Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza immunofluorescencyjna endogennych i egzogennych białek centromerowo-kinetochorowych

15.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53732

⸱

3 marca 2016

 , 
1Center for Childhood Cancer and Blood Diseases, Nationwide Children's Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokoły wykrywania endogennych i egzogennych białek centromer-kinetochoru w komórkach ludzkich i ilościowego określania tych poziomów białek w centromerach-kinetochorach poprzez pośrednie barwienie immunofluorescencyjne za pomocą utrwalania (utrwalanie paraformaldehydu, acetonu lub metanolu).

Streszczenie

"Centromery" i "kinetochory" odnoszą się do miejsca, w którym chromosomy łączą się z wrzecionem podczas podziału komórki. Bezpośrednia wizualizacja białek centromer-kinetochoru podczas cyklu komórkowego pozostaje podstawowym narzędziem w badaniu mechanizmów działania tych białek. Zaawansowane metody obrazowania w mikroskopii fluorescencyjnej zapewniają niezwykłą rozdzielczość składowych centromer-kinetochor i umożliwiają bezpośrednią obserwację określonych składników molekularnych centromerów i kinetochorów. Ponadto kluczowe znaczenie dla tych obserwacji mają metody pośredniego barwienia immunofluorescencyjnego (IIF) przy użyciu swoistych przeciwciał. Jednak pomimo licznych doniesień na temat protokołów IIF, niewiele z nich szczegółowo omawiało problemy specyficznych białek centromer-kinetochoru. 1-4 W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowane protokoły barwienia endogennych białek centromer-kinetochoru w komórkach ludzkich za pomocą wiązania paraformaldehydu i barwienia IIF. Ponadto opisujemy protokoły wykrywania egzogennych białek CENP-A znakowanych flagą w komórkach ludzkich poddanych utrwalaniu acetonem lub metanolem. Metody te są przydatne w wykrywaniu i ilościowym określaniu endogennych białek centromer-kinetochoru i białek CENP-A znakowanych flagą, w tym białek w komórkach ludzkich.

Wprowadzenie

"Centromery" zostały klasycznie zdefiniowane jako regiony stłumionej rekombinacji mejotycznej w genetyce, a później uznane za główne zwężenie chromosomów mitotycznych, co odgrywa istotną rolę w dokładnej segregacji chromosomów podczas mitozy. "Kinetochory" zostały opisane jako wielowarstwowe struktury, które wiążą się z mikrotubulami na powierzchni centromerów, jak ujawniła mikroskopia elektronowa; "kinetochory" zostały później zdefiniowane jako kompleks makromolekularny, który lokalizuje się w centromerze chromosomów mitotycznych. Pomimo dramatycznej rozbieżności w centromerowych sekwencjach DNA u kręgowców, struktura i skład kinetochoru są wysoce konserwatywne. Dynamiczna interakcja między mikrotubulami wrzeciona a kinetochorem jest wymagana do wiernej segregacji chromosomów podczas mitozy, a defekty funkcji centromeru-kinetochoru prowadzą do aneuploidii, a tym samym raka.

Centromer u większości eukariontów nie ma zdefiniowanej sekwencji DNA, ale składa się z dużych tablic (0,3-5 Mb) powtarzalnego alfoidalnego DNA składającego się z 171-bp α-satelitarnego DNA. Z wyjątkiem drożdży pączkujących, tożsamość centromerów osiąga się nie przez sekwencję DNA, ale przez obecność specjalnego nukleosomu, który zawiera wariant histonu H3 CenH3 (białko CENtromeru A [CENP-A] u ludzi). 5 Nukleosomów CENP-A lokalizuje się w wewnętrznej płytce kinetochorówssaków 7 i wiąże się z 171-pz α-satelitarnym DNA. Aktywne centromery wymagają nukleosomów zawierających CENP-A do kierowania rekrutacją konstytutywnej sieci związanej z centromerem (CCAN) i białek kinetochoru, które razem regulują przyłączanie chromosomów do wrzeciona mitotycznego i późniejszą progresję cyklu przez punkt kontrolny wrzeciona.

W świetle powyższych dowodów, CENP-A został zaproponowany jako epigenetyczny znak centromeru8; jednak proces, w którym CENP-A jest włączany do centromerowego DNA i czynniki odpowiedzialne za tę inkorporację nie zostały jeszcze dobrze scharakteryzowane. Krótka domena ukierunkowana na centromery (CATD) znajduje się w regionie fałdu histonowego CENP-A, a zastąpienie odpowiedniego regionu H3 CATD jest wystarczające do skierowania H3 do centromeru. 9 Kilka badań sugerowało funkcjonalne role modyfikacji potranslacyjnej (PTM) CENP-A12-16; jednak mechanizmy molekularne tych PTM CENP-A w rekrutacji do centromerów nie zostały jeszcze wyjaśnione. Wcześniej informowaliśmy, że aktywność ligazy E3 CUL4A-RBX1-COPS8 jest wymagana do ubikwitylacji CENP-A K124 i lokalizacji CENP-A do centromerów. 17

Odkrycie i charakterystyka białek kinetochoru doprowadziły do nowego wglądu w segregację chromosomów. 18 Za pomocą różnych metod zidentyfikowano ponad 100 składników kinetochoru w komórkach kręgowców. 19,20 Zrozumienie, w jaki sposób kinetochory składają się i funkcjonują, wynika również z charakterystyki funkcji komórkowych każdego białka centromer-kinetochoru i sieci białko-białko w komórkach. 19 Bezpośrednia wizualizacja i zaawansowane metody obrazowania w mikroskopii fluorescencyjnej zapewniają niezwykłą rozdzielczość składowych centromeru-kinetochoru i umożliwiają bezpośrednią obserwację określonych składników molekularnych centromerów i kinetochorów. Ponadto kluczowe znaczenie dla tych obserwacji mają metody pośredniego barwienia immunofluorescencyjnego (IIF) przy użyciu swoistych przeciwciał. Jednak pomimo licznych doniesień na temat protokołów IIF, niewiele z nich szczegółowo omawiało problemy specyficznych białek centromer-kinetochoru. 1-4 Dlatego niezwykle ważne jest opracowanie i raportowanie metod barwienia IIF oraz ilościowego testu IIF w celu specyficznej analizy każdego białka centromeru-kinetochoru. W barwieniu IIF należy postępować zgodnie z protokołem barwienia, aby uniknąć utraty interesującego białka lub reszty komórki. Jednak fiksacja czasami niszczy miejsca antygenowe, a różne kombinacje przeciwciało-antygen działają słabo z jednym utrwalaczem, ale bardzo dobrze z innym,21 a wybór utrwalacza zależy w dużej mierze od białka (białek) będących przedmiotem zainteresowania. Dlatego różne metody utrwalania mają kluczowe znaczenie w barwieniu IIF białek centromeru-kinetochoru.

Tutaj zoptymalizowano metody pośredniego barwienia immunofluorescencyjnego (IIF) oraz test do lokalizacji endogennych białek centromerowo-kinetochorowych, w tym CENP-A i egzogennych białek CENP-A znakowanych flagą, oraz opracowano ilościowe określanie tych białek w komórkach ludzkich. Metody te mogą być stosowane do analizy białek centromeru-kinetochoru u innych gatunków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórek i transfekcja

  1. Umieść szkiełko nakrywkę (2 mm x 22 mm) w polistyrenowej płytce 6-dołkowej. Opcjonalnie pokryj szkiełko nakrywkę polilizyną (Poly-L-Lysine), 0,1% w/v w wodzie (patrz Lista materiałów/sprzętu), aby utrzymać komórki w fazie mitozy na szkiełku nakrywce zgodnie z poniższymi krokami:
    Uwaga: Optymalne warunki należy dobrać dla każdej linii komórkowej i zastosowania.
    1. Aseptycznie pokryj powierzchnię hodowlaną polilizyną (Poly-L-Lysine), 0,1% w/v w wodzie (0,4 ml/dołek w polistyrenowej płytce 6-dołkowej). Delikatnie kołysz płytką, aby zapewnić równomierne pokrycie powierzchni hodowlanej.
    2. Po 5 min usuń roztwór poprzez aspirację i dokładnie wypłucz powierzchnię sterylną wodą klasy do hodowli tkanek.
    3. Susz przez co najmniej 2 h przed wprowadzeniem komórek i pożywki.
  2. Wysiej komórki HeLa17 lub komórki HeLa Tet-Off17,2 na szkiełko nakrywkę (2 mm x 2 mm) umieszczone w polistyrenowej płytce 6-dołkowej. Sprawdź, czy gęstość komórek wynosi 5,4 x 105 na dołek. Hoduj komórki w pożywce DMEM z wysoką zawartością glukozy z dodatkiem 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny.
    Uwaga: W celu uzyskania optymalnych wyników empirycznie dobierz gęstość komórek do wysiewania.
  3. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 18 h.
    Uwaga: W przypadku komórek HeLa Tet-Off transkrypcja genu egzogennego jest aktywna w obecności induktora (t.j. tetracykliny/doksycykliny), dlatego hoduj komórki bez tetracykliny/doksycykliny i dokonaj przejściowej transfekcji wektorem nadekspresyjnym pTRM4 (Tabela 2), którego transkrypcja jest regulowana przez promotor TRE (patrz poniżej).
  4. Osiemnaście godzin po wysianiu dokonaj transfekcji komórek w następujący sposób:
    1. Przygotuj roztwór A, mieszając 1,5 µl oligonukleotydu siRNA (roztwór stokowy po hybrydyzacji 20 µM; Tabela 1) i/lub 2,0 µg plazmidu (Tabela 2) w 50 µl pożywki z obniżoną zawartością surowicy (patrz Lista materiałów/sprzętu), a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 min.
      Uwaga: W tej analizie siRNA CA-UTR (mieszanina siRNA dla 5' i 3' UTR; Tabela 1) zostały współtransfekowane do zastosowania w protokołach 3 i 4 (patrz Dyskusja).
    2. Przygotuj roztwór B, mieszając 0,75 µl odczynnika do transfekcji I (patrz Lista materiałów/sprzętu) w 50 µl pożywki z obniżoną zawartością surowicy, a następnie inkubuj w RT przez 5 min.
      Uwaga: Opcjonalnym krokiem jest dodanie 1,0 µl odczynnika do transfekcji II (patrz Lista materiałów/sprzętu).
    3. Wymieszaj roztwory A i B, a następnie inkubuj w RT przez 15 min.
    4. Przemyj hodowlę komórkową raz buforem PBS, a następnie dodaj 50 µl pożywki z obniżoną zawartością surowicy do każdego dołka polistyrenowej płytki 6-dołkowej. Dodaj mieszaninę roztworów A i B (t.j. kompleks RNA i/lub DNA-lipid) bezpośrednio do każdego z poszczególnych dołków.
      Uwaga: Stężenie końcowe wynosi 3,3 µg/ml (plazmid); 50 nM (siRNA).
    5. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 4,5 h. Zmień pożywkę na DMEM z wysoką zawartością glukozy z dodatkiem 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny.
    6. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 48-72 h po transfekcji.
      Uwaga: W celu uzyskania optymalnych wyników należy empirycznie określić okres inkubacji dla wzrostu komórek przed fiksacją, a ubytek i/lub ekspresję białka należy potwierdzić za pomocą analizy Western blot (patrz Protokół 6).
    7. Jeśli analizowane są komórki w fazie mitozy, dodaj paclitaxel (10 nM) do hodowli komórkowych 24 h przed fiksacją lub dodaj TN16 (0,5 µM) do hodowli komórkowych 2,5 h przed fiksacją.

2. Fixacja komórek i barwienie immunofluorescencyjne w celu wykrycia endogennych białek centromerowo-kinetochorowych (fixacja paraformaldehydem)

  1. Przygotowanie utrwalacza, buforów i odczynników.
    1. Świeżo przygotować 50 ml 4% roztworu paraformaldehydu w PBS, pH 7,4.
      1. Do szklanego zlewki na mieszalce magnetycznej w wentylowanej komorze dodać 40 ml 1× PBS. Podgrzewać przy jednoczesnym mieszaniu do temperatury około 60 °CDo podgrzanego PBS dodać 2 g proszku paraformaldehydu.
      2. Powoli podnieść pH, dodając łącznie 1 ml 1 N NaOH, ponieważ proszek nie rozpuści się natychmiast.
        Uwaga: Po dodaniu NaOH roztwór staje się klarowny.
      3. Po rozpuszczeniu paraformaldehydu schłodzić i przefiltrować roztwór.
      4. Dostosować pH do wartości 7,4 za pomocą 1 N HCl oraz uzupełnić objętość roztworu do 50 ml za pomocą 1× PBS.
        Uwaga: Alikwoty roztworu można zamrozić lub przechowywać w temperaturze 2-8 °C przez okres do 1 tygodnia. Roztwór powinien być schłodzony do temperatury lodu lub przechowywany w 4 °C do momentu użycia.
    2. Przygotować 50 ml buforu KB1, składającego się z 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5% BSA oraz 0,5% Triton X-10.
      Uwaga: BSA należy dodać bezpośrednio przed użyciem.
      Uwaga: Bufory z serii KB opierają się na buforze KB opisanym w poprzednich raportach.1,2,4
    3. Przygotuj 50 ml buforu KB2, który składa się z 10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 150 mM NaCl oraz 0,5% BSA.
      Uwaga: BSA należy dodać bezpośrednio przed użyciem.
    4. Przygotować 1 ml buforu KB3 zawierającego DAPI (50 ng/ml).
    5. Przygotować 10 ml medium montażowego, składającego się z 1 mg/ml p-fenylenediamine, 10% PBS oraz 90% glicerolu.
      1. Dostosować pH 1× PBS do wartości 9,8 za pomocą 1 N NaOH, rozpuścić p-fenylenodiaminę w otrzymanym roztworze, a następnie dodać glicerol.
      2. Przechowywać aliquoty o objętości 1 ml w temperaturze -80 °CChronić przed światłem.
  2. Po 48–72 godzinach od transfekcji (patrz Protokół 1) usunąć pożywkę hodowlaną za pomocą aspiratora w celu utrwalenia komórek. Przepłukać komórki raz buforem PBS. Należy aplikować PBS po ściance studzienek hodowlanych, aby uniknąć naruszenia powierzchni komórek.
    Uwaga: Optymalny moment utrwalenia komórek musi zostać wyznaczony empirycznie.
  3. Utrwal komórki w 4% paraformaldehydzie w PBS przez 30 min w temperaturze 4 °CPrzepłukać komórki dwukrotnie buforem KB2, aby wystarczająco usunąć pozostałości 4% paraformaldehydu.
  4. Przeprowadzić permeabilizację próbek w buforze KB1 przez 30 min w temperaturze pokojowej. Przepłukać komórki raz buforem KB2, a następnie dodać bufor KB2 na 5 min w temperaturze pokojowej, aby dodatkowo zablokować miejsca niespecyficznego wiązania.
    Uwaga: Bufor KB1 również w znacznym stopniu przyczynia się do blokowania.
  5. Za pomocą pęsety wyjmij szkiełko nakrywowe (2 mm x 22 mm) z polistyrenowej płytki 6-dołkowej. Używając pisaka do tworzenia barier hydrofobowych (patrz Lista materiałów/sprzętu), narysuj jasnozielony kwadrat lub okrąg, aby utworzyć barierę hydrofobową wokół każdej próbki na szkiełku nakrywowym. Nie dotykaj komórek i nie zbliżaj pisaka do barier hydrofobowych zbyt blisko nich. Umieść szkiełko nakrywowe w nowej polistyrenowej płytce 6-dołkowej.
  6. Należy rozcieńczyć w buforze KB2 przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko białku centromerycznemu lub kinetochoremu (w stosunku rozcieńczenia od 1:10 do 1:20; patrz również Lista materiałów/sprzętu) oraz przeciwciało anty-CENP-B (w stosunku rozcieńczenia 1:40) lub przeciwciała antycentromerowe (ACA) (w stosunku rozcieńczenia 1:20) jako marker lokalizacji centromerów.
    Uwaga: Aby uzyskać optymalne wyniki, końcową stężenie przeciwciała pierwszorzędowego w tym roztworze należy ustalić empirycznie.
  7. Nanieś odpowiednią objętość (ok. 30 µl) rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego, aby zanurzyć próbkę komórek. Inkubować próbkę komórek przez 1 h w temperaturze 37 °CPrzepłukać komórki 3 razy buforem KB2.
  8. Przy użyciu buforu KB2 należy rozcieńczyć przeciwciało wtórne sprzężone z fluorochromem (w stosunku rozcieńczenia od 1:10 do 1:200), skierowane przeciwko każdemu z przeciwciał pierwotnych.
    Uwaga: Aby uzyskać optymalne wyniki, końcowe stężenie przeciwciała wtórnego w tym roztworze musi zostać określone drogą empiryczną.
  9. Nanieść odpowiednią objętość (kroplę ok. 30 µl (na szkiełku nakrywkowym) rozcieńczonego przeciwciała wtórnego, aby zanurzyć próbkę komórek. Inkubować próbkę komórek przez 1 h w temperaturze 37 °CPrzepłucz komórki 5 razy buforem KB2 w ciągu 30 min (pięć 6-minutowych płukań).
    Uwaga: Aby uzyskać optymalne wyniki (t. j.(w celu zminimalizowania utraty komórek), optymalne warunki płukania muszą zostać określone empirycznie.
  10. Nanieś odpowiednią objętość buforu KB3 zawierającego DAPI (50 ng/ml), aby zanurzyć próbkę komórek. Inkubuj próbkę komórek przez 5 min w temperaturze pokojowej. Przepłucz komórki 1-2 razy buforem KB2.
  11. Zamocuj szkiełko nakrywkowe zawierające próbkę komórek na szkiełku przedmiotowym.
    1. Nanieś kroplę medium montażowego na środek szkiełka przedmiotowego.
    2. Usunąć ciecz z próbki komórkowej i, używając rąk lub pęsety, umieścić próbkę w centrum szkiełka przedmiotowego. Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza.
    3. Nadmiar medium montażowego należy usunąć za pomocą ręcznika papierowego.

3. Fixacja komórek i barwienie immunofluorescencyjne białek CENP-A z znaczkiem Flag na terminalu C (fixacja acetonem)

  1. Przygotowanie
    1. Przygotować schłodzony w lodzie 75% aceton.
    2. Przygotuj świeżo 50 ml buforu PBS (pH 7,4) zawierającego 0,5% mleka odtłuszczonego i 0,5% BSA.
    3. Przygotuj na świeżo 50 ml buforu PBS (pH 7,4) zawierającego 0,1% mleka odtłuszczonego i 0,1% BSA.
    4. Przygotować 1 ml PBS (pH 7,4) zawierającego DAPI (50-10 ng/ml).
    5. Przygotować 10 ml medium montażowego zgodnie z opisem w punkcie 2.1.5.
  2. Usunąć pożywkę hodowlaną poprzez aspirację w 48–72 godzinie po transfekcji (patrz Protokół 1) w celu utrwalenia komórek. Przepłukać komórki raz za pomocą PBS. Nanosić PBS na ściankę dołka hodowlanego, aby uniknąć naruszenia powierzchni komórek.
    Uwaga: Optymalny punkt czasowy dla fiksacji komórek musi zostać wyznaczony empirycznie.
  3. Utrwal komórki w lodowatym 75% acetonie i inkubuj je przez 10 min w temperaturze -20 °CSuszyć komórki na szkiełku nakrywce w dygestorium przez 30–60 min w temperaturze pokojowej.
    Uwaga: Aby uzyskać optymalne wyniki, czas niezbędny do fiksacji i wysuszenia komórek musi zostać określony empirycznie.
  4. Za pomocą pisaka do tworzenia barier hydrofobowych (patrz Lista materiałów i sprzętu) narysuj bladozielony kwadrat lub okrąg, aby stworzyć barierę hydrofobową wokół każdej próbki na szkiełku nakrywce. Nie dotykaj komórek pisakiem do tworzenia barier hydrofobowych i nie zbliżaj go zbyt blisko nich.
  5. Zablokować nieswoiste miejsca wiązania na komórkach poprzez dodanie buforu PBS zawierającego 0,5% mleka odtłuszczonego i 0,5% BSA przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  6. Przy użyciu buforu PBS zawierającego 0,1% mleka odtłuszczonego i 0,1% BSA, należy rozcieńczyć przeciwciało anty-Flag (w stosunku 1:1 0) oraz przeciwciało anty-CENP-B (w stosunku 1:20) lub ACA (w stosunku 1:2 00) jako marker lokalizacji centromeru.
    Uwaga: W celu uzyskania optymalnych wyników należy drogą empiryczną określić końcowe stężenie przeciwciała pierwszorzędowego w tym roztworze.
  7. Nanieś odpowiednią objętość (ok. 30 µl) rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego, aby zanurzyć próbkę komórek. Inkubować próbkę komórek przez 1 h w temperaturze 37 °CPrzemyć komórki 5 razy buforem blokującym w ciągu 30 min.
    Uwaga: Komórki można przepłukać buforem PBS. Aby uzyskać optymalne wyniki (t. j., aby uniknąć utraty komórek), optymalne warunki płukania muszą zostać określone empirycznie.
  8. Rozcieńczyć przeciwciało wtórne sprzężone z fluorophorem (stosunek rozcieńczenia od 1:10 do 1:20), skierowane przeciwko każdemu z przeciwciał pierwszorzędowych, w buforze PBS zawierającym 0,1% mleka odtłuszczonego i 0,1% BSA.
    Uwaga: Aby uzyskać optymalne wyniki, końcowe stężenie przeciwciała wtórnego w tym roztworze musi zostać określone empirycznie.
  9. Nanieś odpowiednią objętość (ok. 30 µl) rozcieńczonego przeciwciała wtórnego, aby zanurzyć próbkę komórek. Inkubować próbkę komórek przez 1 h w temperaturze 37 °CPrzemyć komórki dwukrotnie buforem PBS zawierającym 0,1% mleka odtłuszczonego i 0,1% BSA.
    Uwaga: Do przemywania komórek można użyć również samego PBS.
  10. Nanieś odpowiednią objętość buforu PBS zawierającego DAPI (50-10 ng/ml), aby zanurzyć próbkę komórek. Inkubuj próbkę komórek przez 5 min w temperaturze pokojowej. Przepłucz komórki 1-2 razy buforem PBS.
  11. Zamocuj szkiełko nakrywowe zawierające próbkę komórek na preparacie mikroskopowym zgodnie z opisem w punkcie 2.1.

4. Fixacja komórek i barwienie immunofluorescencyjne białek CENP-A z N-końcowym tagiem Flag (fixacja metanolem)

  1. Przygotowanie
    1. Przygotować schłodzony do temperatury 0°C metanol.
    2. Przygotować bufor TBS (pH 7,4) zawierający 4% surowicy koziej.
    3. Przygotuj 1 ml buforu TBS (pH 7,4) zawierającego DAPI (50-10 ng/ml).
    4. Przygotować 100 ml medium montażowego zgodnie z opisem w punkcie 2.1.5.
  2. Usunąć pożywkę hodowlaną za pomocą aspiracji w 48–72 godzinie po transfekcji (patrz Protokół 1) w celu utrwalenia komórek. Przepłukać komórki raz buforem TBS. Nanieść TBS na ścianki studni hodowlanych, aby uniknąć naruszenia powierzchni komórek.
    Uwaga: Optymalny moment fiksacji komórek musi zostać określony empirycznie.
  3. Utrwal komórki w lodowatym metanolu i inkubuj je przez 6 min w temperaturze -20 °CPrzemyj komórki dwukrotnie buforem TBS, aby odpowiednio usunąć pozostałości metanolu.
  4. Używając pisaka do tworzenia barier hydrofobowych (patrz Lista materiałów/sprzętu), narysuj jasnozielony kwadrat lub okrąg, aby stworzyć barierę hydrofobową wokół każdej próbki na szkiełku nakrywce. Należy uważać, aby nie dotknąć komórek pisakiem do barier hydrofobowych ani nie zbliżyć go zbyt blisko nich.
  5. Zablokować nieswoiste miejsca wiązania na komórkach, dodając bufor TBS zawierający 4% surowicy koziej. Inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej.
  6. Rozcieńczyć przeciwciało anty-Flag (rozcieńczenie 1:10) oraz albo przeciwciało anty-CENP-B (stosunek rozcieńczenia 1:20), albo ACA (stosunek rozcieńczenia 1:20) jako marker lokalizacji centromerów w buforze TBS zawierającym 4% surowicy koziej.
    Uwaga: Aby uzyskać optymalne wyniki, końcowe stężenie przeciwciała pierwszorzędowego w tym roztworze musi zostać określone empirycznie.
  7. Nanieś odpowiednią objętość (ok. 30 µl) rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego, aby zanurzyć próbkę komórkową. Inkubować próbkę komórkową przez 1 h w temperaturze 37 °CPrzepłucz komórki 5 razy buforem blokującym w ciągu 30 min. Aby uzyskać optymalne wyniki (t. j., czyli minimalna strata komórek), optymalne warunki płukania muszą zostać określone empirycznie.
  8. Rozcieńczyć przeciwciało wtórne sprzężone z fluorochromem (stosunek rozcieńczenia od 1:10 do 1:20), skierowane przeciwko każdemu z przeciwciał pierwszorzędowych, w buforze TBS zawierającym 4% surowicy koziej.
    Uwaga: Aby uzyskać optymalne wyniki, końcowe stężenie przeciwciała wtórnego w tym roztworze musi zostać określone empirycznie.
  9. Nanieś odpowiednią objętość (ok. 30 µl) rozcieńczonego przeciwciała wtórnego, aby zanurzyć próbkę komórek. Inkubować próbkę komórek przez 1 h w temperaturze 37 °CPrzepłucz komórki trzykrotnie buforem blokującym.
  10. Nanieś odpowiednią objętość buforu TBS zawierającego DAPI (50-10 ng/ml), aby zanurzyć próbkę komórek. Inkubuj próbkę komórek przez 5 min w temperaturze pokojowej. Przepłucz komórki 1-2 razy buforem TBS.
  11. Zamocuj szkiełko nakrywowe zawierające próbkę komórek na szkiełku przedmiotowym zgodnie z opisem w punkcie 2.1.

5. Obserwacja, akwizycja, kwantyfikacja i analiza obrazów immunofluorescencyjnych

  1. Obserwować próbkę komórek za pomocą zmotoryzowanego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obiektywy imersyjne z olejem o powiększeniach 63X i 10X, zewnętrzne kompaktowe źródło światła oraz cyfrową kamerę CCD.
  2. Należy przeprowadzić akwizycję i przetwarzanie obrazów, w tym dekonwolucję, przy użyciu oprogramowania Software A lub oprogramowań B1 i B2 (patrz Lista Materiałów/Sprzętu). Wszystkie polecenia użyte w oprogramowaniu Software A znajdują się w dodatkowych plikach z kodem (Supplemental Code Files) w sekcji 5.2.1. Wszystkie polecenia użyte w oprogramowaniach B1 i B2 znajdują się w sekcji 5.2.2 w dodatkowych plikach z kodem (Supplemental Code Files).
  3. Zastosowano wcześniej opisaną metodę23-25 w celu ilościowego oznaczenia sygnałów białek centromerowo-kinetochorowych (np., pozostałe sygnały CENP-A w centromerze) z następującymi niewielkimi modyfikacjami:
    1. Wybierz obszar białek centromeryczno-kinetochorowych oraz obszar tła w następujący sposób:
      1. Komórka w fazie mitozy: (region centromerowo-kinetochorowy) wybierz obszar pokrywający się z chromosomami barwionymi DAPI; (region tła) obszar poza chromosomami, ale w obrębie tej samej pojedynczej komórki (t. j., region cytozolowy).
      2. Komórka w interfazie: (region centromer-kinetochor) obszar pokrywający się z chromatiną barwioną DAPI; (region tła) obszar poza chromatiną, ale w obrębie tej samej pojedynczej komórki (t.j., obszar cytozolowy).
        Uwaga: Zob. również pomocnicze pliki kodu (5.2.1.4.3) lub (5.2.2.6.4) w celu wyboru obszaru za pomocą oprogramowania Software A lub Software B2, odpowiednio.
    2. Ilościowo określ procent pozostałych sygnałów w centromerach, korzystając z oprogramowania A lub B. W tym celu zastosuj następujący wzór:
      Pozostałe sygnały białek centromerowo-kinetochorowych w obrębie centromeru i kinetochoru
      Równanie wyników chromatografii ΣS_sample(n)−b(n)/r_sample, wykres do porównania analiz.
      gdzie s jasność sygnału w wybranym obszarze, co zostało potwierdzone barwieniem na ACA lub CENP-B; b jest jasnością sygnału tła; rpróbka są sygnały referencyjne ACA lub CENP-B dla komórek traktowanych siRNA; oraz rkontrolna odniesienie sygnałów ACA lub CENP-B dla komórek przetransfekowanych siRNA Luc.
      Uwaga: W niniejszej analizie sygnały CENP-B zostały wykorzystane jako sygnały referencyjne dla CUL4A i RBX1, zgodnie z opisem w poprzednich raportach.17
      1. Do obliczeń należy wykorzystać plik programu Excel po skopiowaniu i wklejeniu surowych danych z opisanego powyżej oprogramowania do kwantyfikacji sygnału. Szczegóły znajdują się również w uzupełniających plikach kodu: (5.2.1.4) oraz (5.2.2.6). Jeden przykład obliczeń przedstawiono w Tabela 3.
    3. Należy przeanalizować co najmniej 20 komórek, aby wyeliminować zmienność w barwieniu i obrazowaniu dla każdego poziomu pomiaru. Opcjonalnie można wykorzystać „wartość średnią” pozostałych sygnałów centromera-kinetochoru dla każdej analizowanej komórki, aby porównać te wartości pomiędzy różnymi białkami centromera-kinetochoru.

6. Analiza Western Blot całkowitego białka

  1.  Resuspender komórki w buforze denaturującym A (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 50 mM NaCl; 0,5% Nonidet P-40; 0,5%t deoksycholanu; 0,5% SDS; 1 mM EDTA oraz kompletny koktajl inhibitorów proteaz bez EDTA),26 poddać zawiesinę sonikacji oraz procesowi zamrażania i rozmrażania, a następnie zmierzyć stężenia białek w następujący sposób:
    1. W procesie sonikacji dodać 50 µl buforu A do komórek zebranych z dwóch studzienek polistyrenowej płytki 6-dołkowej w 48–72 godzinach po transfekcji (patrz Protokół 1). Należy użyć sonikatora wyposażonego w pręt do dezintegracji i mikrokońcówkę (patrz Lista materiałów/sprzętu), stosując łączny czas trwania impulsów przerywanych wynoszący 15 s (cykl pracy 50%) na jedną próbkę.
    2. W celu przeprowadzenia procesu zamrażania i rozmrażania, zamrozić komórki w ciekłym azocie, a następnie rozmrozić je w temperaturze pokojowej.
    3. Zmierz stężenia białek, używając komercyjnego odczynnika do oznaczania białek I lub II (patrz Lista materiałów/sprzętu).
      Uwaga: W celu pomiaru stężeń białek przy użyciu odczynnika I lub II lizaty rozcieńcza się w stosunku 1:10. Przy takim rozcieńczeniu SDS obecny w buforze A wykazuje niewielką lub żadną interferencję w tym pomiarze.
  2. Wymieszać lizat zawierający 20-30 µg białka całkowitego z buforem do ładowania SDS-PAGE o stężeniu 2× lub 4×.27 Gotuj próbki przez 5 min, a następnie nałóż je na denaturujący żel poliakrylamidowy SDS o stężeniu 12,0%–15,0% do elektroforezy.
  3. Przenieś białka rozdzielone metodą SDS-PAGE na membranę PVDF, stosując wcześniej opisaną metodę Western blotting.17,24,27-31
    1. Zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania na błonie, używając 5% mleka odtłuszczonego w 1× PBS, a następnie inkubuj błonę z roztworami rozcieńczonych przeciwciał pierwotnych przez 1 h w temperaturze pokojowej. Szczegółowe informacje znajdują się w Liście materiałów/sprzętu (np. (stosunek rozcieńczenia) każdego przeciwciała pierwszorzędowego.
    2. Po przemyciu membrany 3-4 razy (każda inkubacja trwa od 3 do 5 min z wytrząsaniem) buforem PBS-T (1× PBS i 0,1% Tween-20), należy inkubować membranę przez 1 h w temperaturze pokojowej w mieszaninie przeciwciał wtórnych sprzężonych z barwnikiem fluorescencyjnym bliskiej podczerwieni (IR) (rozcieńczenie 1:20 0), przeciwciał wtórnych sprzężonych z DyLight (rozcieńczenie 1:20 0) i/lub przeciwciał wtórnych sprzężonych z peroksydazą chrzanową (HRP) (rozcieńczonych w PBS-T; rozcieńczenie 1:10 0). Szczegółowe informacje znajdują się w Liście Materiałów/Sprzętu (np. stosunek rozcieńczenia) każdego przeciwciała wtórnego.
  4. Przemyć membranę 3 razy, a następnie poddać ją skanowaniu w celu analizy białek przy użyciu systemu obrazowania w podczerwieni i/lub detektora chemiluminescencyjnego do detekcji immunoblottingowej (patrz Lista materiałów/sprzętu).
    1. W celu skorzystania z systemu obrazowania w podczerwieni należy zapoznać się z sekcją (6.4.1) w dodatkowych plikach kodu (Supplemental Code Files).
    2. W celu skorzystania z systemu obrazowania chemiluminescencyjnego należy zapoznać się z sekcją (6.4.2) w Plikach z Kodem Uzupełniającym. W tym systemie należy zastosować ultrasensytywny substrat do wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) (patrz Lista Materiałów/Sprzętu).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Analiza immunofluorescencyjna endogennego CENP-A potwierdza hipotezę, że ligaza E3 CUL4A jest niezbędna do lokalizacji CENP-A w centromerach
Nasze niedawne badania wykazały, że aktywność ligazy E3 CUL4A-RBX1-COPS8 jest wymagana do ubikwitynacji lizyny 124 (K124) w CENP-A oraz lokalizacji CENP-A w centromerach.17 Początkowo kompleks centromeru w interfazie (ICEN) został wyizolowany za pomocą natywnej immunoprecypitacji chromatyny z przeciwciałami anty-CENP-A...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W ostatnich latach w wielu badaniach opracowano różne ilościowe testy mikroskopowe dla komórek stałych. 42 Postęp w biologii centromerów i kinetochorów często wymaga zrozumienia specyficznej dla centromeru lub kinetochoru funkcji białek, których subkomórkowa regulacja przestrzenno-czasowa odzwierciedla zmieniające się funkcje tych białek podczas cyklu komórkowego. Dlatego opracowaliśmy tutaj metody barwienia IIF i ilościowy test IIF w celu specyficznej analizy względnych poziomów endogennych i egzogennych biał...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez GM68418 grantu NIH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Lipofectamin 2000Life Technologies/Invitrogen11668odczynnik do transfekcji I
Lipofektamin RNAiMAXLife Technologies/Invitrogen13778odczynnik do transfekcji II
Opti-MEM ILife Technologies/Invitrogen31985Zredukowane podłoże surowicy, ciepłe w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem
DMEM o wysokiej zawartości glukozy (Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium)Life Technologies/BioWhittaker12-604DMEM o wysokiej zawartości glukozy, ciepły w 37 stopniach; C Kąpiel wodna przed użyciem
Płodowa surowica bydlęca, certyfikowana, inaktywowana termicznie, pochodzenie z USALife Technologies/Gibco10082FBS (płodowa surowica bydlęca)
Poli-L-lizyna ROZTWÓRSIGMA-SLDRICHP 8920Poli-L-lizyna, 0,1% w/v, w wodzie
UltraPure Distilled WaterLife Technologies/Invitrogen/Gibco10977Sterylna woda klasy do hodowli tkankowych 
Szkło z mikro pokrywą (22 mm x 22 mm) Surgipath105Szkło nakrywkowe (22 mm x 22 mm) 
6-dołkowy klaster do hodowli komórkowychFisher/Corning Incorporated07-200-836-dołkowa płyta polistyrenowa 
Penicylina, Streptomycyna; LiquidFisher/Gibco15-140Penicylina-streptomycyna
PAP PEN Miejsce wiązaniaAD100.1Hydrofobowy długopis barierowy (do hydrofobowej bariery w barwieniu immunofluorescencyjnym)
Paklitaksel (Taxol)SIGMA-SLDRICHT7402Taxol do analizy komórek mitotycznych
TN-16, inhibitor mikrotubul (TN16)Enzo Life SciencesBML-T120TN16 do analizy komórek mitotycznych
BSA (albumina surowicy bydlęcej)SIGMA-SLDRICHA7906Odczynnik blokujący
Triton X-100SIGMA-SLDRICHT8787Detergent do przepuszczalności
ParaformaldehydSIGMA-SLDRICHP6148Reagant utrwalający
DAPISIGMA-SLDRICHD9542Do barwienia jądrowego
p-fenylenodiaminySIGMA-SLDRICHP6001Do montażu medium
Mikroprowadnice VWR, matoweVWR International48312-013Mikroprowadnice 
Przeciwciało anty-CENP-AStressgen/Enzo Life SciencesKAM-CC006Mysie przeciwciało monoklonalne; stosunek rozcieńczenia 1:100 (IIF), 1:5000 (WB)
Przeciwciało anty-CENP-BNovus BiologicalsH00001059-B01PMysie przeciwciało monoklonalne; stosunek rozcieńczenia 1:200 (IIF, wiązanie metanol/aceton)-1:400 (IIF, wiązanie paraformaldehydu)Przeciwciało
anty-CENP-B abcamab25734Przeciwciało poliklonalne królika; stosunek rozcieńczenia 1:200 (IIF, wiązanie metanol/aceton)-1:400 (IIF, wiązanie paraformaldehydu)Przeciwciało
anty-centromerowe (ACA)Fitzgerald Industries International, Inc.90C-CS1058Ludzka surowica centromerowa; stosunek rozcieńczenia 1:2000 (IIF)
Przeciwciało anty-CENP-HBethyl LaboratoriesBL1112 (A400-007A)Przeciwciało poliklonalne królika; stosunek rozcieńczenia 1:200 (IIF)
Przeciwciało anty-CENP-HBD612142Mysie przeciwciało monoklonalne; stosunek rozcieńczenia 1:200 (IIF)
Przeciwciało anty-CENP-IN/A, Dr. Katusmi Kitagawa N/A, Dr. Katusmi KitagawaPrzeciwciało poliklonalne królika; stosunek rozcieńczenia 1:1000 (IIF); Niikura i in., Onkogen, 4133-4146 (2006)
Przeciwciało anty-KNL1Novus BiologicalsNBP1-89223Przeciwciało poliklonalne królika; stosunek rozcieńczenia 1:100 (IIF)Przeciwciało
anty-Hec1Novus Biologicals / GeneTexNB 100-338 / GTX70268Mysie przeciwciało monoklonalne; stosunek rozcieńczenia 1:100 (IIF)
Przeciwciało anty-Hec1GeneTexGTX110735Przeciwciało poliklonalne królika; stosunek rozcieńczenia 1:100 (IIF)
Przeciwciało anty-Ska1abcamab46826Przeciwciało poliklonalne królika; stosunek rozcieńczenia 1:100 (IIF)
Przeciwciało Anti-FlagSIGMA-ALDRICHF3165Mysie przeciwciało monoklonalne; stosunek rozcieńczenia 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)
Przeciwciało Anti-FlagSIGMA-ALDRICHF7425Przeciwciało poliklonalne królika; stosunek rozcieńczenia 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)
Anty-CUL4A przeciwciałoN/A, Dr. Pradip RaychaudhuriN/A, Dr. Pradip RaychaudhuriPrzeciwciało poliklonalne królika; stosunek rozcieńczenia 1:3000 (WB); Shiyanov i wsp., Dziennik chemii biologicznej, 35309-35312 (1999)
Przeciwciało anty-RBX1Sygnalizacja komórkowa4397Przeciwciało poliklonalne królika; stosunek rozcieńczenia 1:2000 (WB)
Przeciwciało anty-GAPDHChemiconMAB374Mysie przeciwciało monoklonalne; stosunek rozcieńczenia 1:5000 (WB)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-MouseIgG Life Technologies/InvitrogenA11001przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem (przeciwciało drugorzędowe oczyszczone z powinowactwa)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgGLife Technologies/InvitrogenA11005drugorzędowe sprzężone z fluoroforem (przeciwciało drugorzędowe oczyszczone z powinowactwa)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgGLife Technologies/InvitrogenA11008drugorzędowe sprzężone z fluoroforem (przeciwciało drugorzędowe oczyszczone z powinowactwa)
Alexa Fluor 594 Kozia Anty-Królicza IgGLife Technologies/InvitrogenA11012drugorzędowe sprzężone z fluoroforem (przeciwciało drugorzędowe oczyszczone z powinowactwa)
Beztłuszczowe mleko w proszku (zatwierdzony zamiennik mleka w proszku z goździka)Fisher ScientificNC9255871 (nr zamówienia 190915; Lot# 90629)Odtłuszczone mleko
Leica DM IRE2 zmotoryzowany mikroskop fluorescencyjny Zmotoryzowany mikroskop fluorescencyjnyLeica
Obiektyw olejowy HCX PL APO 63xLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS63X Soczewka zanurzeniowa
olejowa HCX PL APO 100x Obiektyw immersyjny LeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE100X Obiektyw olejowy
Leica EL6000 Kompaktowe źródło światłaLeicaZewnętrzne kompaktowe źródło światła do wzbudzenia fluorescencyjnego
Cyfrowa kamera CCD ORCA-R2 Cyfrowa kamera CCDHamamatsuC10600-10B
Openlab wersja 5.5.2 Oprogramowanie do obrazowania naukowego Perkin Elmer/ImprovisionDo obserwacji, akwizycji, kwantyfikacji i analizy obrazu
Velocity wersja 6.1.1 Oprogramowanie do analizy obrazów 3D Perkin Elmer/ImprovisionDo obserwacji, akwizycji, kwantyfikacji i analizy obrazu
Kompletny koktajl inhibitorów proteaz bez EDTARoche11873580001/11836170001Inhibitor proteazy w tabletkach koktajlowych
PlusOne 2-D Quant KitAmersham Biosciences80-6483-56Komercyjny odczynnik do oznaczania białek I do pomiaru stężenia białka (kompatybilny z 2% SDS)
Bio-Rad Protein AssayBio-Rad500-0006Komercyjny odczynnik do oznaczania białek II do pomiaru stężenia białka (zgodny z 0,1% SDS)
Immobilon-FLEMD Membrana miliporowaIPFL00010PVDF do przenoszenia
IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgGLI-COR Biosciences926-32210IR fluorescencyjne przeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem (przeciwciało drugorzędowe oczyszczone z powinowactwa); współczynnik rozcieńczenia 1:20000 (IIF)
IRDye 680 Kozia IgG ANTY-KRÓLICZALI-COR Biosciences926-32221IR fluorescencyjne przeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem (przeciwciało drugorzędowe oczyszczone z powinowactwa); stosunek rozcieńczenia 1:20000 (IIF)
Kozioł anty-mysi IgG DyLight 549Fisher ScientificPI35507DyLight Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem IR fluorescencyjne przeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem (przeciwciało drugorzędowe oczyszczone z powinowactwa); stosunek rozcieńczenia 1:20000 Panie przewodniczący, panie i panowie!
Kozia anty-królik DyLight 649Fisher ScientificPI35565DyLight Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem DyLightPrzeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem fluorescencyjnym IR (przeciwciało drugorzędowe oczyszczone z powinowactwa); stosunek rozcieńczenia 1:20000 (IIF)
Kozioł anty-mysie IgG-HRPSanta CruzSC-2005Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z HRPPrzeciwciało drugorzędowe sprzężone z DyLightPrzeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem IR (powinowactwo oczyszczone wtórnie przeciwciało); stosunek rozcieńczenia 1:10000 (IIF)
Kozioł anty-króliczy IgG-HRPSanta CruzSC-2004Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z HRPPprzeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem DyLightPrzeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem IR (przeciwciało drugorzędowe oczyszczone z powinowactwa); stosunek rozcieńczenia 1:10000 (IIF)
Openlab wersja 5.5.2. Oprogramowanie do obrazowania naukowego Improvision/PerkinElmerSoftware A
Volocity wersja 6.3 Oprogramowanie do analizy obrazu 3D (akwizycja Volocity)PerkinElmerSoftware B1
Volocity wersja 6.3 Oprogramowanie do analizy obrazu 3D (kwantyfikacja objętości)PerkinElmerSoftware B2
Branson SONIFIER 450Sonicator
Branson Ultrasonics Sonicator Microtip Step, Solidny, Gwint 9,5 mmVWR Scientific Products Inc.  33995-325Klakson zakłócający do sonikacji
Branson Ultrasonics sonikator Mikrokońcówka stożkowa 6,5 mmVWR Scientific Products Inc.  33996-185Mikrokońcówka do sonikacji
Odyssey CLx System obrazowania w podczerwieni LI-COR BiosciencesSystem obrazowania w podczerwieni do wykrywania plam immunologicznych
Oprogramowanie do analizy Image Studio Ver 4.0 Oprogramowanie LI-COR BiosciencesC
Obrazowanie molekularne System Versadoc MP4000 Obrazowanie chemiluminescencyjneBio-Rad
Ilość Jedno oprogramowanie do analizy 1D Bio-RadSoftware D
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity SubstrateThermo34095Ultraczułe wzmocnione podłoże chemiluminescencyjne (ECL)
przeciwciało przeciwciało przeciwciało    do wykrywania immunoblot

Bibliografia

  1. DeLuca, J. G., et al. Hec1 and nuf2 are core components of the kinetochore outer plate essential for organizing microtubule attachment sites. Molecular biology of the cell. 16, 519-531 (2005).
  2. Earnshaw, W. C., Halligan, N., Cooke, C., Rothfield, N. The kinetochore is part of the metaphase chromosome scaffold. J Cell Biol. 98, 352-357 (1984).
  3. Hoffman, D. B., Pearson, C. G., Yen, T. J., Howell, B. J., Salmon, E. D. Microtubule-dependent changes in assembly of microtubule motor proteins and mitotic spindle checkpoint proteins at PtK1 kinetochores. Molecular biology of the cell. 12, 1995-2009 (2001).
  4. Regnier, V., et al. CENP-A is required for accurate chromosome segregation and sustained kinetochore association of BubR1. Mol Cell Biol. 25, 3967-3981 (2005).
  5. Bernad, R., Sanchez, P., Losada, A. Epigenetic specification of centromeres by CENP-A. Exp Cell Res. 315, 3233-3241 (2009).
  6. Black, B. E., Cleveland, D. W. Epigenetic centromere propagation and the nature of CENP-a nucleosomes. Cell. 144, 471-479 (2011).
  7. Warburton, P. E., et al. Immunolocalization of CENP-A suggests a distinct nucleosome structure at the inner kinetochore plate of active centromeres. Curr Biol. 7, 901-904 (1997).
  8. Karpen, G. H., Allshire, R. C. The case for epigenetic effects on centromere identity and function. Trends Genet. 13, 489-496 (1997).
  9. Black, B. E., et al. Structural determinants for generating centromeric chromatin. Nature. 430, 578-582 (2004).
  10. Black, B. E., et al. Centromere identity maintained by nucleosomes assembled with histone H3 containing the CENP-A targeting domain. Mol Cell. 25, 309-322 (2007).
  11. Fachinetti, D., et al. A two-step mechanism for epigenetic specification of centromere identity and function. Nat Cell Biol. 15, 1056-1066 (2013).
  12. Zeitlin, S. G., Shelby, R. D., Sullivan, K. F. CENP-A is phosphorylated by Aurora B kinase and plays an unexpected role in completion of cytokinesis. The Journal of cell biology. 155, 1147-1157 (2001).
  13. Zhang, X., Li, X., Marshall, J. B., Zhong, C. X., Dawe, R. K. Phosphoserines on maize CENTROMERIC HISTONE H3 and histone H3 demarcate the centromere and pericentromere during chromosome segregation. The Plant cell. 17, 572-583 (2005).
  14. Goutte-Gattat, D., et al. Phosphorylation of the CENP-A amino-terminus in mitotic centromeric chromatin is required for kinetochore function. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 8579-8584 (2013).
  15. Bailey, A. O., et al. Posttranslational modification of CENP-A influences the conformation of centromeric chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 11827-11832 (2013).
  16. Samel, A., Cuomo, A., Bonaldi, T., Ehrenhofer-Murray, A. E. Methylation of CenH3 arginine 37 regulates kinetochore integrity and chromosome segregation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9029-9034 (2012).
  17. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Dev Cell. , (2015).
  18. Chan, G. K., Liu, S. T., Yen, T. J. Kinetochore structure and function. Trends in cell biology. 15, 589-598 (2005).
  19. Hori, T., Okada, M., Maenaka, K., Fukagawa, T. CENP-O class proteins form a stable complex and are required for proper kinetochore function. Molecular biology of the cell. 19, 843-854 (2008).
  20. Fukagawa, T., Earnshaw, W. C. The centromere: chromatin foundation for the kinetochore machinery. Developmental cell. 30, 496-508 (2014).
  21. Kedersha, N. The Proteintech Blog.Proteintech. Grainger, D. , Proteintech Group. (2012).
  22. Clontech Laboratories, Inc. HeLa Tet-Off Advanced Cell Line. , Available from: http://www.clontech.com/CR/Products/Inducible_Systems/Tetracycline-Inducible_Expression/ibcGetAttachment.jsp?cItemId=26908&fileId=6712191&sitex=10020:22372:US (2012).
  23. Meraldi, P., Sorger, P. K. A dual role for Bub1 in the spindle checkpoint and chromosome congression. EMBO J. 24, 1621-1633 (2005).
  24. Niikura, Y., et al. 17-AAG, an Hsp90 inhibitor, causes kinetochore defects: a novel mechanism by which 17-AAG inhibits cell proliferation. Oncogene. 25, 4133-4146 (2006).
  25. Yang, Z., et al. Silencing mitosin induces misaligned chromosomes, premature chromosome decondensation before anaphase onset, and mitotic cell death. Mol Cell Biol. 25, 4062-4074 (2005).
  26. Wang, H., et al. Histone H3 and H4 ubiquitylation by the CUL4-DDB-ROC1 ubiquitin ligase facilitates cellular response to DNA damage. Mol Cell. 22, 383-394 (2006).
  27. Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR? Trends Biochem Sci. 20, 257-259 (1995).
  28. Kitagawa, K., Skowyra, D., Elledge, S. J., Harper, J. W., Hieter, P. SGT1 encodes an essential component of the yeast kinetochore assembly pathway and a novel subunit of the SCF ubiquitin ligase complex. Mol Cell. 4, 21-33 (1999).
  29. Niikura, Y., Dixit, A., Scott, R., Perkins, G., Kitagawa, K. BUB1 mediation of caspase-independent mitotic death determines cell fate. J Cell Biol. 178, 283-296 (2007).
  30. Niikura, Y., Kitagawa, K. Identification of a novel splice variant: human SGT1B (SUGT1B). DNA Seq. 14, 436-441 (2003).
  31. Niikura, Y., Ogi, H., Kikuchi, K., Kitagawa, K. BUB3 that dissociates from BUB1 activates caspase-independent mitotic death (CIMD). Cell Death Differ. 17, 1011-1024 (2010).
  32. Ando, S., Yang, H., Nozaki, N., Okazaki, T., Yoda, K. CENP-A, -B, and -C chromatin complex that contains the I-type alpha-satellite array constitutes the prekinetochore in HeLa cells. Mol Cell Biol. 22, 2229-2241 (2002).
  33. Izuta, H., et al. Comprehensive analysis of the ICEN (Interphase Centromere Complex) components enriched in the CENP-A chromatin of human cells. Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 11, 673-684 (2006).
  34. Obuse, C., et al. Proteomics analysis of the centromere complex from HeLa interphase cells: UV-damaged DNA binding protein 1 (DDB-1) is a component of the CEN-complex, while BMI-1 is transiently co-localized with the centromeric region in interphase. Genes Cells. 9, 105-120 (2004).
  35. Merlet, J., Burger, J., Gomes, J. E., Pintard, L. Regulation of cullin-RING E3 ubiquitin-ligases by neddylation and dimerization. Cell Mol Life Sci. 66, 1924-1938 (2009).
  36. Bennett, E. J., Rush, J., Gygi, S. P., Harper, J. W. Dynamics of cullin-RING ubiquitin ligase network revealed by systematic quantitative proteomics. Cell. 143, 951-965 (2010).
  37. Antonelli, A., et al. Efficient inhibition of macrophage TNF-alpha production upon targeted delivery of K48R ubiquitin. Br J Haematol. 104, 475-481 (1999).
  38. Codomo, C. A., Furuyama, T., Henikoff, S. CENP-A octamers do not confer a reduction in nucleosome height by AFM. Nat Struct Mol Biol. 21, 4-5 (2014).
  39. Thrower, J. S., Hoffman, L., Rechsteiner, M., Pickart, C. M. Recognition of the polyubiquitin proteolytic signal. The EMBO journal. 19, 94-102 (2000).
  40. Yoda, K., et al. Human centromere protein A (CENP-A) can replace histone H3 in nucleosome reconstitution in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 7266-7271 (2000).
  41. Shelby, R. D., Vafa, O., Sullivan, K. F. Assembly of CENP-A into centromeric chromatin requires a cooperative array of nucleosomal DNA contact sites. J Cell Biol. 136, 501-513 (1997).
  42. Majumder, S., Fisk, H. A. Quantitative immunofluorescence assay to measure the variation in protein levels at centrosomes. J Vis Exp. , (2014).
  43. Masumoto, H., Masukata, H., Muro, Y., Nozaki, N., Okazaki, T. A human centromere antigen (CENP-B) interacts with a short specific sequence in alphoid DNA, a human centromeric satellite. J Cell Biol. 109, 1963-1973 (1989).
  44. Yoda, K., Kitagawa, K., Masumoto, H., Muro, Y., Okazaki, T. A human centromere protein, CENP-B, has a DNA binding domain containing four potential alpha helices at the NH2 terminus, which is separable from dimerizing activity. J Cell Biol. 119, 1413-1427 (1992).
  45. Sugata, N., et al. Human CENP-H multimers colocalize with CENP-A and CENP-C at active centromere--kinetochore complexes. Hum Mol Genet. 9, 2919-2926 (2000).
  46. Earnshaw, W. C., Ratrie, H. 3rd, Stetten, G. Visualization of centromere proteins CENP-B and CENP-C on a stable dicentric chromosome in cytological spreads. Chromosoma. 98, 1-12 (1989).
  47. Goshima, G., Kiyomitsu, T., Yoda, K., Yanagida, M. Human centromere chromatin protein hMis12, essential for equal segregation, is independent of CENP-A loading pathway. J Cell Biol. 160, 25-39 (2003).
  48. Liu, S. T., Rattner, J. B., Jablonski, S. A., Yen, T. J. Mapping the assembly pathways that specify formation of the trilaminar kinetochore plates in human cells. J Cell Biol. 175, 41-53 (2006).
  49. Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. T time for point centromeres. Nat Cell Biol. 14, 559-561 (2012).
  50. Gascoigne, K. E., et al. Induced ectopic kinetochore assembly bypasses the requirement for CENP-A nucleosomes. Cell. 145, 410-422 (2011).
  51. Nishino, T., et al. CENP-T provides a structural platform for outer kinetochore assembly. EMBO J. 32, 424-436 (2013).
  52. Malvezzi, F., et al. A structural basis for kinetochore recruitment of the Ndc80 complex via two distinct centromere receptors. EMBO J. 32, 409-423 (2013).
  53. Schleiffer, A., et al. CENP-T proteins are conserved centromere receptors of the Ndc80 complex. Nat Cell Biol. 14, 604-613 (2012).
  54. Rago, F., Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. Distinct organization and regulation of the outer kinetochore KMN network downstream of CENP-C and CENP-T. Curr Biol. 25, 671-677 (2015).
  55. Nishino, T., et al. CENP-T-W-S-X forms a unique centromeric chromatin structure with a histone-like fold. Cell. 148, 487-501 (2012).
  56. Bodor, D. L., et al. The quantitative architecture of centromeric chromatin. Elife. 3, e02137(2014).
  57. Oliver, C. Ch 58. Molecular Biomethods Handbook. Rapely, R., Walker, J. M. , Humana Press. 1063-1079 (2008).
  58. Terasima, T., Tolmach, L. J. Changes in x-ray sensitivity of HeLa cells during the division cycle. Nature. 190, 1210-1211 (1961).
  59. Levenson, G. B. R. Ch 8. Biomedical Photonics Handbook. Vo-Dinh, T. uan , CRC Press LLC. 8-19 (2003).
  60. Sanderson, J. Fluorescence bleed-though. , Available from: http://www.gum2012.fionastoreydesign.co.uk/Downloads/Bleed through text.pdf (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Bia ka endogenne i egzogennefiksacja paraformaldehydemCENP A z tagiem Flaghodowla ludzkich kom rekpo rednie barwienie immunofluorescencyjnemikroskopia fluorescencyjnakwantyfikacja lokalizacji bia ekprotok fiksacji kom rek
Analiza immunofluorescencyjna endogennych i egzogennych białek centromerowo-kinetochorowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.