Bramkowanie" w menu i wybierz "TOF vs." i "Zielony". Kliknij "Sortowanie" w menu i wybierz "TOF vs." i "Czerwony". Grafika bramkowania i sortowania pojawi się wtedy, jak pokazano na rysunku 3A.
      UWAGA: Umożliwi to wizualizację cząstek kontrolnych (emisja w kolorze zielonym i czerwonym), martwych zwierząt zabarwionych przez PI i pęcherzyki (emisja w kolorze czerwonym, a nie zielonym) oraz żywych zwierząt (brak emisji w kanale ani zielonym, ani czerwonym) (rysunek 3A).
    8. Uruchom eksperyment, klikając ACQUIRE.
      UWAGA: Aby zidentyfikować niewielkie różnice w rozmiarach między larwami, przeanalizuj około 10 000 obiektów, czyli około 8 000 zwierząt. Zatrzymaj eksperyment i wyeksportuj dane w .txt formacie, klikając SKLEP.
  4. Pomiar względnej wielkości żywych zwierząt w zsynchronizowanych populacjach
    1. Otwórz plik .txt za pomocą oprogramowania zdolnego do zarządzania dużymi tabelami danych.
    2. Z analizowanych obiektów wyodrębnić wartości TOF związane z cząstkami kontrolnymi, które charakteryzują się emisją w kanale zielonym wyższą niż 100 dowolnych jednostek (wartość ta zależy od parametrów ustalonych w punkcie 3.2.5). Utwórz nową kolumnę i nazwij ją "cząstkami kontrolnymi". Utwórz kolumnę zawierającą wszystkie inne obiekty z wyjątkiem cząstek kontrolnych zwanych "próbką". UWAGA: emisja fluorescencji nowej partii cząstek musi zostać zweryfikowana przed rozpoczęciem akwizycji. Spowoduje to ustawienie progu fluorescencyjnego umożliwiającego identyfikację cząstek kontrolnych powyżej L1s.
    3. Dla każdego analizowanego szczepu zidentyfikuj część eksperymentu, w której natężenie przepływu zostało zmienione (na przykład z powodu obecności czopa jaj). Aby to zrobić:
      1. Wykreślić TOF "cząstek kontrolnych" dla każdej próbki jako współczynnik czasu (rysunek 3B).
      2. Narysuj liniową linię trendu za pomocą narzędzia Linia trendu i wyświetl równanie na wykresie.
        UWAGA: TOF cząstek kontrolnych powinien być stały w czasie (linia pozioma, rysunek 3B). Biorąc pod uwagę równanie liniowej linii trendu narysowanej na danych y = ax + b, upewnij się, że wartość "a" jest niższa niż 10-4. Wszystkie pomiary wykonane w obrębie odcinków czasowych wykazujących pęknięcie w ustawieniu cząstki kontrolnej powinny zostać usunięte z analizy.
    4. Z pomiaru "próbki" należy usunąć martwe zarodki i pęcherzyki (emisja wyższa niż 15 w kolorze czerwonym), jak również drobne zanieczyszczenia i duże zatyczki jajowe (TOF odpowiednio niższe niż 10 i wyższe niż 70).
    5. Wykreślić rozkład 'cząstek kontrolnych' dla każdego analizowanego szczepu. Jak widać na rysunku 3C, rozkłady te powinny nakładać się na siebie prawie idealnie. Gwarantuje to, że pomiary TOF uzyskane dla różnych szczepów mogą być porównywane. UWAGA: normalizacja elementów próbki TOF nad cząstkami kontrolnymi może być zastosowana, jeśli rozkłady cząstek kontrolnych w próbce nie nakładają się na rozkłady próbek kontrolnych. Znormalizowane TOF oblicza się w następujący sposób:
      1. Znormalizować TOF dla genotypu G = (próbka TOF dla G) / (średnia 'cząstka kontrolna' TOF dla G) x (średnia 'cząstka kontrolna' TOF dla wt), gdzie wt jest próbką kontrolną.
    6. Wykreśl rozkład TOF larw dla każdego szczepu, w tym próbki kontrolnej, w naszym przypadku zwierząt wt (ryc. 3D). Zmierz średnią i błąd standardowy średniej (SEM) dla każdej populacji (rys. 5A i B).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosunki szerokości głowy, ogona oraz głowy do ogona są wiarygodnymi wskaźnikami.

Opisane tutaj protokoły zostały z sukcesem wykorzystane do scharakteryzowania funkcji regulatorów i efektorów GTPaz Rho pix-1, pak-1 oraz let-502 w trakcie wczesnej elongacji7. Ge...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje nowatorskie wskaźniki charakteryzujące wczesne i późne fazy wydłużania zarodka.

W sekcji 1 krytycznym krokiem jest potencjalna obecność bakterii na podkładce. Podczas pozyskiwania obrazu zarodki są hermetycznie zamknięte między podpaską a szkiełkiem nakrywkowym. Uszczelnienie szkiełka jest wymagane, aby uniknąć wysuszenia zwierząt podczas pozyskiwania, które trwa dłużej niż dwie godziny. O ile nam wiadomo, żaden z uszczelniaczy używanych do mocowania podkładek agarozowych ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) z Kanady oraz The Canada Foundation for Innovation. Podziękowania dla dr Paula Mainsa (University of Calgary, Calgary, Kanada) za szczep let-502(sb118ts). Niektóre szczepy zostały dostarczone przez Caenorhabditis Genetics Center, które jest finansowane przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agar BioShopAGR001.500
AgarozaBioshopAGA001.500
CaCl2 (chlorek wapnia)Bio Basic Inc.CT1330
CholesterolSigma-aldrichC8667
Roztwór czyszczący union Biometrica300-5072-000
Szkiełka nakrywkowe szklaneFisherbrand12-542B
Szkiełka szklaneFisherbrand12-552-3
Wysokofluorescencyjne cząstki kontrolneunion Biometrica310-5071-001
K2HPO4 (fosforan potasu, dwuzasadowy)Bio Basic Inc.PB0447
K2HPO4 (fosforan potasu, monozasadowy)Bio Basic Inc.PB0445
MgSO4 (siarczan magnezu)Sigma-aldrich230391
Na2HPO4( fosforan sodu, dwuzasadowy)Bio Basic Inc.
NaCl (chlorek sodu)Bio Basic Inc.DB0483
Guma do rysowania Pebeo 45  mlpé bé oPDG033000dowolnym sklepie ze sztuką/rękodziełem
PeptoneBioShopPEP403.500
Złącze buforowe osłonyBiometrica300-5070-100
Złącze COPAS BiosortBiometrica
SDB0487

Bibliografia

  1. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200, 387-407 (2015).
  2. Priess, J. R., Hirsh, D. I. Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elongation of the embryo. Developmental biology. 117, 156-173 (1986).
  3. Zhang, H., et al. A tension-induced mechanotransduction pathway promotes epithelial morphogenesis. Nature. 471, 99-103 (2011).
  4. Diogon, M., et al. The RhoGAP RGA-2 and LET-502/ROCK achieve a balance of actomyosin-dependent forces in C. elegans epidermis to control morphogenesis. Development. 134, 2469-2479 (2007).
  5. Gally, C., et al. Myosin II regulation during C. elegans embryonic elongation: LET-502/ROCK, MRCK-1 and PAK-1, three kinases with different roles. Development. 136, 3109-3119 (2009).
  6. Piekny, A. J., Wissmann, A., Mains, P. E. Embryonic morphogenesis in Caenorhabditis elegans integrates the activity of LET-502 Rho-binding kinase, MEL-11 myosin phosphatase, DAF-2 insulin receptor and FEM-2 PP2c phosphatase. Genetics. 156, 1671-1689 (2000).
  7. Martin, E., et al. pix-1 controls early elongation in parallel with mel-11 and let-502 in Caenorhabditis elegans. PloS one. 9, e94684(2014).
  8. Sulston, J., Hodgkin, J. Methods. Wood, W. B. , 587-606 (1988).
  9. Andersen, E. C., et al. A Powerful New Quantitative Genetics Platform, Combining Caenorhabditis elegans High-Throughput Fitness Assays with a Large Collection of Recombinant Strains. G3 (Bethesda). 5, 911-920 (2015).
  10. Boulier, E. L., Jenna, S. Genetic dissection of Caenorhabditis elegans embryogenesis using RNA interference and flow cytometry. Methods Mol Biol. 550, 181-194 (2009).
  11. Verster, A. J., Ramani, A. K., McKay, S. J., Fraser, A. G. Comparative RNAi screens in C. elegans and C. briggsae reveal the impact of developmental system drift on gene function. PLoS genetics. 10, e1004077(2014).
  12. Ramani, A. K., et al. The majority of animal genes are required for wild-type fitness. Cell. 148, 792-802 (2012).
  13. So, S., Miyahara, K., Ohshima, Y. Control of body size in C. elegans dependent on food and insulin/IGF-1 signal. Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 16, 639-651 (2011).
  14. Dineen, A., Gaudet, J. TGF-beta signaling can act from multiple tissues to regulate C. elegans body size. BMC developmental biology. 14, 43(2014).
  15. Tan, L., Wang, S., Wang, Y., He, M., Liu, D. Bisphenol A exposure accelerated the aging process in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicology letters. 235, 75-83 (2015).
  16. Yu, Z., Yin, D., Deng, H. The combinational effects between sulfonamides and metals on nematode Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and environmental safety. 111, 66-71 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroskopia poklatkowacytometria przepływowaanaliza w programie ImageJobrazowanie w stosach Zsortowanie nicienibarwienie jodkiem propidynypomiar szerokości głowyanaliza długości larw
Nowe wskaźniki charakteryzujące wydłużenie embrionalne nicieni Caenorhabditis elegans
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.