Ten protokół opisuje test o wysokiej przepustowości do testowania preferencji składania jaj przez Drosophila melanogaster w rozdzielczości pojedynczego zwierzęcia. Ten test zapewnia prostą, wydajną i skalowalną platformę do identyfikacji genów i składników obwodów, które kontrolują prosty proces podejmowania decyzji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wysokoprzepustowy test do badania preferencji składania jaj u poszczególnych Drosophila melanogaster
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ostatnio, preferencja składania jaj przez Drosophila pojawiła się jako genetycznie podatny model do badania neuronalnych podstaw prostych procesów decyzyjnych. Wybierając miejsca do złożenia jaj, samice much są w stanie ocenić względną atrakcyjność swoich opcji i wybrać "większy z dwóch towarów". Jednak większość testów preferencji składania jaj nie jest praktyczna, jeśli ktoś chce przyjąć systematyczne genetyczne podejście przesiewowe w celu poszukiwania podstawy obwodu leżącego u podstaw tego prostego procesu podejmowania decyzji. ponieważ są one oparte na populacji i pracochłonne w konfiguracji. Aby zwiększyć wydajność badań nad preferencjami składania jaj przez pojedyncze samice, opracowaliśmy niestandardowe komory, z których każda może jednocześnie testować preferencje składania jaj nawet trzydziestu pojedynczych much, a także protokół, który zapewnia każdej samicy wysoki wskaźnik składania jaj (tak, aby ich preferencje były łatwo dostrzegalne i bardziej przekonujące). Nasze podejście jest proste do wykonania i daje bardzo spójne wyniki. Dodatkowo komory te mogą być wyposażone w różne przystawki, które umożliwiają nagrywanie wideo zwierząt składających jaja i dostarczają światło do badań optogenetycznych. Niniejszy artykuł zawiera plany wytwarzania tych komór oraz procedurę przygotowania much do testowania w tych komorach.
Wprowadzenie
Drosophila melanogaster to potężny genetyczny organizm modelowy do badania neuronalnych podstaw zachowań. Szybki rozwój narzędzi genetycznych do manipulowania neuronami w ukierunkowany sposób oraz pojawienie się wyrafinowanych narzędzi analizy behawioralnej znacznie poprawiły naszą zdolność do analizowania mechanizmów obwodów, które leżą u podstaw procesów transformacji czuciowo-motorycznej kilku wrodzonych i wyuczonych zachowań.
Składanie jaj przez Drosophila jest odpowiednim modelem do badania neuronalnych podstaw prostych procesów podejmowania decyzji. W szczególności wykazano, że samice Drosophila posiadają zdolność do porównywania i oceniania swoich opcji przed "zobowiązaniem" się do złożenia jaja w danej opcji4-8. Na przykład, gdy otrzymują tylko zwykły substrat (wolny od sacharozy) lub tylko substrat zawierający sacharozę, samice chętnie akceptują każdą opcję składania jaj. Jednakże, gdy przedstawiono im obie opcje, samice o dużej wytrzymałości odrzucają substrat sacharozy w niektórych kontekstach7,9,10. Stosunkowo niewiele wiadomo jednak o mechanizmach neuronalnych, które pozwalają kobietom "wybrać większy z dwóch dóbr". Główną przeszkodą jest brak skutecznej metody badania preferencji dotyczących składania jaj, tak aby można było zastosować systematyczne genetyczne badania przesiewowe w celu zbadania tego problemu.
W tym raporcie opisujemy opracowany przez nas protokół, który pozwala na badanie preferencji samic w zakresie składania jaj w rozdzielczości pojedynczego zwierzęcia i ze znacznie lepszą przepustowością i spójnością w porównaniu z poprzednimi metodami. W szczególności dostarczamy plany budowy zaprojektowanych przez nas komór, protokół przygotowania samic tak, aby każda z nich była przygotowana do złożenia wielu jaj oraz protokół korzystania z komór.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie muchówek do badania
- Hodowla jest podawana na standardowych podłożach z melasy/mąki kukurydzianej w inkubatorze ustawionym na temperaturę 25 °C i wilgotność 65%. Należy uważać, aby nie przepełnić fiolek. Na przykład umieść 8 samic i 6 samców w wąskiej fiolce z jedzeniem.
Uwaga: Zastosowana tutaj "wąska fiolka z żywnością" ma średnicę wewnętrzną 2,3 cm. Zazwyczaj dozowaliśmy około 10 ml pokarmu na muchy do każdej fiolki. Przepis na pokarm na muchy, którego użyliśmy, jest opisany tutaj: http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.html. - 2 - 3 dni po zamknięciu samic przygotuj fiolki ze świeżą pastą drożdżową, jak pokazano na rysunku 1E. Przygotować świeżą pastę drożdżową, mieszając 6 g aktywnych drożdży z 10 ml 0,5% kwasu proprionowego. Za pomocą szpatułki nałóż pastę drożdżową na boczną ściankę fiolek z żywnością. Zbierz do fiolek 30 - 35 zamkniętych samic wraz z 20 - 25 samcami.
- Ogólnie rzecz biorąc, należy zbierać samce z tych samych fiolek, w których zbierane są samice (aby zaoszczędzić czas i wysiłek). Jeśli jednak istnieje obawa o płodność samców, zamiast tego użyj samców WT. Pasta drożdżowa jest również ważna dla stymulacji produkcji jaj, dlatego codziennie przygotowuj ją na świeżo.
- Utrzymuj zebrane samice/samce w temperaturze 25 °C, wilgotności 65%, chyba że muchy są wrażliwe na temperaturę.
- Po ~ 4 - 5 dniach sprawdź fiolki, aby zobaczyć, czy samice są gotowe do eksperymentów ze składaniem jaj. Są gotowe, gdy powierzchnia podłoża pokarmowego jest mokra od larw aktywnie zagrzebujących się w pożywieniu (patrz rysunek 1E - F).
Uwaga: Samice zazwyczaj wstrzymują się ze składaniem jaj, gdy powierzchnia pokarmu staje się mokra i pełza od larw. Ten krok zapewnia, że samice będą gotowe do złożenia wielu jaj, gdy napotkają podłoża o pożądanej teksturze (np. ~1% agarozy).
2. Budowa komory, montaż, konfiguracja testu
- Zleć warsztatowi mechanicznemu zbudowanie akrylowych komór do składania jaj (Rysunek 1A - D). Rysunek techniczny różnych elementów przedstawiono na rysunku uzupełniającym 1 - 3. Zdjęcia w wysokiej rozdzielczości można również znaleźć tutaj (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
- Włóż plastikowe arkusze do załadowczej (górnej) części komory, jak pokazano na rysunku 1C. Służy ona jako dolna powierzchnia podczas załadunku much do poszczególnych aren składania jaj.
- Znieczul samice na podkładce CO2 i załaduj je pojedynczo do każdej areny składania jaj. Odczekaj ~30 minut, aby muchy zregenerowały się po CO2 i zaaklimatyzowały się w nowym środowisku.
- Przygotuj podłoża z agarozy.
- Dla wygody przechowuj gotową butelkę stopionej 1% agarozy w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C.
- Do stożkowej probówki o pojemności 50 ml dodać żądaną ilość roztworu sacharozy (2 M) i wymieszać z odpowiednią ilością agarozy. Na przykład, aby przygotować substrat sacharozy o objętości 150 mM, umieść 750 μl 2 M roztworu sacharozy w probówce, a następnie napełnij probówkę agarozą do oznaczenia 10 ml.
- Przygotuj zwykły substrat w ten sam sposób, ale dodaj wodę destylowaną zamiast roztworu sacharozy.
Uwaga: Końcowe stężenie agarozy w tym protokole wynosi nieco mniej niż 1%. Z naszego doświadczenia wynika, że dokładne stężenie agarozy nie ma znaczenia, o ile jest kontrolowane tak, aby mieściło się w granicach ~0,9 - 1,1% i że oba substraty mają takie samo stężenie agarozy.
- Wziąć substrat (dolny) część komory i odpipetować 1 000 μl substratu agarozowego do każdego koryta, jak pokazano na rysunku 1D.
- Pozostaw agarozę do zastygnięcia na ~30 min.
- Gdy podłoża agarozowe i muchy będą gotowe, zmontuj wszystkie trzy części komory do składania jaj, a następnie wyjmij plastikowe arkusze.
- Umieść komory w inkubatorach muchowych.
Uwaga: Czas trwania eksperymentów ze składaniem jaj może się różnić w zależności od potrzeb eksperymentalnych. Zazwyczaj przeprowadzamy eksperyment O/N (14 - 16 godzin). Nie zaobserwowano również istotnego wpływu czasu okołodobowego na preferencje dotyczące składania jaj. - Znieczulić samice, wstrzykując CO2 do komory. Zdemontuj komorę, wyrzuć znieczulone muchy do kostnicy na muchy (tj. pustej puszki po kawie wypełnionej olejem kukurydzianym). Zrób zdjęcia wyników w celu prowadzenia dokumentacji (zob. rysunek 2).
- Policz liczbę jaj ręcznie i oblicz wskaźniki preferencji do analizy. Obliczyć wskaźnik preferencji jako (Na - Nb)/(Na + Nb), gdzie Na i Nb reprezentują odpowiednio liczbę jaj w miejscu a w porównaniu z miejscem b.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Komory do składania jaj składają się z kilku elementów: elementu podstawy (dolnego), elementu dzielącego (środkowego), elementu załadunkowego (górnego) oraz 2 przesuwnych drzwiczek (Rysunek 1A - D). Elementy te służą do niezależnego przygotowania much i podłoży przed eksperymentami dotyczącymi składania jaj. Rysunek 1F przedstawia wygląd fiolek, gdy samice much są gotowe do składania jaj. Gdy muchy miały wybór między podłożem zwykłym a podłożem zawierając...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisane tutaj komory i protokoły mają kilka ulepszeń w porównaniu z poprzednimi testami składania jaj. Po pierwsze, znacznie zwiększają przepustowość oznaczania preferencji pojedynczych zwierząt. Każda komora może badać 30 pojedynczych samic, a jej rozstawienie zajmuje mniej niż godzinę. Po drugie, zwiększają spójność preferencji dotyczących składania jaj w porównaniu z poprzednimi metodami. Standaryzacja wymiarów hali, wielkości substratów do składania jaj oraz odległości między substratami ułatwia porównywanie wyników ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Duke Physics Shop, szczególnie Philowi Lewisowi, za pomoc w budowie aparatu behawioralnego i załączników oraz za stworzenie rysunku. Praca ta jest finansowana przez National Institutes of Health w ramach nagrody numer R01GM100027.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Ultraczysta agaroza | Invitrogen | 16500-500 | |
| Sacharoza | Sigma | S0389 | |
| Kąpiel wodna | Fisher | 15-462-6Q | |
| LifeCam Cinema kamera internetowa | Microsoft | H5D-00013 | |
| Czerwone diody LED | Cree | C503B-RAN-CA0B0AA1 | |
| Komory do składania jaj | Niestandardowe | ||
| uchwyty do kamer | Niestandardowe | ||
| uchwyty LED | Custom Built | ||
| Fiolki Fly (wąskie) | Genesee | 32-116 p.n.e |
Bibliografia
- Perisse, E., Burke, C., Huetteroth, W., Waddell, S. Shocking revelations and saccharin sweetness in the study of Drosophila olfactory memory. Curr. Biol. 23 (17), 752-763 (2013).
- Yamamoto, N. C., Koganezawa, M. Genes and circuits of courtship behaviour in Drosophila males. Nat. Rev. Neurosci. 14 (10), 681-692 (2013).
- Zwarts, L., Versteven, M., Callaerts, P. Genetics and neurobiology of aggression in Drosophila. Fly. 6 (1), 35-48 (2012).
- Joseph, R. M., Devineni, A. V., King, I. F., Heberlein, U. Oviposition preference for and positional avoidance of acetic acid provide a model for competing behavioral drives in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (27), 11352-11357 (2009).
- Miller, P. M., Saltz, J. B., Cochrane, V. A., Marcinkowski, C. M., Mobin, R., Turner, T. L. Natural variation in decision-making behavior in Drosophila melanogaster. PLoS One. 6 (1), 16436(2011).
- Schwartz, N. U., Zhong, L., Bellemer, A., Tracey, W. D. Egg-laying decisions in Drosophila are consistent with foraging costs of larval progeny. PloS One. 7 (5), 37910(2012).
- Yang, C. H., Belawat, P., Hafen, E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Drosophila egg-laying site selection a system to study simple decision-making processes. Science. 319 (5870), 1679-1683 (2008).
- Kacsoh, B. Z., Lynch, Z. R., Mortimer, N. T., Schlenke, T. A. Fruit flies medicate offspring after seeing parasites. Science. 339 (6122), 947-950 (2013).
- Wu, C. -L., Fu, T. -F., Chou, Y. -Y., Yeh, S. -R. A Single Pair of Neurons Modulates Egg-Laying Decisions in Drosophila. PloS one. 10 (3), e0121335(2015).
- Yang, C. H., He, R., Stern, U. Behavioral and circuit basis of sucrose rejection by Drosophila females in a simple decision-making task. J. Neurosci. 35 (4), 1396-1410 (2015).
- Gou, B., Liu, Y., Guntur, A. R., Stern, U., Yang, C. H. Mechanosensitive neurons on the internal reproductive tract contribute to egg-laying induced acetic acid attraction in Drosophila. Cell Rep. 9 (2), 522-530 (2014).
- Stern, U., Zhu, E. Y., He, R., Yang, C. H. Long-duration animal tracking in difficult lighting conditions. Sci. Rep. 5, 10432(2015).
- Zhu, E. Y., Guntur, A. R., He, R., Stern, U., Yang, C. H. Egg-laying demand induces aversion of UV light in Drosophila females. Curr. Biol. 24 (23), (2014).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat. Methods. 6, 451-457 (2009).
- Klatpoetke, N. C., et al. Independent Optical Excitation of Distinct Neural Populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
