Wirusoterapie onkolityczne są w trakcie opracowywania jako nowe terapie w leczeniu raka wątrobowokomórkowego (HCC). W tym artykule opisano metodę lokoregionalnej terapii HCC poprzez wątrobowe podawanie wirusa onkolitycznego do tętnic
.Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przeztętnicze podawanie wirusów onkolitycznych w lokoregionalnej terapii ortotopowego HCC u szczurów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rak wątrobowokomórkowy (HCC) jest chorobą o ograniczonych możliwościach leczenia i złym rokowaniu. W ostatnich latach wirusoterapie onkolityczne okazały się potencjalnie potężnymi narzędziami do walki z nowotworami złośliwymi. Ze względu na unikalne podwójne ukrwienie wątroby, możliwe jest miejscowe stosowanie terapii w ortotopowych guzach wątroby, które są zasilane głównie przez tętniczy przepływ krwi. Wcześniej wykazaliśmy, że dostarczanie wirusów onkolitycznych do tętnic wątrobowych skutkuje bezpieczną i skuteczną skutecznością transdukcji wieloogniskowych zmian HCC, co skutkuje znacznym wydłużeniem przeżycia u szczurów kompetentnych immunologicznie. Procedura ta ściśle naśladuje zastosowanie embolizacji przeztętniczej u pacjentów, która jest standardową opieką paliatywną zapewnianą wielu pacjentom z HCC. Możliwość podawania terapii nowotworowych przez tętnicę wątrobową u szczurów pozwala na wysoce zaawansowany model przedkliniczny do oceny opracowywanych nowych wektorów wirusowych. Tutaj opisujemy szczegółowy protokół mikrodysekcji tętnicy wątrobowej do infuzji wektorów wirusa onkolitycznego w leczeniu ortotopowego HCC.
Wprowadzenie
Rak wątrobowokomórkowy (HCC) jest piątym najczęściej występującym nowotworem na świecie i trzecią najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem, co czyni go poważnym problemem zdrowotnym1,2. U pacjentów, którzy nie kwalifikują się do resekcji guza lub oczekujących na przeszczepienie wątroby, jako standardową opiekę paliatywną stosuje się terapię lokoregionalną obejmującą embolizację przeztętniczą (TAE) lub chemoembolizację przeztętniczą (TACE)3,4. Terapie te wykorzystują unikalną cechę podwójnego dopływu krwi do wątroby, dzięki której guzy są zasilane prawie wyłącznie przez przepływ krwi tętniczej w wątrobie, podczas gdy otaczająca wątroba otrzymuje większość dopływu krwi z żyły wrotnej5,6.
Ze względu na bardzo ograniczoną skuteczność uznanych terapii HCC, wirusy onkolityczne okazały się obiecującymi alternatywnymi terapiami. JX-594, niedawno przemianowany na Pexa-Vec, jest wektorem krowianki z delecją kinazy tymidyny, uzbrojonym w czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF), który zakończył II fazę badania klinicznego dla HCC7. Niedawno rekombinowany wektor wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV) wykazujący ekspresję ludzkiego interferonu-beta wszedł w fazę I badania klinicznego nad HCC opornym na sorafenib (NCT01628640). W miarę jak wirusy onkolityczne zbliżają się do uzyskania zgody na kliniczne zastosowanie HCC u pacjentów, oczywista staje się potrzeba znalezienia skutecznej drogi podawania ukierunkowanej na chorobę wieloogniskową. Podczas gdy dostarczanie ogólnoustrojowe jest w dużej mierze nieskuteczne ze względu na nieefektywną transdukcję guza, aplikacje donowotworowe mogą ograniczyć skuteczność terapii do wstrzykniętego guza, pozostawiając niewstrzykiwane mikroskopijne zmiany podatne na postęp choroby.
Ustaliliśmy metodę izolowania tętnicy wątrobowej u szczurów w celu podania terapii wirusem onkolitycznym w sposób lokoregionalny w celu ukierunkowania na ortotopowe HCC. Wykazaliśmy, że ta droga podania powoduje bezpieczną i skuteczną transdukcję wieloogniskowych guzków HCC, co skutkuje znacznym wydłużeniem przeżycia u szczurów kompetentnych immunologicznie8-10. Tutaj opisujemy metodę uzyskiwania dostępu, preparowania i wstrzykiwania do tętnicy wątrobowej u szczurów. Schemat procedury przedstawiono na rysunku 1 (poprzednio opublikowanym9)
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Uwaga: Następujące kroki zostały wykonane zgodnie z wytycznymi naszej instytucji i samorządu lokalnego Bawarii, Niemcy. Wszelkie próby odtworzenia tego protokołu muszą być podejmowane zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi humanitarnego traktowania zwierząt, podyktowanymi przez lokalną komisję ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania. Na przykład wiele instytutów wymaga noszenia sterylnych rękawiczek podczas operacji na gryzoniach. Ponadto praca z wirusami musi być wykonywana zgodnie z lokalnymi przepisami, z dbałością o bezpieczeństwo osobiste i środowiskowe. Należy zadbać o prawidłową utylizację skażonych odpadów oraz oczyszczenie narzędzi i miejsca pracy (tj. poprzez autoklawowanie i czyszczenie odpowiednim przeciwwirusowym środkiem dezynfekującym zgodnie z instrukcjami producenta).
1. Przygotowania przed rozpoczęciem operacji
- Sterylizuj narzędzia chirurgiczne (np. przez autoklawowanie).
- Rozcieńczyć wirusa do odpowiedniego stężenia, które będzie się różnić w zależności od toksyczności konkretnego używanego wirusa i wrażliwości szczepu szczura.
Uwaga: Na przykład, używając wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej u samców szczurów Buffalo, zazwyczaj wstrzykujemy 107 pfu w objętości 1 ml, co jest maksymalną tolerowaną dawką w tym modelu.- Wstępnie napełnić wirusa (techniką aseptyczną) w strzykawkach o pojemności 1 ml i założyć igły 30 G, uważając, aby usunąć powietrze ze strzykawki i igły.
- Przygotuj salę operacyjną ze wszystkimi wymaganymi materiałami i sprzętem, a następnie spryskaj obszar etanolem w celu dezynfekcji. Napełnij mały pojemnik sterylnym roztworem soli fizjologicznej (0,9% NaCl) do nawilżania wacików z gazy i aplikatorów z bawełnianą końcówką.
2. Przygotowanie Szczura
- Podać lek przeciwbólowy (zgodnie z zaleceniami lokalnej komisji ds. opieki nad zwierzętami i jego stosowania) w odpowiedniej dawce 30 minut przed rozpoczęciem zabiegu chirurgicznego. Na przykład należy podać dużą dawkę metamizolu (100-200 mg/kg).
- Znieczulić szczura za pomocą znieczulenia wziewnego (izofluran) lub do wstrzykiwań (tj. mieszaniny medetomidyny (0,15 mg / kg), midazolamu (2 mg / kg) i fentanylu (0,005 mg / kg), znanego również jako MMF). Podawać izolfluran przez parownik w stężeniu 1-3% i w razie potrzeby dostosować, aby utrzymać prawidłowy oddech i tętno.
- Zanim przejdziesz dalej, upewnij się, że szczur jest w pełni uspokojony i nie jest w stanie odczuwać bólu, ściskając opuszkę stopy i obserwując reakcję.
- Zastosuj weterynaryjną maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
- Ogol obszar brzucha od mostka w dół do tuż nad narządami płciowymi za pomocą małej weterynaryjnej maszynki do strzyżenia włosów. Zadbaj o dokładne golenie, nie uszkadzając skóry.
- Przymocuj szczura do łóżka chirurgicznego za pomocą taśmy na kończynach przednich i tylnych, a w przypadku znieczulenia wziewnego umieść pysk w stożku nosowym o odpowiedniej wielkości. Umieść poduszkę grzewczą pod szczurem, aby utrzymać temperaturę ciała. Zdezynfekuj okolice brzucha za pomocą chirurgicznego środka dezynfekującego, a następnie spłucz nasączeniem alkoholem i nałóż farbę antyseptyczną.
3. Laparotomia
- Używając małego zakrzywionego skalpela, takiego jak #15, wykonaj małe pionowe nacięcie w warstwie skóry bezpośrednio wzdłuż linii środkowej. Przedłuż nacięcie aż do wyrostka ksylfoidalnego. Następnie naciąć warstwę mięśniową, delikatnie podnosząc ją parą kleszczy Adson, aby wykonać nacięcie skalpela, a następnie przedłuż nacięcie aż do wyrostka ksyloidalnego za pomocą nożyczek chirurgicznych. Należy uważać, aby nie przebić narządów jamy brzusznej ani nie uszkodzić małych naczyń po obu stronach wyrostka ksyloidalnego.
- Umieść retraktor w poprzek brzucha, aby rozłożyć mięśnie i skórę oraz odsłonić cały obszar brzucha.
- Zwilż dwa waciki z gazy o wymiarach 7,5 x 7,5 cm2 sterylną solą fizjologiczną i rozprowadź jeden na górze otworu chirurgicznego, a drugi na dole, jak pokazano na rysunku 2A.
4. Izolacja tętnicy wątrobowej
- Za pomocą dwóch zwilżonych bawełnianych wacików zwilżonych sterylną solą fizjologiczną delikatnie wyjmij jelita i jelito ślepe z jamy brzusznej i umieść je na dolnym waciku z gazy. Złóż gazę, aby narządy były wilgotne i nie przeszkadzały.
- Za pomocą dwóch zwilżonych bawełnianych wacików z aplikatorem delikatnie podnieś lewy boczny płat wątroby, który będzie najbardziej dominującym płatem widocznym na tym etapie. Odwróć płatek do góry i za pomocą małych nożyczek sprężynowych przetnij włóknistą błonę na spodniej stronie płata, pozwalając płatkowi całkowicie odchylić się do góry i spocząć na wcześniej umieszczonym waciku z gazy. Złóż wacik z gazy na płatku, aby utrzymać go na miejscu.
- Kontynuuj z następnym płatem (przednim jądrem ogoniastym), który jest teraz najbardziej wysuniętym płatem przednim w polu widzenia. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego i cienkich kleszczy przeciąć cienką błonę otaczającą płat, aby ją uwolnić i umożliwić swobodne odchylenie do góry. Umieść płat pod wacikiem z gazy razem z lewym płatem bocznym.
- Obserwuj tylny płat ogoniastego, który będzie teraz widoczny. Powtórz krok 4.3, aby całkowicie rozciąć tylny płat ogoniastego płata ogoniastego i odwrócić go do góry i do wnętrza gazy razem z poprzednio umieszczonymi płatami wątroby.
- Tuż pod pierwotnym położeniem płata ogoniastego znajdź wspólną tętnicę wątrobową, która będzie teraz widoczna i łatwo rozpoznawalna dzięki silnej pulsacji. Podążając za tętnicą w anatomiczną prawo, obserwuj gruby błoniasty materiał zasłaniający przed wzrokiem tętnicę żołądkowo-dwunastniczą i właściwą tętnicę wątrobową. Za pomocą cienkich kleszczy podnieś ten materiał i delikatnie go rozerwij, uważając, aby w tym obszarze nie było żadnych małych naczyń. Użyj bawełnianych wacików z aplikatorem, aby zatrzymać krwawienie, które może wystąpić.
- Zlokalizuj gałęzie tętnic, które będą wyraźnie widoczne za pomocą mikroskopu preparacyjnego, gdy błony zostaną prawidłowo wypreparowane.
- Za pomocą dwóch cienkich, atraumatycznych kleszczyków ostrożnie wypreparuj wspólną tętnicę wątrobową, tętnicę żołądkowo-dwunastniczą i właściwą tętnicę wątrobową tak, aby zostały uwolnione od otaczających błon (ryc. 2B).
5. Przygotowanie tętnicy do wstrzyknięcia
- Przełóż szew 7-0 Prolene pod tętnicą żołądkowo-dwunastniczą i użyj uchwytu na mikroigłę, aby zawiązać stałą ligaturę na dystalnym końcu, tuż nad rozwidleniem (patrz rysunek 1 w celu prawidłowego umieszczenia). Pozostawić około 2 cali materiału szwowego na końcach i zacisnąć je za pomocą uchwytu na igłę, aby pociągnąć nauczoną tętnicę, jak na rysunku 2C.
- Umieść mały zacisk na wspólnej tętnicy wątrobowej, aby tymczasowo zablokować przepływ krwi (Rysunek 2C).
Uwaga: Jest to ważne, aby zapobiec masywnemu krwawieniu po usunięciu igły z tętnicy. Co więcej, zablokowanie przepływu krwi tętniczej pozwoli na wolniejsze podawanie wirusa i lepszą wydajność transdukcji.- Ważne: Działaj szybko, aby ograniczyć czas zatrzymania przepływu krwi - wykonaj wstrzyknięcie, a następnie podwiązanie tętnicy w ciągu 5 minut od zaciśnięcia tętnicy wątrobowej wspólnej.
- Jeśli to możliwe, zwiększ powiększenie pod mikroskopem preparacyjnym, tak aby tętnica żołądkowo-dwunastnicza była ostra i wydawała się wystarczająco duża, aby dokładnie wprowadzić igłę 30 G. Umieścić igłę strzykawki do wstrzykiwań w świetle tętnicy żołądkowo-dwunastniczej i powoli naciskać na tłok.
Uwaga: Prawidłowe umieszczenie igły spowoduje, że wstrzyknięty roztwór będzie przepływał bezpośrednio przez właściwą tętnicę wątrobową w kierunku wątroby.- Wstrzyknięcie należy wykonywać bardzo powoli, aby zmaksymalizować wydajność transdukcji.
- Po podaniu całej objętości wstrzyknięcia, powoli wycofać igłę z tętnicy.
Uwaga: Nie powinno być krwawienia z miejsca wstrzyknięcia. W przypadku, gdy dojdzie do krwawienia, oznacza to, że zacisk nie jest prawidłowo umieszczony i należy go szybko wyregulować.
6. Zamknięcie
- Przełóż drugi szew 7-0 Prolene pod tętnicą żołądkowo-dwunastniczą i zawiąż drugą stałą ligaturę powyżej miejsca wstrzyknięcia.
- Usuń zacisk ze wspólnej tętnicy wątrobowej. Upewnij się, że przepływ krwi przez właściwą tętnicę wątrobową w kierunku wątroby został przywrócony.
- Odetnij luźne końce ligatur.
- Upewnij się, że nie ma krwawienia przed powrotem jelit i wątroby do jamy brzusznej. Zadbaj o to, aby wyrostek robaczkowy powrócił w swojej pierwotnej orientacji.
- Zszyj mięsień i skórę w oddzielnych warstwach za pomocą materiału do szycia 4-0 vicryl z zakrzywioną igłą. Umieść ciągłe szwy w odległości około 1 mm od siebie i mocno pociągnij.
- Podczas fazy szycia należy podać lek przeciwbólowy, taki jak buprenorfina (0,05 mg/kg).
- Usuń szczura ze znieczulenia. Jeśli zastosowano izofluran, szczur powinien odzyskać przytomność w ciągu kilku minut. Jeśli MMF został użyty jako znieczulenie do wstrzykiwań, należy je zantagonizować za pomocą podskórnego wstrzyknięcia Atipamezolu (0,75 mg/kg), Flumazenilu (0,2 mg/kg) i Naloksonu (9,12 mg/kg), które odwrócą skutki znieczulenia i pozwolą zwierzętom odzyskać przytomność w ciągu 20 minut. Utrzymuj szczury w cieple za pomocą lampy grzewczej na podczerwień podczas początkowej fazy budzenia.
- Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku.
- Nie należy zwracać zwierzęcia, które przeszło operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje.
- Monitoruj szczury po operacji pod kątem patologicznych objawów niepokoju i kontynuuj stosowanie leków przeciwbólowych zgodnie z wymaganiami lokalnego komitetu ds. opieki i wykorzystania zwierząt. Na przykład buprenorfina może być podawana w dawce 0,05 mg/kg mc. co 12 godzin.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Z doświadczeniem można osiągnąć niemal 100% wskaźnik sukcesu (oznaczający, że tętnica została pomyślnie wypreparowana i poddana iniekcji, a zwierzę przeżyło operację). Jednakże stan zdrowia szczura przed zabiegiem (stopień obciążenia guzem, podstawowa funkcja wątroby itp.) będzie oczywiście odgrywał rolę w wyniku interwencji chirurgicznej. Po operacji u szczurów można spodziewać się przejściowej utraty masy ciała oraz niewielkiego, przejściowego wzrostu poziomu enzymów wątrobowyc...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Chociaż bezpośrednie wstrzyknięcie do guza jest niewątpliwie najprostszą metodą pozwalającą na skuteczną transdukcję guza w pojedynczym guzku nowotworowym, wlew tętniczy wątrobowy stanowi idealną drogę podawania w celu uzyskania wieloogniskowego, ortotopowego HCC. Metoda ta okazała się zarówno bezpieczna, jak i skuteczna w leczeniu HCC u szczurów z wirusami onkolitycznymi u szczurów kompetentnych immunologicznie. Ponadto, ponieważ pacjenci z HCC są rutynowo leczeni przez przeztętnicze stosowanie chemoembolizacji, opisa...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca jest wspierana przez podprojekty SFB 824 C6 i C7 (DFG Sonderforschungsbereich 824), Niemiecka Fundacja Badawcza, Bonn, Niemcy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Maszynki do strzyżenia weterynaryjnego | Aesculap | GT415 | Mały, bezprzewodowy trymer idealny do usuwania sierści z obszaru operacyjnego |
| Stereoskop | Zeiss | Stemi SV6 | |
| 30 G Igły | Braun | 4656300 | 30 G x ½ " |
| Strzykawki 1 ml | Braun | 9161406V | Strzykawka tuberkulinowa |
| Jednorazowy skalpel | Pióro | 2975#15 | 15 ostrze |
| Standardowe nożyczki chirurgiczne | Fine Science Tools | 14001-13 | Ostre/, do otwierania skóry i mięśni |
| Kleszcz Adson | Fine Science Tools | 1101-12 | Z zębami, do chwytania skóry i mięśni |
| Retraktor Alm | Fine Science Tools | 17008-07 | Z zębami, do otwierania jamy brzusznej podczas operacji |
| Waciki z gazy | Lohmann & Rauscher | 18504 | 7,5 cm x 7,5 cm, przed użyciem należy go sterylizować w autoklawie |
| Waciki do aplikatorów z bawełnianą końcówką | Lohmann & Rauscher | 11970 | Sterylne |
| Foreceps z cienką końcówką | Fine Science Tools | 11063-07 | 0,4 mm, końcówka kątowa, do preparowania tętnicy wątrobowej |
| Nożyczki sprężynowe Vannas | Fine Science Tools | 91500-09 | Do delikatnego cięcia |
| Uchwyt na mikroigły | Fine Science Tools | 12076-12 | Do podwiązywania tętnicy żołądkowo-dwunastniczej |
| Uchwyt na igłę | Fine Science Tools | 12005-15 | Szczęki z węglika wolframu |
| 7-0 Nici prolenowe | Ethicon | 8648H | Szew polipropylenowy z zakrzywioną igłą, do podwiązania tętnicy żołądkowo-dwunastniczej |
| 4-0 Nici Vicryl | Ethicon | V3040H | Z dołączoną zakrzywioną igłą |
| Lampa grzewcza na podczerwień | Beurer | IL11 | Do utrzymania temperatury ciała po operacji |
Bibliografia
- Murray, C. J., Lopez, A. D. Evidence-based health policy - lessons from the Global Burden of Disease Study. Science. 274, 740-743 (1996).
- Parkin, D. M., Bray, F., Ferlay, J., Pisani, P. Estimating the world cancer burden: Globocan 2000. Int J Cancer. 94, 153-156 (2001).
- Bruix, J., Sala, M., Llovet, J. M. Chemoembolization for hepatocellular carcinoma. Gastroenterology. 127, 179-188 (2004).
- Miraglia, R., Pietrosi, G., Maruzzelli, L., Petridis, I., Caruso, S., Marrone, G., Mamone, G., Vizzini, G., Luca, A., Gridelli, B. Efficacy of transcatheter embolization/chemoembolization (TAE/TACE) for the treatment of single hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 13, 2952-2955 (2007).
- Breedis, C., Young, G. The blood supply of neoplasms in the liver. Am J Pathol. 30, 969-977 (1954).
- Nakashima, T., Kojiro, M. Pathologic characteristics of hepatocellular carcinoma. Semin Liver Dis. 6, 259-266 (1986).
- Heo, J., et al. Randomized dose-finding clinical trial of oncolytic immunotherapeutic vaccinia JX-594 in liver cancer. Nat Med. 19, 329-336 (2013).
- Altomonte, J., Marozin, S., Schmid, R. M., Ebert, O. Engineered newcastle disease virus as an improved oncolytic agent against hepatocellular carcinoma. Mol Ther. 18, 275-284 (2010).
- Shinozaki, K., Ebert, O., Kournioti, C., Tai, Y. S., Woo, S. L. Oncolysis of multifocal hepatocellular carcinoma in the rat liver by hepatic artery infusion of vesicular stomatitis virus. Mol Ther. 9, 368-376 (2004).
- Shinozaki, K., Ebert, O., Woo, S. L. Eradication of advanced hepatocellular carcinoma in rats via repeated hepatic arterial infusions of recombinant VSV. Hepatology. 41, 196-203 (2005).
- Altomonte, J., et al. Synergistic antitumor effects of transarterial viroembolization for multifocal hepatocellular carcinoma in rats. Hepatology. 48, 1864-1873 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
