Standardy ilościowej analizy metaloproteomicznej z wykorzystaniem wykluczenia wielkości ICP-MS

Summary

Chromatografia wykluczania wielkości z łącznikiem plazmy sprzężonej indukcyjnie - spektrometria mas (ICP-MS) to potężne narzędzie do pomiaru zmian w obfitości metaloprotein bezpośrednio z próbek biologicznych. W tym miejscu opisujemy zestaw wzorców metaloprotein używanych do szacowania masy cząsteczkowej i ilości metalu związanego z nieznanymi białkami.

Abstract

Metale są niezbędne do funkcjonowania białek jako kofaktory katalizujące reakcje chemiczne. Zakłócenie homeostazy metali jest związane z wieloma chorobami, w tym chorobą Alzheimera i Parkinsona, ale dokładna rola, jaką odgrywają te metale, nie została jeszcze w pełni wyjaśniona. Identyfikacja metaloprotein napotyka na wiele wyzwań i trudności. W tym miejscu przedstawiamy podejście, które umożliwia ilościowe określenie metaloprotein w złożonych próbkach. Osiąga się to za pomocą chromatografii wykluczania wielkości sprzężonej ze spektrometrią mas plazmy sprzężonej indukcyjnie (SEC-ICP-MS). Korzystając z sześciu znanych metaloprotein, kolumnę wykluczającą wielkość można skalibrować, a odpowiednie pierwiastki śladowe (żelazo, miedź,, kobalt, jod) można wykorzystać do oceny ilościowej. Przedstawiono ślady SEC-ICP-MS ludzkiego mózgu i osocza. Zastosowanie tych wzorców metaloprotein zapewnia środki do ilościowego porównania obfitości metaloprotein między próbkami biologicznymi. Technika ta może pomóc rzucić światło na rolę metaloprotein w chorobach neurodegeneracyjnych, a także w innych chorobach, w których występuje brak równowagi pierwiastków śladowych.

Introduction

Niezbędne metale odgrywają istotną rolę w normalnych funkcjach biologicznych, w tym drugorzędnych szlakach przekaźnikowych, szlakach metabolicznych i funkcjach organelli. Uważa się, że 30% wszystkich białek to metaloproteiny¹, a 50% wszystkie enzymy². Metaloenzymy wykorzystują te metale śladowe jako kofaktory do katalizowania reakcji chemicznych, stabilizacji struktury białek oraz do ról regulacyjnych, takich jak wtórni przekaźniki. Niektóre z najlepiej przebadanych pierwiastków śladowych w odniesieniu do neurodegeneracji to miedź, żelazo i³. Uważa się, że są one zaangażowane w wiele szlaków chorobowych, w których dyshomeostaza może mieć niekorzystne skutki. Na przykład status metaliczny dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) bezpośrednio wpływa na długość życia i fenotyp transgenicznych modeli myszy rodzinnych typu stwardnienia zanikowego bocznego (ALS)⁴. W chorobie Alzheimera techniki metaloproteomiczne zostały wykorzystane do odkrycia spadku statusu metalicznego transferyny w osoczu⁵. Badania te podkreślają ważną rolę, jaką metaloproteiny mogą odgrywać w chorobach.

Badanie metaloprotein bezpośrednio z tkanek biologicznych to rozwijająca się dziedzina. Chociaż niektóre metaloenzymy zostały scharakteryzowane, większość nadal pozostaje niescharakteryzowana lub nieznana⁶. Jednym z głównych wyzwań w pomiarze metaloprotein jest wymóg utrzymania natywnego stanu białka⁷. Klasyczne techniki proteomiczne typu bottom-up polegają na trawieniu białek do peptydów. Proces ten zaburza niekowalencyjne oddziaływanie metali i ich białek. W ten sposób nie uzyskuje się żadnych informacji o statusie metalicznym białka.

Jednym ze sposobów na pokonanie tego problemu jest użycie chromatografii wykluczania wielkości w połączeniu z plazmą sprzężoną indukcyjnie - spektrometria^{mas 8,9} (SEC-ICP-MS). W ten sposób generowane są informacje o przybliżonej wielkości białka, a także o wszelkich metalach, które są z nim związane¹⁰. Co więcej, wykluczenie wielkości jest delikatną techniką chromatograficzną, która może zachować natywny stan enzymu lub kompleksu białko-białko. Jedną z zalet stosowania plazmy sprzężonej indukcyjnie - spektrometrii mas (ICP-MS) jest ilościowy charakter tej technologii. Korzystając z zestawu wzorców metaloprotein, możliwe jest zapewnienie bezwzględnej kwantyfikacji metaloprotein z próbek biologicznych^9,11. Osiąga się to poprzez wygenerowanie krzywej standardowej poprzez wstrzyknięcie znanych metaloprotein w zakresie stężeń metali.

Ten protokół pokazuje przykład, jak można to osiągnąć dla różnych standardów metaloprotein. W tym artykule staramy się stworzyć standardowe krzywe dla metali, które są w dużej mierze badane w dziedzinach biologicznych, w tym żelaza (Fe), miedzi (Cu), (Zn), jodu (I) i kobaltu (Co).

Protocol

1. Przygotowanie i próbek

1. Przygotować 500 ml buforu o stężeniu 200 mM azotanu amonu o pH 7,6 - 7,8 (pH skorygowane wodorotlenkiem amonu (NH₄OH)) z dodatkiem cezu (Cs) i antynomii (Sb) do końcowego stężenia 10 ppb. Cez i antynomia powinny być stosowane jako wzorce wewnętrzne do monitorowania wszelkich odchyleń w odpowiedzi ICP-MS. Przed użyciem przefiltrować bufor przez filtr 0,22 μm.
2. Przygotować próbkę w zależności od rodzaju próbki: ciecz, hodowla tkankowa lub komórkowa.
   1. W przypadku próbek, które wymagają homogenizacji (np. tkanek lub komórek), upewnij się, że nie zawierają detergentu. Do przygotowania próbki należy użyć Tris. Alternatywnie należy stosować fosforanowe, ale mogą one negatywnie wpływać na metaloproteom z czasem lub przy cyklach zamrażania i rozmrażania¹².
   2. Homogenizować próbki tkanek lub kultur komórkowych przez ręczne odbijanie lub sonikację przez 5 minut przy użyciu buforowanej soli fizjologicznej Tris (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM chlorek sodu (NaCl) + inhibitory proteazy wolne od kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)).
   3. Klarować homogenaty przez odwirowanie przy 16 000 x g przez 5 min. Zebrać otrzymany supernatant. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
      Uwaga: Wszystkie próbki muszą zostać odwirowane przed załadowaniem do fiolek do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), aby zapobiec blokowaniu kolumny chromatografii wykluczającej wielkość (SEC) przez cząstki stałe.
3. Znormalizuj całkowitą ilość białka załadowanego na kolumnę w próbkach. Oznaczyć stężenia białek przy długości fali 280 nm za pomocą spektrofotometru UV do pomiaru mikroobjętości¹³. Załaduj od 20 do 150 μg białka. Stosować typowe objętości iniekcji w zakresie od 2 do 80 μl, w zależności od stężenia próbki.
   1. Przed załadowaniem próbki wyczyść ramię spektrofotometru UV o mikroobjętości wodą destylowaną. Ramię próbki to miejsce, w którym ładowane są próbki białka.
   2. Przeprowadzić ślepą próbę przyrządu w stosunku do 2 μl buforu do próbki. Następnie załadować 2 μl każdej próbki na ramię i zmierzyć absorbancję przy 280 nm.
   3. Określić stężenia. W przypadku próbek białka surowego należy zastosować współczynnik ekstynkcji wynoszący 1 Abs = 1 mg/ml. Aby określić stężenie białka w próbkach, należy zastosować prawo Beera-Lamberta, A = ε x l x c, gdzie A to absorbancja, ε to współczynnik ekstynkcji, l to długość drogi w centymetrach, a c to stężenie.

2. Masowa analiza wzorców metaloprotein przy użyciu plazmy sprzężonej indukcyjnie - spektrometria mas

1. Rozgrzej i nastroić instrument zgodnie z protokołami producenta.
2. Po rozgrzaniu i dostrojeniu instrumentu wykonaj masowy ICP-MS.
   Uwaga: Roztwory podstawowe oczyszczonych metaloprotein na ogół muszą być rozcieńczone przed pomiarem. Stężenie metalu w wzorcu można oszacować na podstawie znanych stochiometrii białko-metal i szacowanego stężenia białka. Informacje te można wykorzystać do określenia rozcieńczenia, które będzie odpowiednie, aby mieścić się w zakresie wygenerowanej krzywej wzorcowej.
   1. Rozcieńczyć wzorce metaloprotein, tyreoglobulinę, ferrytynę, ceruloplazminę, Cu/Zn SOD i witaminę B₁₂, aby upewnić się, że mieszczą się w zakresie 0 - 500 μg/L, stosując 1% kwas azotowy. Aby osiągnąć normy w tym zakresie, nie należy stosować rozcieńczeń przekraczających 1 do 20. W razie potrzeby należy wykonać seryjne rozcieńczenia w wodzie, aby rozcieńczyć zapasy.
   2. Ustal kolejność wstrzyknięć. Najpierw przeanalizuj siedem poziomów kalibracji, stężenia w zakresie od 0 do 500 μg/L, a następnie wzorce metaloproteinowe. Siedem poziomów kalibracji to 0, 1, 5, 10, 50, 100 i 500 μg/l.
   3. Wybierz interesujące Cię elementy. Tutaj użyj Fe, Cu, Zn, Co i I, ponieważ są to pierwiastki, z którymi związane są wzorce białkowe. Wybierz pierwiastki w metodzie akwizycji, otwierając zakładkę selektora elementów i dodając pierwiastki oraz odpowiadające im masy izotopowe, które mają być analizowane.
   4. Wykonaj analizę próbki za pomocą urządzenia, a oprogramowanie przyrządu automatycznie utworzy krzywe kalibracyjne dla każdego z analizowanych elementów. Krzywe kalibracyjne są tworzone przez oprogramowanie poprzez wykreślenie liczb/s wykrytego metalu w stosunku do ilości metalu, którą wzorzec ma zawierać, w μg/L. Użyj krzywych kalibracyjnych, aby określić stężenie metalu w nieznanych próbkach.
      Uwaga: Za pomocą krzywej kalibracyjnej oprogramowanie określa stężenie metalu w każdym ze wzorców metaloproteiny.
   5. Na podstawie wyników analizy masowej wygeneruj wzorce metaloprotein, które obejmują trzy najobficiej występujące pierwiastki śladowe w tkankach ssaków, używając mieszaniny Cu, dysmutazy ponadtlenkowej Zn (SOD) rozcieńczonej do 200 μg/l miedzi i oraz ferrytyny (FTN) przy końcowym stężeniu 2,000 μg/l żelaza.

3. Konfiguracja systemu HPLC i wykluczenie rozmiaru Równoważenie kolumny chromatograficznej

Uwaga: Ta sekcja powinna być wykonywana równolegle z poprzednią, ponieważ obie wymagały około 1 - 1,5 godziny na ukończenie.

1. Przepłukać pompy HPLC buforem wykonanym w kroku 1.1 i przepłukać pompy przez 5 minut przy natężeniu przepływu 5 ml/min.
2. Po oczyszczeniu systemu ustaw natężenie przepływu na 0,1 ml/min i podłącz kolumnę wykluczającą rozmiar (4,6 x 300 mm, 3 μm, 150 A).
   Uwaga: Mokre połączenie między rurką a kolumną zapobiega uwięzieniu pęcherzyków powietrza podczas podłączania kolumny.
3. Podłącz przeciwległy koniec kolumny do zestawu detektora UV, aby zmierzyć absorbancję przy 280 nm za pomocą rurki PEEK.
4. Stopniowo zwiększaj natężenie przepływu kolumny w krokach co 0,05 - 0,1 ml/min, aż do osiągnięcia końcowego natężenia przepływu 0,4 ml/min. W tym czasie sprawdź połączenia przewodów z kolumną pod kątem wycieków. Monitoruj ciśnienie w systemie, aby upewnić się, że nie przekracza ono wymagań kolumny, obserwując ślad ciśnienia na chromatogramie w oprogramowaniu.
5. Pozostaw kolumnę do zrównoważenia przy wymaganym natężeniu przepływu przez 5 - 10 objętości kolumny. Po zrównoważeniu podłącz przyrządy, aby umożliwić analizę próbki.
6. Ustawić metodę HPLC tak, aby pompować bufor A nad kolumną z prędkością 0,4 ml/min przez 15 minut.

4. Konfiguracja i uruchamianie Wykluczenie rozmiaru - Plazma sprzężona indukcyjnie - Spektrometria mas

Uwaga: Procedury operacyjne mogą się różnić w zależności od przyrządu i modelu. Skontaktuj się ze specjalistą technicznym urządzenia, aby dowiedzieć się więcej o tym, jak skonfigurować używany ICP-MS.

1. Przełącz ICP - MS w tryb czuwania przed zmianą ustawień sprzętowych.
   1. W trybie czuwania wyłącz komunikację dla automatycznego samplera i zmień wprowadzenie próbki na "inne".
      Uwaga: W zależności od konfiguracji oprogramowania i sprzętu można użyć opcji "HPLC" jako przykładowego źródła wprowadzenia. Skontaktuj się ze specjalistą technicznym ds. instrumentu, aby dowiedzieć się, czy ta opcja jest dostępna.
2. Użyj rurki PEEK (średnica wewnętrzna 0,13 mm), aby podłączyć odpływ z detektora UV bezpośrednio do nebulizatora na ICP-MS.
3. Włącz ponownie ICP - MS i pozwól instrumentowi się rozgrzać przez 10 - 20 minut.
4. Po zapaleniu się plazmy podłącz zdalny od ICP - MS do tylnej części automatycznego podajnika próbek HPLC. Zrób to, gdy plazma się zapali; w przeciwnym razie system HPLC zostanie automatycznie wyłączony, ponieważ ICP - MS nie jest włączony.
5. Zmień metodę ICP-MS w celu zbierania danych dla LC-ICP-MS.
   1. Zmień metodę akwizycji z widma na akwizycję rozdzielczości czasowej (TRA).
   2. Wybierz pierwiastki do analizy, Fe, Cu, Zn, Co, I, a także wszelkie inne interesujące Cię elementy, i ustaw czasy całkowania (zwykle od 0,05 do 0,3 sekundy). Po wybraniu interesujących elementów należy dostosować czas akwizycji do czasu trwania chromatografii (np. 900 sekund dla 15-minutowego przebiegu chromatografii).
   3. Ręcznie dostrój ICP - MS pod kątem czułości i szybkości przepływu helu (He) w komórce zderzeniowej z przepływem bufora chromatograficznego przy użyciu Cs i Sb zawartych w buforze. Natężenia przepływu He są zwykle o ~ 1 ml / min mniejsze niż te stosowane do analizy masowej. Gdy liczba jonów metalu ustabilizuje się, a wartości względnego odchylenia standardowego (RSD) spadną poniżej 5%, system jest gotowy do użycia.
6. Twórz przykładowe listy przebiegów zarówno w programach HPLC, jak i ICP-MS. Przykładowa lista przebiegów zawiera kolejność, w jakiej każda z próbek ma zostać wstrzyknięta, a także nazwę, pod którą dane zostaną zapisane. Sprawdź, czy łączna liczba próbek na liście jest zgodna między tymi dwoma programami.
7. Rozpocznij partię próbki dla ICP-MS przed HPLC, ponieważ wstrzyknięcie próbki przez HPLC spowoduje, że ICP - MS rozpocznie zbieranie danych. Jeśli nie zostanie to zrobione we właściwej kolejności, spowoduje to brakujące dane.
8. Generowanie punktów krzywej kalibracyjnej poprzez wstrzykiwanie różnych objętości mieszanego wzorca SOD i FTN od 200 μg/L do 6 000 μg/L wstrzykiwanego na kolumnę dla Cu i Zn oraz 2 000 μg/L do 60 000 μg/L dla Fe. Objętości wtrysku wahają się od 1 do 30 μl.
   Uwaga: Te zakresy stężeń obejmują stężenia Fe, Cu i Zn zwykle obserwowane w złożonych homogenatach. W przypadku próbek, które zawierają tylko oczyszczone białka, maksymalny zakres krzywej powinien być odpowiednio dostosowany. Ponieważ ilość metalu związanego z białkiem może wymagać mniejszego lub większego zakresu, ponieważ w próbce jest mniej zanieczyszczeń spowodowanych innymi czynnikami.
9. Przeanalizuj każdą z nieznanych próbek tkanki, osocza lub hodowli komórkowej.

5. Analiza, manipulacja i wizualizacja danych

1. Zapisz dane w formacie pliku z wartościami rozdzielanymi przecinkami (csv) i załaduj je do programów przetwarzania zgodnie z wymaganiami.
2. Aby kontrolować dryft instrumentu, podziel liczbę na sekundę dla każdego elementu przez liczbę na sekundę dla Cs lub Sb.
3. Wygeneruj krzywe kalibracyjne dla każdego z elementów.
   1. Określ obszar pod pikiem metalu, który odpowiada metaloproteinie, z którą jest związany dla każdego z wstrzyknięć, wykonując integrację piku w preferowanym oprogramowaniu do analizy danych.
   2. Wykreślić obszar pod pikiem metalu w stosunku do całkowitej ilości metalu, który został wstrzyknięty do kolumny w każdym przebiegu, 200 - 6 000 μg/L dla Cu i Zn i 2 000 - 60 000 μg/L dla Fe. Wykonaj analizę regresji liniowej zgodnie z protokołem oprogramowania.
   3. Użyj wyników nachylenia z analizy regresji liniowej jako czynnika do przeliczenia liczb na sekundę na pg/s. Podziel każdy z punktów danych zliczeń na sekundę na chromatogramie przez gradient wartości linii.
4. Wykres danych w pg/s w stosunku do czasu chromatogramu. Określ obszar pod szczytami zainteresowania. Obszar pod pikiem reprezentuje całkowitą ilość metalu, z którą białko jest związane, w pg.
5. Wygeneruj kalibrację na podstawie masy cząsteczkowej znanych metaloprotein i czasu, w którym eluują. Użyj tego, aby oszacować wielkość pików białka w złożonych próbkach.

Results

Użycie wzorców metaloproteinowych pozwala na kalibrację kolumny wykluczającej rozmiar. Rysunek 1A przedstawia profil elucji dla wzorców tyreoglobuliny, ferrytyny, ceruloplazminy, Cu / Zn SOD i witaminy B₁₂ w oparciu o metal, z którym są związane (Fe, Co, Cu, Zn i I). Rysunek 1B przedstawia krzywą kalibracyjną dla kolumny wykluczającej wielkość opartą na masie cząsteczkowej wzorców białek i czasie ich elucji, przedstawioną w formacie objętości elucyjnej (Ve) podzielonej przez objętość pustej przestrzeni kolumny (Vo). Białka używane do generowania tej krzywej standardowej to konkanawalina A, konalbumina, ceruloplazmina, ferrytyna, SOD i tyreoglobulina.

Rysunek 2A pokazuje elucję ferrytyny w zakresie 2 000 - 60 000 pg Fe wstrzykniętego na kolumnę, a Rysunek 2D przedstawia analizę regresji przeprowadzoną przy użyciu powierzchni piku. Rysunki 2B i 2C to profile elucji dla Cu/Zn, SOD dla Cu i Zn, a 2E i 2F to analizy regresji wygenerowane przy użyciu powierzchni pików. Wyniki analizy regresji są wykorzystywane do konwersji surowych danych w liczbach/s na pg/s, dzięki czemu można ilościowo określić ilość metalu związanego z białkiem. Konwersja odbywa się poprzez podzielenie zliczeń/s przez nachylenie regresji liniowej (np. 334,6 (liczeń/s) x (s/pg) miedzi).

Jak już wspomniano, ta technika może być używana do identyfikacji metaloprotein w złożonych próbkach biologicznych. Ludzki mózg i osocze zostały poddane tej technice, a rysunki 3 i 4 pokazują odpowiednio uzyskane wyniki. Ludzki mózg oddzielony przez SEC-ICP-MS pokazano na rysunkach 3A-3C, z których każdy reprezentuje inny metal będący przedmiotem zainteresowania (Cu, Zn lub Fe). Ryciny 4A-4C pokazują ślady uzyskane podczas poddawania ludzkiej techniki osocza ludzkiemu. Złożoność i obfitość próbki będzie miała wpływ na liczbę obserwowanych pików. Zgodnie z oczekiwaniami osocze jest zdominowane przez kilka metaloprotein, w tym ceruloplazminę i transferynę.

Rysunek 1.Kalibracja chromatografii wykluczającej wielkość - plazma sprzężona indukcyjnie - spektrometria mas z wykorzystaniem znanych metaloprotein. (A) Profil elucji dla wzorców metaloprotein w oparciu o ich odpowiednie metale. (B) Krzywa kalibracji masy cząsteczkowej dla wzorców białkowych tyreoglobuliny (i), ferrytyny (ii), ceruloplazminy (iii), konalbuminy (iv), Cu/Zn SOD (v) i konkanawaliny A (vi). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Zastosowanie ferrytyny i Cu/Zn SOD jako wzorców metaloprotein do określenia ilości Cu, Fe lub Zn związanej z metaloproteinami w złożonej próbce biologicznej. (A) Profil elucji ferrytyny w zakresie wtrysku 2 000 - 60 000 μg/L żelaza. (B) i (C) Profil elucji dla Cu/Zn SOD w zakresie wtrysku odpowiednio 200 - 6 000 μg/L miedzi i. (D), (E) i (F) pokazują wyniki analizy regresji odpowiednio dla metali żelaza, miedzi i. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Metaloproteom Cu, Fe i Zn w ludzkim mózgu. (A) Ślad miedzi (B) Ślad żelaza (C) Ślad. Elucja wzorców białkowych dla każdego metalu jest pokazana za pomocą czarnego śladu z ich masą cząsteczkową wskazaną pod wykresem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Metaloproteom Cu, Fe i Zn w osoczu ludzkim. (A) Ślad miedzi (B) Ślad żelaza (C) Ślad. Elucja wzorców białkowych dla każdego metalu jest pokazana za pomocą czarnego śladu z ich masą cząsteczkową wskazaną pod wykresem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Zapewnienie natywnego stanu białka oznacza konieczność zwrócenia szczególnej uwagi na stosowane i przechowywanie próbki. Nie wszystkie techniki chromatografii lub techniki przygotowania próbek mogą być stosowane. Ważne jest, aby stosowane podczas przygotowywania próbek i chromatografii były pozbawione chelatorów metali i wykorzystywały, które naśladują fizjologiczne pH i stężenia soli. Inne warunki, których należy unikać, obejmują podgrzewanie próbki lub dodawanie denaturantów białkowych (np. mocznika). Bardzo ważne jest, aby zminimalizować liczbę cykli zamrażania i rozmrażania. Zdolność wybranego buforu do wiązania metali dwuwartościowych jest również ważna i jest powodem, dla którego wybiera się Tris lub azotanu amonu zamiast na bazie fosforanów.

Niska rozdzielczość i szczytowa zdolność chromatografii wykluczającej wielkość w porównaniu z innymi formami chromatografii jest głównym ograniczeniem tej techniki. Jednak łagodny charakter chromatografii wykluczającej wielkość jest ważny dla utrzymania natywnego stanu białka, a tym samym zachowania stosunkowo słabych wiązań metal-białko. Wymóg utrzymania stanu natywnego białek wymaga zwrócenia szczególnej uwagi na obróbkę próbek, w tym ograniczenie liczby cykli zamrażania i rozmrażania, unikanie chelatorów metali (np. EDTA) lub soli chaotropowych i detergentów.

Ta niska rozdzielczość tej techniki wpływa na zdolność do ilościowego określenia ilości metalu związanego z określonym białkiem, jeśli znajduje się ono w złożonej próbce, ponieważ obserwowane piki będą zawierać więcej niż jedno białko. W związku z tym ilość metalu określona za pomocą integracji pików byłaby wskaźnikiem całkowitej ilości metalu związanego ze wszystkimi białkami eluującymi w tym punkcie czasowym, a nie tylko z jednym konkretnym białkiem. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, białko będące przedmiotem zainteresowania musiałoby zostać dodatkowo oczyszczone w warunkach rodzimych. Pozwoliłoby to na ilościowe określenie metalu związanego z tym białkiem z większą pewnością. Innym potencjalnym ograniczeniem tej techniki byłaby utrata białka z powodu nieodwracalnego wiązania z kolumną. W celu ustalenia, czy tak się dzieje, należy przeprowadzić eksperyment odzysku, w którym analizuje się ilość białka uwalniającego się z kolumny w celu określenia, czy odpowiada ona ilości wstrzykniętej. To samo można zrobić, mierząc zawartość metalu w materiale elucyjnym i materiale wyjściowym za pomocą ICP-MS luzem. Odzysk kolumny może się różnić w zależności od zastosowanych warunków, ale wykazano, że możliwe jest całkowite odzyskanie białek z kolumny wykluczającej wielkość⁹. Dlatego ważne jest, aby sprawdzić, czy w użytkowanych warunkach pracy nie występują żadne straty.

Modyfikacje protokołu mogą być związane z stosowanymi wzorcami metaloprotein, a także analizowanymi pierwiastkami. Rodzaj zastosowanego wzorca metaloproteiny będzie się różnił w zależności od interesujących pierwiastków. Do pierwiastków takich jak białka Cu, Fe i Zn stosuje się SOD i ferrytynę. Można również użyć każdej innej metaloproteiny, która ma znane stoichometry, a kilka przykładów pokazano tutaj.

Jedną z głównych komplikacji, które mogą wyniknąć z zastosowania tej techniki, jest gromadzenie się kryształów soli w palniku ICP-MS. Aby zapobiec gromadzeniu się kryształków soli, pochodnia jest myta wodą destylowaną po każdych 500 - 1 000 ml buforu, który przeszedł przez system lub gdy na podstawie oględzin stwierdzono, że pochodnia powinna zostać umyta. Innym problemem, który może się pojawić, jest szybszy spadek czystości próbki i stożków ekstrakcyjnych. Należy je regularnie czyścić zgodnie z protokołami producenta.

Wstępne przygotowanie próbki jest najbardziej krytycznym krokiem w protokole. Jeśli wystąpią jakiekolwiek zmiany w kompleksie białko - metal, wygenerowane informacje nie będą ważne. Jest to jedno z głównych ograniczeń tej techniki; Ponadto użycie kolumny o niskiej rozdzielczości i wykluczeniu rozmiaru daje ograniczony szczegółowy obraz prawdziwej złożoności metaloprotein w biologii.

Opisana tu technika pozwala na poszerzenie wiedzy na temat metaloproteomu organizmu. Analiza masowa daje jedynie przybliżone wskazanie zmian ilości metalu w próbce. Oprócz ogólnych rozważań, które należy wziąć pod uwagę, technika ta zapewnia narzędzie, które można wykorzystać do ilościowego określenia ilości metalu związanego z białkami, a także do identyfikacji metaloprotein, które różnią się od siebie, porównując uzyskane ślady. Zastosowanie tej techniki może być wykorzystane do identyfikacji różnic między stanami chorobowymi. Zidentyfikowane metaloproteiny mogą być następnie dalej badane, aby pomóc w określeniu roli, jaką odgrywają w procesach chorobowych. Zastosowanie ICP-MS z łącznikiem ma coraz większą przyszłość w celu określenia roli leków, które mają heteroatom, takich jak platyna, jod lub miedź, ponieważ ICP-MS można wykorzystać do identyfikacji białek, które wiąże lek.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pompa binarna Agilent 1290 Infinity	Agilent	G4220A
Automatyczny podajnik próbek Agilent 1290 Infinity	Agilent	G4226A
Termostat automatycznego podajnika próbek Agilent serii 1200	Agilent	G1330B
Agilent 1290 Nieskończoność Termostatowana komora kolumny	Agilent	G1316C
Detektor zmiennej długości fali Agilent 1290 Infinity	Agilent	G1314E
Agilent 7700 ICP-MS	Agilent	G3282A
Wodorotlenek amonu na bazie metali śladowych	Sigma	338818
Azotan amonu	Sigma	256064	Przygotuj świeży roztwór 200 mM w dniu eksperymentu
Antynomia	Wybór analityczny	10002-3
Ceruloplazmina	Sigma
Cez	Wybór analityczny	100011-1
Kompletne inhibitory proteazy wolne od EDTA	Roche	11873580001
Konalbumina	Sigma	C7786
Concanavalin A z Canavalia ensiformis (fasola Jack)	Sigma	L7647
Cu, Zn dysmutaza ponadtlenkowa	Sigma	S9697
Ferrytyna	Sigma	F4503
Wieloelementowe wzorce kalibracyjne ICP-MS	AccuStandard		Wykonany do wymaganych stężeń w 1% kwasie azotowym
Spektrofotometr UV mikroobjętościowy	Thermo Scientific
65% Kwas azotowy	Millipore	100441	Rozcieńczony do 1% do użycia
Rurki Peek	Agilent	5042-6461
Kolumna wykluczająca rozmiar BioSEC-3 Kolumna PLC., 4,6 x 300 mm, 3 μ m, 150 & Aring;	Agilent	5190-2508
Chlorek sodu	Dostawa chemiczna	SA046
Chlorowodorek tris	ICN Biomedicals inc.	Numer katalogowy 103130
Tyreoglobulina	Sigma	T9145
Witamina B12	Sigma	V2876