Method Article

Analiza immunofluorescencyjna endogennych i egzogennych białek centromer-kinetochoru

DOI:

10.3791/53732

⸱

March 3rd, 2016

 , 
1Center for Childhood Cancer and Blood Diseases, Nationwide Children's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokoły wykrywania endogennych i egzogennych białek centromer-kinetochoru w komórkach ludzkich i ilościowego określania tych poziomów białek w centromerach-kinetochorach poprzez pośrednie barwienie immunofluorescencyjne za pomocą utrwalania (utrwalanie paraformaldehydu, acetonu lub metanolu).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"Centromery" i "kinetochory" odnoszą się do miejsca, w którym chromosomy łączą się z wrzecionem podczas podziału komórki. Bezpośrednia wizualizacja białek centromer-kinetochoru podczas cyklu komórkowego pozostaje podstawowym narzędziem w badaniu mechanizmów działania tych białek. Zaawansowane metody obrazowania w mikroskopii fluorescencyjnej zapewniają niezwykłą rozdzielczość składowych centromer-kinetochor i umożliwiają bezpośrednią obserwację określonych składników molekularnych centromerów i kinetochorów. Ponadto kluczowe znaczenie dla tych obserwacji mają metody pośredniego barwienia immunofluorescencyjnego (IIF) przy użyciu swoistych przeciwciał. Jednak pomimo licznych doniesień na temat protokołów IIF, niewiele z nich szczegółowo omawiało problemy specyficznych białek centromer-kinetochoru. 1-4 W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowane protokoły barwienia endogennych białek centromer-kinetochoru w komórkach ludzkich za pomocą wiązania paraformaldehydu i barwienia IIF. Ponadto opisujemy protokoły wykrywania egzogennych białek CENP-A znakowanych flagą w komórkach ludzkich poddanych utrwalaniu acetonem lub metanolem. Metody te są przydatne w wykrywaniu i ilościowym określaniu endogennych białek centromer-kinetochoru i białek CENP-A znakowanych flagą, w tym białek w komórkach ludzkich.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"Centromery" zostały klasycznie zdefiniowane jako regiony stłumionej rekombinacji mejotycznej w genetyce, a później uznane za główne zwężenie chromosomów mitotycznych, co odgrywa istotną rolę w dokładnej segregacji chromosomów podczas mitozy. "Kinetochory" zostały opisane jako wielowarstwowe struktury, które wiążą się z mikrotubulami na powierzchni centromerów, jak ujawniła mikroskopia elektronowa; "kinetochory" zostały później zdefiniowane jako kompleks makromolekularny, który lokalizuje się w centromerze chromosomów mitotycznych. Pomimo dramatycznej rozbieżności w centromerowych sekwencjach DNA u kręgowców, struktura i skład kinetochoru są wysoce konserwatywne. Dynamiczna interakcja między mikrotubulami wrzeciona a kinetochorem jest wymagana do wiernej segregacji chromosomów podczas mitozy, a defekty funkcji centromeru-kinetochoru prowadzą do aneuploidii, a tym samym raka.

Centromer u większości eukariontów nie ma zdefiniowanej sekwencji DNA, ale składa się z dużych tablic (0,3-5 Mb) powtarzalnego alfoidalnego DNA składającego się z 171-bp α-satelitarnego DNA. Z wyjątkiem drożdży pączkujących, tożsamość centromerów osiąga się nie przez sekwencję DNA, ale przez obecność specjalnego nukleosomu, który zawiera wariant histonu H3 CenH3 (białko CENtromeru A [CENP-A] u ludzi). 5 Nukleosomów CENP-A lokalizuje się w wewnętrznej płytce kinetochorówssaków 7 i wiąże się z 171-pz α-satelitarnym DNA. Aktywne centromery wymagają nukleosomów zawierających CENP-A do kierowania rekrutacją konstytutywnej sieci związanej z centromerem (CCAN) i białek kinetochoru, które razem regulują przyłączanie chromosomów do wrzeciona mitotycznego i późniejszą progresję cyklu przez punkt kontrolny wrzeciona.

W świetle powyższych dowodów, CENP-A został zaproponowany jako epigenetyczny znak centromeru8; jednak proces, w którym CENP-A jest włączany do centromerowego DNA i czynniki odpowiedzialne za tę inkorporację nie zostały jeszcze dobrze scharakteryzowane. Krótka domena ukierunkowana na centromery (CATD) znajduje się w regionie fałdu histonowego CENP-A, a zastąpienie odpowiedniego regionu H3 CATD jest wystarczające do skierowania H3 do centromeru. 9 Kilka badań sugerowało funkcjonalne role modyfikacji potranslacyjnej (PTM) CENP-A12-16; jednak mechanizmy molekularne tych PTM CENP-A w rekrutacji do centromerów nie zostały jeszcze wyjaśnione. Wcześniej informowaliśmy, że aktywność ligazy E3 CUL4A-RBX1-COPS8 jest wymagana do ubikwitylacji CENP-A K124 i lokalizacji CENP-A do centromerów. 17

Odkrycie i charakterystyka białek kinetochoru doprowadziły do nowego wglądu w segregację chromosomów. 18 Za pomocą różnych metod zidentyfikowano ponad 100 składników kinetochoru w komórkach kręgowców. 19,20 Zrozumienie, w jaki sposób kinetochory składają się i funkcjonują, wynika również z charakterystyki funkcji komórkowych każdego białka centromer-kinetochoru i sieci białko-białko w komórkach. 19 Bezpośrednia wizualizacja i zaawansowane metody obrazowania w mikroskopii fluorescencyjnej zapewniają niezwykłą rozdzielczość składowych centromeru-kinetochoru i umożliwiają bezpośrednią obserwację określonych składników molekularnych centromerów i kinetochorów. Ponadto kluczowe znaczenie dla tych obserwacji mają metody pośredniego barwienia immunofluorescencyjnego (IIF) przy użyciu swoistych przeciwciał. Jednak pomimo licznych doniesień na temat protokołów IIF, niewiele z nich szczegółowo omawiało problemy specyficznych białek centromer-kinetochoru. 1-4 Dlatego niezwykle ważne jest opracowanie i raportowanie metod barwienia IIF oraz ilościowego testu IIF w celu specyficznej analizy każdego białka centromeru-kinetochoru. W barwieniu IIF należy postępować zgodnie z protokołem barwienia, aby uniknąć utraty interesującego białka lub reszty komórki. Jednak fiksacja czasami niszczy miejsca antygenowe, a różne kombinacje przeciwciało-antygen działają słabo z jednym utrwalaczem, ale bardzo dobrze z innym,21 a wybór utrwalacza zależy w dużej mierze od białka (białek) będących przedmiotem zainteresowania. Dlatego różne metody utrwalania mają kluczowe znaczenie w barwieniu IIF białek centromeru-kinetochoru.

Tutaj zoptymalizowano metody pośredniego barwienia immunofluorescencyjnego (IIF) oraz test do lokalizacji endogennych białek centromerowo-kinetochorowych, w tym CENP-A i egzogennych białek CENP-A znakowanych flagą, oraz opracowano ilościowe określanie tych białek w komórkach ludzkich. Metody te mogą być stosowane do analizy białek centromeru-kinetochoru u innych gatunków.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórkowa i transfekcja

  1. Umieść szkło nakrywkowe (22 mm x 22 mm) w 6-dołkowej płytce polistyrenowej. Opcjonalnie pokryj szkło nakrywkowe poli-L-lizyną, 0,1% w/v, w wodzie (patrz Lista materiałów/sprzętu), aby utrzymać komórki mitotyczne na szkle nakrywkowym, wykonując poniższe czynności:
    Uwaga: Optymalne warunki muszą być określone dla każdej linii komórkowej i zastosowania.
    1. Aseptyczne pokrycie powierzchni hodowli poli-L-lizyną, 0,1% w/v, w wodzie (0,4 ml/studzienkę 6-dołkowej płytki polistyrenowej). Delikatnie kołysz, aby zapewnić równomierne pokrycie powierzchni hodowli.
    2. Po 5 minutach usunąć roztwór przez aspirację i dokładnie spłukać powierzchnię sterylną wodą z kultur tkankowych.
    3. Suszyć co najmniej 2 godziny przed wprowadzeniem komórek i podłoża.
  2. Wysiewaj komórki HeLa17 lub HeLa Tet-Off17,22 na szkle nakrywkowym (22 mm x 22 mm) umieść w 6-dołkowej płytce polistyrenowej. Sprawdź, czy gęstość komórek wynosi 5,4 x 105 na studzienkę. Hodowla komórek w DMEM o wysokiej zawartości glukozy z 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny.
    Uwaga: Aby uzyskać optymalne wyniki, empirycznie określ gęstość komórek, która ma być używana podczas wysiewu.
  3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 18 godzin.
    Uwaga: W przypadku komórek HeLa Tet-Off transkrypcja genu egzogennego jest aktywna pod nieobecność induktora (tj. tetracykliny/doksycykliny), dlatego hoduje się komórki bez tetracykliny/doksycykliny i transfekuje przejściowo z wektorem nadekspresji pTRM4 (Tabela 2), którego transkrypcja jest regulowana przez promotor TRE (patrz poniżej).
  4. Osiemnaście godzin po wysiewie przetransfekuj komórki w następujący sposób:
    1. Przygotować roztwór A, mieszając 1,5 μl oligonukleotydy siRNA (20 μM wyżarzonego bulionu; Tabela 1) i/lub 2,0 μg plazmidu (Tabela 2) w 50 μl zredukowanej pożywki surowicy (patrz Wykaz materiałów/sprzętu) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
      Uwaga: W tej analizie siRNA CA-UTR (mieszanina siRNA 5' i 3' UTR; Tabela 1) zostały przetransfekowane w celu wykorzystania w protokołach 3 i 4 (zob. Dyskusja).
    2. Przygotować roztwór B, mieszając 0,75 μl odczynnika do transfekcji I (patrz Wykaz materiałów/sprzętu) w 50 μl zredukowanej pożywki surowicy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
      Uwaga: Opcjonalnym krokiem jest dodanie 1,0 μl odczynnika do transfekcji II (patrz Lista materiałów/sprzętu).
    3. Zmieszać ze sobą roztwory A i B i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    4. Umyj wyhodowane komórki raz PBS, a następnie dodaj 500 μl zredukowanej pożywki surowicy do każdego dołka 6-dołkowej płytki polistyrenowej. Dodaj mieszaninę roztworów A i B (tj. RNA i / lub kompleksu DNA-lipid) bezpośrednio do każdego z indywidualnych studzienek.
      Uwaga: Stężenie końcowe wynosi 3,3 μg/ml (plazmid); 50 nM (siRNA).
    5. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 4,5 godziny. Zmienić podłoże na DMEM o wysokiej zawartości glukozy z 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny.
    6. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 48–72 godziny po transfekcji.
      Uwaga: W celu uzyskania optymalnych wyników, okres inkubacji dla wzrostu komórek przed utrwaleniem musi być określony empirycznie, a zubożenie i/lub ekspresja białka muszą być potwierdzone za pomocą analizy Western blot (patrz Protokół 6).
    7. Jeśli interesująca jest analiza komórek mitotycznych, dodać paklitaksel (10 nM) do hodowanych komórek 24 godziny przed utrwaleniem lub dodać TN16 (0,5 μM) do hodowanych komórek 2,5 godziny przed utrwaleniem.

2. Utrwalanie komórek i barwienie immunofluorescencyjne w celu wykrycia endogennych białek centromeru kinetochorowego (wiązanie paraformaldehydu)

  1. Przygotowanie utrwalacza, i odczynników.
    1. Świeżo przygotować 50 ml 4% roztworu paraformaldehydu w PBS, pH 7,4.
      1. Dodać 40 ml 1× PBS do szklanej zlewki na mieszadło umieszczonym w wentylowanym kapturze. Podgrzać mieszając do około 60 °C. Dodać 2 g proszku paraformaldehydu do podgrzanego PBS.
      2. Powoli podnosić pH, dodając łącznie 1 ml 1 N NaOH, ponieważ proszek nie rozpuści się natychmiast.
        Uwaga: Roztwór klaruje się po dodaniu NaOH.
      3. Po rozpuszczeniu paraformaldehydu ostudzić i przefiltrować roztwór.
      4. Dostosować pH za pomocą 1 N HCl do pH 7,4, a objętość roztworu za pomocą 1× PBS do 50 ml.
        Uwaga: Podwielokrotności roztworu można zamrozić lub przechowywać w temperaturze 2-8 °C przez okres do 1 tygodnia. Roztwór powinien być lodowaty lub przechowywany w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
    2. Przygotować 50 ml buforu KB1, który składa się z 10 mM Tris-HCl o pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% BSA i 0,5% Triton X-100,
      Uwaga: BSA powinno być świeżo dodane.
      Uwaga: Seria KB jest oparta na KB opisanych w poprzednich raportach. 1,2,4
    3. Przygotować 50 ml buforu KB2, który składa się z 10 mM Tris-HCl o pH 7,5; 150 mM NaCl; i 0,5% BSA.
      Uwaga: BSA powinno być świeżo dodane.
    4. Przygotować 1 ml buforu KB3 zawierającego DAPI (50 ng/ml).
    5. Przygotować 100 ml podłoża mocującego, które składa się z 1 mg/ml p-fenylenodiaminy, 10% PBS i 90% glicerolu.
      1. Dostosować pH 1× PBS do 9,8 za pomocą 1 N NaOH, rozpuścić p-fenylenodiaminę w roztworze, a następnie dodać glicerol.
      2. Przechowywać 1 ml porcji w temperaturze -80 °C. Chronić przed światłem.
  2. Usunąć pożywkę hodowlaną przez aspirację w 48-72 godzinach po transfekcji (patrz protokół 1) w celu utrwalenia komórek. Przepłucz komórki raz za pomocą PBS. Nałożyć PBS na bok dołków hodowlanych, aby uniknąć naruszenia powierzchni komórek.
    Uwaga: Optymalny punkt czasowy dla utrwalenia komórek musi być określony empirycznie.
  3. Utrwalić komórki w 4% paraformaldehydzie w PBS przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przepłukać komórki dwukrotnie buforem KB2, aby usunąć pozostałości 4% paraformaldehydu.
  4. Próbki należy przepuszczać w buforze KB1 przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przepłukać komórki raz buforem KB2 i dodać bufor KB2 przez 5 minut w temperaturze pokojowej do dodatkowych miejsc blokowych niespecyficznego wiązania.
    Uwaga: Bufor KB1 również w znacznym stopniu przyczynia się do blokowania.
  5. Usuń szklankę nakrywkową (22 mm x 22 mm) z 6-dołkowej płytki polistyrenowej za pomocą kleszczy. Za pomocą pisaka do bariery hydrofobowej (patrz Lista materiałów/sprzętu) narysuj bladozielony kwadrat lub okrąg, aby utworzyć hydrofobową barierę wokół każdej próbki szkła nakrywkowego. Nie dotykaj ani nie zbliżaj się zbytnio do komórek za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego. Umieść szkło nakrywkowe w nowej 6-dołkowej płytce polistyrenowej.
  6. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało przeciwko białkom centromerowym lub kinetochorowym (stosunek rozcieńczenia 1:100 do 1:200; patrz także Wykaz materiałów/urządzeń) i przeciwciało anty-CENP-B (stosunek rozcieńczenia 1:400) lub przeciwciało anty-centromerowe (ACA) (stosunek rozcieńczenia 1:2 000) jako znacznik lokalizacji centromerów w buforze KB2.
    Uwaga: Aby uzyskać optymalne wyniki, końcowe stężenie przeciwciała pierwszorzędowego w tym roztworze należy określić empirycznie.
  7. Nanieść odpowiednią objętość (ok. 30 μl) rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego, aby zanurzyć próbkę komórki. Inkubować próbkę komórek przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Przepłukać komórki 3 razy buforem KB2.
  8. Używając buforu KB2, rozcieńczyć sprzężone z fluoroforem przeciwciało drugorzędowe (stosunek rozcieńczenia 1:100 do 1:200) skierowane przeciwko każdemu przeciwciału pierwszorzędowemu.
    Uwaga: Aby uzyskać optymalne wyniki, końcowe stężenie przeciwciała drugorzędowego w tym roztworze należy określić empirycznie.
  9. Nanieść odpowiednią objętość (kropla ok. 30 μl na szkło nakrywkowe) rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego, aby zanurzyć próbkę komórki. Inkubować próbkę komórek przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Przepłukać komórki 5 razy buforem KB2 przez okres 30 minut (pięć 6-minutowych płukań).
    Uwaga: Aby uzyskać optymalne wyniki (tj. zminimalizować utratę komórek), optymalne warunki prania muszą być określone empirycznie.
  10. Zastosować wystarczającą objętość buforu KB3 zawierającego DAPI (50 ng/ml), aby zanurzyć próbkę komórki. Inkubować próbkę komórek przez 5 minut w temperaturze pokojowej tonacji. Przepłukać komórki 1-2 razy buforem KB2.
  11. Zamontuj szkiełko nakrywkowe, które zawiera próbkę komórki, na mikroszkiełku.
    1. Umieść kroplę medium montażowego na środku mikroszkiełka.
    2. Usuń płyn z próbki celi i za pomocą rąk lub kleszczy umieść próbkę na środku mikroszkiełka. Unikaj pęcherzyków powietrza.
    3. Usuń nadmiar nośnika montażowego ręcznikiem papierowym.

3. Utrwalanie komórek i barwienie immunofluorescencyjne białek CENP-A oznaczonych flagą C-końcową (utrwalanie acetonu)

  1. preparat
    1. Przygotuj lodowaty 75% aceton.
    2. Świeżo przygotuj 50 ml PBS (pH 7,4) zawierającego 0,5% odtłuszczonego mleka i 0,5% BSA.
    3. Świeżo przygotuj 50 ml PBS (pH 7,4) zawierającego 0,1% odtłuszczonego mleka i 0,1% BSA.
    4. Przygotować 1 ml PBS (pH 7,4) zawierającego DAPI (50-100 ng/ml).
    5. Przygotować 100 ml podłoża do sporządzania roztworu, jak opisano w ppkt 2.1.5.
  2. Usunąć pożywkę hodowlaną przez aspirację w 48-72 godzinach po transfekcji (patrz protokół 1) w celu utrwalenia komórek. Przepłucz komórki raz za pomocą PBS. Dobrze nałóż PBS na bok hodowli, aby uniknąć naruszenia powierzchni komórek.
    Uwaga: Optymalny punkt czasowy dla utrwalenia komórek musi być określony empirycznie.
  3. Utrwalić komórki w lodowatym 75% acetonie i inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze -20 °C. Wysuszyć komórki na szkle nakrywkowym w dygestorium przez 30-60 minut w temperaturze RT.
    Uwaga: Aby uzyskać optymalne wyniki, czas potrzebny do utrwalenia i wysuszenia komórek musi być określony empirycznie.
  4. Za pomocą pisaka do bariery hydrofobowej (patrz Lista materiałów/sprzętu) narysuj bladozielony kwadrat lub okrąg, aby utworzyć hydrofobową barierę wokół każdej próbki szkła nakrywkowego. Nie dotykaj ani nie zbliżaj się zbytnio do komórek za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego.
  5. Zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania na komórkach, dodając PBS zawierający 0,5% odtłuszczonego mleka i 0,5% BSA przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Używając PBS zawierającego 0,1% mleka odtłuszczonego i 0,1% BSA, rozcieńczyć przeciwciało anty-Flag (stosunek rozcieńczenia 1:1,000) i przeciwciało anty-CENP-B (stosunek rozcieńczenia 1:200) lub ACA (stosunek rozcieńczenia 1:2,000) jako znacznik lokalizacji centromerów.
    Uwaga: Aby uzyskać optymalne wyniki, końcowe stężenie przeciwciała pierwszorzędowego w tym roztworze należy określić empirycznie.
  7. Nanieść odpowiednią objętość (ok. 30 μl) rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego, aby zanurzyć próbkę komórki. Inkubować próbkę komórkową przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Przepłukać komórki 5 razy buforem blokującym przez okres 30 min.
    Uwaga: Komórki można przepłukać PBS. Aby uzyskać optymalne wyniki (tj. uniknąć utraty komórek), optymalne warunki mycia muszą być określone empirycznie.
  8. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem (stosunek rozcieńczenia 1:100 do 1:200) skierowane przeciwko każdemu przeciwciału pierwszorzędowemu w PBS zawierającym 0,1% mleka odtłuszczonego i 0,1% BSA.
    Uwaga: Aby uzyskać optymalne wyniki, końcowe stężenie przeciwciała drugorzędowego w tym roztworze należy określić empirycznie.
  9. Nanieść wystarczającą objętość (ok. 30 μl) rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego, aby zanurzyć próbkę komórki. Inkubować próbkę komórek przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Przepłukać komórki 2 razy PBS zawierającym 0,1% odtłuszczonego mleka i 0,1% BSA.
    Uwaga: Sam PBS może być również używany do mycia komórek.
  10. Nałożyć wystarczającą objętość PBS zawierającego DAPI (50-100 ng/ml), aby zanurzyć próbkę komórki. Inkubować próbkę komórek przez 5 minut w temperaturze pokojowej at. Przepłukać komórki 1-2 razy PBS.
  11. Zamontować szkło nakrywkowe zawierające próbkę celi na mikroszkiełku w sposób opisany w ppkt 2.11.

4. Utrwalanie komórek i barwienie immunofluorescencyjne N-końcowych białek CENP-A oznaczonych flagą (wiązanie metanolu)

  1. preparat
    1. Przygotuj lodowaty metanol.
    2. Przygotuj TBS (pH 7,4) zawierający 4% koziej surowicy.
    3. Przygotować 1 ml TBS (pH 7,4) zawierającego DAPI (50-100 ng/ml).
    4. Przygotować 100 ml podłoża do sporządzania roztworu, jak opisano w ppkt 2.1.5.
  2. Usunąć pożywkę hodowlaną przez aspirację w 48-72 godzinach po transfekcji (patrz protokół 1) w celu utrwalenia komórek. Jednokrotne przepłukanie komórek za pomocą TBS. Nałożyć TBS na bok studzienek hodowlanych, aby uniknąć naruszenia powierzchni komórek.
    Uwaga: Optymalny punkt czasowy dla utrwalenia komórek musi być określony empirycznie.
  3. Umieścić komórki w lodowatym metanolu i inkubować komórki przez 6 minut w temperaturze -20 °C. Przepłukać komórki dwukrotnie TBS, aby w wystarczającym stopniu usunąć resztki metanolu.
  4. Za pomocą pisaka do bariery hydrofobowej (patrz Lista materiałów/sprzętu) narysuj bladozielony kwadrat lub okrąg, aby utworzyć hydrofobową barierę wokół każdej próbki szkła nakrywkowego. Nie dotykaj ani nie zbliżaj się zbytnio do komórek za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego.
  5. Zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania na komórkach, dodając TBS zawierający 4% koziej surowicy. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Rozcieńczyć przeciwciało anty-Flag (rozcieńczenie 1:1,000) i przeciwciało anty-CENP-B (stosunek rozcieńczenia 1:200) lub ACA (stosunek rozcieńczenia 1:2,000) jako marker lokalizacji centromerów w TBS zawierającym 4% surowicy koziej.
    Uwaga: Aby uzyskać optymalne wyniki, końcowe stężenie przeciwciała pierwszorzędowego w tym roztworze należy określić empirycznie.
  7. Nanieść odpowiednią objętość (ok. 30 μl) rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego, aby zanurzyć próbkę komórki. Inkubować próbkę komórek przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Przepłukać komórki 5 razy buforem blokującym przez okres 30 minut. Aby uzyskać optymalne wyniki (tj. minimalną utratę komórek), optymalne warunki mycia muszą być określone empirycznie.
  8. Rozcieńczyć sprzężone z fluoroforem przeciwciało drugorzędowe (stosunek rozcieńczenia 1:100 do 1:200) skierowane przeciwko każdemu przeciwciału pierwszorzędowemu w TBS zawierającym 4% surowicy koziej.
    Uwaga: Aby uzyskać optymalne wyniki, końcowe stężenie przeciwciała drugorzędowego w tym roztworze należy określić empirycznie.
  9. Nanieść wystarczającą objętość (ok. 30 μl) rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego, aby zanurzyć próbkę komórki. Inkubować próbkę komórek przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Przepłukać komórki 3 razy buforem blokującym.
  10. Zastosować wystarczającą objętość TBS zawierającą DAPI (50-100 ng/ml), aby zanurzyć próbkę komórki. Inkubować próbkę komórek przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przepłukać komórki 1-2 razy za pomocą TBS.
  11. Zamontować szkło nakrywkowe, które zawiera próbkę komórki, na mikroszkiełku podstawowym zgodnie z opisem w ppkt 2.11.

5. Obserwacja, akwizycja, kwantyfikacja i analiza obrazu immunofluorescencji

  1. Obserwuj próbkę komórkową za pomocą zmotoryzowanego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w soczewkę olejową 63X i 100X, zewnętrzne kompaktowe źródło światła i cyfrową kamerę CCD.
  2. Wykonywanie akwizycji i przetwarzania obrazu, w tym dekonwolucji, przy użyciu oprogramowania A lub oprogramowania B1 i B2 (patrz Lista materiałów/sprzętu). Zapoznaj się z Plikami kodu uzupełniającego (5.2.1), aby zapoznać się ze wszystkimi poleceniami używanymi w oprogramowaniu A. Aby zapoznać się ze wszystkimi poleceniami używanymi w programach B1 i B2, zobacz (5.2.2) w Plikach z kodami uzupełniającymi.
  3. Zastosować poprzednio opisaną metodę23-25 do ilościowego oznaczania sygnałów białek centromeru-kinetochoru (np. pozostałych sygnałów CENP-A w centromerze) z następującymi niewielkimi modyfikacjami:
    1. Wybrać obszar białek centromer-kinetochoru i obszar tła w następujący sposób:
      1. Komórka mitotyczna: (region centromerowo-kinetochorowy) Wybierz obszar nakładający się na chromosomy wybarwione DAPI; (obszar tła) i obszar poza chromosomami, ale wewnątrz identycznej pojedynczej komórki (tj. region cytozolowy).
      2. Komórka interfazowa: (region centromerowo-kinetochorowy) Wybierz obszar nakładający się na chromatynę barwioną DAPI; (obszar tła) i obszar poza chromatyną, ale wewnątrz identycznej pojedynczej komórki (tj. regionu cytozolowego).
        Uwaga: Zobacz także Pliki kodów uzupełniających (5.2.1.4.3) lub (5.2.2.6.4), aby zapoznać się z wyborem obszaru odpowiednio za pomocą oprogramowania A lub oprogramowania B2.
    2. Określ ilościowo procent pozostałych sygnałów w centromerach za pomocą oprogramowania A lub B. Do tego zadania użyj następującej formuły:
      Pozostałe sygnały białka centromer-kinetochoru w centromer-kinetochorze
      figure-protocol-1
      gdzie s jest jasnością sygnału wybranego obszaru, która jest potwierdzona barwieniem ACA lub CENP-B; b oznacza jasność sygnału tła; rpróbka jest referencyjnym sygnałem ACA lub CENP-B dla komórek poddanych działaniu siRNA(s); a rctrl jest referencyjnym sygnałem ACA lub CENP-B dla komórek transfekowanych siRNA Luca.
      Uwaga: W tej analizie sygnały CENP-B zostały wykorzystane jako sygnały referencyjne dla CUL4A i RBX1, jak opisano w poprzednich raportach. 17
      1. Użyj pliku Excel do tego obliczenia po skopiowaniu i wklejeniu surowych danych z opisanego powyżej oprogramowania do określania ilości sygnałów. Szczegółowe informacje można znaleźć w Plikach kodów uzupełniających: (5.2.1.4) i (5.2.2.6). Jeden z przykładów obliczeń przedstawiono w tabeli 3.
    3. Przeanalizuj co najmniej 20 komórek, aby wyeliminować różnice w barwieniu i akwizycji obrazu dla każdego poziomu pomiaru. Opcjonalnie należy użyć "uśrednionej wartości" pozostałych sygnałów centromer-kinetochor dla każdej analizowanej komórki, aby porównać te wartości między różnymi białkami centromer-kinetochor.

6. Analiza Western Blot całkowitego białka

  1. Ponownie zawiesić komórki w denaturującym buforze A (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 50 mM NaCl; 0,5% nonidetu P-40; 0,5% deoksycholanu; 0,5% SDS; 1 mM EDTA; i kompletny koktajl inhibitorów proteazy wolny od EDTA),26 poddać zawiesinę procesowi sonikacji i zamrażania-rozmrażania oraz mierzyć stężenia białek w następujący sposób:
    1. W procesie sonikacji dodać 50 μl buforu A do komórek pobranych z dwóch dołków 6-dołkowej płytki polistyrenowej w 48-72 godzinach po transfekcji (patrz Protokół 1). Uruchom sonikator wyposażony w klakson zakłócający i mikrokońcówkę (patrz Lista materiałów/sprzętu) przez łączny czas trwania przerywanego impulsu wynoszący 15 sekund (cykl pracy 50%) na jedną próbkę.
    2. W przypadku procesu zamrażania i rozmrażania należy zamrozić komórki ciekłym azotem i rozmrozić komórki w temperaturze pokojowej.
    3. Zmierzyć stężenie białka za pomocą dostępnego w handlu odczynnika do oznaczania białek I lub II (patrz Wykaz materiałów/sprzętu).
      Uwaga: Lizaty rozcieńcza się w stosunku 1:10 przy pomiarze stężeń białek odczynnikiem I lub II. Przy tym rozcieńczeniu SDS obecny w buforze A wykazuje niewielką lub żadną interferencję w tym pomiarze.
  2. Zmieszać lizat zawierający 20-30 μg białka ogółem z 2× lub 4× buforem ładującym SDS-PAGE. 27 Gotuj próbki przez 5 minut, a następnie załaduj je na 12,0%-15,0% denaturujący żel poliakryloamidowy SDS do elektroforezy.
  3. Przenieś białka oddzielone za pomocą SDS-PAGE na błonę PVDF przy użyciu opisanej wcześniej metody Western blotting. 17,24,27-31
    1. Zablokować niespecyficzne miejsca wiązania na błonie za pomocą 5% beztłuszczowego mleka w 1× PBS, a następnie inkubować błonę z roztworami rozcieńczonych przeciwciał pierwszorzędowych przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Patrz Lista materiałów/sprzętu w celu uzyskania szczegółowych informacji (np. stosunku rozcieńczenia) każdego przeciwciała pierwszorzędowego.
    2. Po przemyciu membrany 3-4 razy (każda inkubacja przez 3 do 5 minut z wytrząsaniem) buforem PBS-T (1× PBS i 0,1% Tween-20), inkubować membranę w mieszaninie przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z barwnikiem fluorescencyjnym w bliskiej podczerwieni (IR) (stosunek rozcieńczenia 1:20 000), przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z DyLight (stosunek rozcieńczenia 1:20 000) i / lub przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z peroksydazą chrzanową (HRP) (rozcieńczonych w PBS-T; stosunek rozcieńczenia 1:10 000) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Szczegółowe informacje (np. stosunek rozcieńczenia) każdego przeciwciała drugorzędowego można znaleźć na liście materiałów/sprzętu.
  4. Umyj membranę 3 razy, a następnie zeskanuj membranę, aby przeanalizować białka za pomocą systemu obrazowania w podczerwieni i/lub kamery chemiluminescencyjnej w celu wykrycia immunoblot (patrz Lista materiałów/sprzętu).
    1. Informacje na temat korzystania z systemu obrazowania w podczerwieni znajdują się w (6.4.1) w Plikach z kodami uzupełniającymi.
    2. Informacje na temat korzystania z imagera chemiluminescencyjnego, patrz (6.4.2) w Plikach z kodami uzupełniającymi. Do tego systemu należy użyć ultraczułego wzmocnionego podłoża chemiluminescencyjnego (ECL) (patrz Lista materiałów/sprzętu).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza immunofluorescencyjna endogennego CENP-A potwierdza hipotezę, że ligaza CUL4A-E3 jest niezbędna do lokalizacji CENP-A w centromerach
Nasze ostatnie badania wykazały, że aktywność ligazy E3 CUL4A-RBX1-COPS8 jest wymagana do ubikwitylacji lizyny 124 (K124) na CENP-A i lokalizacji CENP-A do centromerów. 17 Początkowo kompleks interfazowo-centromerowy (ICEN) wyizolowano za pomocą immunoprecypitacji anty-CENP-A: natywnej chromatyny,32-34 i postawiono hip...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich latach w wielu badaniach opracowano różne ilościowe testy mikroskopowe dla komórek stałych. 42 Postęp w biologii centromerów i kinetochorów często wymaga zrozumienia specyficznej dla centromeru lub kinetochoru funkcji białek, których subkomórkowa regulacja przestrzenno-czasowa odzwierciedla zmieniające się funkcje tych białek podczas cyklu komórkowego. Dlatego opracowaliśmy tutaj metody barwienia IIF i ilościowy test IIF w celu specyficznej analizy względnych poziomów endogennych i egzogennych biał...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez GM68418 grantu NIH.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Lipofectamin 2000Life Technologies/Invitrogen11668odczynnik do transfekcji I
Lipofektamin RNAiMAXLife Technologies/Invitrogen13778odczynnik do transfekcji II
Opti-MEM ILife Technologies/Invitrogen31985Zredukowane podłoże surowicy, ciepłe w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem
DMEM o wysokiej zawartości glukozy (Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium)Life Technologies/BioWhittaker12-604DMEM o wysokiej zawartości glukozy, ciepły w 37 stopniach; C Kąpiel wodna przed użyciem
Płodowa surowica bydlęca, certyfikowana, inaktywowana termicznie, pochodzenie z USALife Technologies/Gibco10082FBS (płodowa surowica bydlęca)
Poli-L-lizyna ROZTWÓRSIGMA-SLDRICHP 8920Poli-L-lizyna, 0,1% w/v, w wodzie
UltraPure Distilled WaterLife Technologies/Invitrogen/Gibco10977Sterylna woda klasy do hodowli tkankowych 
Szkło z mikro pokrywą (22 mm x 22 mm) Surgipath105Szkło nakrywkowe (22 mm x 22 mm) 
6-dołkowy klaster do hodowli komórkowychFisher/Corning Incorporated07-200-836-dołkowa płyta polistyrenowa 
Penicylina, Streptomycyna; LiquidFisher/Gibco15-140Penicylina-streptomycyna
PAP PEN Miejsce wiązaniaAD100.1Hydrofobowy długopis barierowy (do hydrofobowej bariery w barwieniu immunofluorescencyjnym)
Paklitaksel (Taxol)SIGMA-SLDRICHT7402Taxol do analizy komórek mitotycznych
TN-16, inhibitor mikrotubul (TN16)Enzo Life SciencesBML-T120TN16 do analizy komórek mitotycznych
BSA (albumina surowicy bydlęcej)SIGMA-SLDRICHA7906Odczynnik blokujący
Triton X-100SIGMA-SLDRICHT8787Detergent do przepuszczalności
ParaformaldehydSIGMA-SLDRICHP6148Reagant utrwalający
DAPISIGMA-SLDRICHD9542Do barwienia jądrowego
p-fenylenodiaminySIGMA-SLDRICHP6001Do montażu medium
Mikroprowadnice VWR, matoweVWR International48312-013Mikroprowadnice 
Przeciwciało anty-CENP-AStressgen/Enzo Life SciencesKAM-CC006Mysie przeciwciało monoklonalne; stosunek rozcieńczenia 1:100 (IIF), 1:5000 (WB)
Przeciwciało anty-CENP-BNovus BiologicalsH00001059-B01PMysie przeciwciało monoklonalne; stosunek rozcieńczenia 1:200 (IIF, wiązanie metanol/aceton)-1:400 (IIF, wiązanie paraformaldehydu)Przeciwciało
anty-CENP-B abcamab25734Przeciwciało poliklonalne królika; stosunek rozcieńczenia 1:200 (IIF, wiązanie metanol/aceton)-1:400 (IIF, wiązanie paraformaldehydu)Przeciwciało
anty-centromerowe (ACA)Fitzgerald Industries International, Inc.90C-CS1058Ludzka surowica centromerowa; stosunek rozcieńczenia 1:2000 (IIF)
Przeciwciało anty-CENP-HBethyl LaboratoriesBL1112 (A400-007A)Przeciwciało poliklonalne królika; stosunek rozcieńczenia 1:200 (IIF)
Przeciwciało anty-CENP-HBD612142Mysie przeciwciało monoklonalne; stosunek rozcieńczenia 1:200 (IIF)
Przeciwciało anty-CENP-IN/A, Dr. Katusmi Kitagawa N/A, Dr. Katusmi KitagawaPrzeciwciało poliklonalne królika; stosunek rozcieńczenia 1:1000 (IIF); Niikura i in., Onkogen, 4133-4146 (2006)
Przeciwciało anty-KNL1Novus BiologicalsNBP1-89223Przeciwciało poliklonalne królika; stosunek rozcieńczenia 1:100 (IIF)Przeciwciało
anty-Hec1Novus Biologicals / GeneTexNB 100-338 / GTX70268Mysie przeciwciało monoklonalne; stosunek rozcieńczenia 1:100 (IIF)
Przeciwciało anty-Hec1GeneTexGTX110735Przeciwciało poliklonalne królika; stosunek rozcieńczenia 1:100 (IIF)
Przeciwciało anty-Ska1abcamab46826Przeciwciało poliklonalne królika; stosunek rozcieńczenia 1:100 (IIF)
Przeciwciało Anti-FlagSIGMA-ALDRICHF3165Mysie przeciwciało monoklonalne; stosunek rozcieńczenia 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)
Przeciwciało Anti-FlagSIGMA-ALDRICHF7425Przeciwciało poliklonalne królika; stosunek rozcieńczenia 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)
Anty-CUL4A przeciwciałoN/A, Dr. Pradip RaychaudhuriN/A, Dr. Pradip RaychaudhuriPrzeciwciało poliklonalne królika; stosunek rozcieńczenia 1:3000 (WB); Shiyanov i wsp., Dziennik chemii biologicznej, 35309-35312 (1999)
Przeciwciało anty-RBX1Sygnalizacja komórkowa4397Przeciwciało poliklonalne królika; stosunek rozcieńczenia 1:2000 (WB)
Przeciwciało anty-GAPDHChemiconMAB374Mysie przeciwciało monoklonalne; stosunek rozcieńczenia 1:5000 (WB)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-MouseIgG Life Technologies/InvitrogenA11001przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem (przeciwciało drugorzędowe oczyszczone z powinowactwa)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgGLife Technologies/InvitrogenA11005drugorzędowe sprzężone z fluoroforem (przeciwciało drugorzędowe oczyszczone z powinowactwa)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgGLife Technologies/InvitrogenA11008drugorzędowe sprzężone z fluoroforem (przeciwciało drugorzędowe oczyszczone z powinowactwa)
Alexa Fluor 594 Kozia Anty-Królicza IgGLife Technologies/InvitrogenA11012drugorzędowe sprzężone z fluoroforem (przeciwciało drugorzędowe oczyszczone z powinowactwa)
Beztłuszczowe mleko w proszku (zatwierdzony zamiennik mleka w proszku z goździka)Fisher ScientificNC9255871 (nr zamówienia 190915; Lot# 90629)Odtłuszczone mleko
Leica DM IRE2 zmotoryzowany mikroskop fluorescencyjny Zmotoryzowany mikroskop fluorescencyjnyLeica
Obiektyw olejowy HCX PL APO 63xLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS63X Soczewka zanurzeniowa
olejowa HCX PL APO 100x Obiektyw immersyjny LeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE100X Obiektyw olejowy
Leica EL6000 Kompaktowe źródło światłaLeicaZewnętrzne kompaktowe źródło światła do wzbudzenia fluorescencyjnego
Cyfrowa kamera CCD ORCA-R2 Cyfrowa kamera CCDHamamatsuC10600-10B
Openlab wersja 5.5.2 Oprogramowanie do obrazowania naukowego Perkin Elmer/ImprovisionDo obserwacji, akwizycji, kwantyfikacji i analizy obrazu
Velocity wersja 6.1.1 Oprogramowanie do analizy obrazów 3D Perkin Elmer/ImprovisionDo obserwacji, akwizycji, kwantyfikacji i analizy obrazu
Kompletny koktajl inhibitorów proteaz bez EDTARoche11873580001/11836170001Inhibitor proteazy w tabletkach koktajlowych
PlusOne 2-D Quant KitAmersham Biosciences80-6483-56Komercyjny odczynnik do oznaczania białek I do pomiaru stężenia białka (kompatybilny z 2% SDS)
Bio-Rad Protein AssayBio-Rad500-0006Komercyjny odczynnik do oznaczania białek II do pomiaru stężenia białka (zgodny z 0,1% SDS)
Immobilon-FLEMD Membrana miliporowaIPFL00010PVDF do przenoszenia
IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgGLI-COR Biosciences926-32210IR fluorescencyjne przeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem (przeciwciało drugorzędowe oczyszczone z powinowactwa); współczynnik rozcieńczenia 1:20000 (IIF)
IRDye 680 Kozia IgG ANTY-KRÓLICZALI-COR Biosciences926-32221IR fluorescencyjne przeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem (przeciwciało drugorzędowe oczyszczone z powinowactwa); stosunek rozcieńczenia 1:20000 (IIF)
Kozioł anty-mysi IgG DyLight 549Fisher ScientificPI35507DyLight Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem IR fluorescencyjne przeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem (przeciwciało drugorzędowe oczyszczone z powinowactwa); stosunek rozcieńczenia 1:20000 Panie przewodniczący, panie i panowie!
Kozia anty-królik DyLight 649Fisher ScientificPI35565DyLight Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem DyLightPrzeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem fluorescencyjnym IR (przeciwciało drugorzędowe oczyszczone z powinowactwa); stosunek rozcieńczenia 1:20000 (IIF)
Kozioł anty-mysie IgG-HRPSanta CruzSC-2005Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z HRPPrzeciwciało drugorzędowe sprzężone z DyLightPrzeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem IR (powinowactwo oczyszczone wtórnie przeciwciało); stosunek rozcieńczenia 1:10000 (IIF)
Kozioł anty-króliczy IgG-HRPSanta CruzSC-2004Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z HRPPprzeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem DyLightPrzeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem IR (przeciwciało drugorzędowe oczyszczone z powinowactwa); stosunek rozcieńczenia 1:10000 (IIF)
Openlab wersja 5.5.2. Oprogramowanie do obrazowania naukowego Improvision/PerkinElmerSoftware A
Volocity wersja 6.3 Oprogramowanie do analizy obrazu 3D (akwizycja Volocity)PerkinElmerSoftware B1
Volocity wersja 6.3 Oprogramowanie do analizy obrazu 3D (kwantyfikacja objętości)PerkinElmerSoftware B2
Branson SONIFIER 450Sonicator
Branson Ultrasonics Sonicator Microtip Step, Solidny, Gwint 9,5 mmVWR Scientific Products Inc.  33995-325Klakson zakłócający do sonikacji
Branson Ultrasonics sonikator Mikrokońcówka stożkowa 6,5 mmVWR Scientific Products Inc.  33996-185Mikrokońcówka do sonikacji
Odyssey CLx System obrazowania w podczerwieni LI-COR BiosciencesSystem obrazowania w podczerwieni do wykrywania plam immunologicznych
Oprogramowanie do analizy Image Studio Ver 4.0 Oprogramowanie LI-COR BiosciencesC
Obrazowanie molekularne System Versadoc MP4000 Obrazowanie chemiluminescencyjneBio-Rad
Ilość Jedno oprogramowanie do analizy 1D Bio-RadSoftware D
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity SubstrateThermo34095Ultraczułe wzmocnione podłoże chemiluminescencyjne (ECL)
przeciwciało przeciwciało przeciwciało    do wykrywania immunoblot

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DeLuca, J. G., et al. Hec1 and nuf2 are core components of the kinetochore outer plate essential for organizing microtubule attachment sites. Molecular biology of the cell. 16, 519-531 (2005).
  2. Earnshaw, W. C., Halligan, N., Cooke, C., Rothfield, N. The kinetochore is part of the metaphase chromosome scaffold. J Cell Biol. 98, 352-357 (1984).
  3. Hoffman, D. B., Pearson, C. G., Yen, T. J., Howell, B. J., Salmon, E. D. Microtubule-dependent changes in assembly of microtubule motor proteins and mitotic spindle checkpoint proteins at PtK1 kinetochores. Molecular biology of the cell. 12, 1995-2009 (2001).
  4. Regnier, V., et al. CENP-A is required for accurate chromosome segregation and sustained kinetochore association of BubR1. Mol Cell Biol. 25, 3967-3981 (2005).
  5. Bernad, R., Sanchez, P., Losada, A. Epigenetic specification of centromeres by CENP-A. Exp Cell Res. 315, 3233-3241 (2009).
  6. Black, B. E., Cleveland, D. W. Epigenetic centromere propagation and the nature of CENP-a nucleosomes. Cell. 144, 471-479 (2011).
  7. Warburton, P. E., et al. Immunolocalization of CENP-A suggests a distinct nucleosome structure at the inner kinetochore plate of active centromeres. Curr Biol. 7, 901-904 (1997).
  8. Karpen, G. H., Allshire, R. C. The case for epigenetic effects on centromere identity and function. Trends Genet. 13, 489-496 (1997).
  9. Black, B. E., et al. Structural determinants for generating centromeric chromatin. Nature. 430, 578-582 (2004).
  10. Black, B. E., et al. Centromere identity maintained by nucleosomes assembled with histone H3 containing the CENP-A targeting domain. Mol Cell. 25, 309-322 (2007).
  11. Fachinetti, D., et al. A two-step mechanism for epigenetic specification of centromere identity and function. Nat Cell Biol. 15, 1056-1066 (2013).
  12. Zeitlin, S. G., Shelby, R. D., Sullivan, K. F. CENP-A is phosphorylated by Aurora B kinase and plays an unexpected role in completion of cytokinesis. The Journal of cell biology. 155, 1147-1157 (2001).
  13. Zhang, X., Li, X., Marshall, J. B., Zhong, C. X., Dawe, R. K. Phosphoserines on maize CENTROMERIC HISTONE H3 and histone H3 demarcate the centromere and pericentromere during chromosome segregation. The Plant cell. 17, 572-583 (2005).
  14. Goutte-Gattat, D., et al. Phosphorylation of the CENP-A amino-terminus in mitotic centromeric chromatin is required for kinetochore function. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 8579-8584 (2013).
  15. Bailey, A. O., et al. Posttranslational modification of CENP-A influences the conformation of centromeric chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 11827-11832 (2013).
  16. Samel, A., Cuomo, A., Bonaldi, T., Ehrenhofer-Murray, A. E. Methylation of CenH3 arginine 37 regulates kinetochore integrity and chromosome segregation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9029-9034 (2012).
  17. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Dev Cell. , (2015).
  18. Chan, G. K., Liu, S. T., Yen, T. J. Kinetochore structure and function. Trends in cell biology. 15, 589-598 (2005).
  19. Hori, T., Okada, M., Maenaka, K., Fukagawa, T. CENP-O class proteins form a stable complex and are required for proper kinetochore function. Molecular biology of the cell. 19, 843-854 (2008).
  20. Fukagawa, T., Earnshaw, W. C. The centromere: chromatin foundation for the kinetochore machinery. Developmental cell. 30, 496-508 (2014).
  21. Kedersha, N. The Proteintech Blog.Proteintech. Grainger, D. , Proteintech Group. (2012).
  22. Clontech Laboratories, Inc. HeLa Tet-Off Advanced Cell Line. , Available from: http://www.clontech.com/CR/Products/Inducible_Systems/Tetracycline-Inducible_Expression/ibcGetAttachment.jsp?cItemId=26908&fileId=6712191&sitex=10020:22372:US (2012).
  23. Meraldi, P., Sorger, P. K. A dual role for Bub1 in the spindle checkpoint and chromosome congression. EMBO J. 24, 1621-1633 (2005).
  24. Niikura, Y., et al. 17-AAG, an Hsp90 inhibitor, causes kinetochore defects: a novel mechanism by which 17-AAG inhibits cell proliferation. Oncogene. 25, 4133-4146 (2006).
  25. Yang, Z., et al. Silencing mitosin induces misaligned chromosomes, premature chromosome decondensation before anaphase onset, and mitotic cell death. Mol Cell Biol. 25, 4062-4074 (2005).
  26. Wang, H., et al. Histone H3 and H4 ubiquitylation by the CUL4-DDB-ROC1 ubiquitin ligase facilitates cellular response to DNA damage. Mol Cell. 22, 383-394 (2006).
  27. Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR? Trends Biochem Sci. 20, 257-259 (1995).
  28. Kitagawa, K., Skowyra, D., Elledge, S. J., Harper, J. W., Hieter, P. SGT1 encodes an essential component of the yeast kinetochore assembly pathway and a novel subunit of the SCF ubiquitin ligase complex. Mol Cell. 4, 21-33 (1999).
  29. Niikura, Y., Dixit, A., Scott, R., Perkins, G., Kitagawa, K. BUB1 mediation of caspase-independent mitotic death determines cell fate. J Cell Biol. 178, 283-296 (2007).
  30. Niikura, Y., Kitagawa, K. Identification of a novel splice variant: human SGT1B (SUGT1B). DNA Seq. 14, 436-441 (2003).
  31. Niikura, Y., Ogi, H., Kikuchi, K., Kitagawa, K. BUB3 that dissociates from BUB1 activates caspase-independent mitotic death (CIMD). Cell Death Differ. 17, 1011-1024 (2010).
  32. Ando, S., Yang, H., Nozaki, N., Okazaki, T., Yoda, K. CENP-A, -B, and -C chromatin complex that contains the I-type alpha-satellite array constitutes the prekinetochore in HeLa cells. Mol Cell Biol. 22, 2229-2241 (2002).
  33. Izuta, H., et al. Comprehensive analysis of the ICEN (Interphase Centromere Complex) components enriched in the CENP-A chromatin of human cells. Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 11, 673-684 (2006).
  34. Obuse, C., et al. Proteomics analysis of the centromere complex from HeLa interphase cells: UV-damaged DNA binding protein 1 (DDB-1) is a component of the CEN-complex, while BMI-1 is transiently co-localized with the centromeric region in interphase. Genes Cells. 9, 105-120 (2004).
  35. Merlet, J., Burger, J., Gomes, J. E., Pintard, L. Regulation of cullin-RING E3 ubiquitin-ligases by neddylation and dimerization. Cell Mol Life Sci. 66, 1924-1938 (2009).
  36. Bennett, E. J., Rush, J., Gygi, S. P., Harper, J. W. Dynamics of cullin-RING ubiquitin ligase network revealed by systematic quantitative proteomics. Cell. 143, 951-965 (2010).
  37. Antonelli, A., et al. Efficient inhibition of macrophage TNF-alpha production upon targeted delivery of K48R ubiquitin. Br J Haematol. 104, 475-481 (1999).
  38. Codomo, C. A., Furuyama, T., Henikoff, S. CENP-A octamers do not confer a reduction in nucleosome height by AFM. Nat Struct Mol Biol. 21, 4-5 (2014).
  39. Thrower, J. S., Hoffman, L., Rechsteiner, M., Pickart, C. M. Recognition of the polyubiquitin proteolytic signal. The EMBO journal. 19, 94-102 (2000).
  40. Yoda, K., et al. Human centromere protein A (CENP-A) can replace histone H3 in nucleosome reconstitution in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 7266-7271 (2000).
  41. Shelby, R. D., Vafa, O., Sullivan, K. F. Assembly of CENP-A into centromeric chromatin requires a cooperative array of nucleosomal DNA contact sites. J Cell Biol. 136, 501-513 (1997).
  42. Majumder, S., Fisk, H. A. Quantitative immunofluorescence assay to measure the variation in protein levels at centrosomes. J Vis Exp. , (2014).
  43. Masumoto, H., Masukata, H., Muro, Y., Nozaki, N., Okazaki, T. A human centromere antigen (CENP-B) interacts with a short specific sequence in alphoid DNA, a human centromeric satellite. J Cell Biol. 109, 1963-1973 (1989).
  44. Yoda, K., Kitagawa, K., Masumoto, H., Muro, Y., Okazaki, T. A human centromere protein, CENP-B, has a DNA binding domain containing four potential alpha helices at the NH2 terminus, which is separable from dimerizing activity. J Cell Biol. 119, 1413-1427 (1992).
  45. Sugata, N., et al. Human CENP-H multimers colocalize with CENP-A and CENP-C at active centromere--kinetochore complexes. Hum Mol Genet. 9, 2919-2926 (2000).
  46. Earnshaw, W. C., Ratrie, H. 3rd, Stetten, G. Visualization of centromere proteins CENP-B and CENP-C on a stable dicentric chromosome in cytological spreads. Chromosoma. 98, 1-12 (1989).
  47. Goshima, G., Kiyomitsu, T., Yoda, K., Yanagida, M. Human centromere chromatin protein hMis12, essential for equal segregation, is independent of CENP-A loading pathway. J Cell Biol. 160, 25-39 (2003).
  48. Liu, S. T., Rattner, J. B., Jablonski, S. A., Yen, T. J. Mapping the assembly pathways that specify formation of the trilaminar kinetochore plates in human cells. J Cell Biol. 175, 41-53 (2006).
  49. Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. T time for point centromeres. Nat Cell Biol. 14, 559-561 (2012).
  50. Gascoigne, K. E., et al. Induced ectopic kinetochore assembly bypasses the requirement for CENP-A nucleosomes. Cell. 145, 410-422 (2011).
  51. Nishino, T., et al. CENP-T provides a structural platform for outer kinetochore assembly. EMBO J. 32, 424-436 (2013).
  52. Malvezzi, F., et al. A structural basis for kinetochore recruitment of the Ndc80 complex via two distinct centromere receptors. EMBO J. 32, 409-423 (2013).
  53. Schleiffer, A., et al. CENP-T proteins are conserved centromere receptors of the Ndc80 complex. Nat Cell Biol. 14, 604-613 (2012).
  54. Rago, F., Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. Distinct organization and regulation of the outer kinetochore KMN network downstream of CENP-C and CENP-T. Curr Biol. 25, 671-677 (2015).
  55. Nishino, T., et al. CENP-T-W-S-X forms a unique centromeric chromatin structure with a histone-like fold. Cell. 148, 487-501 (2012).
  56. Bodor, D. L., et al. The quantitative architecture of centromeric chromatin. Elife. 3, e02137(2014).
  57. Oliver, C. Ch 58. Molecular Biomethods Handbook. Rapely, R., Walker, J. M. , Humana Press. 1063-1079 (2008).
  58. Terasima, T., Tolmach, L. J. Changes in x-ray sensitivity of HeLa cells during the division cycle. Nature. 190, 1210-1211 (1961).
  59. Levenson, G. B. R. Ch 8. Biomedical Photonics Handbook. Vo-Dinh, T. uan , CRC Press LLC. 8-19 (2003).
  60. Sanderson, J. Fluorescence bleed-though. , Available from: http://www.gum2012.fionastoreydesign.co.uk/Downloads/Bleed through text.pdf (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Immunofluorescence AnalysisCentromere Kinetochore ProteinsEndogenous Exogenous ProteinsParaformaldehyde FixationFlag tagged CENP AHuman Cell CultureIndirect Immunofluorescence StainingFluorescence MicroscopyProtein Localization QuantificationCell Fixation Protocol

Related Articles