Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Leczenie myszy SCA1 związkami rozpuszczalnymi w wodzie w celu niespecyficznego wzmocnienia funkcji mitochondriów

10.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53758

⸱

22 stycznia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neuroscience Program, Skidmore College, 2Chemistry Department, Skidmore College, 3Health and Exercise Science Department, Skidmore College

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół biochemiczny i behawioralny do oceny skuteczności związków rozpuszczalnych w wodzie ukierunkowanych na mitochondria w leczeniu ataksji rdzeniowo-móżdżkowej typu 1 (SCA1) i innych chorób neurodegeneracyjnych móżdżku.

Streszczenie

Dysfunkcja mitochondriów odgrywa znaczącą rolę w procesie starzenia się oraz w chorobach neurodegeneracyjnych, w tym kilku dziedzicznych ataksjach rdzeniowo-móżdżkowych i innych zaburzeniach ruchowych charakteryzujących się postępującą degeneracją móżdżku. Celem tego protokołu jest ocena dysfunkcji mitochondriów w ataksji rdzeniowo-móżdżkowej typu 1 (SCA1) i ocena skuteczności farmakologicznego ukierunkowania oddychania metabolicznego za pomocą rozpuszczalnego w wodzie związku kwasu bursztynowego w celu spowolnienia postępu choroby. Podejście to ma zastosowanie w przypadku innych chorób móżdżku i może być dostosowane do wielu terapii rozpuszczalnych w wodzie.

Analiza ex vivo oddychania mitochondrialnego służy do wykrywania i ilościowego określania zmian w funkcjonowaniu mitochondriów związanych z chorobą. Na podstawie dowodów genetycznych (dane niepublikowane) i proteomicznych dowodów dysfunkcji mitochondriów w mysim modelu SCA1, oceniamy skuteczność leczenia rozpuszczalnym w wodzie wzmacniaczem metabolizmu kwasem bursztynowym poprzez rozpuszczenie tego związku bezpośrednio w wodzie pitnej w klatce domowej. Zdolność leku do przenikania przez barierę krew-mózg można wywnioskować za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Skuteczność tych związków można następnie przetestować przy użyciu wielu paradygmatów behawioralnych, w tym przyspieszającego rotarodu, testu równoważnicy i analizy śladu węglowego. Integralność cytoarchitektoniczną móżdżku można ocenić za pomocą testów immunofluorescencyjnych, które wykrywają jądra komórek Purkiniego i dendryty komórek Purkiniego oraz somę. Metody te są solidnymi technikami określania dysfunkcji mitochondriów i skuteczności leczenia związkami rozpuszczalnymi w wodzie w chorobie neurodegeneracyjnej móżdżku.

Wprowadzenie

Mitochondria są kluczowymi producentami trifosforanu adenozyny (ATP), niezbędnego koenzymu dla energii komórkowej, przy czym większość mitochondrialnego ATP wytwarzana jest w procesie fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) przy użyciu łańcucha transportu elektronów. Mózg, ze względu na wysokie wymagania metaboliczne i zależność od fosforylacji oksydacyjnej w celu zasilania aktywności neuronalnej, jest bardzo podatny na dysfunkcję mitochondriów. W rezultacie, dysfunkcja mitochondriów jest wywoływana podczas procesu starzenia 1 i jest zaangażowana w patogenezę wielu chorób neurodegeneracyjnych 2,3,4. Wynika z tego, że mitochondria są atrakcyjnymi celami terapeutycznymi dla neurodegeneracji.

W tym protokole przyjęliśmy użycie ataksji rdzeniowo-móżdżkowej typu 1 (SCA1) jako modelowej choroby neurodegeneracyjnej do badania dysfunkcji mitochondriów i rozwoju terapii ukierunkowanych na mitochondria. SCA1 jest spowodowany mutacją powtórzeń poliglutaminy (polyQ) w produkcie genu ataksyny-1, która powoduje postępującą degenerację neuronów Purkinjego móżdżku i neuronów innych obszarów mózgu. Zastosowana tutaj transgeniczna linia myszy (oznaczona jako mysz SCA1), która wykazuje ekspresję transgenu ataksyny-1 z mutacją polyQ pod kontrolą promotora specyficznego dla komórek Purkinjego, pozwala na ukierunkowaną analizę składnika komórki Purkinjego SCA1 5. Myszy SCA1 przechodzą stopniową degenerację komórek Purkinjego i rozwijają ataksyjny chód 6.

Dysfunkcja kompleksu mitochondrialnego i skuteczność leczenia ukierunkowanego na mitochondria mogą być oceniane za pomocą zestawu testów molekularnych i behawioralnych. Dysfunkcja kompleksu mitochondrialnego jest mierzona ex vivo za pomocą testów oddychania, które wykrywają zmienione zużycie tlenu w tkance móżdżku w obecności substratów i inhibitorów łańcucha transportu elektronów 7. Testy oddychania były wcześniej stosowane z przepuszczalną tkanką, izolatami mitochondrialnymi i całymi tkankami 7,8,9. Pozwalają one na bezpośrednią ocenę funkcji mitochondriów, w przeciwieństwie do metod zbierania danych morfologicznych, takich jak transmisyjna mikroskopia elektronowa czy barwienie immunofluorescencyjne. Użycie całej tkanki, a nie izolowanych mitochondriów, zapobiega tendencyjnej selekcji zdrowych mitochondriów, która może wystąpić podczas procesu izolacji 7. Po dostosowaniu do protokołu, jak pokazano, test oddychania jest cenną metodą wykrywania dysfunkcji mitochondriów w stanach choroby neurodegeneracyjnej móżdżku.

Niespecyficzne aktywatory metabolizmu mogą być używane do wnioskowania o dysfunkcji mitochondriów u transgenicznych myszy modeli chorób neurodegeneracyjnych i pomocy w opracowywaniu nowych terapii. Wykazano, że kwercetyna, koenzym q10 i kreatyna łagodzą patologię chorób neurodegeneracyjnych u pacjentów i w zwierzęcych modelach chorób neurodegeneracyjnych 10,11,12,13,14,15,16. Przedstawiamy nowy aktywator metaboliczny, kwas bursztynowy, który stymuluje metabolizm i poprawia funkcję mitochondriów w chorobach neurodegeneracyjnych. Aby upewnić się, że aktywator przekracza barierę krew-mózg, HPLC zastosowano do wykrywania dostarczania do tkanki nerwowej u leczonych myszy 17.

Aby ocenić efekty terapeutyczne metabolicznie ukierunkowanych związków rozpuszczalnych w wodzie, takich jak kwas bursztynowy, można użyć zestawu paradygmatów behawioralnych i badań immunopatologicznych. Ze względu na deficyty koordynacji ruchowej występujące w chorobie neurodegeneracyjnej móżdżku, test pasa startowego odcisku stopy, test wiązki i test przyspieszającego pręta obrotowego są używane do wykrywania ratowania patologii behawioralnej 6, 18, 19. Pomiary te są uzupełnione immunopatologiczną oceną cytoarchitektury móżdżku poprzez ocenę grubości warstwy molekularnej (zdefiniowanej jako długość dendrytycznego trzpienia komórek Purkinjego) i liczby somy komórek Purkinjego w określonym zraziku tkanki móżdżku 6, 20, 21. W tym artykule przedstawiamy wiele neuropatologicznych i behawioralnych metod wykrywania i leczenia dysfunkcji mitochondriów za pomocą metabolicznie ukierunkowanych związków rozpuszczalnych w wodzie.

Używamy analizy ex vivo oddychania mitochondrialnego do analizy dysfunkcji mitochondriów u transgenicznej myszy SCA1. Ponadto wykazaliśmy, że objawy choroby i patologia są poprawiane przez rozpuszczalny w wodzie mitochondrialny kwas bursztynowy, co dodatkowo implikuje dysfunkcję mitochondriów w progresji choroby SCA1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół ten jest zgodny z wytycznymi IACUC w Skidmore College dotyczącymi pracy z myszami.

1. Leczenie związkami rozpuszczalnymi w wodzie

  1. Kwas bursztynowy rozpuścić do stężenia 0,75 mg/ml w klatce wody pitnej. Należy pamiętać, że na tym etapie można zastąpić dowolny związek rozpuszczalny w wodzie o pożądanym stężeniu. Wymieszaj roztwór, aby upewnić się, że związek jest całkowicie rozpuszczony.
  2. Po tym, jak myszy osiągną pożądany wiek leczenia, zastąp wodę pitną w klatce domowej z grupy leczonej roztworem z kroku 1.1.
  3. Codziennie mierz wagę butelek z wodą zarówno w grupie leczonej, jak i kontrolnej, aby upewnić się, że zarówno myszy leczone, jak i kontrolne piją tę samą ilość wody. Użyj tych pomiarów, aby obliczyć całkowitą dawkę leku na klatkę. Kontynuuj leczenie przez cały czas trwania eksperymentu i monitoruj wagę butelki.

2. Analiza śladu

  1. Umieść pas startowy na podłodze lub stole w zamkniętym pomieszczeniu. Ustaw wybieg pod lekkim kątem do góry w kierunku domowego pudełka wyłożonego pościelą i jedzeniem z nagrodami (np. słodkimi płatkami zbożowymi). Wyłóż długość pasa startowego arkuszem białego papieru. Pozwól pacjentowi zaaklimatyzować się w pudełku domowym przez 5 minut.
  2. Usuń obiekt z pudełka głównego i pomaluj odpowiednio lewą i prawą tylną łapę niebieską i czerwoną nietoksyczną farbą na bazie wody. Odciski farby zostaną wykorzystane do obliczenia wielu wyjściowych pomiarów behawioralnych.
  3. Umieść obiekt na początku pasa startowego i pozwól mu podejść do pola głównego. Gdy tester dotrze do skrzynki domowej, zamknij klapę i pozwól testerowi pozostać w skrzynce domowej przez minutę, zanim wróci do odpowiedniej klatki domowej. Wyczyść wybieg i pudełko domowe 30% etanolem i wymień pościel, jedzenie z nagrodami i papier na wybieg na następny temat.
  4. Określ ilościowo liczbę kroków, szerokość bramy, kąt kroku i liczbę obrotów wykonanych przez podmiot zgodnie z metodami analitycznymi opisanymi wcześniej 6. Udana próba odcisku stopy jest definiowana jako co najmniej 5 kolejnych śladów, w których badany idzie w kierunku pola bramkowego, nie odwracając się ani nie zatrzymując.

3. Analiza belki

  1. Ustaw aparat belkowy zgodnie ze specyfikacją krzyża prętów opisaną wcześniej 6 z następującymi 6 belkami: belka 1 = prostokątna, szerokość 28 mm; belka 2 = okrągła, średnica 28 mm; belka 3 = prostokątna, szerokość 12 mm; belka 4 = okrągła, średnica 12 mm; belka 5 = prostokątna, szerokość 6 mm; belka 6 = okrągła, średnica 6 mm. Na jednym końcu belki ustaw zaciemnione pudełko domowe z jedzeniem z nagrodami.
  2. Aby trenować osoby na belce, zmontuj urządzenie z belką 3. Delikatnie umieść obiekt na końcu belki naprzeciwko pola głównego i pozwól mu przejść w poprzek. Pozwól każdemu badanemu na maksymalnie trzy 2-minutowe próby, aby osiągnąć udany bieg, zdefiniowany jako przejście przez belkę i wejście do pola głównego w ciągu 2 minut. Pomiędzy próbami pozwól badanemu odpocząć w pudełku domowym przez 2 minuty. Pomiędzy badanymi wyczyść belkę i pudełko domowe 30% etanolem i zastąp karmę nagrodą, przygotowując się do następnego przedmiotu.
  3. Powtarzaj krok 3.2 raz dziennie przez następne dwa dni, co daje w sumie 3 kolejne dni treningowe. Dzień testowy, dzień 4, powinien następować kolejno po dniach treningowych.
  4. Aby przetestować badanych w dniu 4, najpierw zmontuj aparaturę z belką 1 i ustaw skrzynkę domową zgodnie z opisem w kroku 3.1. Umieść kamerę wideo przed aparatem i sprawdź, czy aparat z pełną wiązką światła może być wyraźnie uchwycony na wideo. Rozpocznij nagrywanie i umieść pierwszy obiekt na belce przeciwnej do pudełka głównego, co pozwoli na pomyślne zakończenie próby w maksymalnie 3 2-minutowych próbach. Pomiędzy próbami pozwól pacjentowi odpocząć przez 2 minuty w pudełku domowym.
  5. Kontynuuj testowanie obiektu na każdej z sześciu wiązek w kolejności numerycznej, pozwalając testerowi odpocząć przez 2 minuty w pudełku głównym przed rozpoczęciem następnej wiązki. Pomiędzy badanymi wyczyść każdą belkę i pudełko domowe 30% etanolem i zastąp karmę nagrodą, przygotowując się do każdego badanego.
    1. Nagraj na taśmę wideo każdą próbę i zapisz liczbę udanych prób na uczestnika na wiązkę w następujący sposób: "1" oznacza, że uczestnik odniósł sukces w pierwszym badaniu, "2" oznacza, że uczestnik odniósł sukces w drugim badaniu, "3" oznacza, że uczestnik odniósł sukces w trzecim i ostatnim badaniu, a "4" oznacza, że uczestnik nie odniósł sukcesu w żadnej z trzech prób.
  6. Wykorzystaj nagrania wideo z prób mierzących poślizgi stóp przez osoby oceniające, które są ślepe na warunki eksperymentalne badanego. Zdefiniuj ślizg stopy jako tylną stopę, która znajduje się w bezpośrednim view kamery, zanurzając się poniżej teoretycznej linii środkowej na całej długości belki. Średnie wyniki poślizgu od wielu strzelców.
  7. Aby przeanalizować liczbę udanych prób i liczbę danych dotyczących osuwisk, należy obliczyć błąd średni i standardowy w obrębie każdej kohorty genotypu i warunków eksperymentalnych. Przeprowadź jednoczynnikową analizę ANOVA i wielokrotne porównania post-hoc w celu ustalenia, czy istnieje wpływ leczenia i genotypu na liczbę udanych prób i liczbę osuwania się.

4. Przyspieszenie Rotarod

  1. Zaaklimatyzować badanych w pomieszczeniu testowym 10 minut przed rozpoczęciem badania. Podczas tego okresu aklimatyzacji należy przygotować aparat rotarod, czyszcząc każdą linię aparatu 30% etanolem.
  2. Otwórz oprogramowanie rotarod i ustaw ustawienia startowe na 4 obr./min, ustawienia przyspieszenia na 5 min i ustawienia prędkości końcowej na 40 obr./min. Te ustawienia zapewniają stałe przyspieszenie od 4 do 40 obr./min przez okres 5 minut. Myszy mogą pozostawać na rotarodzie z prędkością 40 obr./min przez dodatkowe 5 minut po okresie przyspieszania, co daje maksymalną długość biegu wynoszącą 10 minut.
  3. Po aklimatyzacji umieść obiekty na rotarodzie na odpowiednich pasach, podczas gdy pręt obraca się z prędkością 4 obr./min. Gdy wszyscy badani znajdą się na swoich pasach, rozpocznij pierwszą próbę. Nagraj opóźnienie do upadku za pomocą oprogramowania instrumentu; Dodatkowy zegar może być wykorzystany jako kopia zapasowa.
  4. Po zakończeniu próby, pozwól każdemu badanemu odpocząć w odpowiednich zbiornikach pasa przez dziesięć minut przed następną próbą, aby zapobiec zmęczeniu.
  5. Powtórz kroki 4.3 i 4.4, aby uzyskać łącznie cztery próby.
  6. Powtarzaj kroki 4.3 - 4.5 w sumie przez cztery kolejne dni, kontynuując leczenie przez cały okres próbny. Po zakończeniu określ ilościowo opóźnienie, które ma spaść z obracającego się pręta dla każdego badania na badanego 6.

5. Ekstrakcja i unieruchomienie móżdżku

  1. Eutanazja myszy poprzez uduszenie dwutlenkiem węgla zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi IACUC. Umieść testera w komorze na dwutlenek węgla i uwolnij dwutlenek węgla do komory. Obserwuj zwierzę przez cały czas podczas etapu eutanazji i nie zostawiaj go bez opieki.
  2. Gdy oddychanie ustanie, a badani nie będą odczuwać bólu przez nacisk tylnej stopy, wyjmij testera z komory i wykonaj górne nacięcie linii środkowej przez tkankę nabłonkową od środka czaszki doogonowo do podstawy czaszki przez tkankę nabłonkową.
  3. Za pomocą nożyczek preparacyjnych przeciąć czaszkę od podstawy przy rdzeniu kręgowym przez szew strzałkowy do bregmy. Przeciąć bocznie każdy szew koronowy przed ściągnięciem kości czołowej, ciemieniowej i międzyciemieniowej za pomocą kleszczy.
  4. Użyj kleszczy, aby odłamać kość boczną do móżdżku. Użyj kleszczy, aby oddzielić móżdżek od wzgórków i pnia mózgu i wyciągnąć go z reszty tkanki. Oddziel móżdżek na lewą i prawą półkulę za pomocą kleszczy.
  5. Natychmiast umieść prawy móżdżek w ciekłym azocie, aby zaoszczędzić na analizę HPLC, a lewy móżdżek we wstępnie schłodzonym 4% paraformaldehydzie (PFA) w celu utrwalenia tkanek. Pobrać wszelkie inne tkanki będące przedmiotem zainteresowania przed przecięciem aorty i wyrzuceniem tuszy zgodnie z zasadami IACUC.
    ostrożność: PFA jest wysoce toksycznym, łatwopalnym i.
  6. Dwadzieścia cztery godziny po ekstrakcji umyć tkankę utrwaloną w PFA (4% w PBS) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (trzy razy, 5 minut/mycie) przed umieszczeniem tkanki w 30% sacharozie w temperaturze 4 °C na okres do 2 tygodni.

6. Test immunopatologiczny

  1. Podłącz rurkę mikrotomu sanek do kranu zlewozmywakowego i skrzynki kontrolnej temperatury. Użyj skrzynki kontrolnej temperatury, aby schłodzić stolik mikrotomu do -25 °C. Ustaw pokrętło grubości przekroju na 50 μm.
    UWAGA: Jeśli tarcza na mikrotomie sanek nie osiągnie 50 μm, ustaw tarczę na cieńsze ustawienie i pomnóż grubość, odpowiednio przesuwając ustawienie (na przykład ustaw tarczę na 10 μm i przesuń pięć razy przed przekrojem, aby uzyskać całkowitą grubość 50 μm).
  2. Nałóż na scenę porcję roztworu do cięcia w optymalnej temperaturze (OTC) wielkości dziesięciocentówki. Zanim OTC zamarznie, użyj kleszczy, aby ustawić półkulę tak, aby powierzchnia cięcia w połowie strzałki była skierowana w dół na warstwie OTC. Pracując szybko, delikatnie ustaw tkankę za pomocą kleszczy tak, aby boczny koniec półkuli był skierowany w stronę ostrza, nad sceną. Poczekaj, aż OTC całkowicie zamarznie.
    1. Pracując warstwami, dodaj dodatkowe OTC wokół tkanki, pozwalając OTC całkowicie zamrozić się przed dodaniem następnej warstwy. Dodaj cienką warstwę OTC na wierzch tkanki i zamroź.
  3. Podziel tkankę, rozkładając równy ciężar ciała na ostrze tnące podczas cięcia. Zbierz skrawki za pomocą pędzla artystycznego i umieść w odpowiednio oznakowanej płytce zawierającej 1x PBS. Pomiędzy sekcjami ustaw ponownie grubość cięcia na pokrętle mikrotomu sań, jeśli to konieczne, na 50 μm.
  4. Zastąp PBS w każdym dołku płytki studzienki roztworem mocznika [0,01 M mocznika w PBS] i umieść płytkę na lodzie. Gdy będzie gotowy, wyjmij płytkę z lodu i gotuj fragmenty w roztworze mocznika trzy razy przez 15 sekund za każdym razem, aby zdemaskować epitopy do znakowania immunologicznego. Ten krok można łatwo wykonać, umieszczając płytkę na bloku grzewczym ustawionym na temperaturę wrzenia. Pomiędzy każdym etapem gotowania schłodzić płytkę zawierającą skrawki tkanek na lodzie.
    UWAGA: W przypadku wykonywania etapów mocznika, blokowania, przeciwciała pierwszorzędowego, przeciwciała drugorzędowego i DAPI na płytce 96-dołkowej, należy użyć objętości 100 μl w całym tekście. Jeśli używana jest studzienka o innym rozmiarze, odpowiednio dostosuj objętości odczynników. Zamiast bloku grzewczego można użyć kuchenki mikrofalowej do gotowania próbek tkanek w moczniku. Próbki mikrofalowe na wysokim ustawieniu mocy w trzech odstępach 15 s.
  5. Po ugotowaniu umyć sekcje trzy razy, za każdym razem usuwając obecny roztwór, zastępując roztwór roztworem 1x PBS i mieszając przez 10 minut.
  6. Blokować skrawki roztworem surowicy osła (3% normalnej surowicy osła, 0,3% trytonu X-100 w PBS) poprzez inkubację tkanki w surowicy przez godzinę z delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór surowicy osła.
  7. Oznaczyć skrawki 0,2 μg/ml antykalbindyny i przeciwciałem anty-ataksyny-1 w stosunku 1:2 000 (11NQ)16 w roztworze surowicy osła i inkubować w temperaturze 4 °C przez 72 godziny z delikatnym mieszaniem.
  8. Przemyć skrawki PBS jak w kroku 6.5 przed inkubacją skrawków w odpowiednim przeciwciałie drugorzędowym (przeciwciała anty-kozie 1:500 Alexa Fluor-488 i 1:500 Alexa Fluor-594-anty-królicze rozcieńczone w roztworze surowicy osła) w temperaturze 4 °C przez 48 godzin, delikatnie mieszając.
  9. Przemyć skrawki trzykrotnie PBS, jak w kroku 6.5, przed znakowaniem jąder komórkowych roztworem DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindol) rozcieńczonym do końcowego stężenia 0,5 μg/ml w PBS. Inkubacja DAPI nie powinna trwać dłużej niż dziesięć minut. Usunąć roztwór i przemyć PBS jak w kroku 6.5.
  10. Zamontuj chusteczkę na szkiełkach pokrytych żelatyną o stężeniu 2% z podłożem montażowym, aby zmniejszyć fotowybielanie. Nakryj szkiełko nakrywkowe i uszczelnij lakierem do paznokci.
  11. Za pomocą skaningowego mikroskopu konfokalnego zlokalizuj pierwotną szczelinę móżdżku w świetle jasnego pola. Za pomocą obiektywu 10X UIS2 skanuj i sekwencyjnie wzbudzaj kanały DAPI, AlexaFluor-488 i AlexaFluor-594 za pomocą lasera diodowego 405 nm, argonowego lasera gazowego 488 nm i lasera diodowego 559 nm w połączeniu z dichroicznym rozdzielaczem wiązki DM488/559 nm. Oddzielaj i zbieraj emitowane światło za pomocą rozdzielaczy wiązki SDM490 i SDM560 oraz filtra pasmowoprzepustowego BA575-675.
    1. Dla każdego kanału należy utworzyć stos z w szczelinie pierwotnej, w którym z = 20 μm i krok = 0,1 μm. Użyj oprogramowania do przetwarzania końcowego dostarczonego z mikroskopem konfokalnym, aby dodać znacznik rozmiaru do końcowego obrazu.
      UWAGA: Alternatywne lasery, filtry i fluorofory można zastąpić w zależności od dostępności. Jeśli detekcja AlexaFluor-488 lub AlexaFluor-594 jest słaba, można zastosować detektor fosforku galu (GaAsP) o wysokiej czułości w celu wzmocnienia sygnału, jeśli jest dostępny.

7. Kwantyfikacja grubości warstwy molekularnej i liczby komórek Purkinjego

  1. Korzystając z ImageJ, otwórz obraz stosu z poplamioną szczeliną główną i podziel każdy obraz na kanały czerwony, niebieski i zielony, wybierając "Obraz" z paska menu, "Kolor" z zakładki Obraz i "Podziel kanały" z karty Kolor.
  2. Utwórz maksymalną projekcję Z dla każdego kanału, który został podzielony. Gdy interesujący Cię obraz kanału jest otwarty, wybierz "Obraz" z paska menu, "Sekcje" z zakładki Obraz i "Projekt Z" z zakładki "Sekcje". W menu poleceń "Z-project" wybierz "Projekcja Max Z" i kliknij "OK". Powtórz te czynności dla każdego kanału.
  3. Otwórz wtyczkę Cell Counter, wybierając "Wtyczki" z paska menu, "Analizuj" z zakładki Wtyczki i "Licznik komórek" z zakładki Analizuj.
    UWAGA: ImageJ i wtyczkę ImageJ Cell Counter można pobrać ze stron internetowych podanych w Tabeli materiałów i wyposażenia.
  4. Określ ilościowo liczbę komórek Purkinjego, licząc jądra znakowane ataksyną 1, które leżą wzdłuż z góry określonego odcinka 200 μm przedniej i tylnej długości pierwotnej szczeliny. Użyj mapy progów, wybierając "Obraz" z paska menu, "Dostosuj" z zakładki Obraz i "Próg" z zakładki Dostosuj, aby utworzyć mapę progową kanału zainteresowania (czerwona w przypadku jąder znakowanych ataksyną-1).
    1. Wybierz zakres pikseli, który można znormalizować podczas kwantyfikacji (na przykład 31–225 pikseli). Odrzuć szum z obrazów, zaznaczając pole "Ciemne tło" w oknie Próg. Sygnał obrazu można odwrócić, aby ułatwić liczenie.
  5. Określ ilościowo grubość warstwy molekularnej w kanale zielonym za pomocą narzędzi "Podziel kanały" i "Mapa progowa", jak w krokach 7.1 i 7.2. Używając znacznika rozmiaru na każdym obrazie jako przewodnika, losowo zmierz trzy długości warstw molekularnych w każdym z dwóch wyznaczonych odcinków 200 μm każdego pierwotnego obrazu szczeliny. Wykonaj pomiary od bliższego końca altany dendrytycznej Purkinjego u podstawy somy Purkinjego do dystalnego końca altany dendrytycznej Purkinjego.
  6. Zapisz liczbę komórek Purkinjego i grubość warstwy molekularnej jako średnie plus lub minus błąd standardowy. Wykonaj jednoczynnikową ANOVA z wieloma porównaniami analizy post-hoc, aby przetestować wpływ warunków leczenia lub genotypu na liczbę komórek i długość trzpienia dendrytycznego.

8. Analiza HPLC stężeń kwasu bursztynowego w móżdżku po leczeniu

  1. Przygotowanie próbki do analizy
    1. Zważyć każdą pobraną prawą półkulę móżdżku przed użyciem w analizie HPLC. Zmielić połówki półkuli pojedynczo we wstępnie schłodzonym homogenizatorze z dounce i dodać 0,5 ml roztworu woda:metanol o proporcji 75:25 (objętościowo) do każdej homogenizowanej połówki 17.
    2. Używając wąskiego, wstępnie schłodzonego homogenizatora, grubo rozdrobnij tkankę za pomocą 5 uderzeń odbić. Kontynuuj drobno mielenie każdej próbki tkanki za pomocą szerszego homogenizatora, wykonując 20 uderzeń po odbiciu.
    3. Przenieść homogenaty do wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej. Po każdej próbce przepłukać homogenizator 0,5 ml lodowatej wody: roztworu metanolu i dodać płukanie do probówki mikrowirówkowej.
    4. Odwirować homogenat próbek o masie 1 300 x g przez 30 minut w temperaturze 25 °C i zebrać supernatant w czystej probówce do mikrowirówki.
    5. Przefiltrować supernatant przez filtr odśrodkowy umieszczony w filtrze z regenerowanej celulozy o nominalnej masie cząsteczkowej 10 kilodaltonów (kDa). Jeżeli analiza HPLC nie zostanie przeprowadzona natychmiast, przefiltrowane próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.
  2. Oprzyrządowanie i warunki HPLC
    1. Podłączyć kolumnę do chromatografii wykluczającej jony o długości co najmniej 30 cm i wielkości cząstek 7 μm do wysokosprawnego chromatografu cieczowego.
    2. Przygotować i odgazować wystarczającą ilość 1 mM buforu octanowego dostosowanego do pH 5.
    3. Ustawić HPLC z prędkością fazy ruchomej 0,8 ml/min. W przypadku korzystania z detektora UV-vis wybierz długość fali detektora 224 nm. Typowe czasy elucji kwasu bursztynowego w tych warunkach wynoszą od 10 do 12 minut.
  3. Uruchamianie i analizowanie standardów i próbek
    1. Przygotować zestaw wzorców w fazie ruchomej buforu octanowego o stężeniach kwasu bursztynowego między 0 a 250 ppm.
    2. Uruchomić każdy wzorzec i przygotować krzywą kalibracyjną, używając powierzchni piku zmierzonej z każdego przebiegu.
    3. Po uzyskaniu dokładnej krzywej wzorcowej należy uruchomić wcześniej przygotowane próbki rozcieńczone w buforze octanowym . Aby uzyskać większą dokładność pomiaru, próbki można wzbogacić znanymi stężeniami kwasu bursztynowego, które zostały rozcieńczone w fazie ruchomej. Uruchom wszystkie próbki w trzech egzemplarzach.
    4. Analizować chromatogramy HPLC w celu określenia stężenia kwasu bursztynowego w próbkach za pomocą krzywej kalibracyjnej, a następnie pomnożyć przez objętość próbki i podzielić przez pierwotną masę próbki.

9. Analiza ex vivo funkcjonalności mitochondriów móżdżku przy użyciu jednostki sterującej elektrodą tlenową

  1. Utwórz elektrodę typu Clark za pomocą dostępnego na rynku systemu, najpierw nakładając kroplę roztworu chlorku potasu (50% KCl w/v) na katodę platynową, przecinając 1,5cm2 kawałek komercyjnej bibułki tytoniowej i delikatnie umieszczając papier na katodzie platynowej.
    1. Przykryj katodę i otaczającą anodę kawałkiem papieru politetrafluoroetylenowego (P.T.F.E) o długości2 cm i dokładnie zabezpiecz obie membrany pierścieniami uszczelniającymi o przekroju okrągłym, upewniając się, że w membranach nie ma fałd ani pęcherzyków. Wlej 50% roztwór KCl do otaczającej studni.
  2. Zamocuj wstępnie przygotowaną elektrodę w komorze testowej i napełnij ją wodą nasyconą powietrzem. Podgrzać komorę do temperatury 30 °C, dodać do roztworu mieszadło o średnicy 0,8 cm i mieszać z prędkością 70 obr./min za pomocą oprogramowania przyrządu. Skalibruj komorę, ustalając zero tlenu. W tym celu należy kolejno dodać do roztworu kilka kryształów środka redukującego, ditionianu sodu.
    1. Po osiągnięciu kalibracji przemyj komorę raz 70% etanolem, a następnie przemyj sześć razy wodą dejonizowaną, zanim pozwolisz komorze zaaklimatyzować się w 1,5 ml buforu oddechowego (5 mM MgCl2, 60 mM KCl, 100 mM mannitol, 10 mM KH2PO4, 0,5 mM Na2EDTA, 60 mM Tris-HCl [pH 7,4]) 7.
      UWAGA: wszelkie ślady ditionianu sodu muszą zostać całkowicie usunięte podczas etapów prania przed przystąpieniem do pomiaru stężenia tlenu podczas eksperymentów z oddychaniem.
  3. Delikatnie homogenizować zważone półkule móżdżku w 0,5 ml buforu homogenatycznego (0,25 M sacharozy, 0,5 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl [pH 7,4]). Przenieść homogenat do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i przechowywać w stanie schłodzonym do momentu rozpoczęcia testu.
  4. Dodać homogenat do komory, osiągając końcową objętość 2 ml. Przepuszczalność homogenatu móżdżku poprzez dodanie 40 μl digitoniny lub saponiny (5 mg/ml); Pozostawić homogenizowaną tkankę do inkubacji przez 10 min.
    UWAGA: Digitonina i saponina są toksyczne, a czas inkubacji powinien być ograniczony do minimum.
  5. Aby rozpocząć rejestrację zużycia tlenu, należy określić funkcję mitochondriów poprzez aktywację i hamowanie łańcucha fosforylacji oksydacyjnej za pomocą odpowiednio substratów i inhibitorów (3 minuty zapisów na substrat).
    1. Dodać substraty za pomocą czystych strzykawek w następujący sposób: 10 μL 2 M glutaminianu [końcowe stężenie (f.c) 0,01 M], 5 μL 0,8 M jabłczanu [f.c. 2 mM], 20 μL 0,5 M difosforanu adenozyny (ADP) [f.c. 5 mM], 1 μL 1 mM rotenonu [f.c. 0,5 μM], 20 μL 1M kwasu bursztynowego [10 mM], 1 μl 5 mM antymycyny A [f. c. 2,5 μM], 1 μl 0,8 M askorbinianu [f.c. 0,4 mM] i 5 μl 0,2 M tetrametylo-p-fenylenodiaminy (TMPD). [f.c. 0,5 mM] Podczas dodawania substratów do komory należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do systemu.
      UWAGA: Szczegółowe informacje na temat efektu funkcjonalnego indukowanego przez każdy substrat i inhibitor są opisane w wcześniej opublikowanym protokole 7. Może być konieczne wygenerowanie indywidualnych krzywych dawka-odpowiedź w celu określenia optymalnych stężeń substratów i inhibitorów w preparatach/tkankach/gatunkach, które nie były wcześniej badane. Podobnie, protokół może być zoptymalizowany pod kątem wrodzonych tendencji metabolicznych badanej tkanki/gatunku, takich jak preferencje dotyczące substratów.
  6. Po zakończeniu zbierania danych delikatnie zassać homogenaty móżdżku i oczyścić komorę etanolem i wodą dejonizowaną. Po oczyszczeniu, dodatkowe próbki homogenatu móżdżku mogą być badane bez dodatkowej kalibracji tak długo, jak długo membrana PTFE pozostaje nienaruszona. Po ostatecznym zakończeniu oczyść elektrodę wodą dejonizowaną i etanolem i przechowuj z żelem krzemionkowym lub środkiem osuszającym.
    UWAGA: Pomiędzy biegami tego samego dnia napełnij komorę wodą dejonizowaną, upewniając się, że membrana nie wysycha.
  7. Korzystając z arkusza danych utworzonego przez oprogramowanie urządzenia, wyeksportuj 40 minut danych dotyczących oddychania, zaczynając dwie minuty po dodaniu podłoża do programu arkusza kalkulacyjnego.
  8. Obliczyć szybkość oddychania na substrat lub inhibitor. Normalizuj dane, dzieląc całkowite oddychanie przez częstość oddechów podczas dodawania substratu askorbinianu-TMPD.
    UWAGA: Częstość oddechów może być dodatkowo znormalizowana do zawartości białka w tkance, co może być szczególnie pożądane w eksperymentach neurodegeneracyjnych, w których zawartość tkanki może się różnić. W tym celu należy zarezerwować 50 μl homogenatu próbki (z kroku 9.3) do wykorzystania w standardowym teście białkowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Poprzez farmakologiczne celowanie w mitochondria móżdżku za pomocą kwasu bursztynowego jesteśmy w stanie zapobiec dysfunkcji mitochondrialnej w mysim modelu cerebellarnej choroby neurodegeneracyjnej SCA1. Kanoniczny donor elektronów dla dehydrogenazy bursztynianowej, kwas bursztynowy, rozpuszczono w wodzie pitnej w klatkach myszy SCA1 na okres jednego miesiąca; ocenę behawioralną rozpoczęto w drugim tygodniu leczenia, natomiast ocenę neuropatologiczną przeprowadzono po zakończeniu terapii...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Jeśli metody te zostaną zastosowane zgodnie z opisem, są w stanie wykryć i złagodzić dysfunkcję mitochondriów za pośrednictwem fosforylacji oksydacyjnej w modelach myszy z chorobą neurodegeneracyjną móżdżku. Połączone testy biochemiczne i behawioralne są wieloaspektowymi metodami określania zakresu udziału mitochondriów w patologii choroby neurodegeneracyjnej móżdżku. Lecząc myszy kwasem bursztynowym w celu pobudzenia metabolizmu i poprawy funkcji mitochondriów, jesteśmy w stanie pokazać ratunek w deficytach behawioralny...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować doktorowi Harry'emu Orrowi z University of Minnesota za jego hojny dar w postaci transgenicznych myszy. Chcielibyśmy również podziękować następującym absolwentom Skidmore College za ich pracę podczas wykonywania poprzednich eksperymentów: Monice Villegas, Porter Hall, Mitchell Spring, Nicholas Toker, Jenny Zhang, Chloe Larson i Cheyanne Slocum. Ponadto chcielibyśmy podziękować Skidmore College za sfinansowanie rozwoju tych metod.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Difosforan adenozynySigma AldrichA2754ADP
AskorbinianSigma AldrichA7631
Albumina surowicy bydlęcejSigma AldrichA2153BSA
4',6-Diamidino-2-fenyloindolSigma AldrichD9542DAPI
DigitoninaSigma AldrichD141
DitiothreitolSigma AldrichD0632DTT
Serum osłaSigma AldrichD9663
GlutaminianSigma Aldrich1446600
JabłczanSigma Aldrich6994
MannitolSigma AldrichM4125
ParaformaldehydSigma AldrichP6148
Laktobionian potasuBio-Cukry69313-67-3
RotenonSigma AldrichR8875
SaponinaSigma Aldrich47036
Kwas bursztynowySigma AldrichS3674
N,N,N′,N′ -tetrametylo-p-fenylenodiaminaSigma AldrichT7394TMPD
Triton X-100Sigma AldrichT9284
MocznikSigma AldrichU0631
Vectashield podłoże montażoweVector LabsH-1000
przeciwciała
11NQ (anty-ataksyna-1 )Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801
Alexa Fluor 488 anty-mysie przeciwciało wtórneLife TechnologiesA-11015
Alexa Fluor 594 przeciwciało drugorzędowe przeciwko królikowiLife TechnologiesA-11012
Przeciwciało Calbindin (koza)Santa CruzC-20
Animals
Kontroluj transgeniczne myszyHarry Orr, Ph.D.A02Burright, et al. 1997, PMID: 9217978
myszy SCA1Harry Orr, Ph.D.B05Burright, et al. 1997, PMID: 9217978
Myszy typu dzikiegoThe Jackson Laboratory001800
Equipment
ESM-100L mikrotomERMASanki mikrotom
Fluoview FV1200 Mikroskop konfokalnyOlympus
Szkiełka glicerolowo-żelatynoweFD Neuro TechnologiesPO101
Strzykawka HamiltonSigma AldrichVCAT 80465
OXYT1 Jednostka sterująca elektrodą OxythermHansatech Instruments Papier
P.T.F.E.Cole-ParmerUX-08277-15
Rotallion RotarodPPP& Gskontaktuj się z autorem korespondencyjnym w celu uzyskania informacji
Ultimate 3000 HPLCDionex
Software
ImageJNational Institute of Healthhttp://imagej.nih.gov/ij/
Wtyczka licznika komórek (dla ImageJ)National Institute of Healthhttp://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html
3P& G Rota-Rod v3.3.3 (oprogramowanie rotarod)PPP& Gskontaktuj się z autorem korespondencyjnym w celu uzyskania
informacji Phidget21.dll (wymagane dla oprogramowania rotarod)DLL-Files.comhttps://www.dll-files.com/phidget21.dll.html

Bibliografia

  1. Stucki, D. M., et al. Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ. Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).
  2. Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A. Modeling mitochondrial dysfunctions in the brain, from mice to men. J Inherit Metab Dis. 35 (2), 193-210 (2012).
  3. Breuer, M. E., et al. The role of mitochondrial OXPHOS dysfunction in the development of neurologic diseases. Neurobiol Dis. , (2012).
  4. Hroudová, J., Singh, N., Fizar, Z. Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases, relevance to Alzheimer's disease. Biomed Res Int. 2014, 175062(2014).
  5. Burright, E. N., et al. SCA1 transgenic mice, a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG trinucleotide repeat. Cell. 82 (6), 937-948 (1995).
  6. Clark, H. B., et al. Purkinje cell expression of a mutant allele of SCA1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological alterations. J Neurosci. 17 (19), 7385-7395 (1997).
  7. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
  8. Deng-Bryant, Y., Singh, I. N., Carrico, K. M., Hall, E. D. Neuroprotective effects of tempol, a catalytic scavenger of peroxynitrite-derived free radicals, in a mouse traumatic brain injury model. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1114-1126 (2008).
  9. Vaishnav, R. A., Singh, I. N., Miller, D. M., Hall, E. D. Lipid peroxidation-derived reactive aldehydes directly and differentially impair spinal cord and brain mitochondrial function. J Neurotrauma. 27 (7), 1311-1320 (2010).
  10. Matthews, R. T., Yang, L., Browne, S., Baik, M., Beal, M. F. Coenzyme Q10 administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (15), 8892-8897 (1998).
  11. Ferrante, R. J., et al. Neuroprotective effects of creatine in a transgenic mouse model of Huntington's disease. J Neurosci. 20 (12), 4389-4397 (2000).
  12. Ferrante, R. J., et al. Therapeutic effects of coenzyme Q10 and remacemide in transgenic mouse models of Huntington's disease. J Neurosci. 22 (5), 1592-1599 (2002).
  13. Hersch, S. M., et al. Creatine in Huntington disease is safe, tolerable, bioavailable in brain and reduces serum 8OH2'dG. Neurology. 66 (2), 250-252 (2006).
  14. Yang, L., et al. Combination therapy with coenzyme Q10 and creatine produces additive neuroprotective effects in models of Parkinson's and Huntington's diseases. J Neurochem. 109 (5), 1427-1439 (2009).
  15. Yang, X., Dai, G., Li, G., Yang, E. S. Coenzyme Q10 reduces beta-amyloid plaque in an APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer's disease. J Mol Neurosci. 41 (1), 110-113 (2010).
  16. Sandhir, R., Mehrotra, A. Quercetin supplementation is effective in improving mitochondrial dysfunctions induced by 3-nitropropionic acid, implications in Huntington's disease. Biochim Biophys Acta. 1832 (3), 421-430 (2013).
  17. Ergonul, P. G., Nergiz, C. Determination of organic acids in olive fruit by HPLC. 'Czech Food Sci. 28 (3), 202-205 (2010).
  18. Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. J Pharm Pharmacol. 20 (4), 302-304 (1968).
  19. Luong, T. N., Carlisle, H. J., Southwell, A., Patterson, P. H. Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam. J Vis Exp. (49), (2011).
  20. Servadio, A., Koshy, B., Armstrong, D., Antalffy, B., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. Expression analysis of the ataxin-1 protein in tissues from normal and spinocerebellar ataxia type 1 individuals. Nat Genet. 10 (1), 94-98 (1995).
  21. Klement, I. A., et al. Ataxin-1 nuclear localization and aggregation, role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice. Cell. 95 (1), 41-53 (1998).
  22. Serra, H. G., et al. Gene profiling links SCA1 pathophysiology to glutamate signaling in Purkinje cells of transgenic mice. Hum Mol Genet. 13 (20), 2535-2543 (2004).
  23. Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. J Neurosci. 19 (8), 3248-3257 (1999).
  24. Anjomani Virmouni, S., et al. A novel GAA-repeat-expansion-based mouse model of Friedreich's ataxia. Dis Model Mech. 8 (3), 225-235 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obr bka kwasem bursztynowymtesty behawioralneanalizy immunofluorescencyjneanaliza HPLCoddychanie mitochondrialnetkanka m d kuchoroba neurodegeneracyjna
Leczenie myszy SCA1 związkami rozpuszczalnymi w wodzie w celu niespecyficznego wzmocnienia funkcji mitochondriów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.