Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie połączonych metodologii w celu zdefiniowania roli dostarczania błony plazmatycznej podczas rozgałęziania aksonów i morfogenezy neuronów

DOI:

10.3791/53743

⸱

16 marca 2016

 ,  , 
1Curriculum in Neurobiology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Cell Biology and Physiology, The University of North Carolina at Chapel Hill

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniki mikroskopii świetlnej w połączeniu z testami biochemicznymi wyjaśniają udział egzocytozy za pośrednictwem SNARE w zależnym od netryny rozgałęzianiu aksonów. Ta kombinacja technik pozwala na identyfikację mechanizmów molekularnych kontrolujących rozgałęzianie się aksonów i zmianę kształtu komórki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas rozwoju neuronalnego, rosnące aksony rozciągają się na wielu partnerów synaptycznych poprzez rozwijanie gałęzi aksonalnych. Rozgałęzianie się aksonów jest promowane przez zewnątrzkomórkowe wskazówki naprowadzające, takie jak netryna-1, i powoduje dramatyczny wzrost powierzchni aksonalnej błony plazmatycznej. Rozgałęzienia aksonów zależne od Netrin-1 prawdopodobnie obejmują czasową i przestrzenną kontrolę rozszerzania błony plazmatycznej, której składniki są dostarczane przez fuzję pęcherzyków egzocytarnych. Te zdarzenia fuzji są poprzedzone tworzeniem kompleksów SNARE, zawierających v-SNARE, takich jak VAMP2 (białko błonowe związane z pęcherzykami 2) i t-SNARE błony plazmatycznej, syntaksynę-1 i SNAP25 (białko związane z synaptosomalami 25). Szczegółowo opisano w niniejszym dokumencie wielotorowe podejście stosowane do badania roli egzocytozy za pośrednictwem SNARE w rozgałęzianiu aksonów. Mocną stroną połączonego podejścia jest pozyskiwanie danych w różnych rozdzielczościach przestrzennych i czasowych, począwszy od dynamiki pojedynczych zdarzeń fuzji pęcherzyków w pojedynczych neuronach, a skończywszy na tworzeniu kompleksów SNARE i rozgałęzianiu aksonów w populacjach hodowanych neuronów. Protokół ten wykorzystuje uznane podejścia biochemiczne do oznaczania poziomów endogennych kompleksów SNARE i mikroskopii całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF) neuronów korowych eksprymujących VAMP2 znakowanych wrażliwym na pH GFP (VAMP2-pHlourin) w celu identyfikacji zależnych od netryny-1 zmian aktywności egzocytarnej w poszczególnych neuronach. Aby wyjaśnić czas rozgałęzień zależnych od netryny-1, wykorzystuje się mikroskopię poklatkowego kontrastu interferencji różnicowej (DIC) pojedynczych neuronów w ciągu kilku godzin. Utrwalona immunofluorescencja komórek w połączeniu z neurotoksynami botulinowymi rozszczepiającymi maszynerię SNARE i blokującymi egzocytozę pokazuje, że rozgałęzianie aksonów zależne od netryny-1 wymaga aktywności egzocytarnej za pośrednictwem SNARE.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnie szacunki sugerują, że ludzki mózg składa się z 1011 neuronów z 1014 połączeniami synaptycznymi1, co podkreśla znaczenie rozgałęziania się aksonów in vivo. Zewnątrzkomórkowe wskazówki naprowadzające aksonów, takie jak netrin-1, kierują aksony do odpowiednich partnerów synaptycznych i stymulują rozgałęzianie aksonów, zwiększając w ten sposób pojemność synaptyczną2-5. Arboryzacja aksonalna zależna od Netrin-1 wiąże się ze znaczną ekspansją błony plazmatycznej6, co jak przypuszczamy, wymaga dostarczenia dodatkowych składników błony poprzez fuzję pęcherzyków egzocytarnych zależną od kompleksu SNARE

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczenie o etyce badawczej: Wszystkie eksperymenty na zwierzętach opisane tutaj podlegają zasadom i przepisom Komitetu UNC ds. Opieki nad Zwierzętami oraz standardom NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Przygotowanie i posiewanie zdysocjowanych neuronów korowych

  1. Poddaj eutanazji samice w ciąży w czasie przez wdychanie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Usuń całe mózgi z czaszek myszy w dniu embrionalnym 15.5 (E15.5) i przeprowadź mikrosekcję kory mózgowej z każdej półkuli. Szczegółowe instrukcje dotyczące mikrodysekcji embrionalnej kory myszy znajdują się w Vi....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie technik biochemicznych in vitro do oznaczania ilości odpornych na SDS kompleksów SNARE w populacji neuronów. Rysunek 1 przedstawia powstałą western blot po zakończeniu testu kompleksu SNARE opornego na SDS badanego pod kątem SNAP-25, syntaksyny1A i VAMP2.

Mikroskopia TIRF na błonie komórkowej podstawy dostarcza obrazów o wysokiej rozdzielczości poszczególnych egzocytarnych fuzji w pojedync.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozgałęzianie aksonów jest podstawowym procesem neurorozwojowym i stanowi podstawę rozległych połączeń neurologicznych układu nerwowego ssaków. Zrozumienie mechanizmów związanych z miejscową ekspansją błony plazmatycznej jest integralną częścią naszego zrozumienia zarówno normalnego, jak i patologicznego rozwoju neurologicznego. Zastosowanie wielotorowego podejścia obejmującego zarówno metodologie na poziomie populacji, jak i na poziomie pojedynczej komórki zwiększa odtwarzalność oraz rozdzielczość przestrzenną i czasową.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health: RO1-GM108970 (SLG) i F31-NS087837 (CW).

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
6-dołkowe płytki poddane hodowli tkankowejOlympus Plastics25-105
szklane szkiełka nakrywkoweFisher scientific12-545-8112CIR-1.5; muszą być poddane działaniu kwasu azotowego przez 24 godziny, przepłukane w wodzie DI 2x i wysuszone przed użyciem. Musi być pokryty 1 mg/ml poli-d-lizyny i wypłukany przed posiewem komórek.
Roztwór nukleofekcji AmaxaLonzaVPG-1001100 ml/transfekcja
Amaxa Nucleofector/elektroporatorProgram LonzaO-005
35 mm Naczynia do obrazowania żywych komórek ze szklanym dnemMatek Corporationp356-1.5-14-Cmuszą być pokryte 1 mg/ml poli-d-lizyny i przepłukane przed posiewem komórek
Mikroskop odwrócony Olympus IX81-ZDC2Olympus
Lampa ksenonowa Lambda LSFirma Sutter Instruments Środowisko
Inkubator górnyTokai Hit
100x 1.49 NA TIRFobiektyw Olympus
Andor iXon EM-CCDAndor
Odyssey Licor System obrazowania w podczerwieniLI-COROdyssey CL-XSłuży do skanowania kleksów
Studio obrazów pakiet oprogramowaniaLI-CORSłuży do skanowania w systemie Odyssey Infrared; Image studio lite służy do analizy plam w trybie offline
Metamorph dla urządzeń OlympusMolecular Devices, LLCwersja 7.7.6.0Oprogramowanie używane do obrazowania i analizy timelapse DIC
Oprogramowanie sterujące CELL TIRFOprogramowanie Olympusużywane do sterowania laserami do obrazowania TIRF
Fidżi (zdjęcie J)NIHImageJ Wersja 1.49t
60x Plan Apochromat 1.4 NAobiektywOlympus
40x 1.4 NA Plan ApochromatOlympus
NeurobasewGIBCO21103-049Roztwór bazowy do pożywek hartujących bez surowicy i trypsyny
Suplement B27GIBCO17504-044500 ml/50 ml Pożywka bez surowicy i pożywka do gaszenia trypsyny
L-Glutamina35050-0611 ml/50 ml Pożywka bez surowicy
Albumina surowicy bydlęcejBio Basic Incorporated9048-46-810% roztwór w 1x PBS do blokowania szkiełek nakrywkowych; 5% roztwór w TBS-T do blokowania błon nitrocelulozowych.
10x  trypsynaSigma59427C
HEPESCELLGRO25-060-CL
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)+ Ca + MgCorning21-030-cm
Surowica bydlęcapłodu Corning/CELLGRO35-010-CV
Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)Corning/CELLGRO20-021-CV
NaClFisher scientificBP358-10
EGTAFisher scientificCAS67-42-5
MgCl2FisherscientificBP214-500
TRIS HClSigmaT5941-500
TRIS baseFisher scientificBP152-5
N-Propyl GalusanMP Biomedicals102747
Glicerol Klasa fotometrycznaAcros Organics18469-5000
Glicerol (klasa nieoptyczna)Fisher scientificCAS56-81-5
B-merkaptoetonalnyFisher scientificBP176-100
SDSFisher scientificBP166-500
Woda destylowana GIBCO152340-147
Poli-D-LizynaSigmap-7886Rozpuszczony w sterylnej wodzie w stężeniu 1 mg/ml
Toksyna botulinowa A Lista BoNTALaboratoria biologiczne128-A
Królik poliklonalny anty ludzki VAMP2Sygnalizacja komórkowa11829
Mysi monoklonalny anty szczur Syntaxin1ASanta Cruz Biotechnologysc-12736
Koza poliklonalna anty ludzka SNAP-25Santa Cruz Biotechnologysc-7538
Mysz monoklonalna anty ludzka i beta; III-tubulina CovanceMMS-435P
Alexa Fluor 568 i Alexa Fluor 488 falloidyna lub Alexa Fluor 647Invitrogen
LI-COR IR-dye przeciwciała drugorzędoweLI-CORP / N 925-32212, P / N 925-68023, P/N 926-68022800 ośle anty-mysz, 680 osioł anty królik, 680 osioł anty koza
0,2 i # 956; m wielkość porów membrana nitrocelulozowaBiorad9004-70-0
Tween-20Fisher scientificBP337-500
MetanolFisher scientificS25426A
Bromphenol BlueSigmaB5525-5G
SacharozaFisher scientificS6-212
ParaformaldehydFisher scientificO-4042-500
Triton-X100Fisher scientificBP151-500
TEMEDFisher scientificBP150-20
40% bis-akrylimiduFisher scientificBP1408-1
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alternatywne zwalidowane przeciwciała
Mouse Monoklonalna antysyntaksyna HPC-1 klonSigma AldrichS0664
  Mysi monoklonalny synaptobrevin 2 (VAMP2)Systemy synaptyczne104-211
Mysie monoklonalnesystemy synaptyczne111-011
SNAP25

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Drachman, D. A. Do we have brain to spare? Neurology. 64 (12), 2004-2005 (2005).
  2. Serafini, T., et al. Netrin-1 Is Required for Commissural Axon Guidance in the Developing Vertebrate Nervous System. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
  3. Métin, C., Deléglise, D., Se....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Axon BranchingNeuronal MorphogenesisSNARE Mediated ExocytosisTIRF MicroscopyVAMP2 pHlourinDIC ImagingWestern BlotBotulinum ToxinNetrin 1 StimulationCortical Neurons

Powiązane artykuły