Ten artykuł przedstawia proste podejście do dostarczania nieciągłych gradientowych naprężeń statycznych na koncentrycznym hydrożelu wypełnionym komórkami w celu regulacji wyrównania komórek w inżynierii tkankowej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Gradient Strain Chip do stymulowania zachowań komórkowych w hydrożelu z komórkami
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Sztuczne prowadzenie do wyrównania komórek to gorący temat w dziedzinie inżynierii tkankowej. Większość wcześniejszych badań dotyczyła wyrównania komórkowego wywołanego pojedynczym szczepem na hydrożelu obciążonym komórkami przy użyciu złożonych procesów eksperymentalnych i systemów kontroli masy, które zwykle wiążą się z problemami z zanieczyszczeniem. Dlatego w tym artykule proponujemy proste podejście do budowy gradientowego odkształcenia statycznego przy użyciu chipa fluidycznego z plastikową osłoną PDMS i przezroczystym szklanym podłożem UV do stymulacji zachowania komórkowego w hydrożelu 3D. Przeciążenie fotowzorcowego prepolimeru komórkowego w komorze fluidalnej może wytworzyć wypukłą, zakrzywioną membranę PDMS na pokrywie. Po usieciowaniu UV, poprzez koncentryczny kołowy mikrowzór pod zakrzywioną membraną PDMS i mycie bufora, mikrośrodowisko do badania zachowań komórek pod różnymi szczepami gradientowymi jest ustalane w pojedynczym chipie fluidycznym, bez zewnętrznych instrumentów. Komórki NIH3T3 wykazano po zaobserwowaniu zmiany trendu wyrównania komórek pod kierunkiem geometrii, we współpracy ze stymulacją szczepów, która wahała się od 15 do 65% na hydrożelach. Po 3-dniowej inkubacji geometria hydrożelu zdominowała ułożenie komórek pod obciążeniem o niskiej kompresji, gdzie komórki ustawiały się wzdłuż kierunku wydłużania hydrożelu pod wpływem silnego odkształcenia ściskającego. Pomiędzy nimi komórki wykazywały losowe wyrównanie ze względu na rozproszenie radykalnego kierowania wydłużeniem hydrożelu i przewodnictwa geometrycznego wzorzystego hydrożelu.
Wprowadzenie
Służąc jako materiał blokowy, który naśladuje natywne mikrośrodowisko, hydrożel zawierający macierz zewnątrzkomórkową (ECM) może odbudować biomimetyczne rusztowania tkankowe, aby wspierać wzrost komórek. Aby posiadać funkcje tkanki, niezbędne jest zorganizowane wyrównanie komórek. Różne dopasowania komórek 2D (tj. komórki hodowane na powierzchni) i 3D (tj. komórki zamknięte w hydrożelu) uzyskano poprzez hodowlę lub enkapsulację komórek w elastycznych podłożach lub na elastycznych podłożach z mikro- lub nanowzorcami1. Wyrównanie komórek 3D w mikroarchitekturze jest bardziej atrakcyjne, ponieważ mikrośrodowisko jest bliższe naty....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Synteza GelMA
- Odważyć 10 g żelatyny w proszku i dodać ją do szklanej kolby ze 100 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco. Włożyć mieszadło magnetyczne do kolby i umieścić kolbę na mieszającej płycie grzejnej.
- Przykryj kolbę folią aluminiową, aby uniknąć parowania wody. Ustawić temperaturę płyty grzejnej na 50-60 °C, a mieszadło na 100 obr./min na 1 godzinę, aby dobrze rozpuścić żelatynę w proszku.
- Po rozpuszczeniu żelatyny bardzo powoli dodawać 8 ml bezwodnika metakrylowego (jedna kropla na sekundę) za pomocą pipety. Pozwól mu reagować w temperaturze 60 °C przez 3 godziny.
- Dodać wstępnie ogrzan....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby porównać zmienność mechaniczną każdego okrągłego hydrożelu w ukończonym chipie do stymulacji gradientowym odkształceniem, zmierzono szerokości linii każdego okrągłego hydrożelu w dwóch takich samych chipach, odpowiednio przy objętościach wtrysku 0 µL (Rycina 4a) i 40 µL (Rycina 4b). Procentowe wydłużenie dla każdego okręgu obliczono poprzez podzielenie wydłużeń w chipie z wtryskiem 40 µL przez szerokości linii odpowiadających.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym artykule przedstawiono proste podejście do porównania zachowania wyrównania komórek po prowadzeniu kształtu hydrożelu i rozciąganiu. Elastyczna membrana PDMS tworzy krzywiznę w kształcie kopuły do generowania różnych wysokości koncentrycznych okrągłych hydrożeli. Po zwolnieniu ciśnienia membrana PDMS automatycznie przykłada siłę do hydrożeli z mikrowzorem, tworząc gradientowe odkształcenie/wydłużenie, z maksimum w środku i minimum na zewnętrznej granicy. Ponieważ tworzenie odkształcenia gradientowego jest projektow.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ten projekt był wspierany przez Program Studiów Podyplomowych za Granicą (NSC-101-2917-I-007-010); Program Inżynierii Biomedycznej (NSC-101-2221-E-007-032-MY3); oraz Krajowy Program Nanotechnologii (NSC-101-2120-M-007-001-); oraz Ministerstwo Nauki i Technologii (MOST-104-2221-E-007-072-MY3), Narodowa Rada Nauki R.O.C., Tajwan. Autorzy chcieliby podziękować prof. Ali Khademhosseini, Guldenowi Camci-Unalowi, Arghya Paulowi i Ronglihowi Liao z Harvard Medical School za podzielenie się hydrożelem i technologią enkapsulacji komórek.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| probówka do mikrowirówek 1,5 ml | Argos Technologies | 03-391-161 | Ten można zastąpić neutralnym kolorem tubki 1,5 ml pokrytej folią aluminiową |
| 10x DPBS | Sigma-Aldrich | 56064C | |
| Alexa Fluor 488 falloidyna | Invitrogen | A12379 | |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| Sonda molekularna | Calcein | C1430 | Do znakowania żywotnych komórek |
| CCD | PCO. Obrazowanie | Pixelfly qe | |
| Roztwór przenikający przez błonę komórkową | Sigma-Aldrich | X100 | 0,5% Triton X-100 do przenikania błony komórkowej |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | Barwienie jądra komórkowego Membrana |
| dializowa | Sigma-Aldrich | D9527 | Granica masy cząsteczkowej = 14 000 |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| Taśma dwustronna | 3M | 8003 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Żelatyna | Sigma-Aldrich | G2500 | żel o mocy 300, typ A, ze skóry świni |
| Elektroniczny generator koronowy wysokiej częstotliwości | Produkty elektrotechniczne | MODEL BD-20 | |
| Bezwodnik metakrylowy | Sigma-Aldrich | 276685 | |
| Mikrostrzykawka | Hamilton | 80501 | 50 μ L |
| Mikroskop Olympus | IX71 | Zawiera dwa zestawy filtrów: LF405/LP-B-000 i LF488/LP-C-000 firmy Semrock | |
| Maszyna plazmowa | tlenowa Harrick plazma | PDC-001 | |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | P6148 | Do mocowania komórki |
| PDMS | DOW CORNING | Sylgard 184 | Mieszanina do produkcji odlewów chipowych PDMS |
| Pen-Strep | Gibco | 10378-016 | penicylina/streptomycyna |
| Fotoinicjator | CIBA | Irgacure 2959 | |
| Jodek propidyny | Sigma-Aldrich | P4170 | Do oznaczania martwych komórek |
| Sterylny kubek filtracyjny | Millipore | SCGPT05RE | |
| TMSPMA | Sigma-Aldrich | 440159 | Do immobilizacji hydrożelu |
| Ultradźwięki | Delta | D150H | 150W, 43kHz |
| światło UV | DAIHAN | WUV-L10 | |
| Liofilizator | FIRSTEK | 150311025 | |
| NIH3T3 (fibroblast) | Instytut Badawczo-Rozwojowy Przemysłu Spożywczego (FIRDI) | 08C0011 | |
| MOXI Z Mini automatyczny licznik komórek | ORFLO | MXZ001 |
Bibliografia
- Simmons, C. S., Petzold, B. C., Pruitt, B. L. Microsystems for biomimetic stimulation of cardiac cells. Lab Chip. 12 (18), 3235-3248 (2012).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 69....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
