Ekspresja transgenu za pośrednictwem HSV konstruktów chimerycznych w celu zbadania funkcji behawioralnej heteromerów GPCR u myszy

Summary

Ten artykuł opisuje, jak wstrzyknąć wektory wirusowe do kory czołowej myszy w celu przetestowania testów behawioralnych, które wymagają tworzenia heteromerycznego GPCR.

Abstract

Heteromeryczny kompleks receptorowy pomiędzy 5-HT_2A i mGlu2 został zamieszany w niektóre fenotypy behawioralne w mysich modelach psychozy^1,2. W związku z tym badanie szczegółów strukturalnych interakcji między 5-HT_2A i mGlu2 wpływających na zachowania związane ze schizofrenią stanowi potężne narzędzie translacyjne. Jak wykazano wcześniej, reakcja skurczu głowy (HTR) u myszy jest wywoływana przez leki halucynogenne i ta reakcja behawioralna jest nieobecna u myszy z nokautem 5-HT_2A (KO)^3,4. Dodatkowo, poprzez warunkową ekspresję receptora 5-HT_2A tylko w korze, wykazano, że zależne od receptora 5-HT_2A szlaki sygnałowe na korowych neuronach piramidowych są wystarczające do wywołania zachowania drgawek głowy w odpowiedzi na leki halucynogenne³. Wreszcie, wykazano, że reakcja behawioralna drgań głowy wywołana przez halucynogeny DOI i dietyloamid kwasu lizergowego (LSD) jest znacznie zmniejszona u myszy mGlu2-KO⁵. Odkrycia te sugerują, że mGlu2 jest przynajmniej częściowo niezbędny dla zależnych od receptora 5-HT_2A efektów behawioralnych podobnych do psychozy, indukowanych przez leki podobne do LSD. Nie dostarcza to jednak dowodów na to, czy kompleks receptora_{5-HT 2A-mGlu2} jest niezbędny dla tego fenotypu behawioralnego. Aby odpowiedzieć na to pytanie, wykorzystano konstrukty wirusa opryszczki pospolitej (HSV) do ekspresji mGlu2 lub mGlu2ΔTM4N (chimeryczny konstrukt mGlu2 / mGlu3, który nie tworzy kompleksu receptora 5-HT_2A-mGlu2) w korze czołowej myszy mGlu2-KO, aby zbadać, czy ten heteromeryczny kompleks GPCR jest potrzebny do efektów behawioralnych wywołanych przez leki podobne do LSD⁶.

Introduction

Halucynogeny, takie jak LSD, psylocybina i meskalina powodują znaczące zmiany w ludzkiej świadomości, poznaniu i emocjach^7-9. Inaktywacja sygnalizacji receptora serotoniny 5-HT_2A za pomocą metod genetycznych lub farmakologicznych powoduje znacznie osłabione reakcje behawioralne na halucynogeny zarówno u gryzoni^3,10, jak i u ludzi¹¹. Chociaż halucynogeny wiążą inne podtypy receptorów⁸, receptor_{5-HT 2A} jest uważany za niezbędny dla unikalnej aktywności behawioralnej tych substancji chemicznych.

Metabotropowe receptory glutaminianu grupy II (tj. mGlu2 i mGlu3) były prze....

Protocol

UWAGA: Wszystkie procedury związane z hodowlą i opieką nad zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z rozporządzeniem Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Icahn School of Medicine w Mount Sinai. Pamiętaj, aby używać sterylnych rękawiczek przez cały czas trwania zabiegu.

1. Przygotowanie leków i wirusów

1. Przygotowanie leku
   1. Przygotować 15,0 ml środka znieczulającego ketamina/ksylazyna, rozpuszczając 1,35 ml 100 mg/ml ketaminy i 0,75 ml 20 mg/ml ksylazyny w 12,9 ml 0,9% roztworu soli fizjologicznej. Dokładnie wymieszaj roztwór.
2. Przygotowanie wirusa ....

Results

Poprzednie wyniki pokazują, że mysia reakcja behawioralna drgań głowy jest niezawodnie i solidnie wywoływana przez halucynogeny, a nie występuje u myszy 5-HT_2A-KO ³. Ponadto wykazano, że reakcja skurczowa głowy wywołana przez halucynogennych agonistów 5-HT_2A DOI i LSD była znacznie zmniejszona u myszy mGlu2-KO⁵. Jednakże, chociaż poprzednie odkrycia przekonująco pokazują, że 5-HT_2A i mGlu2 są składane jako kompleks heteromeryczny .......

Discussion

Wraz z wcześniejszymi odkryciami na myszach mGlu2-KO⁵, wyniki z chimerycznymi konstruktami mGlu2 i mGlu2/mGlu3, które nie tworzą kompleksu receptora 5-HT_2A-mGlu2 w hodowanych komórkach, sugerują, że kompleks receptora heteromerycznego 5-HT_2A-mGlu2 w korze czołowej myszy jest potrzebny do wywołania drgań głowy przez halucynogenny 5-HT_2A podobny do LSD agonistów receptorów. Ograniczeniem tej metody jest to, że nie mierzy ona bliskiej bliskości molekularnej na poziomie subkomórkow.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
mGlu2 wektor bitronicznego wirusa opryszczki pospolitej (HSV)	MIT Core		mGlu2 i mGlu2DTM4N poddano subklonowaniu do bicystronicznego wektora wirusa HSV-GFP p1005 + HSV eksprymującego GFP pod kontrolą promotora CMV. Cząsteczki wirusa zostały wyprodukowane przez Viral Core Facility w Instytucie McGoverna (MIT). Aby uzyskać więcej informacji, prosimy o kontakt z dyrektorem, dr Rachael Neve (rneve@mit.edu)
mGlu2Δ Wektor wirusa opryszczki pospolitej (HSV) bicitronic TM4N	MIT Core		mGlu2 i mGlu2DTM4N poddano subklonowaniu do bicystronicznego wektora wirusa HSV-GFP p1005 + HSV eksprymującego GFP pod kontrolą promotora CMV. Cząsteczki wirusa zostały wyprodukowane przez Viral Core Facility w Instytucie McGoverna (MIT). Aby uzyskać więcej informacji, skontaktuj się z dyrektorem, dr Rachael Neve (rneve@mit.edu)
GFP wektor wirusa opryszczki pospolitej (HSV)	MIT Core		mGlu2 i mGlu2DTM4N poddano subklonowaniu do bicystronicznego wektora wirusa HSV-GFP p1005 + HSV eksprymującego GFP pod kontrolą promotora CMV. Cząsteczki wirusa zostały wyprodukowane przez Viral Core Facility w Instytucie McGoverna (MIT). Aby uzyskać więcej informacji, prosimy o kontakt z dyrektorem, dr Rachael Neve (rneve@mit.edu)
Xylazine	Nr Lloyd	List 4811-20ml, NADA #139-236, kod NDC: 61311-481-10	1,35 ml ketaminy (100 mg/ml) + 0,75 ml ksylazyny (20 mg/ml) rozcieńcza się w 12,0 ml 0,9% roztworu soli
fizjologicznej Ketamina	Vedco	KetaVed-10ml, NADA #200-029, NDC Kod(y): 50989-161-06	1,35 ml ketaminy (100 mg/ml) + 0,75 ml ksylazyny (20 mg/ml) rozcieńcza się w 12,0 ml 0,9% roztworu soli
Żel okulistyczny	Fisher Scientific	NC0550805
Klipsy do burwet	Fisher Scientific	NC9268369
Wodór Nadtlenek	Fisher Scientific	19-898-919
Strzykawka Hamilton	Fisher Scientific	14815203
Hamilton™ Małe wyjmowane igły w piaście (33 Ga)	Fisher Scientific	14816206
akumulatorowa mikrowiertarka	Fisher Scientific	NC9089241
Dermabond Klej skórny	Fisher Scientific	NC0690470
(±)-1-(2,5-dimetoksy-4-jodofenylo)-2-aminopropan chlorowodorek (DOI)	Sigma-Aldrich	42203-78-1	rozpuszczony w 0,9% roztworze soli do stężenia 2,0 mg/kg