Wykorzystanie połączonych metodologii w celu zdefiniowania roli dostarczania błony plazmatycznej podczas rozgałęziania aksonów i morfogenezy neuronów

Summary

Techniki mikroskopii świetlnej w połączeniu z testami biochemicznymi wyjaśniają udział egzocytozy za pośrednictwem SNARE w zależnym od netryny rozgałęzianiu aksonów. Ta kombinacja technik pozwala na identyfikację mechanizmów molekularnych kontrolujących rozgałęzianie się aksonów i zmianę kształtu komórki.

Abstract

Podczas rozwoju neuronalnego, rosnące aksony rozciągają się na wielu partnerów synaptycznych poprzez rozwijanie gałęzi aksonalnych. Rozgałęzianie się aksonów jest promowane przez zewnątrzkomórkowe wskazówki naprowadzające, takie jak netryna-1, i powoduje dramatyczny wzrost powierzchni aksonalnej błony plazmatycznej. Rozgałęzienia aksonów zależne od Netrin-1 prawdopodobnie obejmują czasową i przestrzenną kontrolę rozszerzania błony plazmatycznej, której składniki są dostarczane przez fuzję pęcherzyków egzocytarnych. Te zdarzenia fuzji są poprzedzone tworzeniem kompleksów SNARE, zawierających v-SNARE, takich jak VAMP2 (białko błonowe związane z pęcherzykami 2) i t-SNARE błony plazmatycznej, syntaksynę-1 i SNAP25 (białko związane z synaptosomalami 25). Szczegółowo opisano w niniejszym dokumencie wielotorowe podejście stosowane do badania roli egzocytozy za pośrednictwem SNARE w rozgałęzianiu aksonów. Mocną stroną połączonego podejścia jest pozyskiwanie danych w różnych rozdzielczościach przestrzennych i czasowych, począwszy od dynamiki pojedynczych zdarzeń fuzji pęcherzyków w pojedynczych neuronach, a skończywszy na tworzeniu kompleksów SNARE i rozgałęzianiu aksonów w populacjach hodowanych neuronów. Protokół ten wykorzystuje uznane podejścia biochemiczne do oznaczania poziomów endogennych kompleksów SNARE i mikroskopii całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF) neuronów korowych eksprymujących VAMP2 znakowanych wrażliwym na pH GFP (VAMP2-pHlourin) w celu identyfikacji zależnych od netryny-1 zmian aktywności egzocytarnej w poszczególnych neuronach. Aby wyjaśnić czas rozgałęzień zależnych od netryny-1, wykorzystuje się mikroskopię poklatkowego kontrastu interferencji różnicowej (DIC) pojedynczych neuronów w ciągu kilku godzin. Utrwalona immunofluorescencja komórek w połączeniu z neurotoksynami botulinowymi rozszczepiającymi maszynerię SNARE i blokującymi egzocytozę pokazuje, że rozgałęzianie aksonów zależne od netryny-1 wymaga aktywności egzocytarnej za pośrednictwem SNARE.

Introduction

Ostatnie szacunki sugerują, że ludzki mózg składa się z 10¹¹ neuronów z 10¹⁴ połączeniami synaptycznymi¹, co podkreśla znaczenie rozgałęziania się aksonów in vivo. Zewnątrzkomórkowe wskazówki naprowadzające aksonów, takie jak netrin-1, kierują aksony do odpowiednich partnerów synaptycznych i stymulują rozgałęzianie aksonów, zwiększając w ten sposób pojemność synaptyczną^2-5. Arboryzacja aksonalna zależna od Netrin-1 wiąże się ze znaczną ekspansją błony plazmatycznej⁶, co jak przypuszczamy, wymaga dostarczenia dodatkowych składników błony poprzez fuzję pęcherzyków egzocytarnych zależną od kompleksu SNARE⁷.

Badanie roli egzocytozy za pośrednictwem SNARE w rozgałęzianiu aksonów zależnym od netryny-1 jest skomplikowane z powodu kilku czynników. Po pierwsze, heterogeniczność neuronów korowych zwiększa wielkość próbki wymaganej do zidentyfikowania znaczących efektów, komplikując techniki jednokomórkowe, takie jak obrazowanie. Po drugie, chociaż techniki biochemiczne pozwalają na obserwację zmian zachodzących na poziomie populacji, brakuje im rozdzielczości czasowej i przestrzennej niezbędnej do zlokalizowania ekspansji błony plazmatycznej do aksonu w ramach czasowych rozgałęziania się aksonów. Wreszcie, chociaż gałęzie aksonów tworzą się w ciągu godzin, zmiany komórkowe, które przyczyniają się do wydłużenia aksonów, mogą rozpocząć się w ciągu kilku minut i wystąpić w ciągu kilku sekund, rozszerzając w ten sposób zakres czasowy do rozważenia eksperymentalnego.

Przedstawiamy podejście oparte na wielu technikach, które odnosi się do tych różnorodnych czasowych i przestrzennych skal egzocytozy i rozgałęziania aksonów, a tym samym zwiększa nasze zrozumienie podstawowych mechanizmów komórkowych. Wykorzystanie tych podejść dostarcza dowodów potwierdzających kluczową rolę egzocytozy za pośrednictwem SNARE w rozgałęzianiu aksonów.

Protocol

Oświadczenie o etyce badawczej: Wszystkie eksperymenty na zwierzętach opisane tutaj podlegają zasadom i przepisom Komitetu UNC ds. Opieki nad Zwierzętami oraz standardom NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Przygotowanie i posiewanie zdysocjowanych neuronów korowych

1. Poddaj eutanazji samice w ciąży w czasie przez wdychanie CO₂ , a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Usuń całe mózgi z czaszek myszy w dniu embrionalnym 15.5 (E15.5) i przeprowadź mikrosekcję kory mózgowej z każdej półkuli. Szczegółowe instrukcje dotyczące mikrodysekcji embrionalnej kory myszy znajdują się w Viesselmann i wsp. ⁸.
2. Umieścić nie więcej niż 4 kory w 1 ml pożywki preparacyjnej w sterylnej mikroprobówce o pojemności 1,6 ml. Dodaj 120 μl 10x trypsyny i odwróć probówkę 3 - 5 razy, aby wymieszać.
3. Za pomocą hemocytometru policz komórki na szalkach z hodowlą komórek nasiennych. Uwaga: 1 półkula korowa dostarcza około trzech milionów komórek.
   1. W przypadku odpornego na SDS złożonego testu biochemicznego SNARE należy ułożyć sześć milionów komórek na szalce o średnicy 35 mm i wykorzystać dwie szalki na warunek. Uwaga: Jest to uproszczone dzięki użyciu płytek 6-dołkowych podczas porównywania wielu warunków.
   2. Do testów rozgałęzień, neurony płytkowe na kwasie azotowym płukały okrągłe szkiełka nakrywkowe o gęstości 250 000 komórek na 35 mm szalkę, do obrazowania DIC płytki rozgałęziającej aksony o gęstości 150 000. Dzięki tym gęstościom pozwala uniknąć przeludnienia i upraszcza analizę.
4. W przypadku mikroskopii TIRF z żywymi komórkami ponownie zawieś dwa miliony neuronów na transfekcję w roztworze nukleofekcji w RT.
   1. Dodać 100 μl zawiesiny komórkowej do mikroprobówki zawierającej 10 μg plazmidu ekspresyjnego VAMP2-pHlourin i elektroporować nukleofektorem zgodnie z protokołem^{producenta 9}.
   2. Po transfekcji natychmiast dodać 500 μl pożywki hartowniczej trypsyny, usunąć zawiesinę z kuwet i komórek płytki o gęstości 400 000 komórek na 35 mm szklane dno pokryte PDL.
5. Umieść wszystkie neurony korowe w 2 ml pożywki wolnej od surowicy.

2. Test tworzenia kompleksu SNARE

Uwaga: Odporne na SDS kompleksy SNARE zostały przetworzone i przeanalizowane zgodnie z pierwotnym opisem¹⁰ z modyfikacjami opisanymi poniżej. Aby zapoznać się z zwalidowanymi przeciwciałami alternatywnymi do zastosowanych tutaj, patrz sekcja dotycząca materiałów.

1. Stymulować neurony korowe E15,5 przez 2 dni in vitro (DIV) za pomocą 250 ng / ml netrin-1 lub kontroli pozorowanej przez 1 godzinę przed lizą.
2. Przed przetworzeniem próbek schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C i ustawić temperaturę łaźni wodnej na 37 °C, a podgrzewać blok na 100 °C.
3. Wyjmij szalki z komórkami z inkubatora i umieść je na lodzie.
   1. Odessać pożywkę z komórek, zastąpić ~ 2 ml lodowatej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) delikatnie 2 razy przez 1 - 2 minuty na płukanie.
   2. Do tego testu użyj 2 studzienek na warunek.
   3. Odessać PBS z pierwszego dołka stanu i zastąpić buforem homogenizacyjnym o pojemności 250 μl. Pozostaw na lodzie na 5 minut, a następnie za pomocą podnośnika komórkowego homogenizuj komórki na lodzie.
   4. Odessać PBS z następnego dołka o tym samym stanie i dodać do dołka niedawno zhomogenizowaną mieszaninę. Spowoduje to zwiększenie stężenia białka. Powtórz dla wszystkich warunków.
   5. Po zakończeniu pipetować homogenizowany roztwór do wstępnie schłodzonej mikroprobówki o pojemności 1,6 ml na lodzie i dodać 20% TritonX-100, aby osiągnąć końcowe stężenie 1% TritonX-100. Rozetrzyj 10 razy za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl, minimalizując pęcherzyki.
4. Inkubuj probówki na lodzie przez 2 minuty, aby rozpuścić białka. Po inkubacji odwirować przez 10 minut w temperaturze 6,010 rcf w temperaturze 4 °C w celu osadzenia nierozpuszczonego materiału. Przenieść supernatant lizatu do nowej schłodzonej probówki o pojemności 1,6 ml na lodzie.
5. Przeprowadzić analizę stężenia białka przy użyciu testu Bradforda¹¹ i rozcieńczyć próbki do końcowego stężenia białka 3 - 5 mg / ml z pozostałym buforem homogenizacyjnym uzupełnionym 1% TritonX-100 i 5-krotnym buforem próbki uzupełnionym B-merkapteetanolem (BME).
6. Podziel każdą próbkę doświadczalną równomiernie na 2 probówki. Inkubować jedną próbkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut (kompleksy SNARE), a drugą w temperaturze 100 °C przez 30 minut (monomery SNARE). Odwracaj probówki z przerwami, aby utrzymać próbki w roztworze.
7. Próbki należy zamrażać w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będą gotowe do rozdzielenia za pomocą SDS-PAGE. Przed poddaniem próbek elektroforezie przy użyciu standardowych technik, należy ponownie zaolejić wcześniej gotowane próbki przez 5 minut w temperaturze 100 °C, a następnie rozmrozić próbki w temperaturze 37 °C w temperaturze pokojowej.
8. Uruchom duplikaty próbek (30 - 40 μg białka na próbkę) zarówno na 8%, jak i 15% żelu; 8% zapewnia idealne oddzielenie kompleksu, podczas gdy 15% służy do ilościowego oznaczania monomerów białkowych SNARE (SNAP-25 ~ 25 kDa, VAMP2 ~ 18 kDa, syntaksyna-1 ~ 35 kDa). Utrzymuj źródło zasilania na poziomie 70 V, aż linia barwnika przejdzie przez żel do układania w stosy i zwiększ napięcie do 90 V. Uruchom żele, aż barwnik spłynie.
9. Aby zachować monomery, przenieś białka do membrany nitrocelulozowej 0,2 μm na lodzie za pomocą buforu do zimnego transferu z dodatkiem 20% metanolu (MeOH) pod napięciem 70 V przez 45 minut.
10. Suszyć membranę w przykrytym naczyniu przez 2 godziny do O/N przy temperaturze pokojowej (O/N zapewnia najlepsze wyniki).
11. Zablokuj błony kompleksu SNARE w 10% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
12. Przygotować przeciwciała pierwszorzędowe (rozpoznające specyficzne składniki kompleksu SNARE) w rozcieńczeniu 1:1 000 i sondować O/N w temperaturze 4 °C na wytrząsarce obrotowej.
    1. Opłucz bloty w buforowanym roztworze soli fizjologicznej Tris plus 0,1% Tween-20 (TBS-T) 3 razy przez 5 minut każdy.
13. Przygotować fluorescencyjne roztwory przeciwciał drugorzędowych w rozcieńczeniu 1:20 000 w 1% BSA w TBS-T i sondować przez 1 godzinę, pod przykryciem w temperaturze RT. Powtórzyć krok 2.12.1 po 1 godzinie.
14. Obrazowanie na fluorescencyjnym urządzeniu skanującym wyposażonym w pakiet oprogramowania i ilościowe określenie zarówno kompleksu białkowego SNARE (prążki immunoreaktywne powyżej 40 kDa), jak i prążków monomerów (prążki immunoreaktywne przy 25 kDa, 18 kDa, 35 kDa odpowiednio dla SNAP-25, VAMP2 i syntaksyny-1) przy użyciu instrukcji producenta dotyczących rysowania prostokątnych ROI.

3. Obrazowanie zdarzeń egzocytarnych za pomocą mikroskopii TIRF

Uwaga: Ten protokół wymaga specjalistycznego sprzętu do mikroskopii, w tym komory środowiskowej do utrzymywania temperatury, wilgotności i CO₂, odwróconego mikroskopu TIRF wyposażonego w oświetlenie epifluorescencyjne, obiektywu TIRF o dużym powiększeniu/dużej aperturze numerycznej (NA), zautomatyzowanego stolika XYZ i czułego detektora CCD (Charge Coupled Device). Protokół ten wykorzystuje w pełni zautomatyzowany mikroskop odwrócony wyposażony w obiektyw TIRF 100x 1,49NA, laser półprzewodnikowy 491 nm i przetwornik CCD zwielokrotniający elektrony (EM-CCD). Wszystkie urządzenia są sterowane za pomocą oprogramowania do obrazowania i sterowania laserem. Przed rozpoczęciem protokół obrazowania włącza komorę środowiskową, scenę, lampę, komputer i kamerę.

1. Wybierz obiektyw w oprogramowaniu do obrazowania. Po umieszczeniu obiektywu na miejscu przymocuj grzałkę obiektywu do kołnierza.
2. Upewnij się, że obiektyw jest całkowicie opuszczony przed zamocowaniem inkubatora etapowego w gnieździe stopnia. Wlej równomiernie wodę destylowaną do wlotów inkubatora stopniowego, aby zapobiec rozlaniu.
3. Włącz system inkubacji. Otwórz zawór do zbiornika CO₂ i upewnij się, że ciśnienie jest odpowiednie dla systemu zgodnie z instrukcjami producenta. Odczekać, aż komora osiągnie 5% CO₂ i 37 °C. Przed dodaniem naczynia do obrazowania umieść pustą miskę w inkubatorze, aby uniknąć kondensacji wody na obiektywie.
4. Włącz źródło lasera.
5. Inkubator na etapie otwartym i dodaj olejek immersyjny do soczewki. Umieścić próbkę w inkubatorze i ustabilizować za pomocą ramion stabilizujących lub obciążnika szalkowego. Podnieś obiektyw do momentu, aż olej zetknie się z dnem próbki. Przełącz się na oświetlenie światłem przechodzącym i znajdź neuronalną płaszczyznę ogniskową przez okulary.
6. Uruchom oprogramowanie lasera i połącz się z oprogramowaniem sterującym laserem. Ustaw oświetlenie na szerokie pole i wybierz używany obiektyw (zalecane jest 100X 1.49 NA TIRF). Ustaw współczynnik załamania światła próbki (komórki ~1,38). Dostosuj intensywność lasera, odznaczając "TTL" dla lasera 491 nm. Ustaw suwak w pozycji 100, a następnie zmniejsz go z powrotem do wartości z zakresu od 20 do 40%. Ponownie sprawdź "TTL".
7. Ponownie skoncentruj się na próbce w oświetleniu światłem przechodzącym. Przejdź do oprogramowania do obrazowania i wybierz oświetlenie laserowe 491 nm i otwórz migawkę. Dokładnie wyreguluj ogniskową lasera na suficie i wyśrodkuj punkt do środka membrany zamkniętego pola z usuniętym kondensatorem. Umieść kondensator do góry nogami na ławce optycznej, aby nie zarysować soczewki.
8. Wymień kondensator i przejdź do oprogramowania TIRF i ustaw głębokość penetracji (PD) na 110 nm. Przełącz się z oświetlenia szerokokątnego na tryb oświetlenia TIRF w celu obrazowania.
9. Znajdź komórki eksprymujące VAMP2-phluorin przez okulary za pomocą epifluorescencji szerokokątnej ze źródłem światła epifluorescencyjnego.
   1. Dostosuj parametry obrazowania (czas ekspozycji, wzmocnienie i moc lasera), aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu i zakres dynamiczny, wykorzystując minimalny czas ekspozycji i intensywność lasera, aby zmniejszyć fotowybielanie i fototoksyczność (na przykład: ekspozycja między 50 a 100 ms, z wzmocnieniem 15 - 30 przy 30% maksymalnej mocy lasera).
   2. Ustaw ciągły autofokus na komórkę. Uzyskaj zestaw zdjęć poklatkowych z akwizycją odbywającą się co 0,5 sekundy przez 5 minut. W przypadku stanu stymulowanego netryną-1 dodać 500 ng/ml netryny-1 do naczynia z komórkami w okapie z przepływem laminarnym i umieścić naczynie z powrotem w inkubatorze na 1 godzinę przed obrazowaniem.
10. Aby określić ilościowo częstotliwość zdarzeń egzocytarnych znormalizowanych dla obszaru komórki i czasu, otwórz stosy obrazów w ImageJ, przeciągając plik do okna lub przechodząc do Plik> Otwórz> Nazwa pliku (Rysunek 2A Wstawka 1).
    1. Aby usunąć stabilne sygnały fluorescencyjne, które nie reprezentują zdarzeń fuzji pęcherzyków, utwórz średnią projekcję z całego stosu za pomocą Image>Stack>Z-Project>Projection type: Average Intensity (Średnia intensywność). Odejmij ten średni obraz od każdego obrazu w timelapse za pomocą Process> Image Calculator> Image1: your stack Operacja: Odejmij Image2 nowo utworzoną średnią projekcji z. Podkreśla to zdarzenia egzocytarne (ryc. 2A, wstawka 2-3).
    2. Policz zdarzenia fuzji egzocytarnej na oko. Zdarzenia egzocytarne definiuje się jako pojawienie się ograniczonego dyfrakcją sygnału fluorescencji, który szybko dyfunduje, gdy VAMP2-phluorin dyfunduje w błonie plazmatycznej (figura 2A Inset 6).
    3. Użyj polecenia Próg, aby podświetlić pierwszy obraz za pomocą suwaka Image>Adjust>Threshold> aż cała komórka zostanie podświetlona jako próg (Rysunek 2A Wstawka 7 - 8).
    4. W obszarze Analizuj wybierz pozycję SetMeasurements i zaznacz obszar oraz wyświetl etykietę. Wybierz progowy obszar komórkowy za pomocą narzędzia do śledzenia różdżki i naciśnij "m", aby zmierzyć (Rysunek 2A, wstawka 7 - 8).
    5. Przenieś zarówno liczbę zdarzeń fuzji egzocytarnej, pomiary powierzchni komórki, jak i czas, który upłynął od obrazowania, do arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć liczbę zdarzeń egzocytarnych / mm² / czas (Figura 2A Wstawka 9).

4. Kontrast interferencyjny różnicowy (DIC) Mikroskopia poklatkowa rozgałęzień aksonów

Uwaga: Dostępny jest kompletny protokół i demonstracja ogólnego podejścia do obrazowania DIC¹². Chociaż protokół ten wykorzystuje DIC, inne metody mikroskopii światła przechodzącego mogą być używane do tych samych celów (na przykład: kontrast fazowy).

1. Przy 2 DIV umieść naczynie do obrazowania ze szklanym dnem zawierające nietransfekowane neurony we wstępnie ogrzanej komorze środowiskowej, aby utrzymać wilgotne środowisko z 5% CO₂ i 37 °C. Wykorzystaj mikroskop wyposażony w 60-krotny planapochromat, soczewkę obiektywową 1,4 NA DIC i kondensor o wysokiej NA, aby uzyskać najlepszą jakość i rozdzielczość obrazu.
2. Dostosuj płaszczyznę ogniskowej, aby znaleźć neurony przez okulary za pomocą oświetlenia światłem przechodzącym.
3. Korzystając z funkcji akwizycji wielu obszarów w oprogramowaniu do obrazowania, znajdź i zapisz lokalizacje XYZ co najmniej 6 komórek. Ustaw stolik tak, aby interesujące go neurony mieściły się w polu widzenia, aby uzyskać najlepsze wyniki.
   1. Stymulować 250 ng/ml netrin-1 i nacisnąć przycisk "rozpocznij akwizycję wieloobszarową". Sekwencyjnie rejestruj obrazy w każdej pozycji co 20 sekund przez 24 godziny, zatrzymując akwizycję i ponownie ustawiając ostrość w razie potrzeby.
4. Przeglądanie obrazów w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu za pomocą opcji Apps>Review Multi Dimensional Data>open file name. Zidentyfikuj stabilne gałęzie aksonów (o długości 20 μm), które tworzą się podczas sesji obrazowania. Użyj narzędzia do rysowania linii, aby zmierzyć gałąź stableaxon od podstawy przy aksonie do końcówki, aby upewnić się, że spełnione są wymagania dotyczące długości 20 μm.
   1. W arkuszu kalkulacyjnym zapisz numer klatki po stymulacji netryny, gdy wypukłości błony inicjują się w obszarach, w których później tworzą się gałęzie, a także numer klatki po stymulacji netryny, gdy powstające gałęzie osiągają 20 μm długości.
   2. Pomnóż liczbę ramek między występem a formacją gałęzi przez 20 sekund, aby obliczyć czas formowania na gałąź.

5. Manipulacje toksynami i immunofluorescencja komórek stałych

1. W 2 DIV potraktuj neurony w warunkach eksperymentalnych 250 ng / ml netrin-1 i / lub 10 nM toksyny botulinowej A (BoNTA), która rozszczepia białko SNARE SNAP25 i skutecznie hamuje egzocytozę za pośrednictwem SNARE¹³, plus 250 ng / ml netryny-1. Pozostaw jeden zestaw nieleczonych neuronów jako warunek kontrolny.
   UWAGA: BoNTA wymaga stosowania środków ochrony oczu i dróg oddechowych podczas przygotowywania i stosowania roztworów. Utrzymuj wszystkie skażone materiały jako materiał niebezpieczny biologicznie i jak najszybciej przeprowadź autoklaw.
2. W 3 DIV (24 godziny po poddaniu działaniu substancji) odessać pożywkę i natychmiast zastąpić co najmniej 1 ml utrwalacza PHEM (szczegóły patrz Tabela 1) ogrzanej do temperatury 37 °C. Inkubować przez 20 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
3. Spłukać 3x PBS (do wykorzystania w przyszłości uszczelnić parafilmem i przechowywać w temperaturze 4 °C).
4. Umieść szkiełka nakrywkowe w ciemnej, wilgotnej komorze barwienia i przepuszczaj błony komórkowe przez 10 minut w świeżo rozcieńczonym 0,2% TritonX-100 w PBS (wykonanym z 10% bulionu TritonX-100).
5. Usunąć roztwór przepuszczalny i spłukać 50 μl 1x z PBS. Blokuj przez 30 minut w ~ 50 μl 10% albuminy surowicy bydlęcej w PBS (BSA-PBS) lub 10% gotowanej surowicy osła w PBS w temperaturze pokojowej.
6. Ponownie spłucz 1x PBS. Inkubować szkiełka nakrywkowe w 50 μl pierwszorzędowego przeciwciała (tubulina 1:1,000 βIII, w celu potwierdzenia tożsamości neuronalnej) w 1% BSA-PBS przez 1 godzinę w RT, w ciemności.
7. Wykonaj 3 prania po 5 minut w PBS. Inkubować szkiełka nakrywkowe w 50 μl spektralnie odrębnego przeciwciała drugorzędowego dla tubuliny (1:400) i fluorescencyjnej falloidyny (różni się w zależności od wzbudzenia: 488 falloidyny w 1:400, 647 falloidyny w 1:100) w 1% BSA-PBS przez 1 godzinę.
8. Umyć 3x 5 min w 1x PBS i zamontować szkiełka nakrywkowe na szkiełkach w mediach montażowych.
9. Odkurz nadmiar mediów montażowych z krawędzi szkiełka nakrywkowego i uszczelnij przezroczystym lakierem do paznokci.
10. Zbieraj obrazy epifluorescencji o szerokim polu widzenia w mikroskopie odwróconym z obiektywem 40X 1,4NA, możliwościami epifluorescencyjnymi i EM-CCD.
    1. Ręczne analizowanie rozgałęzień przy użyciu narzędzia ImageJ. Otwórz stosy obrazów w ImageJ, przeciągając plik do okna lub przechodząc do opcji Plik> Otwórz> Nazwa pliku (Rysunek 4A wstawka 1).
    2. Używając linii >segmentowej linii, prześledź akson, zdefiniowany jako najdłuższy neuryt wystający z somy (Rysunek 4A wstawka 2 - 3).
    3. Korzystając z narzędzia Analyze>Tools>ROI Manager, zapisz śledzenie aksonów jako obszar zainteresowania. Śledź i zapisz każdą gałąź aksonu, zdefiniowaną jako neuryt o długości ≥20 μm. W analizie należy uwzględnić tylko gałęzie pierwotne (wyrostki wyrastające bezpośrednio z aksonu) (rysunek 4A, wstawka 3 - 4).
    4. Naciśnij "m", aby zmierzyć zapisane obszary zainteresowania i przenieś długości w pikselach do arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć długość w μm.
    5. Podziel liczbę gałęzi aksonów o długości ≥20 μm przez długość aksonu w μm podzieloną przez 100, aby uzyskać liczbę gałęzi aksonów na 100 μm długości.

Results

Wykorzystanie technik biochemicznych in vitro do oznaczania ilości odpornych na SDS kompleksów SNARE w populacji neuronów. Rysunek 1 przedstawia powstałą western blot po zakończeniu testu kompleksu SNARE opornego na SDS badanego pod kątem SNAP-25, syntaksyny1A i VAMP2.

Mikroskopia TIRF na błonie komórkowej podstawy dostarcza obrazów o wysokiej rozdzielczości poszczególnych egzocytarnych fuzji w pojedync...

Discussion

Rozgałęzianie aksonów jest podstawowym procesem neurorozwojowym i stanowi podstawę rozległych połączeń neurologicznych układu nerwowego ssaków. Zrozumienie mechanizmów związanych z miejscową ekspansją błony plazmatycznej jest integralną częścią naszego zrozumienia zarówno normalnego, jak i patologicznego rozwoju neurologicznego. Zastosowanie wielotorowego podejścia obejmującego zarówno metodologie na poziomie populacji, jak i na poziomie pojedynczej komórki zwiększa odtwarzalność oraz rozdzielczość przestrzenną i czasową...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-dołkowe płytki poddane hodowli tkankowej	Olympus Plastics	25-105
szklane szkiełka nakrywkowe	Fisher scientific	12-545-81	12CIR-1.5; muszą być poddane działaniu kwasu azotowego przez 24 godziny, przepłukane w wodzie DI 2x i wysuszone przed użyciem. Musi być pokryty 1 mg/ml poli-d-lizyny i wypłukany przed posiewem komórek.
Roztwór nukleofekcji Amaxa	Lonza	VPG-1001	100 ml/transfekcja
Amaxa Nucleofector/elektroporator	Program Lonza		O-005
35 mm Naczynia do obrazowania żywych komórek ze szklanym dnem	Matek Corporation	p356-1.5-14-C	muszą być pokryte 1 mg/ml poli-d-lizyny i przepłukane przed posiewem komórek
Mikroskop odwrócony Olympus IX81-ZDC2	Olympus
Lampa ksenonowa Lambda LS	Firma Sutter Instruments Środowisko
Inkubator górny	Tokai Hit
100x 1.49 NA TIRF	obiektyw Olympus
Andor iXon EM-CCD	Andor
Odyssey Licor System obrazowania w podczerwieni	LI-COR	Odyssey CL-X	Służy do skanowania kleksów
Studio obrazów pakiet oprogramowania	LI-COR		Służy do skanowania w systemie Odyssey Infrared; Image studio lite służy do analizy plam w trybie offline
Metamorph dla urządzeń Olympus	Molecular Devices, LLC	wersja 7.7.6.0	Oprogramowanie używane do obrazowania i analizy timelapse DIC
Oprogramowanie sterujące CELL TIRF	Oprogramowanie Olympus		używane do sterowania laserami do obrazowania TIRF
Fidżi (zdjęcie J)	NIH	ImageJ Wersja 1.49t
60x Plan Apochromat 1.4 NA	obiektywOlympus
40x 1.4 NA Plan Apochromat	Olympus
Neurobasew	GIBCO	21103-049	Roztwór bazowy do pożywek hartujących bez surowicy i trypsyny
Suplement B27	GIBCO	17504-044	500 ml/50 ml Pożywka bez surowicy i pożywka do gaszenia trypsyny
L-Glutamina		35050-061	1 ml/50 ml Pożywka bez surowicy
Albumina surowicy bydlęcej	Bio Basic Incorporated	9048-46-8	10% roztwór w 1x PBS do blokowania szkiełek nakrywkowych; 5% roztwór w TBS-T do blokowania błon nitrocelulozowych.
10x  trypsyna	Sigma	59427C
HEPES	CELLGRO	25-060-CL
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)+ Ca + Mg	Corning	21-030-cm
Surowica bydlęca	płodu Corning/CELLGRO	35-010-CV
Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)	Corning/CELLGRO	20-021-CV
NaCl	Fisher scientific	BP358-10
EGTA	Fisher scientific	CAS67-42-5
MgCl2Fisher	scientific	BP214-500
TRIS HCl	Sigma	T5941-500
TRIS base	Fisher scientific	BP152-5
N-Propyl Galusan	MP Biomedicals	102747
Glicerol Klasa fotometryczna	Acros Organics	18469-5000
Glicerol (klasa nieoptyczna)	Fisher scientific	CAS56-81-5
B-merkaptoetonalny	Fisher scientific	BP176-100
SDS	Fisher scientific	BP166-500
Woda destylowana	GIBCO	152340-147
Poli-D-Lizyna	Sigma	p-7886	Rozpuszczony w sterylnej wodzie w stężeniu 1 mg/ml
Toksyna botulinowa A Lista BoNTA	Laboratoria biologiczne	128-A
Królik poliklonalny anty ludzki VAMP2	Sygnalizacja komórkowa	11829
Mysi monoklonalny anty szczur Syntaxin1A	Santa Cruz Biotechnology	sc-12736
Koza poliklonalna anty ludzka SNAP-25	Santa Cruz Biotechnology	sc-7538
Mysz monoklonalna anty ludzka i beta; III-tubulina	Covance	MMS-435P
Alexa Fluor 568 i Alexa Fluor 488 falloidyna lub Alexa Fluor 647	Invitrogen
LI-COR IR-dye przeciwciała drugorzędowe	LI-COR	P / N 925-32212, P / N 925-68023, P/N 926-68022	800 ośle anty-mysz, 680 osioł anty królik, 680 osioł anty koza
0,2 i # 956; m wielkość porów membrana nitrocelulozowa	Biorad	9004-70-0
Tween-20	Fisher scientific	BP337-500
Metanol	Fisher scientific	S25426A
Bromphenol Blue	Sigma	B5525-5G
Sacharoza	Fisher scientific	S6-212
Paraformaldehyd	Fisher scientific	O-4042-500
Triton-X100	Fisher scientific	BP151-500
TEMED	Fisher scientific	BP150-20
40% bis-akrylimidu	Fisher scientific	BP1408-1
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Alternatywne zwalidowane przeciwciała
Mouse Monoklonalna antysyntaksyna HPC-1 klon	Sigma Aldrich	S0664
Mysi monoklonalny synaptobrevin 2 (VAMP2)	Systemy synaptyczne	104-211
Mysie monoklonalne	systemy synaptyczne	111-011