Tutaj stosujemy metodologię FISH do śledzenia retrotranspozycji LINE-1 na poziomie pojedynczych jąder w rozsiewach chromosomów linii komórkowych HepG2 stabilnie wyrażających syntetyczną LINE-1.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza retrotranspozycji LINE-1 na poziomie pojedynczego jądra
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Długi przeplatany pierwiastek jądrowy-1 (Linia-1 lub L1) stanowi około 17% DNA obecnego w ludzkim genomie. Podczas gdy większość L1s jest nieaktywna z powodu obcięć 5', ~ 80-100 tych elementów pozostaje kompetentnych do retrotranspozycji i rozprzestrzenia się do różnych miejsc w całym genomie za pośrednictwem produktów pośrednich RNA. Podczas gdy uważa się, że starsze L1 celują w bogate w AT regiony genomu, cele chromosomalne nowszych, bardziej aktywnych L1 pozostają słabo zdefiniowane. Tutaj opisujemy metodologię hybrydyzacji fluorescencji in situ (FISH), którą można wykorzystać do śledzenia wzorców insercji L1 i szybkości inkorporacji ektopowego L1 na poziomie pojedynczego jądra. W tych eksperymentach sondy neomycyny znakowane izotiocyjanianem fluoresceiny/cyjaniną-3 (FITC/CY3) zastosowano do śledzenia retrotranspozycji L1 in vitro w komórkach HepG2 stabilnie eksprymujących ektopowy L1. Metodyka ta zapobiega błędom w szacowaniu wskaźników retrotranspozycji spowodowanych toksycznością i uwzględnia występowanie wielokrotnych insercji do pojedynczego jądra.
Wprowadzenie
Długo przeplatany Ludzki Pierwiastek Jądrowy-1 (Linia-1 lub L1) jest autonomicznym ruchomym pierwiastkiem, który rozprzestrzenia się w obrębie genomu poprzez mechanizm retrotranspozycji "kopiuj i wklej". Typowy ludzki L1 ma ~6 kb długości i składa się z 5'UTR (Nieprzetłumaczony Region), który służy jako promotor, dwóch otwartych ramek odczytu (ORF): L1-ORF1 i L1-ORF2 oraz 3'UTR z ogonem polyA. Białko L1-ORF1 ma trzy odrębne domeny: domenę cewka-cewka, motyw rozpoznawania RNA i domenę C-końcową, podczas gdy białko L1-ORF2 ma endonukleazę, odwrotną transkryptazę i domeny bogate w cysteinę1,2,3,4,5....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Wszystkie kroki powinny być wykonywane w temperaturze pokojowej, chyba że określono inaczej. Zapoznaj się z sekcją Odczynniki, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat przygotowania poszczególnych odczynników.
1. Etykietowanie sond L1
UWAGA: Sondy mogą być oznaczone za pomocą etykietowania chemicznego lub PCR.
- Etykietowanie substancji chemicznych
- Przygotować 0,7-1% żelu agarozowego w buforze Tris-acetate-EDTA (TAE), podgrzać w kuchence mikrofalowej do stopienia, pozostawić żel do ostygnięcia, a następnie dodać bromek etydyny (0,5 μg/ml). Wlej do tacki na....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Schematyczny rysunek wektora retrotranspozycji L1 przedstawiono na Rysunku 1. Wektor składa się z genu neomycyny w orientacji antysensownej względem ORF-ów L1, który jest przerwany intronem globiny w orientacji sensownej i otoczony miejscami SD oraz SA. Po stabilnej integracji z chromosomem, mRNA L1 jest transkrybowane z połączonego promotora CMV i L1-5'UTR (Rysunek 1). Podczas procesu przetwarzania RNA, intron globiny jest wyci.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Do badania retrotranspozycji L1 zastosowano takie metodologie, jak sekwencjonowanie całego genomu, odwrócony PCR i southern blot. Chociaż metodologie te są niezwykle cenne w lokalizowaniu miejsc insercji L1 w genomach, wyzwaniem dla wszystkich z nich jest potrzeba programowania in-silico w celu ponownego złożenia sekwencji. Opisana tu metodologia FISH ma na celu uzupełnienie tych metod, szczególnie w przypadku badań wymagających analizy ektopowej retrotranspozycji L1 w hodowanych komór.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak potencjalnych konkurencyjnych interesów.
Podziękowania
Ta praca była częściowo wspierana przez granty z National Institute of Environmental Health Sciences (ES014443 i ES017274) oraz AstraZeneca dla KSR.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sondy do znakowania | |||
| Go Tag DNA polimeraza Promega | M3178 | ||
| GO Tag 10x bezbarwny bufor | Promega | M3178 | |
| Indywidualny dNTP | Sigma | DNTP10 | Dostosuj stężenie dATP, dGTP, dCTP do 2 mM i dTTP do 1,5 mM w wodzie wolnej od nukleaz. |
| dUTP-16-Biotyna (0,5 mM) | Roche | 11093070910 | |
| dUTP-FITC (0,5 mM) | Thermo Scientific | R0101 | |
| dUTP-CY3 (0,5 mM) | Sigma | GEPA53022 | |
| MIRUS FISH | MIRUS | MIR3225 | |
| NucleoSpin PCR | Qiagen | 1410/0030 | Zamiast zestawu do czyszczenia PCR NucleoSpin PCR Clean Up Kit można użyć dowolnego odczynnika |
| PCR Do | wzmocnienia produktu etykietowego można użyć dowolnego termocyklera. | ||
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Przygotowanie spreadów chromosomowych | |||
| Colcemid | Life Technologies | 15212-012 | Dodać Colcemid bezpośrednio do pożywki wzrostowej do końcowego stężenia 0,4 &mikro; g/ml |
| 1 M KCl | Sigma | P9541 | Rozcieńczony 1 M KCl rozwiązanie do 75 Roztwór mM do przygotowania roztworu hipotonicznego |
| utrwalający Carnoya | Wymieszaj 3 objętości metanolu i 1 objętość kwasu octowego, aby uzyskać roztwór utrwalający Carnoya. Zrób świeżość za każdym razem. | ||
| Metanol | Sigma | 322415 | |
| Kwas octowy | Sigma | 320099 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Rozpuścić Hoechst-33342 w PBS do końcowego stężenia 1 mg/ml. |
| Marker Diamond Point | Thermo Scientific | 750 | |
| Matowe slajdy | Thermo Scientific | 2951-001 | |
| Trypsyna-EDTA (0,25%) | Technologie życia | R001100 | Aby zdetechizować komórki, inkubuj komórkę w trypsynie przez 5 minut i nieaktywną z równą objętością kompletnego podłoża. |
| Prowadnice pokrywy | VWR | 48366067 | |
| Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Blok | Do tego celu można użyć dowolnego bloku grzewczego, chociaż zalecane są bloki montowane do prowadnic grzewczych. | ||
| Zlewka (600 ml) | Sigma | CLS1003600 | Napełnij zlewkę wodą, podgrzej do wrzenia, użyj gorącej pary, aby rozerwać chromosomy. |
| Mikroskop | Nikon Nikon | 125690 | Do sprawdzenia jakości rozprowadzania można użyć dowolnego mikroskopu. |
| Odczynniki i materiały dla RYB | |||
| cytrynian trisodowy | Sigma | S1804 | |
| Sodium Chroride | Sigma | S3014 | |
| Formamid | Sigma | F9037 | |
| Tween-20 | Sigma | F1379 | |
| Detran Sulfate | Sigma | D8906 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| życia DNA plemników łososia | 15632-011 | ||
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Sigma | A8531 | |
| HCl (N) | Sigma | 38283 | |
| Alkohol etylowy | Sigma | 459844 | |
| Metanol | Sigma 322415 | ||
| DPBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| Rnaza A | Sigma | R4642 | |
| Pepsyna | Sigma | P6887 | |
| Paraformaldehyd (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Rozpuścić Hoechst-33342 w PBS do końcowego stężenia 1 mg/ml. |
| Uszczelniacz z cementu gumowego/Cytobond | 2020-00-1 | ||
| Siedem słoików z kopliną | Thermo Scientific | 107 | |
| Ciemna komora nawilżana | Sigma | CLS2551 | |
| Szkiełka osłonowe | VWR | 48366067 | |
| Suchy cyfrowy blok grzewczy | VWR | 13259 | |
| Mikroskop | |||
| 20x sól fizjologiczno-cytrynian sodu (20x SSC) | Połącz 175 g NaCl i 88,2 g cytrynianu trisodowego z 800 ml klasy cząsteczkowej H2O. Mieszać, dostosowując do pH 7. Gdy wszystkie sole się rozpuszczą, dostosuj objętość do 1 l i przefiltruj przez 0,22 &mikro; m Bibuła filtracyjna. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. | ||
| 1 mg/ml Rnazy A | Rozcieńczyć 20x bufor SSC do 2x bufor SSC. Rozpuścić RNazę A w 2x buforze SSC do końcowego stężenia 1 mg/ml. Za każdym razem przygotuj świeże rozwiązanie. | ||
| 1% pepsyna | Rozpuścić pepsynę (W/V) w 10 mM HCl do końcowego stężenia 1% roztworu. Zrób świeże za każdym razem. | ||
| 4% Paraformaldehyd (4% PFA) | Odważyć 4,0 g PFA w dygestorium, dodać 50 ml 1xPBS, podgrzać do 60 ° C mieszając i dostosuj pH kroplami NaOH, aż cały PFA się rozpuści, a roztwór stanie się klarowny. Dostosuj głośność do 100 ml, przefiltrować przez 0,22 i mikro; m Filtruj bibułę i przechowuj 5 ml porcji w temperaturze -20 °C. Rozmrozić podwielokrotność PFA w 37 ° C przez 10-15 minut do kolejnych zastosowań. Dostosuj rozmiar filtra w zależności od ilości paraformaldehydu. | ||
| Bufor | Połącz 100 ml formamidu (20%) z 2,5 ml 20x SSC, dostosuj do pH 7 za pomocą 1,0 M HCl i doprowadź objętość do 500 ml za pomocą klasy cząsteczkowej H2O. | ||
| hybrydyzacyjny | Połącz 50% formamidu, 10% siarczanu dekstranu, 0,1% SDS i 300 ng / ml DNA plemników łososia w 2x buforze SSC. Ilość formamidu określa stopień skupienia chromatyd; Miareczkować ilość. | ||
| Bufor | Rozcieńczyć 20x bufor SSC do 4x i dodać 0,2% Tween-20, aby utworzyć bufor detekcji. | ||
| Bufor blokujący | Połącz 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) z 0,2% Tween-20 w buforze 4x SSC. | ||
| odwadniający | Wykonaj 70%, 80% i 95% roztworów etanolu. |
Bibliografia
- Mathias, S. L., Scott, A. F., Kazazian, H. H., Boeke, J. D., Gabriel, A. Reverse transcriptase encoded by a human transposable element. Science. 254, 1808-1810 (1991).
- Feng, Q., Moran, J. V., Kazazian, H. H., Boeke, J. D. Human L1 retrotransposon encodes a conserved endonuclease ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
