Profilowanie transkryptomu zarodków bydlęcych wyprodukowanych in vivo przed implantacją przy użyciu dwukolorowej platformy mikromacierzy

Wczesna utrata zarodków u wysokowydajnych krów mlecznych jest jednym z głównych wyzwań w przemyśle mleczarskim^1,2. Bydło stało się interesującym modelem do badania rozwoju zarodków przedimplantacyjnych ze względu na podobny proces rozwojowy^3,4. Potrzebne są jednak dalsze badania, aby lepiej zrozumieć geny zaangażowane we wczesny rozwój embrionalny bydła.

Po dwudziestu latach od pierwszej technologii mikromacierzy opracowanej w 1995 roku⁵, rozwój bardziej wyrafinowanej technologii produkcji sond zmniejszył błędy drukowania i zmienność układów matrycowych w obrębie i pomiędzy różnymi platformami mikromacierzy⁶. Ulepszona technologia mikromacierzy zaowocowała szerokim zastosowaniem tej technologii w badaniach klinicznych⁷, a ostatnio we wczesnej ocenie jakości zarodków⁸.

Duża ilość materiału wymaganego do technologii mikromacierzy jest głównym powodem, dla którego technologia mikromacierzy początkowo nie weszła do wielu dziedzin badań, takich jak wczesny rozwój embrionalny. Ostatnio metody amplifikacji RNA zostały ulepszone w celu liniowej amplifikacji RNA do poziomu mikrogramów z sub-nanogramowego materiału wyjściowego RNA⁹. Na rynku dostępnych jest kilka komercyjnych zestawów do amplifikacji RNA; jednak bardziej popularne, dobrze opracowane zestawy są związane z metodami Ribo-Single Primer Isothermal Amplification¹⁰ i T7 promotor driven¹¹. Najpopularniejsza amplifikacja antysensownego RNA wykorzystuje transkrypcję in vitro ze starterem oligo dT łączącym się z promotorem T7 na końcu 5' ¹². Technologia ta pozwala na zachowanie większości reprezentatywnych transkryptów antysensownych po liniowym wzmocnieniu dla hybrydyzacji tablic¹³. Metoda ta została dostosowana do amplifikacji poziomu pikogramu całkowitego RNA wyekstrahowanego z bydlęcego zarodka⁸.

Universal Linkage System (ULS) to metoda znakowania, która bezpośrednio łączy DNA lub amplifikowane RNA z barwnikiem fluorescencyjnym połączonym platyną, cyjaniną 547 lub cyjaniną 647, tworząc wiązanie koordynacyjne na pozycji N7 guaniny¹⁴. Metoda ta została zaadaptowana w badaniach nad embrionami w celu wygenerowania bardziej stabilnego amplifikowanego aRNA bez modyfikacji w porównaniu z aRNA modyfikowanym aminoallilem generowanym metodą enzymatyczną¹⁵. Zarówno metody znakowania pojedynczym barwnikiem, jak i dwoma barwnikami zostały dostosowane za pomocą Universal Linkage System w mikromacierzy. Duże badanie porównawcze mikromacierzy wykazało, że istnieje dobra korelacja jakości danych między platformami tablic jedno- i dwukolorowych⁶.

Ostatnio, zarówno metody amplifikacji antysensownego RNA sterowane promotorem T7, jak i znakowania ULS zostały opracowane, aby zapewnić bardziej niezawodny protokół do generowania wystarczającej ilości wysokiej jakości znakowanych materiałów aRNA do hybrydyzacji mikromacierzy8^,16. W związku z tym badanie to dostarcza protokołu demonstrującego niektóre z ważnych etapów od ekstrakcji RNA do analizy danych związanych z dwukolorową mikromacierzą na przykładzie zarodków bydlęcych dnia 7.

Część tego badania na zwierzętach została przeprowadzona w Jednostce Badań Metabolicznych Uniwersytetu Alberty w Edmonton w Kanadzie, ze wszystkimi procedurami eksperymentalnymi na zwierzętach zatwierdzonymi (Protokół # AUP00000131) przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Alberty, a zwierzęta były pod opieką zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady Opieki nad Zwierzętami (1993).

1. Produkcja zarodków, izolacja całkowitego RNA i leczenie DNazą

1. Aby zapoznać się z protokołami doświadczalnymi na zwierzętach i pobieraniem zarodków, zapoznaj się z naszymi poprzednimi publikacjami^{17, 18}.
2. Zebrać i zamrozić zarodki w podobnym stadium rozwoju od każdej krowy w ciekłym azocie, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji RNA.
3. Ekstrakcja całkowitego RNA za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA opartego na kolumnie, który umożliwia ekstrakcję RNA z próbek w skali pikograficznej (informacje o zestawie są dostępne w Liście materiałów).
   UWAGA: Zalecany zestaw zawiera: Bufor kondycjonujący, Bufor ekstrakcyjny, 70% Etanol, Bufor do przemywania 1, Bufor do płukania 2, Bufor elucyjny, Kolumny oczyszczające RNA z probówkami zbiorczymi i probówkami do mikrowirówek.
4. Dodać 10 μl buforu ekstrakcyjnego do probówki zawierającej zarodki i inkubować przez 30 minut w temperaturze 42 °C. Probówkę wirówkową o pojemności 800 x g przez 2 minuty w celu zebrania ekstraktu komórkowego do probówki mikrowirówkowej.
5. Odpipetować 250 μl buforu kondycjonującego na membranę filtracyjną kolumny oczyszczającej. Inkubować kolumnę oczyszczającą RNA z buforem kondycjonującym przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odwirować kolumnę oczyszczającą w probówce zbiorczej o stężeniu 16 000 x g przez 1 min.
6. Odpipetować 10 μl 70% etanolu do mieszaniny buforu do ekstrakcji RNA i zarodków. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Odpipetować mieszaninę do wstępnie przygotowanej kolumny oczyszczającej.
7. Aby związać RNA, należy odwirować kolumnę oczyszczającą przez 2 minuty przy 100 x g, a następnie natychmiast po niej odwirować przy 16 000 x g przez 30 sekund w celu usunięcia przepływu.
8. Odpipetować 100 μl buforu płuczącego 1 do kolumny oczyszczającej i odwirowywać przez 1 minutę przy 8 000 x g.
   UWAGA: Leczenie DNazą jest zalecane w przypadku wykonywania odwrotnej transkrypcji lub amplifikacji po izolacji RNA.
9. Trawić genomowe DNA zaraz po kroku 1.8.
   UWAGA: Zalecany zestaw DNazy jest dostępny na liście materiałów. Zalecany zestaw zawiera: roztwór podstawowy DNazy I i bufor.
10. Przygotować mieszaninę do inkubacji DNazy, mieszając 5 μl roztworu podstawowego DNazy I z 35 μl buforu. Wymieszaj, delikatnie odwracając.
11. Odpipetować 40 μl mieszaniny inkubacyjnej DNazy bezpośrednio do membrany kolumny oczyszczającej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
12. Odpipetować 40 μl buforu płuczącego 1 do membrany kolumny oczyszczającej, a następnie odwirować przy 8 000 x g przez 15 s.
13. Odpipetować 100 μl buforu płuczącego 2 do kolumny oczyszczającej i odwirowywać przez 1 minutę przy 8 000 x g.
14. Odpipetować kolejne 100 μl buforu płuczącego 2 do kolumny oczyszczającej i odwirowywać przez 2 minuty przy 16 000 x g.
15. Przenieść kolumnę oczyszczającą do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml. Odpipetować 11 μl buforu elucyjnego bezpośrednio na membranę kolumny oczyszczającej. Aby zapewnić maksymalne wchłanianie buforu elucyjnego do membrany, delikatnie przyłóż końcówkę pipety do powierzchni membrany podczas dozowania buforu elucyjnego.
16. Inkubować kolumnę przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Wirować kolumnę przez 1 minutę przy 1,000 x g, aby rozprowadzić bufor elucyjny w kolumnie, a następnie wirować przez 1 minutę przy 16,000 x g, aby wymyć RNA.
17. Użyj bioanalizatora zgodnie z instrukcjami producenta, aby ocenić jakość i ilość RNA¹⁹.
18. Próbkę RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.

2. Amplifikacja i etykietowanie RNA do analizy mikromacierzy

UWAGA: Po raz pierwszy użytkownik pracujący z procedurami amplifikacji i znakowania RNA powinien użyć pięciu ng impulsowego RNA wraz z rzeczywistymi próbkami aRNA do monitorowania pomiaru kontroli jakości amplifikacji i hybrydyzacji RNA. Mieszanka RNA z kolcem zawiera dziesięć zsyntetyzowanych in vitro, poliadenylowanych transkryptów w określonych proporcjach. Gdy procedura przebiega prawidłowo, oznakowane transkrypty specyficznie hybrydyzują tylko z komplementarnymi sondami kontrolnymi w tablicach, a dane mogą być skanowane w celu śledzenia zapewnienia kontroli jakości przy minimalnej samohybrydyzacji lub krzyżowej. Więcej szczegółowych opisów dotyczących intensywności kontroli wkłutych i procedury normalizacji po zeskanowaniu tablicy i analizie danych znajduje się w poprzednich publikacjach^{20, 21}. Poniższa procedura jest podana dla rutynowych użytkowników mikromacierzy.

1. Przygotować 100 pg wysokiej jakości próbkę RNA (wartość liczby integralności RIN co najmniej > 7,0) w całkowitej objętości 10 - 11 μl.
2. Amplifikuj próbki RNA za pomocą zestawu do amplifikacji, który jest w stanie pracować z próbkami w skali pikograficznej (już od 100 pg).
   UWAGA: Zalecane informacje o zestawie amplifikacyjny jest dostępny na liście materiałów i jest zgodny z instrukcjami producenta bez żadnych modyfikacji.
3. Użyj oceny ilościowej opartej na fluorescencji, aby ocenić profil zakresu rozmiarów amplifikowanego aRNA.
4. Użyć przyrządu spektrofotometrycznego (w oparciu o absorbancję przy 260 i 280 nm) do pomiaru stężenia amplifikowanego aRNA.
5. Amplifikowany aRNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będzie gotowy do etykietowania.
6. Użyj 2 μg amplifikowanego RNA do znakowania fluorescencyjnego zgodnie z instrukcją obsługi zestawu do znakowania aRNA ULS.
   UWAGA: Ponieważ barwnik cyjaniny 547 i cyjaniny 647 jest wrażliwy na fotodegradację, a barwnik cyjaniny 647 łatwo ulega degradacji przez ozon, procedura etykietowania odbywa się przy minimalnej ilości światła i w środowisku wolnym od ozonu.
7. Włącz skrzynkę ozonową (Rysunek 1A), aż poziom ozonu wyniesie 0,001 ppm.
8. Wykonaj konfigurację reakcji wewnątrz pojemnika ozonowego (rysunek 1B), dodając 2 μl cyjaniny 547 lub cyjaniny 647, 2 μl buforu do znakowania, a następnie dostosuj do końcowej objętości 20 μl wodą wolną od RNaz pod światłem awaryjnym. Dodaj filtr ciemniowy do źródła światła.
9. Delikatnie wymieszać i inkubować probówki w termocyklerze w temperaturze 85 °C przez 15 minut. Umieścić próbki na lodzie na co najmniej 1 minutę. Zawirować w dół, aby zebrać zawartość probówek przed przystąpieniem do zestawu do ekstrakcji RNA, z wyjątkiem etapów związanych z obróbką DNazy (od 1,9 do 1,11), w celu oczyszczenia amplifikowanego RNA znakowanego barwnikiem Cy.
10. Użyj spektrofotometru do pomiaru i określenia stężenia znakowanego amplifikowanego RNA i utrzymuj znakowane aRNA w maksymalnej temperaturze -80 °C przez 3 dni przed użyciem.

3. Hybrydyzacja i mycie mikromacierzy

UWAGA: Następujące ważne kroki są dostosowane do protokołu analizy ekspresji genów opartego na dwukolorowych mikromacierzach (wersja 6.5, maj 2010 r.).

1. Dodaj równą ilość 825 ng z każdego aRNA znakowanego cyjaniną 547 i cyjaniną 647 i wymieszaj z 25-krotną fragmentacją i 10-krotnym buforem blokującym.
2. Podgrzewać mieszaninę w temperaturze 60 °C przez 15 minut i schłodzić na lodzie przez 1 minutę.
3. Dodaj równą ilość 2x bufora hybrydyzacyjnego i dobrze wymieszaj.
4. Odwirować z prędkością 13 000 obr./min, a następnie mieszanina jest gotowa do hybrydyzacji.
5. Załadować 100 μl z mieszaniny na szkiełko matrycowe i uszczelnić szkiełko wewnątrz komory hybrydyzacji.
6. Załadować zmontowaną komorę do pieca do hybrydyzacji na 17 godzin w temperaturze 65 °C, obracając z prędkością 10 obr./min w piecu.
7. Umyć matryce zgodnie z protokołem z obróbką ochronną ozonem, zanurzając je w roztworze stabilizacyjnym i suszącym na 30 sekund.
8. Wyjmij matryce z roztworu i upewnij się, że powierzchnia macierzy jest sucha i nie ma cząstek kurzu

4. Slajd skanowania mikromacierzy

1. Trzymaj macierze w ciemnym miejscu i włączaj skaner, aż będzie gotowy do użycia (czas oczekiwania 15 minut).
2. Załaduj kod kreskowy tablicy po lewej stronie do skanera i rozpocznij skanowanie. Wykonaj analizę punktową zgodnie z instrukcją obsługi oprogramowania i zapisz dane w formacie pliku (gpr).

5. Analiza statystyczna

1. Pobierz oprogramowanie FlexArray http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php Kliknij "importuj surowe dane" i załaduj pliki gpr do FlexArray.
2. W razie potrzeby wykonaj normalizację i analizę statystyczną, postępując zgodnie z instrukcją. Uwaga: Oblicz próg dla pozytywnej selekcji miejsca w tym badaniu, jak opisano wcześniej²².
3. Wybierz rozwijaną instrukcję z przeglądarki wydruku FlexArray, aby wyświetlić wszystkie hybrydyzowane punkty i sygnały tła. Uwaga: Podobny obraz wzbogaconego w kontrole po hybrydyzacji do mikromacierzy można zobaczyć w poprzednim badaniu⁸.
4. Wybierz normalizację lessową w tablicy, a następnie proces normalizacji kwantylu między tablicami z listy rozwijanej FlexArray.
5. Wyeksportuj wszystkie znormalizowane dane z FlexArray do pliku Excel w celu dalszego wykorzystania.

6. Analiza bioinformatyczna

Oryginalna adnotacja sekwencji sondy z mikromacierzy BESTv1 (bydlęcych transkryptów specyficznych dla zarodków) została opisana wcześniej⁸. W niniejszym badaniu uzyskano 20 403 unikalnych symboli genów (GS) (Supplement File1) za pośrednictwem EmbryoGENE Laboratory Information Management System (LIMS) ELMA (http://elma.embryo-gene.ca). Wybrano listę 6 765 unikalnych genów (Supplement File2), które odpowiadały wszystkim pozytywnym sygnałom po procesie normalizacji mikromacierzy (Krok 5.5) z profilu ekspresji genów zarodków bydła dnia 7. Próg sygnału dodatniego został obliczony na podstawie poprzedniej publikacji¹⁶ od intensywności sygnału wartości A.

1. Aby przeprowadzić analizę funkcjonalną za pomocą systemu klasyfikacji PANTHER (Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships)^{23, 24}, otwórz następujący link (http://www.pantherdb.org/about.jsp).
2. Prześlij listę 6 765 GS specyficznych dla zarodka, aby zidentyfikować określony proces biologiczny podczas rozwoju embrionalnego za pomocą statystycznego testu nadreprezentacji i użyj domyślnego ustawienia Bos taurus (wszystkie geny w bazie danych) jako listy referencyjnej²⁵.
   UWAGA: Pozwala to na identyfikację procesów związanych z rozwojem na podstawie terminów GO, które są statystycznie nadmiernie lub niedostatecznie wyrażone za pomocą testu dwumianowego.
3. Ustaw próg wartości P na < 0,05 jako domyślny program. Dane można pobrać i wyeksportować do pliku Excel w celu dalszego wyboru¹⁶.

Reprezentatywny wynik całkowitego RNA i amplifikowanego aRNA z zarodków bydlęcych dnia 7 jest pokazany na rysunku 3 i podsumowany w Tabeli 1.

Integralność i profil RNA można ocenić po ekstrakcji RNA. Ocenę jakości RNA można przeprowadzić za pomocą bioanalizatora (rysunek 3A) i tylko te próbki, których wartość RIN jest wyższa niż 7,0, są kwalifikowane do użycia do amplifikacji (tabela 1).

Jakość i ilość amplifikowanego RNA powinna być oceniana po amplifikacji. Podobieństwo amplifikowanego profilu RNA i odpowiedni zakres wielkości są głównymi czynnikami kontroli jakości (ryc. 3B). Po dwurundowej amplifikacji amplifikowane fragmenty RNA są bardzo podobne pod względem wielkości, w zakresie od 200 do 800 pz (ryc. 3B), a wszystkie aRNA o podobnym zakresie wielkości są wybierane do dalszego znakowania fluorescencyjnego. Ponadto udana amplifikacja oryginalnego całkowitego RNA spowoduje co najmniej ponad tysiąckrotny wzrost aRNA (Tabela 1).

Skuteczność znakowania fluorescencyjnego można obliczyć na podstawie stopnia współczynnika etykietowania. Formuła jest dostępna w instrukcji obsługi zestawu do znakowania aRNA ULS. Instrukcja obsługi sugeruje, że stopień znakowania powinien wynosić 1,0 - 3,6%, co oznacza, że średnio 1 - 3,6 cząsteczek ULS na 100 nukleotydów.

Pliki obrazów po hybrydyzacji i skanowaniu można przeglądać z FlexArray. Dobrej jakości zeskanowany obraz po hybrydyzacji i myciu mikromacierzy pokazano na rysunku 4A. Jeśli oznakowane materiały są niższe lub wyższe niż ten zakres, sygnały będą zbyt niskie do wykrycia lub po zeskanowaniu zostaną wykryte wysokie poziomy tła (Rysunek 4B).

W obecnym badaniu, próg sygnału dodatniego został ustalony na poziomie 7,6 (sygnał sondy wyższy niż 7,6 lub < tła 7,6 uważany za pozytywny). Około 46% zestawów sond reprezentujących 20826 dodatnich plamek jest oznaczonych kolorem czerwonym u zarodków bydła dnia 7 (ryc. 5). Po usunięciu nieopisanych i zduplikowanych symboli genów, do analizy PANTHER pozostaje tylko 6 765 unikalnych symboli genów.

Te 6 765 genów reprezentuje unikalne transkrypty RNA wyrażone w blastocyście bydła dnia 7. W celu poznania procesu biologicznego specyficznego dla blastocysty bydła przeprowadza się Test Nadreprezentacji PANTHER. Wybrano 10 najważniejszych identyfikatorów terminów ontologii genów (GO) o najwyższym wskaźniku wzbogacenia krotnego (ryc. 6). Ogólnie rzecz biorąc, te specyficzne terminy GO w dużej mierze reprezentują aktywny proces podziału komórek, taki jak mitoza i segregacja chromosomów, regulacja cyklu komórkowego i inicjacja translacji cytoplazmatycznej i mitochondrialnej.

Rysunek 1: Skrzynka bezozonowa (A) i reakcja znakowania tablicy (B). A) Ozone Free Box składa się z katalizatora, który zawraca powietrze i niszczy ozon oraz bardzo czułego czujnika ozonu do monitorowania poziomu ozonu wewnątrz ozonu podczas pracy mikromacierzy. B) Procedura etykietowania i hybrydyzacja macierzy przebiegają wewnątrz pudełka, aby uniknąć degradacji barwnika fluorescencyjnego cyjaniny 647 przez ozon. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Analiza listy genów PANTHER. Czerwone strzałki wskazują obszar, który należy wypełnić. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Reprezentatywny elektroferogram bioanalizatora całkowitego RNA (A) i żelowy obraz amplifikowanego RNA (B). A) Pokazanie ogólnego wyniku z wartością RIN, stężeniem RNA i stosunkiem rRNA. B) Profil amplifikowanego RNA po amplifikacji dwurundowej. Oczekuje się, że amplifikowane fragmenty RNA będą mieścić się w zakresie od 200 do 800 pz. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Obraz mapy intensywności tablicy. (A) Dobry obraz slajdu z matrycą pokazujący kanały zielony i czerwony odpowiada sygnałom cyjaniny 547 i cyjaniny 647 po skanowaniu z dużą intensywnością plamki (oznaczoną po lewej stronie kolorem niebiesko-zielonym) i niskim tłem (oznaczonym po prawej kolorem ciemnoniebieskim). (B) Zły obraz slajdu tablicowego pokazujący bardzo wysoki obraz tła z kanału czerwonego (oznaczony z górnego panelu podobnym niebiesko-zielonym kolorem z obrazu intensywności plamki cyjaniny 647). Wykres kolorów wskazuje intensywność sygnału za pomocą wartości liczbowych odpowiadających różnym kolorom. Wartość natężenia sygnału jest najniższa w zakresie barwy ciemnoniebieskiej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Wykres MA dla profilu ekspresji genów zarodków bydlęcych w dniu 7. 20 826 czerwonych plam reprezentowało pozytywne sygnały powyżej sygnałów tła. Plamy tła są podświetlone na czarno. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: 10 najważniejszych identyfikatorów terminów ontologii genów (GO) z najwyższym indeksem wzbogacania fałdowania. Te specyficzne terminy GO w dużej mierze reprezentują aktywny proces podziału komórek, taki jak mitoza i segregacja chromosomów, regulacja cyklu komórkowego i inicjacja translacji cytoplazmatycznej i mitochondrialnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Informacje o próbce i RNA. Stężenie i jakość RNA należy ocenić po ekstrakcji. Integralność i stężenie RNA można ocenić za pomocą dowolnego bioanalizatora. Liczba integralności RNA powinna być większa niż 7,0. Stężenie RNA należy zbadać za pomocą spektrofotometru po amplifikacji. Jakość zarodków oceniano zgodnie z Podręcznikiem Międzynarodowego Towarzystwa Transferu Zarodków (wyd. 3, Savoy, IL).

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.