Artykuł metodologiczny

Przygotowanie hodowli progenitorowych oligodendrocytów szczurów i kwantyfikacja oligodendrogenezy za pomocą skanowania fluorescencyjnego w podwójnej podczerwieni

DOI:

10.3791/53764

⸱

17 lutego 2016

 ,  ,  , 
1Neurology, Johns Hopkins University, School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oligodendrocyty to komórki mielinizujące ośrodkowego układu nerwowego. Protokół ten opisuje metodę izolacji i hodowli ich prekursorów, komórek progenitorowych oligodendrocytów, z kory szczura, a także szybką i wiarygodną metodę ilościową oceny oligodendrogenezy in vitro w odpowiedzi na czynniki eksperymentalne.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skuteczna oligodendrogeneza jest celem terapeutycznym wielu obszarów badań, w tym urazów rdzenia kręgowego, niedotlenienia noworodków i chorób demielinizacyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane i poprzeczne zapalenie rdzenia kręgowego. Mielinizacja jest wymagana, aby nie tylko ułatwić szybką propagację impulsów w ośrodkowym układzie nerwowym, ale także zapewnić wsparcie troficzne dla leżących poniżej aksonów. Komórki progenitorowe oligodendrocytów (OPC) można badać in vitro, aby pomóc w identyfikacji czynników, które mogą promować lub hamować różnicowanie oligodendrocytów. Do tej pory wiele dostępnych metod oceny tego procesu wymagało albo dużej liczby komórek, co ograniczało liczbę warunków, które można badać w dowolnym momencie, albo pracochłonnych metod kwantyfikacji. W niniejszym artykule opisano protokół izolacji dużej liczby wysoce czystych OPC wraz z szybką i niezawodną metodą określania oligodendrogenezy z wielu warunków jednocześnie. OPC są izolowane z kory noworodków szczurów P5-P7 i hodowane in vitro przez trzy dni przed różnicowaniem. Cztery dni po różnicowaniu oligodendrogenezę ocenia się za pomocą testu skanowania fluorescencji w podwójnej podczerwieni w celu określenia ekspresji białka mieliny.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Efektywne przewodnictwo nerwowe w ośrodkowym układzie nerwowym (CNS) u ssaków wymaga mielinizacji aksonów przez oligodendrocyty. Podczas rozwoju oligodendrocyty powstają z puli komórek progenitorowych oligodendrocytów (OPC), które, jak się uważa, migrują ze stref komorowych rozwijającego się przodomózgowia i cewy nerwowej1. Po migracji OPC różnicują się w dojrzałe, mielinizujące oligodendrocyty, które nie tylko ułatwiają efektywną propagację impulsów, ale także zapewniają aksonom wsparcie troficzne2. Dorosły OUN utrzymuje obfitą populację OPC, które są rozproszone w istocie szarej i białej, stanowiąc około 5-8% wszystkich komórek3. Po zniewadze demielinizacyjnej OPC migrują do miejsca urazu, namnażają się i różnicują, zastępując utracone lub uszkodzone osłonki mielinowe na odsłoniętych aksonach. Jednak w niektórych warunkach choroby/urazu proces ten okazuje się nieefektywny lub może całkowicie zakończyć się niepowodzeniem4. Podczas gdy uważa się, że przewlekła demieninizacja zwiększa obciążenie chorobą, skuteczna oligodendrogeneza i remielinizacja mogą złagodzić objawy5. W związku z tym interesujące było badanie OPC in vitro w celu określenia wpływu czynników eksperymentalnych na oligodendrogenezę.

Wgląd w różne fazy różnicowania oligodendrocytów stał się możliwy dzięki identyfikacji markerów komórkowych specyficznych dla danego etapu. Samoodnawiające się wczesne komórki progenitorowe są definiowane przez ekspresję receptora alfa czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego (PDGFRα), antygenu nerwowego/glejowego 2 (NG2) i A2B5 6-8. Gdy OPC inicjują swój program różnicowania i wycofują się z cyklu komórkowego, regulują ekspresję tych markerów i zaczynają wyrażać białka wskazujące na premielinizujące oligodendrocyty, w tym 3'-fosfodiesterazy cyklicznego nukleotydu (CNPaza) i O4. Wreszcie, ich różnicowanie w bardziej dojrzałe oligodendrocyty charakteryzuje się ekspresją białek związanych z mieliną, w tym glikoproteiny związanej z mieliną (MAG), białka proteolipidowego (PLP) i zasadowego białka mieliny (MBP). MBP jest wewnątrzkomórkowym białkiem błony obwodowej i głównym składnikiem osłonki mielinowej. Myszy pozbawione MBP rozwijają ciężki fenotyp, w którym mielinizacja OUN jest znacznie zmniejszona, co prowadzi do drżenia, drgawek i wczesnej śmierci9,10. Ta ważna rola MBP w mielinizacji doprowadziła do jego wykorzystania jako markera różnicowania oligodendrocytów zarówno in vitro, jak i in vivo11.

Kwantyfikacja MBP może być osiągnięta przy użyciu kilku różnych metodologii. Analiza RT-PCR i Western blot pozwala na ilościowe określenie poziomów MBP przy różnych schematach leczenia. Immunocytochemia jest powszechnym podejściem jakościowym, które może być również ilościowe, gdy stosowane są podejścia mikroskopowe oparte na kamerach. Chociaż systemy te są wiarygodne i mają fundamentalne znaczenie dla badania różnicowania oligodendrocytów, każdy z nich ma swoje wady, które ograniczają ich stosowanie w badaniach przesiewowych leków. Po pierwsze, ilość pierwotnych OPC, które są potrzebne do analizy RT-PCR i Western blot, zmniejsza liczbę zmiennych, które mogą być badane jednocześnie. Chociaż zapotrzebowanie komórek na immunocytochemię jest znacznie niższe, jeśli celem jest kwantyfikacja, należy poświęcić dużo czasu na każdy eksperyment. Konieczne jest wykonanie wielu obrazów, a następnie ich ilościowe określenie, aby ułatwić analizę eksperymentalną. Zastrzeżenia te stają się ważnymi przeszkodami, które należy wziąć pod uwagę w przypadku badań, które wymagają oceny o wysokiej przepustowości. W tym miejscu opisujemy metodę, która wykorzystuje podstawowe aspekty zarówno immunocytochemii, jak i metodologii Western blot do ilościowego oznaczania mieliny, jednocześnie znacznie zmniejszając zarówno liczbę wymaganych komórek, jak i czas do zakończenia analizy ilościowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) oraz Johns Hopkins School of Medicine.

1. Przygotowanie płytek testowych, roztworów podstawowych i pożywek bazowych OPC

Uwaga: Opisana tutaj pożywka dla szczurzej zasady OPC (Sato) pochodzi z wcześniej opublikowanych badań12,13. Alternatywne preparaty pożywek mogą być również zgodne z tą procedurą.

  1. Zawiesić poli-L-lizynę (PLL) do stężenia 10 μg/ml w sterylnej wodzie dejonizowanej. Odpipetować 400 μl rozcieńczonego PLL do każdego dołka czarnościennego, przezroczystego naczynia do hodowli tkankowych z 24 dołkami.
  2. Naczynia do hodowli tkankowych należy pokrywać przez 2 godziny w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C lub przez noc w lodówce o temperaturze 4 °C.
  3. Odessać PLL z powlekanych naczyń co najmniej 20 minut przed posiewem. Pozostaw pozostałą PLL do wyschnięcia z dołka, umieszczając 24 płytki dołkowe z częściowo uchyloną pokrywką w kapturze do hodowli tkankowych. Sprawdź, czy studzienki są całkowicie suche przed poszyciem izolowanych OPC. Komórki nie będą przylegać do plastiku, w którym występuje płynny PLL.
  4. Przygotować roztwór podstawowy N-acetylo-L-cysteiny (NAC) (1000x): Rozpuścić 100 mg N-acetylo-L-cysteiny (NAC) w 20 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  5. Przygotuj roztwór podstawowy hydrokortyzonu (1000x): Dodaj 1 ml etanolu do 1 mg hydrokortyzonu i zamieszaj do rozpuszczenia. Dodać 19 ml DMEM, wymieszać roztwór, porcję i przechowywać w temperaturze -20 °C. Wykazano, że dodanie hydrokortyzonu do pożywki podstawowej zwiększa przeżywalność komórek glejowych14.
  6. Przygotuj roztwór podstawowy d-biotyny (5 000x): Rozpuść 2,5 mg d-biotyny w 50 ml PBS. Dodaj 1-2 x 5 μl kropli 0,1 N NaOH, aby pomóc w rozpuszczeniu. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  7. Przygotuj podstawowy roztwór insuliny (100x): Rozpuść 25 mg insuliny w 50 ml wody o czystości do hodowli tkankowej. Dodać 250 μl 1 N HCl i mieszać, aż roztwór będzie klarowny. Sterylizować filtrem 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 tygodni.
  8. Przygotuj roztwór podstawowy Sato (100x):
    1. Przygotować roztwór podstawowy progesteronu (25 μg/μl): Rozpuścić 2,5 mg progesteronu w 100 μl etanolu.
    2. Przygotować roztwór podstawowy seleninu sodu (400 ng/μl): Rozpuścić 4 mg seleninu sodu w 100 μl 0,1 N NaOH. Dodaj 10 ml DMEM i wymieszaj.
    3. Do 100 ml DMEM dodać 1 g ludzkiej apo-transferyny, 1 g albuminy surowicy bydlęcej i 160 mg putrescyny i wymieszać do całkowitego rozpuszczenia. Dodać 25 μl roztworu podstawowego progesteronu, 1 000 μl roztworu podstawowego seleninu sodu i wymieszać. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  9. Przygotuj pożywkę bazową OPC: na 100 ml DMEM (z 4,5 g/l D-glukozy, L-glutaminą i 110 mg/l pirogronianu sodu), dodać 100 μl NAC, 100 μl hydrokortyzonu, 20 μl d-biotyny, 1 ml insuliny, 1 ml bulionu Sato, 100 μl pierwiastków śladowych B, 2 ml suplementu B-27 (50x) i 1 ml penicyliny/streptomycyny (100x). Sterylizować filtrem 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  10. Przygotować roztwór podstawowy PDGF-AA (1 000x): Rozpuścić 250 μg w 12,5 ml PBS z 0,1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA), aby uzyskać roztwór o stężeniu 20 μg/ml. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  11. Przygotowanie pożywki proliferacyjnej OPC: Pożywki bazowe OPC uzupełnione o 20 ng/ml PDGF-AA.
  12. Przygotuj pożywkę różnicującą OPC: pożywkę bazową OPC uzupełnioną trójjodotyroniną o długości 45 nM.
  13. Przygotować bufor kolumnowy: Do 500 ml PBS dodać 2,5 g BSA i 2 ml 0,5 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i dostosować pH do 7,2. Sterylizować filtrem 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Sekcja mózgu szczura

Uwaga: W tym protokole używane są szczenięta szczurów P5-P7. Każda kora szczeniąt szczura daje około 1,5-2,0 x 106 komórek A2B5 dodatnich.

  1. Wysterylizuj cały sprzęt do preparacji za pomocą podgrzewanego sterylizatora perełkowego o temperaturze 250 °C.
  2. Dodać 15-20 ml PBS (bez Ca2+ i Mg2+) do 50 ml stożkowych probówek. Jedna stożkowa probówka o pojemności 50 ml wystarcza na 3-4 korowe młode szczury. Umieść 50 ml stożkowych probówek na lodzie. Użyj stożkowych probówek o pojemności 50 ml, aby przytrzymać pokrojoną w kostkę tkankę kory podczas sekcji.
  3. Dodaj zimny PBS do 10 cm szalki Petriego. To naczynie będzie używane do sekcji pod mikroskopem świetlnym.
  4. Składaj w ofierze szczenięta szczurów przez ścięcie dużych nożyczek chirurgicznych. Głowica natryskowa z 70% etanolem.
  5. Wydobądź cały mózg
    1. Za pomocą małych nożyczek przetnij skórę wzdłuż linii środkowej i za uszami i oderwij płaty skóry z powrotem. Przetnij czaszkę wzdłuż linii środkowej, zaczynając od pnia mózgu, a kończąc na oczach. Uważaj, aby nie ciąć zbyt głęboko, aby zachować strukturę leżącej pod spodem kory.
    2. Wykonaj dwa boczne nacięcia poniżej móżdżku, wkładając małe nożyczki chirurgiczne do otworu wielkiego. Wykonaj dodatkowe nacięcie między oczami, przed opuszkami węchowymi.
    3. Ostrożnie oderwij każdą połówkę czaszki z powrotem. Usuń cały mózg i umieść go na 10 cm szalce Petriego wypełnionej zimnym PBS.
  6. Pod mikroskopem świetlnym preparacyjnym usuń opuszki węchowe i móżdżek za pomocą cienkich kleszczy chirurgicznych.
  7. Odwróć mózg tak, aby powierzchnia brzuszna była widoczna pod mikroskopem świetlnym.
  8. Za pomocą cienkich, prostych kleszczy wykonaj rozwarstwienie, umieszczając zamknięte końcówki kleszczy między korą a podwzgórzem na głębokość około 2/3 mózgu. Po umieszczeniu kleszczyków pozwól ich otworzyć. Powtórz dla drugiej półkuli.
  9. Drażnij korę z okolic podwzgórza i śródmózgowia.
  10. Usuń podwzgórze, wzgórze i śródmózgowie, przytrzymując śródmózgowie na jego tylnej powierzchni i złuszczając je w kierunku przedniego końca mózgu. Przeciąć połączenia przednie.
  11. Usuń hipokamp, wypłukując go na zewnątrz, a następnie przecinając jego połączenie z korą za pomocą drobno zgiętych kleszczy preparacyjnych.
  12. Usuń pozostałe prążkowie, zeskrobując je z leżącej poniżej kory w ruchu ukośnym na zewnątrz za pomocą drobno zgiętych kleszczy preparacyjnych.
  13. Oczyść wszelkie naczynia krwionośne i opony mózgowe z brzusznej powierzchni kory.
  14. Odwróć mózg tak, aby widoczna była powierzchnia grzbietowa. Opony mózgowe i naczynia krwionośne powinny być widoczne. Oderwij opony mózgowe od leżącej poniżej kory za pomocą drobnych kleszczy preparacyjnych. Rozpocznij peeling od miejsca przyczepu opuszki węchowej.
  15. Wykonaj kroki 2.4-2.14, aby uzyskać w sumie 3-4 szczurze szczenięta.
  16. Umieść 3-4 wypreparowane korki szczeniąt szczura na suchej szalce Petriego i posiekaj wysterylizowaną żyletką, aż uzyskasz kawałki o wymiarach 1 mm x 1 mm. Zebrać tkankę, płucząc naczynie PBS z jednej stożkowej probówki o pojemności 50 ml (krok 2), a następnie umieścić z powrotem na lodzie.

3. Enzymatyczna i mechaniczna dysocjacja tkanek

Uwaga: Na tym etapie zalecany jest zestaw do dysocjacji neuronalnej na bazie papainy. Za pomocą zestawu do dysocjacji neuronalnej (P) opisano specjalne kroki, które są optymalne dla izolacji OPC.

  1. Przygotować pierwszy enzym dysocjacyjny, rozcieńczając enzym P odpowiednim buforem. Zawartość każdych 50 ml stożkowego (1 próbka) zostanie ponownie zawieszona w całkowitej ilości 1 950 μl mieszaniny enzymów. Umieścić w mieszaninie enzymów w kąpieli o temperaturze 37 °C przez 10 min.
    1 próbka: 1 900 μl buforu + 50 μl enzymu papainy
  2. Wirować wszystkie stożkowe probówki o pojemności 50 ml zawierające 3-4 pokrojone w kostkę korowe szczeniąt szczura przy 300 x g przez 3 minuty.
  3. Odessać supernatant i dodać 1,950 μl roztworu enzymu do każdej probówki z próbką i rozbić osad, odwracając probówkę i delikatnie wstrząsając.
  4. Inkubować w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C przez 15 minut, obracając rurkę w sposób ciągły.
  5. W ciągu ostatnich 5 minut inkubacji należy przygotować drugą mieszaninę enzymów A. Rozcieńczyć enzym w odpowiednim buforze. Do każdej stożkowej probówki z próbką o pojemności 50 ml dodaje się łącznie 30 μl.
    1 próbka: 20 μl buforu + 10 μl enzymu
  6. Po zakończeniu inkubacji dodać 30 μl drugiej mieszanki enzymów do każdej probówki i odwrócić do mieszania.
  7. Za pomocą szklanej pipety Pasteura podłączonej do kontrolera pipet należy mechanicznie rozdzielić tkankę, pipetując 10-15 razy lub do momentu, gdy kawałki tkanki zmniejszą swoją objętość, a roztwór stanie się mętny. Umieścić próbkę z powrotem w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C na 15 minut z ciągłą rotacją.
  8. Odpipetować każdą próbkę tkanki homogenizować 10-15 razy za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
  9. Odpipetować każdą próbkę jednorodnej tkanki 15-20 razy za pomocą pipety o pojemności 200 μl
  10. Umieścić wszystkie próbki z powrotem w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C na 10 minut z ciągłą rotacją.
  11. Dodać 10 ml PBS (z Ca2+ i Mg2+) do każdej próbki i przefiltrować homogenat przez filtr porowy 40 μm umieszczony nad probówką o pojemności 50 ml. Przepłucz filtr dodatkowymi 1-2 ml PBS.
  12. Zebrać wszystkie próbki homogenatu w jednej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i uzyskać całkowitą liczbę komórek.
  13. Po zliczeniu komórek należy równomiernie podzielić homogenat na stożkowe probówki o pojemności 15 ml (1 probówka na każdą próbkę). Wirować przez 10-12 minut przy 300 x g.

4. Aplikacja ściegu anty-A2B5, oczyszczanie kolumn i powlekanie

  1. Wykonaj obliczenia dla bufora kolumny i mikrokulek anty-A2B5. Dodaj 7 μl bufora kolumnowego na każde 1 x 106 komórek. Dodaj 2 μl mikrogranulek anty-A2B5 na każde 1 x 106 komórek.
  2. Połączyć wszystkie próbki, ponownie zawieszając komórki w całkowitej objętości 10 ml buforu kolumnowego i odwirować przy 300 x g przez 10-12 minut.
  3. Ponownie zawiesić osad komórek w odpowiedniej ilości bufora kolumny, jak obliczono w kroku 4.1. Jeśli osad jest duży i luźny, należy dodać tylko około połowy objętości buforu kolumny, aby utrzymać przeciwciało w odpowiednim stężeniu w reuspensji komórki.
  4. Inkubować zawiesinę komórkową przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Dodać mikrogranulki anty-A2B5 (obliczone w kroku 4.1), kilkakrotnie odwrócić i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30-60 minut. Delikatnie odwrócić probówkę kilka razy co 10 minut. Dłuższy czas inkubacji może zwiększyć wydajność komórek, ale może zwiększyć niespecyficzne wiązanie.
  6. Dodaj 5 woluminów bufora kolumn. Jeśli komórki są ponownie zawieszone w objętości 1 ml, dodać 5 ml buforu kolumnowego, natomiast jeśli komórki są ponownie zawieszone w 2 ml, dodać 10 ml buforu kolumnowego.
  7. Wirować przez 10 minut przy 300 x g.
  8. Określ, ile kolumn LS będzie potrzebnych do oczyszczenia. Jedna kolumna LS wystarcza na 15-20 x 10łącznie 6 komórek.
  9. Ponownie zawiesić osad komórek w 1,000 μl bufora kolumny na każdą używaną kolumnę LS.
  10. Zalać każdą kolumnę LS, dodając 5 ml buforu kolumny. Zebrać przepływ w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Gdy bufor kolumny całkowicie przejdzie przez górną komorę, nanieść 1 000 μl zawiesiny komórek na każdą kolumnę i pozwolić komórkom przejść grawitacyjnie.
    Uwaga: Jeśli gęstość komórek jest zbyt duża, kolumna może działać wolno.
  11. Natychmiast po przejściu zawiesiny komórek przez kolumnę, powoli dodawać 3 ml buforu kolumnowego do każdej kolumny, aby przemyć niezwiązane komórki. Jeśli płukanie łatwo przepływa przez kolumnę (1 kropla na każde 30-45 sekund), przemyj dwa razy dodatkowe 3 ml buforu kolumny.
  12. Wyjmij każdą kolumnę i umieść ją w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Dodać 5 ml buforu kolumny i szybko zanurzyć bufor w kolumnie za pomocą plastikowego tłoka dołączonego do kolumny. Zanurzanie spowoduje przemieszczenie związanych komórek, uwalniając je z kolumny.
  13. Zwiększyć czystość, przepuszczając próbkę przez drugą rundę kolumn LS. Użyj jednej trzeciej liczby kolumn używanych podczas pierwszego przejścia. Zalać kolumny 5 ml buforu kolumnowego. Pozwól, aby bufor kolumny przeszedł przez górną komorę.
  14. Ponieważ objętość zawiesiny komórek będzie znacznie większa, równomiernie nałóż 1 000 μl zawiesiny komórek na każdą kolumnę i pozwól zawiesinie przejść przez górną komorę kolumny przed uzupełnieniem o dodatkowe 1 000 μl.
  15. Po całkowitym nałożeniu zawiesiny komórek na drugą rundę kolumn, przemyć 2-3 razy 3 ml buforu kolumnowego.
  16. Wyjmij każdą kolumnę i umieść ją na sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Dodać 5 ml buforu kolumnowego i zanurzyć bufor za pomocą plastikowego tłoka dołączonego do kolumny. Zanurzanie spowoduje przemieszczenie związanych komórek, uwalniając je z kolumny.
  17. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez 12-15 min. Pellet powinien wydawać się zwarty.
  18. Zawiesić osad komórkowy w 5-10 ml wstępnie podgrzanej pożywki proliferacyjnej OPC (pożywka bazowa OPC uzupełniona PDGF-AA 20 ng/ml).
  19. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
  20. Ułóż komórki na płytce. Rozcieńczyć komórki do 60 000 komórek/ml za pomocą pożywki do proliferacji OPC. Do każdej czarnej, przezroczystej studzienki z dnem należy wlać 500 μl komórek wzdłuż boku studzienki, aby uzyskać 30 000 komórek na studzienkę. Wymieszaj komórki, potrząsając płytką poziomo, wykonując ruch ósemki. Jeśli wykonujesz test na płytkach 48-, 96- lub 384-dołkowych, dodaj odpowiednio 15 000, 7 500 lub 1 500 komórek na dołek. Liczby te mogą być dostosowywane w zależności od specyfikacji poszczególnych płyt.
  21. Przygotuj oddzielną płytkę dla podstawowych kultur kontrolnych dnia 0. Tę płytkę kontrolną należy utrwalić 4% paraformaldehydem, jak opisano w sekcji 5.7, gdy różnicowanie rozpoczyna się w dniu 0.
  22. Hodować komórki w pożywce proliferacyjnej OPC w temperaturze 37 °C przez 3 dni bez zmiany pożywki.

5. Indukcja różnicowania i utrwalania OPC za pomocą 4% paraformaldehydu

Uwaga: Podczas testowania wpływu małych cząsteczek na oligodendrogenezę, rutynowo rozpuszczamy leki w dimetylosulfotlenku (DMSO), aby przygotować 1000 razy więcej zapasów, które można następnie przechowywać w temperaturze -80 °C i rozcieńczać bezpośrednio na podłożach SATO, aby uzyskać końcowe stężenie 0,1% DMSO. Nie zaobserwowaliśmy żadnych zmian ani w proliferacji, ani w różnicowaniu OPC przy użyciu tego stężenia DMSO (dane nie pokazane).

  1. Podgrzej wstępnie podłoże bazowe OPC do 37 °C i rozmroź zapasy do leczenia leków do temperatury pokojowej. Wykonując zabiegi dwukrotnie, należy przygotować około 1,25 ml pożywki na grupę zabiegową w probówce o pojemności 1,5 ml. W przypadku próbek trzykrotnych należy użyć probówek wirówkowych o pojemności 2 ml w celu uwzględnienia luzu.
  2. Przygotować główne mieszanki do uzdatniania do powtórzenia studzienek, rozcieńczając zapasy uzdatniania bezpośrednio w pożywkach bazowych OPC. Krótko zmieszaj lub delikatnie wymieszaj każdą mieszankę główną, aby zapewnić jednorodne rozprowadzenie zabiegu.
  3. Przygotować 45 nM trójjodotyroniny (T3) jako kontrolę dodatnią i odpowiedni nośnik jako kontrolę ujemną. Rozcieńczyć 10 mM T3 zapas w stosunku 1:1 000 w 1 ml pożywki bazowej OPC, a następnie rozcieńczyć w głównej mieszance zabiegowej, aby w razie potrzeby zmniejszyć końcowe stężenie DMSO.
  4. Odsysać pożywkę z dołków hodowlanych po jednej grupie poddawanej działaniu substancji na raz, aby uniknąć wysuszenia komórek. Użyj końcówki pipety o pojemności 200 μl na końcu szklanej pipety Pasteura, aby uniknąć zeskrobywania czarnego materiału z boków studzienki do kultury.
  5. Powoli dodać 500 μl mieszanki głównej do zabiegu wzdłuż boku studzienki za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
  6. Inkubuj kultury przez pożądany czas, wykonując pełną wymianę pożywki ze świeżymi pożywkami zabiegowymi co 2-3 dni. Rutynowo obserwujemy 30-40% posiewu MBP+ po 4 dniach w pożywkach różnicujących.
  7. Pod koniec pożądanego okresu leczenia przygotuj świeży 4% paraformaldehyd (PFA) lub rozmroź zamrożony bulion do temperatury pokojowej. UWAGA: PFA jest wyjątkowo toksyczny i musi być przygotowany w dygestorium.
  8. Odessać pożywkę i powoli dodawać 400 μl PFA z boku studzienki, aby utrwalić komórki. Inkubować płytkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Odessać PFA i powoli dodać 500 μl sterylnego D-PBS (z Ca2+ i Mg2+) na bok studzienki, aby przepłukać komórki. Powtórz pranie w sumie jeszcze dwa razy. Nie zasysaj końcowego prania.
  10. Owinąć płytkę w parafolię i przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszej obróbki lub przejść bezpośrednio do następnego etapu. Talerze można przechowywać przez kilka tygodni.

6. Immunocytochemia i kwantyfikacja podstawowego białka mieliny

Uwaga: Podczas wykonywania procedur obchodzenia się z cieczą na płytkach 24-dołkowych zaleca się szybką pracę, aby uniknąć wysuszenia komórek. W tym przypadku zaleca się stosowanie wielokanałowego aspiratora próżniowego i pipety wielokanałowej.

  1. Doprowadź płytkę do temperatury pokojowej, odessaj studzienki i dodaj 250 μl D-PBS (z Ca2+ i Mg2+) zawierającego 0,1% Triton X-100 i 5% normalnej surowicy koziej (NGS). Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, delikatnie wstrząsając orbitalnie.
  2. Przygotować podstawowy roztwór do inkubacji, rozcieńczając mysie przeciwciało monoklonalne anty-MBP 1:1,000 i królicze poliklonalne przeciwciało anty-aktynowe 1:200 w D-PBS (z Ca2+ i Mg2+) zawierającym 5% NGS. Alternatywnie, poliklonalny anty-Olig2 królika w stosunku 1:1,000 może być stosowany do normalizacji specyficznej dla oligodendrocytów w mieszanych kulturach glejowych. Przygotuj wystarczającą ilość roztworu pierwotnego, aby pomieścić 250 μl na studzienkę.
  3. Inkubować przeciwciała pierwszorzędowe w temperaturze 4 °C przez noc przez 16-18 godzin, delikatnie wstrząsając orbitalnie.
  4. Odessać roztwór do inkubacji pierwotnej i przemyć komórki 3 x 10 min 500 μl D-PBS (z Ca2+ i Mg2+) w temperaturze pokojowej z delikatnym wytrząsaniem orbitalnym.
  5. Podczas mycia płytki należy przygotować wtórny roztwór inkubacyjny, rozcieńczając przeciwciała anty-mysie 680 i anty-królicze 800 w stosunku 1:500 w D-PBS (zCa2+ iMg2+) zawierającym 5% NGS. Przygotowując ten roztwór, zminimalizuj ekspozycję na światło otoczenia.
  6. Odessać ostatnie płukanie i dodać 250 μl wtórnego roztworu do inkubacji. Chronić płytkę przed światłem i inkubować ją w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z delikatnym potrząsaniem orbitalnym
    7. .
  7. Zassać wtórny roztwór inkubacyjny i przemyć studzienki 3 x 10 min 500 μl D-PBS (z Ca2+ i Mg2+) w temperaturze pokojowej z delikatnym wytrząsaniem orbitalnym
    8. .
  8. Zeskanuj płytkę za pomocą systemu obrazowania zdolnego do wykrywania emisji fluorescencji 700 nm i 800 nm. Jako punkt wyjścia ustaw przesunięcie ogniskowej na 3 i czułość na 1,5 dla MBP, 5,0 dla aktyny i 3,5 dla Olig2. Dostosuj wartości czułości zgodnie z potrzebami, aby uniknąć prześwietlenia sygnału.
  9. Określ ilościowo zakres oligodendrogenezy za pomocą półautomatycznych metod opartych na oprogramowaniu.
    1. Za pomocą oprogramowania ustaw tryb analizy płyt na "24 odwierty" i wyrównaj okręgi wokół zewnętrznego obwodu zeskanowanych studni. Ustaw kanał normalizacji na "800" i wyeksportuj całkowitą i względną intensywność fluorescencji dla kanałów 700 nm (MBP) i 800 nm (Olig2/Actin).
    2. Podzielić intensywność przy 700 nm przez intensywność przy 800 nm, aby uzyskać znormalizowaną ekspresję MBP we względnych jednostkach fluorescencji. Obliczyć średnią z powtórzonych pomiarów i przeskalować wyrażenie do kontrolek dnia 0 +PDGF zgodnie z potrzebami analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A2B5-dodatnie OPC są izolowane poprzez pozytywną selekcję komórek za pomocą systemu separacji kolumn magnetycznych. Przed procedurą izolacji cały mózg jest usuwany ze szczeniąt szczurów, które znajdują się między P5 a P7. Po pomyślnym odłączeniu całego mózgu od czaszki, opuszki węchowe i móżdżek są usuwane za pomocą cienkich kleszczy chirurgicznych (ryc. 1A). W celu wyizolowania tkanki kory mózgowej podwzgórze, wzgórze i śródmózgowie są wycinane przez staranną sekcję (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół opisuje szybką i niezawodną metodę izolowania OPC u szczurów i ilościowego określania oligodendrogenezy in vitro w odpowiedzi na czynniki eksperymentalne. Stosując selekcję pozytywną, wysokie plony żywotnych i czystych OPC są wykorzystywane bezpośrednio do celów eksperymentalnych. Metoda ta usprawnia etapy izolacji, hodowli i różnicowania w ciągu 1 tygodnia, a utrwalone komórki można wygodnie przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni bez utraty czułości testu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sponsor grantu: National Institutes of Health; Numer grantu: R37 NS041435.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały preparacyjne
PBS bez Ca2+ i Mg2+Mediatech21-040-CV1x
10 cm Polistyrenowe szalki PetriegoFisherbrand0857512
Lekki mikroskop preparacyjnyMoticSM2-168
Disocjacja Materiały< / strong>
Tube RotatorMiltenyi Biotec130-090-753rurki dysocjacyjnej
dysocjacji tkanek nerwowych (P)Miltenyi Biotec130-092-628Zestaw do dysocjacji enzymatycznej
PBS z Ca2+ i Mg2+Corning20-030-CV1x
40 μ m Sitko komórkoweCorning352340
A2B5 Oczyszczanie kolumny 
Anty-A2B5 MikrogranulkiMiltenyi Biotec130-097-864z przeciwciałem A2B5 wiązane przez koraliki
Miltenyi Biotec130-042-401Magnetyczne kolumny selekcyjne
EDTACorning46-034-Cl2 mM
PBS z Ca2+ i Mg2+Corning20-030-CV1x
Albumina surowicy bydlęcej Sigma-AldrichA96470,50%
Materiały hodowlane
PDGF-AAPeproTech Inc100-13A20 ng/ml
DimetylosulfotlenekSigma-AldrichD2650Hybri-Max 100 ml
Trijodotyronina Sigma-AldrichT639745 nM
Sól fumaranu klemastynySigma-AldrichSML0445-100MG1 μ M
Sól hemifumaranu kwetiapinySigma-AldrichQ3638-10MG1 μ M
N-acetylocysteinaSigma-AldrichA91655 μ g/ml
ProgesteronSigma-AldrichP878360 ng/ml
Poli-L-lizynaSigma-AldrichP152410 μ g/ml
PutrecineSigma-AldrichP750516 μ g/ml
Selenin soduSigma-AldrichS526140 ng/ml
HydrokortyzonSigma-AldrichH013550 ng/ml
d-BiotynaSigma-AldrichB463910 ng/ml
InsulinaSigma-AldrichI66345 μ g/ml
Apo-TransferrinSigma-AldrichT1147100 μ g/ml
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA4161100 μ g/ml
Pierwiastki śladowe BCorning25-022-Cl1x 
B-27 SuplementTechnologie Życia175040441x 
Penicylina/StreptomycynaTechnologie Życia151401221x 
DMEMLife Technologies11995-0651x 
24-dołkowa płytka wizycyjna z pokrywkąPerkin Elmer1450-605Klasa hodowli tkankowej
Immunocytochemia i oznaczanie ilościowe
PFASigma-Aldrich100-13A4%
Triton X-100Sigma-Aldrich787870,10%
Normalna surowica koziaJackson Immuno Research005-000-1215 proc.
mysz monoklonalna anty-MBPBiolegendSMI-99P1:1,000 Rozcieńczenie
poliklonalnego królika anty-aktynySanta Cruz BiotecnologySC-72101:200 Rozcieńczenie
królika poliklonalnego anty-Olig2MilliporeAB96101:1,000 Rozcieńczenie
kozła anty-myszy 680RDLicor926-680701:500 Rozcieńczenie
kozioł anty-królik 800CWLicor926-322111:500 Rozcieńczenie
Alexa Fluor 594 kozie anty-mysietechnologie LifeA110321:1,000 rozcieńczenie
Alexa Fluor 488 kozie anty-królikiLife TechnologiesA110081:1,000 rozcieńczenie
Prolong Gold anti-fade z DAPILife TechnologiesP36931
DPBS z Ca2+ i Mg2+Corning21-030-CV
System obrazowania na podczerwień Licor Odyssey Clx Licor
Zestaw do dysocjacji Zestaw do Kolumny LS

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rowitch, D. H., Kriegstein, A. R. Developmental genetics of vertebrate glial-cell specification. Nature. 468 (7321), 214-222 (2010).
  2. Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nat Rev Neurosci. 11 (4), 275-283 (2010).
  3. Dawson, M. R. L., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS. Mol Cell Neurosci. 24 (2), 476-488 (2003).
  4. Goldschmidt, T., Antel, J., König, F. B., Brück, W., Kuhlmann, T. Remyelination capacity of the MS brain decreases with disease chronicity. Neurology. 72 (22), 1914-1921 (2009).
  5. Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F., Schultz, R. D. Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6832-6836 (2009).
  6. Nishiyama, A., Chang, A., Trapp, B. D. NG2+ glial cells: a novel glial cell population in the adult brain. J Neuropath Exp Neur. 58 (11), 1113-1124 (1999).
  7. Baracskay, K. L., Kidd, G. J., Miller, R. H., Trapp, B. D. NG2-positive cells generate A2B5-positive oligodendrocyte precursor cells. Glia. 55 (10), 1001-1010 (2007).
  8. Ffrench-Constant, C., Raff, M. C. Proliferating bipotential glial progenitor cells in adult rat optic nerve. Nature. 319 (6053), 499-502 (1986).
  9. Popko, B., et al. Myelin deficient mice: expression of myelin basic protein and generation of mice with varying levels of myelin. Cell. 48 (4), 713-721 (1987).
  10. Bourre, J. M., et al. Density profile and basic protein measurements in the myelin range of particulate material from normal developing mouse brain and from neurological mutants (Jimpy; quaking; Trembler; shiverer and its mld allele) obtained by zonal centrifugation. J Neurochem. 35 (2), 458-464 (1980).
  11. Baxi, E. G., et al. A selective thyroid hormone β receptor agonist enhances human and rodent oligodendrocyte differentiation. Glia. 62 (9), 1513-1529 (2014).
  12. Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
  13. Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat Protoc. 2 (5), 1044-1051 (2007).
  14. Warringa, R. A., et al. Hydrocortisone stimulates the development of oligodendrocytes in primary glial cultures and affects glucose metabolism and lipid synthesis in these cultures. Brain Res. 431 (1), 79-86 (1987).
  15. Tosic, M., Torch, S., Comte, V., Dolivo, M., Honegger, P., Matthieu, J. M. Triiodothyronine has diverse and multiple stimulating effects on expression of the major myelin protein genes. J Neurochem. 59 (5), 1770-1777 (1992).
  16. Xiao, L., et al. Quetiapine facilitates oligodendrocyte development and prevents mice from myelin breakdown and behavioral changes. Mol Psychiatry. 13 (7), 697-708 (2008).
  17. Mei, F., et al. Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nat Med. 20 (8), 954-960 (2014).
  18. Deshmukh, V. A., et al. A regenerative approach to the treatment of multiple sclerosis. Nature. 502 (7471), 327-332 (2013).
  19. Najm, F. J., et al. Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo. Nature. 522 (7555), 216-220 (2015).
  20. Zhang, S. C. Defining glial cells during CNS development. Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).
  21. O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. Derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues. J Vis Exp. (54), (2011).
  22. Dugas, J. C., Emery, B. Purification of oligodendrocyte precursor cells from rat cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 745-758 (2013).
  23. Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. G. T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Clin Exp Immunol. 162 (1), 1-11 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

kom rki progenitorowe oligodendrocyt wkwantyfikacja oligodendrogenezysekcja kory m zgu szczuramagnetyczna aktywacyjna sortownia kom rekdetekcja podstawowego bia ka mielinyimmunocytochemia Olig2r nicowanie hodowli kom rkowychtraktowanie czynnikami eksperymentalnymianaliza obrazowania fluorescencyjnego

Powiązane artykuły