Artykuł metodologiczny

Gradient Strain Chip do stymulowania zachowań komórkowych w hydrożelu z komórkami

DOI:

10.3791/53715

⸱

8 sierpnia 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of NanoEngineering and MicroSystems, National Tsing Hua University, 2Department of Engineering and System, National Tsing Hua University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia proste podejście do dostarczania nieciągłych gradientowych naprężeń statycznych na koncentrycznym hydrożelu wypełnionym komórkami w celu regulacji wyrównania komórek w inżynierii tkankowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sztuczne prowadzenie do wyrównania komórek to gorący temat w dziedzinie inżynierii tkankowej. Większość wcześniejszych badań dotyczyła wyrównania komórkowego wywołanego pojedynczym szczepem na hydrożelu obciążonym komórkami przy użyciu złożonych procesów eksperymentalnych i systemów kontroli masy, które zwykle wiążą się z problemami z zanieczyszczeniem. Dlatego w tym artykule proponujemy proste podejście do budowy gradientowego odkształcenia statycznego przy użyciu chipa fluidycznego z plastikową osłoną PDMS i przezroczystym szklanym podłożem UV do stymulacji zachowania komórkowego w hydrożelu 3D. Przeciążenie fotowzorcowego prepolimeru komórkowego w komorze fluidalnej może wytworzyć wypukłą, zakrzywioną membranę PDMS na pokrywie. Po usieciowaniu UV, poprzez koncentryczny kołowy mikrowzór pod zakrzywioną membraną PDMS i mycie bufora, mikrośrodowisko do badania zachowań komórek pod różnymi szczepami gradientowymi jest ustalane w pojedynczym chipie fluidycznym, bez zewnętrznych instrumentów. Komórki NIH3T3 wykazano po zaobserwowaniu zmiany trendu wyrównania komórek pod kierunkiem geometrii, we współpracy ze stymulacją szczepów, która wahała się od 15 do 65% na hydrożelach. Po 3-dniowej inkubacji geometria hydrożelu zdominowała ułożenie komórek pod obciążeniem o niskiej kompresji, gdzie komórki ustawiały się wzdłuż kierunku wydłużania hydrożelu pod wpływem silnego odkształcenia ściskającego. Pomiędzy nimi komórki wykazywały losowe wyrównanie ze względu na rozproszenie radykalnego kierowania wydłużeniem hydrożelu i przewodnictwa geometrycznego wzorzystego hydrożelu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Służąc jako materiał blokowy, który naśladuje natywne mikrośrodowisko, hydrożel zawierający macierz zewnątrzkomórkową (ECM) może odbudować biomimetyczne rusztowania tkankowe, aby wspierać wzrost komórek. Aby posiadać funkcje tkanki, niezbędne jest zorganizowane wyrównanie komórek. Różne dopasowania komórek 2D (tj. komórki hodowane na powierzchni) i 3D (tj. komórki zamknięte w hydrożelu) uzyskano poprzez hodowlę lub enkapsulację komórek w elastycznych podłożach lub na elastycznych podłożach z mikro- lub nanowzorcami1. Wyrównanie komórek 3D w mikroarchitekturze jest bardziej atrakcyjne, ponieważ mikrośrodowisko jest bliższe natywnemu konstruktowi tkankowemu2,3,4. Jednym z powszechnych podejść do wyrównywania komórek 3D jest geometryczna wskazówka hydrożelu shape2,3. Ze względu na ograniczoną przestrzeń do proliferacji komórek w kierunku krótkiej osi, komórki dążą do wyrównania wzdłuż kierunku długiej osi w hydrożelu o mikrowzorze. Innym podejściem jest zastosowanie rozciągania rozciągającego do hydrożeli w celu uzyskania wyrównania komórek równolegle do kierunku rozciągania4,5.

Stymulacja biofizyczna za pomocą hydrożeli ECM, takich jak napięcie kompresyjne lub pole elektryczne, może regulować funkcje komórek w celu prawidłowej integracji tkanek, proliferacji i różnicowania1,2,3. Przeprowadzono wiele badań w celu zbadania zachowania komórek poprzez zastosowanie jednego warunku szczepu na raz przy użyciu wielu mechanicznych jednostek sterujących4,6,7,8,9. Na przykład powszechne jest stosowanie mechanicznych silników krokowych ściskanych lub rozciąganych na hydrożelu kolagenowym 3D otoczonym komórkami 3D7,10. Jednak takie urządzenia kontrolne wymagają dodatkowej przestrzeni i borykają się z problemem zanieczyszczenia w inkubatorze7,9,11,12. Ponadto duży instrument nie jest w stanie zapewnić precyzyjnego środowiska sterowania, aby zapewnić wysoką odtwarzalność13.

Biorąc pod uwagę, że hydrożele zawierające komórki są zwykle stosowane w mikroskali do zastosowań biomedycznych, korzystne jest połączenie technik MEMS w celu wygenerowania szeregu stymulacji szczepu/rozciągania w celu jednoczesnego badania zachowań komórek w konstruktach biomimetycznych 3D in vitro2,14,15,16,17,18. Na przykład użycie ciśnienia gazu do deformacji membrany PDMS w chipach mikroprzepływowych może spowodować powstanie różnych szczepów, napędzając różnicowanie komórek do różnych linii9,16. Istnieje jednak wiele wyzwań technicznych, takich jak skomplikowane procesy produkcji chipów w pomieszczeniu czystym oraz integracja oprogramowania sterującego silnikami, pompami, zaworami i sprężonymi gazami.

W tej pracy pokazujemy proste podejście do uzyskania samopodtrzymującego się gradientowego układu mikroprzepływowego o statycznym naprężeniu, wykorzystując koncentryczny okrągły wzór hydrożelu i elastyczną membranę PDMS. W przeciwieństwie do większości istniejących podejść, nasza platforma jest przenośnym i jednorazowym miniaturowym urządzeniem, które można wytworzyć poza żółtym pomieszczeniem i które posiada samogenerujące się szczepy gradientowe na koncentrycznych hydrożelach zamkniętych w komórkach, bez zewnętrznego sprzętu mechanicznego podczas inkubacji. Zachowanie komórek fibroblastów 3T3, na które wpływa kombinacja kształtu hydrożelu i różnych wskazówek dotyczących rozciągania przy rozciąganiu, wykazano podczas obserwacji wyrównania komórek w środowiskach 3D ECM-mimetycznych w chipie odkształcenia gradientowego przez 3 dni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synteza GelMA

  1. Odważyć 10 g żelatyny w proszku i dodać ją do szklanej kolby ze 100 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco. Włożyć mieszadło magnetyczne do kolby i umieścić kolbę na mieszającej płycie grzejnej.
  2. Przykryj kolbę folią aluminiową, aby uniknąć parowania wody. Ustawić temperaturę płyty grzejnej na 50-60 °C, a mieszadło na 100 obr./min na 1 godzinę, aby dobrze rozpuścić żelatynę w proszku.
  3. Po rozpuszczeniu żelatyny bardzo powoli dodawać 8 ml bezwodnika metakrylowego (jedna kropla na sekundę) za pomocą pipety. Pozwól mu reagować w temperaturze 60 °C przez 3 godziny.
  4. Dodać wstępnie ogrzany DPBS (40 °C) do kolby do końcowej objętości 500 ml i pozostawić na 15 minut, aby zatrzymać reakcję.
  5. W międzyczasie przetnij membranę dializacyjną (masa cząsteczkowa odcięcia 14 kDa) na kilka rurek o długości 25 cm. Zanurz je w wodzie dejonizowanej (DI) na 15 minut i zawiąż węzeł, aby zamknąć jeden koniec rurek dializacyjnych.
  6. Załadować odpowiednią ilość (30 - 60 ml) roztworu polimeru do probówek dializacyjnych i zamknąć drugi koniec. Umieść je w 5-litrowej plastikowej zlewce z wodą DI na tydzień. Wodę demineralizowaną należy wymieniać dwa razy dziennie i utrzymywać roztwór w temperaturze 40 - 50 °C podczas procesu dializy.
  7. Zebrać roztwór z probówki do szklanej butelki o pojemności 500 ml. Wlej ~ 450 - 500 ml roztworu do kubka filtracyjnego o pojemności 500 ml (wielkość porów 0,22 μm) i zastosuj podciśnienie do kubka filtra, aby wymusić przejście roztworu przez membranę filtracyjną w celu sterylizacji.
  8. Przenieś wysterylizowany polimer do kilku wysterylizowanych probówek o pojemności 50 ml i przechowuj je w zamrażarce o temperaturze -80 °C przez 3 - 5 dni.
  9. Liofilizować polimer o temperaturze -80 °C przez 1 tydzień za pomocą liofilizatora, aby uzyskać GelMA. Przechowuj GelMA w zamrażarce w temperaturze -80 °C.

2. Modyfikacja 3-(trimetoksysililo)metakrylanu propylu (TMSPMA)

  1. Pokrój komercyjne szkiełka szklane na dwie małe części (25 mm x 37,5 mm) i zanurz je w 0,5 M roztworze NaOH na 4 godziny. Umyj szkiełka dużą ilością wody DI.
  2. Umieść szkiełko na stojaku w szklanym pojemniku z 95% etanolem i czyść za pomocą ultradźwięków o częstotliwości 43 kHz przez 15 minut. Wysuszyć szkiełko na powietrzu.
  3. Zanurz szkiełka w 5% TMSPMA w 99,5% etanolu na 1 godzinę.
  4. Umyj szkiełka w 95% etanolu, wysusz je na powietrzu i wyżarzaj powłokę TMSPMA w piecu w temperaturze 80 °C przez 2 godziny.

3. Produkcja chipów

  1. Weź jedną płytkę z polimetakrylanu metylu (PMMA) o grubości 2 mm i jedną 0,3 mm, nałóż taśmę dwustronną na jedną stronę powierzchni PMMA i zwolnij wkładkę z jednej strony. Pozostaw dwie płyty PMMA o grubości 2 mm i jedną płytę o grubości 1 mm bez taśmy dwustronnej.
  2. Wytnij laserowo płytę PMMA o grubości 2 mm bez taśmy dwustronnej na 42 mm x 30 mm w celu wykonania płyty dolnej. Wytnij płytę PMMA o grubości 2 mm za pomocą taśmy dwustronnej, aby wykonać ramkę graniczną o wymiarach zewnętrznych 42 mm x 30 mm i wymiarach wewnętrznych 37,5 mm x 25 mm.
  3. Wytnij laserowo płytkę PMMA o grubości 0,3 mm za pomocą taśmy dwustronnej w 12-milimetrowy środkowy okrąg z dwoma kanałami przepływowymi o szerokości 2 mm i długości 8 mm po przeciwnych stronach okręgu (Rysunek 1a).
  4. Aby przygotować formę PMMA do odlewania pokrywy PDMS, zmontuj trzy części elementów PMMA z kroków 3.2-3.3 (Rysunek 1b) za pomocą taśmy dwustronnej.
  5. Wytnij laserowo płytę PMMA o grubości 2 mm za pomocą taśmy dwustronnej na kawałek o wymiarach 5 cm x 5 cm z układem 3 x 3 pustych prostokątów o wymiarach 8,5 mm x 8,5 mm. Wytnij kolejny kawałek o wymiarach 5 cm x 5 cm za pomocą układu 3 x 3 pustych kółek o średnicy 4 mm. Wytnij laserowo płytę PMMA o grubości 1 mm bez taśmy dwustronnej na dolną płytę PMMA o wymiarach 5 cm x 5 cm.
  6. Przygotuj formę PMMA do odlewania wtyczki PDMS, montując trzy części komponentów PMMA z kroku 3.5 ( Rysunek 1c) za pomocą taśmy dwustronnej.
  7. Przygotować pokrywę PDMS i zatyczkę PDMS, odpowiednio mieszając 30 g elastomeru PDMS i 3 g utwardzacza PDMS; odgazowywać mieszaninę w komorze próżniowej przez 1 godzinę.
  8. Wlej 1,8-2,0 g mieszanki do formy PMMA na pokrywę PDMS i użyj odpowiedniej ilości do wypełnienia każdej wnęki formy PMMA dla wtyczki PDMS. Odlać 10 g nieutwardzonej mieszaniny PDMS na czystą 10-centymetrową płytkę z tworzywa sztucznego. Umieść te foremki w komorze próżniowej, aby odgazować na 30 minut.
  9. Utwardzać PDMS przez 2 godziny w temperaturze 80 °C. Po schłodzeniu utwardzonego PDMS na formie, należy odłączyć osłony PDMS i zaślepki PDMS od form PMMA.
  10. Przebić dwa otwory o średnicy około 3 mm na końcach kanałów przepływowych pokryw PDMS.
  11. Pokrój arkusz PDMS uformowany z 10-centymetrowej plastikowej płytki na wiele kostek o wymiarach 1 cm x 1 cm i wybij 3-milimetrowy otwór w każdej kostce PDMS. Przykleić dwie nieutwardzone kostki PDMS o wymiarach 1 cm x 1 cm do otworów pokrywy PDMS (aby służyły jako zbiorniki pożywki i wspomagały proces utwardzania gradientowych okrągłych wzorów hydrożelowych) i utwardzały przez 1 godzinę w temperaturze 80 °C.
  12. Przyklej pokrywy PDMS z dwoma zbiornikami PDMS na szkiełku pokrytym TMSPMA, poddając wstępnej obróbce stronę łączącą pokrywy PDMS i szkiełka pokrytego TMSPMA pod maszyną plazmową tlenową (moc RF 30 W (tryb wysoki) i sprężone powietrze 600 mTorr) lub elektronicznym generatorem koronowym wysokiej częstotliwości (115 V, 50/60 Hz, 0,35 A) przez 90 s obróbki plazmowejO2.
  13. Zetknąć się z plazmową powierzchnią pokryw PDMS i suwaka TMSPMA i mocno je docisnąć w celu trwałego połączenia poprzez utworzenie wiązania Si-O-Si.
    UWAGA: Umieszczenie frytki w piekarniku w temperaturze 80 °C na 1 godzinę może jeszcze bardziej zwiększyć siłę wiązania.
  14. Po schłodzeniu zanurz frytki w 95% etanolu na 15 minut i wysusz na powietrzu. Następnie sterylizuj wióry pod promieniowaniem UV przez 1 godzinę i przechowuj je w pudełku owiniętym folią aluminiową w kapturze laminarnym.

4. Statyczne odkształcenie gradientowe na hydrożelu wypełnionym komórkami

  1. Wydrukuj i wytnij kawałek fotomaski o wymiarach 25 mm x 37,5 mm, drukując układ w Rysunek 2b na przezroczystej folii. Dostosuj rozmiar wydruku Rysunek 2b, aby dopasować wymiar w Rysunek 2a.
  2. Przygotuj 100 ml pożywki DMEM z 10% FBS, 1% Pen-Strep i 250 ml DPBS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do użycia jako pożywka do hodowli komórkowych.
  3. Odważyć 25 mg liofilizowanego preparatu GelMA w 0,3 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) pożywki do hodowli komórkowych w czarnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Umieść probówkę do mikrowirówki na mieszadle laboratoryjnym/płycie grzejnej, aż GelMA rozpuści się w pożywce.
  4. Odważyć 50 mg fotoinicjatora w 1 ml DPBS w probówce do mikrowirówki i umieścić w piecu o temperaturze 80 °C na 15 minut lub do momentu, gdy fotoinicjator się rozpuści.
  5. Weź 25 μl 10% fotoinicjatora z kroku 4.4 i dodaj go do probówki mikrowirówkowej z kroku 4.3. Odpipetować kilka razy, aby dobrze wymieszać.
  6. Policz 3 x 106 komórek NIH 3T3 za pomocą automatycznego licznika komórek. Odwirować zawiesinę o sile 200 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 175 μl pożywki do hodowli komórkowych.
  7. Dodaj roztwór komórkowy z kroku 4.6 do probówki mikrowirówki z kroku 4.5, aby uzyskać prepolimerowy roztwór komórek o stężeniu 5% GelMA, 0,5% fotoinicjatora i ~6 x 106 komórek 3T3/ml. Po wymieszaniu załaduj 100 μl prepolimeru komórkowego do mikrostrzykawki o pojemności 100 μl.
  8. Ręcznie wyrównaj (patrz Rysunek 3a) kawałek fotomaski na dolnym szkiełku wysterylizowanego chipa odkształcenia gradientowego i po prostu ustal pozycję, używając małej kropli wody DI pomiędzy nimi. Podłącz mikrostrzykawkę o pojemności 100 μl wypełnioną roztworem ogniw prepolimerowych do wlotu chipa.
  9. Umieść (patrz klasa Rysunek 3b) 50 μl roztworu komórek prepolimerowych w kanale przepływowym za pomocą mikrostrzykawki, a następnie zatkaj wylot za pomocą wtyczki PDMS. Wstrzyknąć dodatkowe 40 μl roztworu, aby utworzyć wypukłe wybrzuszenie w okrągłej membranie PDMS.
  10. Przesuń chip z fotomaską (na dole), mikrostrzykawką (wlot) i wtyczką PDMS (wylot) z kroku 4.9 pod lampą UV (365 nm, 9 mW/cm2) i wystaw go na 30 - 45 s, aby usieciować koncentryczny okrągły hydrożel w komorze fluidycznej.
  11. Wyjmij zatyczkę PDMS i mikrostrzykawkę, aby uwolnić ciśnienie cieczy (patrz Rysunek 3c). Użyj strzykawki o pojemności 1 ml wypełnionej wstępnie podgrzanym DPBS, aby 3 razy wypłukać nieusieciowane żywice, spłukując je od wlotu do wylotu.
  12. Napełnij kanał przepływowy około 100 μl pożywki do hodowli komórkowych.
  13. Umieścić chip w wysterylizowanym naczyniu hodowlanym i kulturę w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C na tydzień. Odświeżaj podłoże każdego dnia.
  14. Zrób zdjęcia trzech chipów w dniu 0 po 4 godzinach inkubacji, jako grupa kontrolna, i trzech chipów w dniu 3, jako zestaw eksperymentalny, używając mikroskopu z obiektywem 20X. Zmierz szerokość linii każdego hydrożelu od linii 1 do linii 12 za pomocą oprogramowania (np. ImageJ), aby obliczyć naprężenia kompresujące ( Rysunek 4).
    UWAGA: Procent wydłużenia oblicza się, dzieląc wartość różnicy szerokości linii między 40 μL a 0 μL przez szerokość linii przy 40 μL.

5. Barwienie komórek do analizy wyrównania

  1. Za pomocą strzykawki wstrzyknąć 4% paraformaldehydu (PFA) w DPBS w temperaturze pokojowej do chipa przepływowego na 15 minut w celu utrwalenia hydrożelu wypełnionego komórkami.
    UWAGA: Uwaga. PFA jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
  2. Zastąp roztwór 0,5% roztworem przenikającym błonę komórkową w DPBS przez 10 minut, aby przeniknąć przez błonę komórkową w temperaturze pokojowej.
  3. PBS przemyć próbki 3 razy w odstępach od 5 do 10 minut między myciami (przy użyciu załadowanej strzykawki, jak w kroku 5.1).
  4. Załaduj 1% roztwór BSA do kanału fluidycznego na 45-60 minut w temperaturze pokojowej (za pomocą załadowanej strzykawki przez port wlotowy).
  5. Dodaj 1,5 ml metanolu do fiolki z falloidyną Alexa Fluor 488, aby uzyskać końcowe stężenie roztworu podstawowego 6,6 μM.
  6. Weź 5 μl falloidyny Alexa Fluor 488 z kroku 5.5 i rozcieńcz ją w 200 μl DPBS z 0,1% BSA, aby uzyskać końcowe stężenie 0,165 μM Alexa Fluor 488 falloidyny.
  7. Dodać 200 μl roztworu mieszaniny do kanału fluidycznego za pomocą mikropipety i inkubować chip w temperaturze 37 °C przez 45-60 minut w celu barwienia aktyny. PBS przemyć (jak wyżej) próbki 3 razy.
  8. Przygotować 1 μg/ml DAPI w PBS, przepuścić przez chip i wybarwić jądra komórkowe w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
  9. Pipetować DPBS do kanału fluidycznego, aby wypłukać roztwór barwiący i ponownie napełnić komorę fluidyczną roztworem PBS, aby wykonać zdjęcia za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
  10. Uchwyć obrazy fluorescencyjne komórek 3T3 w hydrożelach za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego pod 40-krotnym powiększeniem z detektorem CCD i zestawami filtrów ex / em przy 488/520 nm i 358/461 nm odpowiednio dla falloidyny Alexa Fluor 488 (aktyna) i DAPI (jądro).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby porównać mechaniczne różnice między każdym okrągłym hydrożelem w ukończonym chipie do stymulacji szczepów gradientowych, zmierzyliśmy szerokości linii każdego okrągłego hydrożelu w dwóch takich samych chipach, z objętościami wtrysku 0 μL (Rysunek 4a) i 40 μL (Rysunek 4b), odpowiednio. Wydłużenia procentowe w każdym okręgu obliczono, dzieląc wydłużenia w chipie wtryskiwanym 40 μl przez szerokości linii odpowiednich hydrożeli w chipie wtryskiwanym...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule przedstawiono proste podejście do porównania zachowania wyrównania komórek po prowadzeniu kształtu hydrożelu i rozciąganiu. Elastyczna membrana PDMS tworzy krzywiznę w kształcie kopuły do generowania różnych wysokości koncentrycznych okrągłych hydrożeli. Po zwolnieniu ciśnienia membrana PDMS automatycznie przykłada siłę do hydrożeli z mikrowzorem, tworząc gradientowe odkształcenie/wydłużenie, z maksimum w środku i minimum na zewnętrznej granicy. Ponieważ tworzenie odkształcenia gradientowego jest projektow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten projekt był wspierany przez Program Studiów Podyplomowych za Granicą (NSC-101-2917-I-007-010); Program Inżynierii Biomedycznej (NSC-101-2221-E-007-032-MY3); oraz Krajowy Program Nanotechnologii (NSC-101-2120-M-007-001-); oraz Ministerstwo Nauki i Technologii (MOST-104-2221-E-007-072-MY3), Narodowa Rada Nauki R.O.C., Tajwan. Autorzy chcieliby podziękować prof. Ali Khademhosseini, Guldenowi Camci-Unalowi, Arghya Paulowi i Ronglihowi Liao z Harvard Medical School za podzielenie się hydrożelem i technologią enkapsulacji komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
probówka do mikrowirówek 1,5 mlArgos Technologies 03-391-161Ten można zastąpić neutralnym kolorem tubki 1,5 ml pokrytej folią aluminiową
10x DPBSSigma-Aldrich56064C
Alexa Fluor 488 falloidyna InvitrogenA12379 
BSASigmaA1595
Sonda molekularnaCalceinC1430Do znakowania żywotnych komórek
CCDPCO. ObrazowaniePixelfly qe
Roztwór przenikający przez błonę komórkowąSigma-AldrichX1000,5% Triton X-100 do przenikania błony komórkowej
DAPISigma-AldrichD8417Barwienie jądra komórkowego Membrana
dializowaSigma-AldrichD9527Granica masy cząsteczkowej = 14 000
DMEMGibco11995-065
Taśma dwustronna3M8003
FBSHycloneSH30071.03
ŻelatynaSigma-AldrichG2500żel o mocy 300, typ A, ze skóry świni
Elektroniczny generator koronowy wysokiej częstotliwościProdukty elektrotechniczneMODEL BD-20
Bezwodnik metakrylowySigma-Aldrich276685
MikrostrzykawkaHamilton8050150 μ L 
Mikroskop OlympusIX71Zawiera dwa zestawy filtrów: LF405/LP-B-000 i LF488/LP-C-000 firmy Semrock
Maszyna plazmowatlenowa Harrick plazmaPDC-001
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148Do mocowania komórki
PDMSDOW CORNINGSylgard 184Mieszanina do produkcji odlewów chipowych PDMS
Pen-StrepGibco10378-016penicylina/streptomycyna
FotoinicjatorCIBAIrgacure 2959
Jodek propidynySigma-AldrichP4170Do oznaczania martwych komórek
Sterylny kubek filtracyjnyMilliporeSCGPT05RE
TMSPMASigma-Aldrich440159Do immobilizacji hydrożelu
UltradźwiękiDeltaD150H150W, 43kHz
światło UVDAIHANWUV-L10
LiofilizatorFIRSTEK150311025
NIH3T3 (fibroblast)Instytut Badawczo-Rozwojowy Przemysłu Spożywczego (FIRDI)08C0011
MOXI Z Mini automatyczny licznik komórekORFLOMXZ001

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simmons, C. S., Petzold, B. C., Pruitt, B. L. Microsystems for biomimetic stimulation of cardiac cells. Lab Chip. 12 (18), 3235-3248 (2012).
  2. Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
  3. Guan, J., et al. The stimulation of the cardiac differentiation of mesenchymal stem cells in tissue constructs that mimic myocardium structure and biomechanics. Biomaterials. 32 (24), 5568-5580 (2011).
  4. Wan, C. R., Chung, S., Kamm, R. D. Differentiation of embryonic stem cells into cardiomyocytes in a compliant microfluidic system. Ann Biomed Eng. 39 (6), 1840-1847 (2011).
  5. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  6. Li, X., Chu, J. S., Yang, L., Li, S. Anisotropic effects of mechanical strain on neural crest stem cells. Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 598-605 (2012).
  7. Butcher, J. T., Barrett, B. C., Nerem, R. M. Equibiaxial strain stimulates fibroblastic phenotype shift in smooth muscle cells in an engineered tissue model of the aortic wall. Biomaterials. 27 (30), 5252-5258 (2006).
  8. Ramon-Azcon, J., et al. Gelatin methacrylate as a promising hydrogel for 3D microscale organization and proliferation of dielectrophoretically patterned cells. Lab Chip. 12 (16), 2959-2969 (2012).
  9. Park, S. H., Sim, W. Y., Min, B. H., Yang, S. S., Khademhosseini, A., Kaplan, D. L. Chip-Based Comparison of the Osteogenesis of Human Bone Marrow- and Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells under Mechanical Stimulation. PLoS One. 7 (9), e46689(2012).
  10. Gould, R. A., et al. Cyclic Strain Anisotropy Regulates Valvular Interstitial Cell Phenotype and Tissue Remodeling in 3D Culture. Acta Biomater. 8 (5), 1710-1719 (2012).
  11. Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. Proc Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stemcells. Natl Acad Sci USA. 103 (44), 16095-16100 (2006).
  12. Sim, W. Y., Park, S. W., Park, S. H., Min, B. H., Park, S. R., Yang, S. S. A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation. Lab Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).
  13. Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L. Strain-Induced Alignment in Collagen Gels. PLoS One. 4 (6), e5902(2009).
  14. Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue Eng Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).
  15. Wan, J. Microfluidic-Based Synthesis of Hydrogel Particles for Cell Microencapsulation and Cell-Based Drug Delivery. Polymers. 4 (2), 1084-1108 (2012).
  16. Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).
  17. Keung, A. J., Kumar, S., Schaffer, D. V. Presentation Counts: Microenvironmental Regulation of Stem Cells by Biophysical and Material. Cues. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 533-556 (2010).
  18. Segers, V. F., Lee, R. T. Stem-cell therapy for cardiac disease. Nature. 451 (7181), 937-942 (2008).
  19. Hsieh, H. Y., et al. Gradient static-strain stimulation in a microfluidic chip for 3D cellular alignment. Lab Chip. 14 (3), 482-493 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Stymulacja zachowania kom rkowegohydro el 3Dprzygotowanie GelMApokrywa z PDMSsieciowanie UVwzorowanie fotomaskkom rki NIH3T3analiza gradientu odkszta ceniapomiar orientacji kom rek

Powiązane artykuły