Oligodendrocyty to komórki mielinizujące ośrodkowego układu nerwowego. Protokół ten opisuje metodę izolacji i hodowli ich prekursorów, komórek progenitorowych oligodendrocytów, z kory szczura, a także szybką i wiarygodną metodę ilościową oceny oligodendrogenezy in vitro w odpowiedzi na czynniki eksperymentalne.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie hodowli progenitorowych oligodendrocytów szczurów i kwantyfikacja oligodendrogenezy za pomocą skanowania fluorescencyjnego w podwójnej podczerwieni
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Skuteczna oligodendrogeneza jest celem terapeutycznym wielu obszarów badań, w tym urazów rdzenia kręgowego, niedotlenienia noworodków i chorób demielinizacyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane i poprzeczne zapalenie rdzenia kręgowego. Mielinizacja jest wymagana, aby nie tylko ułatwić szybką propagację impulsów w ośrodkowym układzie nerwowym, ale także zapewnić wsparcie troficzne dla leżących poniżej aksonów. Komórki progenitorowe oligodendrocytów (OPC) można badać in vitro, aby pomóc w identyfikacji czynników, które mogą promować lub hamować różnicowanie oligodendrocytów. Do tej pory wiele dostępnych metod oceny tego procesu wymagało albo dużej liczby komórek, co ograniczało liczbę warunków, które można badać w dowolnym momencie, albo pracochłonnych metod kwantyfikacji. W niniejszym artykule opisano protokół izolacji dużej liczby wysoce czystych OPC wraz z szybką i niezawodną metodą określania oligodendrogenezy z wielu warunków jednocześnie. OPC są izolowane z kory noworodków szczurów P5-P7 i hodowane in vitro przez trzy dni przed różnicowaniem. Cztery dni po różnicowaniu oligodendrogenezę ocenia się za pomocą testu skanowania fluorescencji w podwójnej podczerwieni w celu określenia ekspresji białka mieliny.
Wprowadzenie
Efektywne przewodnictwo nerwowe w ośrodkowym układzie nerwowym (CNS) u ssaków wymaga mielinizacji aksonów przez oligodendrocyty. Podczas rozwoju oligodendrocyty powstają z puli komórek progenitorowych oligodendrocytów (OPC), które, jak się uważa, migrują ze stref komorowych rozwijającego się przodomózgowia i cewy nerwowej1. Po migracji OPC różnicują się w dojrzałe, mielinizujące oligodendrocyty, które nie tylko ułatwiają efektywną propagację impulsów, ale także zapewniają aksonom wsparcie troficzne2. Dorosły OUN utrzymuje obfitą populację OPC, które są rozproszone w istocie szarej i białej, stanowiąc około 5-8% wszystkich komórek3. Po ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) oraz Johns Hopkins School of Medicine.
1. Przygotowanie płytek testowych, roztworów podstawowych i pożywek bazowych OPC
Uwaga: Opisana tutaj pożywka dla szczurzej zasady OPC (Sato) pochodzi z wcześniej opublikowanych badań12,13. Alternatywne preparaty pożywek mogą być również zgodne z tą procedurą.
- Zawiesić poli-L-lizynę (PLL) do stężenia 10 μg/ml w sterylnej wodzie dejonizowanej. Odpipetować 400 μl rozcieńczonego PLL do każdego dołka czarnościennego, przezroczystego naczynia do hodowli tkankowych z 24 dołkami.
- Nac....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
OPC dodatnie pod kątem A2B5 są izolowane poprzez pozytywną selekcję komórek przy użyciu systemu separacji kolumnowej z magnesami. Przed procedurą izolacji cały mózg zostaje usunięty z młodych szczurów w wieku od P5 do P7. Po pomyślnym oddzieleniu całego mózgu od czaszki, cebulki węchowe oraz móżdżek są usuwane za pomocą precyzyjnych pęset chirurgicznych (Ryc. 1A). W celu wyizolowania tkanki kory mózgowej, podwzgórze, wzgórze oraz śródmózgie są wycinane poprzez ostrożną dy.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiony tutaj protokół opisuje szybką i niezawodną metodę izolowania OPC u szczurów i ilościowego określania oligodendrogenezy in vitro w odpowiedzi na czynniki eksperymentalne. Stosując selekcję pozytywną, wysokie plony żywotnych i czystych OPC są wykorzystywane bezpośrednio do celów eksperymentalnych. Metoda ta usprawnia etapy izolacji, hodowli i różnicowania w ciągu 1 tygodnia, a utrwalone komórki można wygodnie przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni bez utraty czułości testu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Sponsor grantu: National Institutes of Health; Numer grantu: R37 NS041435.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Materiały preparacyjne | |||
| PBS bez Ca2+ i Mg2+ | Mediatech | 21-040-CV | 1x |
| 10 cm Polistyrenowe szalki Petriego | Fisherbrand | 0857512 | |
| Lekki mikroskop preparacyjny | Motic | SM2-168 | |
| Disocjacja Materiały< / strong> | |||
| Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | rurki dysocjacyjnej |
| dysocjacji tkanek nerwowych (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Zestaw do dysocjacji enzymatycznej |
| PBS z Ca2+ i Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1x |
| 40 μ m Sitko komórkowe | Corning | 352340 | |
| A2B5 Oczyszczanie kolumny | |||
| Anty-A2B5 Mikrogranulki | Miltenyi Biotec | 130-097-864 | z przeciwciałem A2B5 wiązane przez koraliki |
| Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Magnetyczne kolumny selekcyjne | |
| EDTA | Corning | 46-034-Cl | 2 mM |
| PBS z Ca2+ i Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1x |
| Albumina surowicy bydlęcej | Sigma-Aldrich | A9647 | 0,50% |
| Materiały hodowlane | |||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 20 ng/ml |
| Dimetylosulfotlenek | Sigma-Aldrich | D2650 | Hybri-Max 100 ml |
| Trijodotyronina | Sigma-Aldrich | T6397 | 45 nM |
| Sól fumaranu klemastyny | Sigma-Aldrich | SML0445-100MG | 1 μ M |
| Sól hemifumaranu kwetiapiny | Sigma-Aldrich | Q3638-10MG | 1 μ M |
| N-acetylocysteina | Sigma-Aldrich | A9165 | 5 μ g/ml |
| Progesteron | Sigma-Aldrich | P8783 | 60 ng/ml |
| Poli-L-lizyna | Sigma-Aldrich | P1524 | 10 μ g/ml |
| Putrecine | Sigma-Aldrich | P7505 | 16 μ g/ml |
| Selenin sodu | Sigma-Aldrich | S5261 | 40 ng/ml |
| Hydrokortyzon | Sigma-Aldrich | H0135 | 50 ng/ml |
| d-Biotyna | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 ng/ml |
| Insulina | Sigma-Aldrich | I6634 | 5 μ g/ml |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1147 | 100 μ g/ml |
| Albumina surowicy bydlęcej | Sigma-Aldrich | A4161 | 100 μ g/ml |
| Pierwiastki śladowe B | Corning | 25-022-Cl | 1x |
| B-27 Suplement | Technologie Życia | 17504044 | 1x |
| Penicylina/Streptomycyna | Technologie Życia | 15140122 | 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | 1x |
| 24-dołkowa płytka wizycyjna z pokrywką | Perkin Elmer | 1450-605 | Klasa hodowli tkankowej |
| Immunocytochemia i oznaczanie ilościowe | |||
| PFA | Sigma-Aldrich | 100-13A | 4% |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 78787 | 0,10% |
| Normalna surowica kozia | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | 5 proc. |
| mysz monoklonalna anty-MBP | Biolegend | SMI-99P | 1:1,000 Rozcieńczenie |
| poliklonalnego królika anty-aktyny | Santa Cruz Biotecnology | SC-7210 | 1:200 Rozcieńczenie |
| królika poliklonalnego anty-Olig2 | Millipore | AB9610 | 1:1,000 Rozcieńczenie |
| kozła anty-myszy 680RD | Licor | 926-68070 | 1:500 Rozcieńczenie |
| kozioł anty-królik 800CW | Licor | 926-32211 | 1:500 Rozcieńczenie |
| Alexa Fluor 594 kozie anty-mysie | technologie Life | A11032 | 1:1,000 rozcieńczenie |
| Alexa Fluor 488 kozie anty-króliki | Life Technologies | A11008 | 1:1,000 rozcieńczenie |
| Prolong Gold anti-fade z DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| DPBS z Ca2+ i Mg2+ | Corning | 21-030-CV | |
| System obrazowania na podczerwień Licor Odyssey Clx Licor |
Bibliografia
- Rowitch, D. H., Kriegstein, A. R. Developmental genetics of vertebrate glial-cell specification. Nature. 468 (7321), 214-222 (2010).
- Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nat Rev Neurosci. 11 (4), 275-283 (2010).
- Dawson, M. R. L., Polito, A., Le....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Tagi
kom rki progenitorowe oligodendrocyt wkwantyfikacja oligodendrogenezysekcja kory m zgu szczuramagnetyczna aktywacyjna sortownia kom rekdetekcja podstawowego bia ka mielinyimmunocytochemia Olig2r nicowanie hodowli kom rkowychtraktowanie czynnikami eksperymentalnymianaliza obrazowania fluorescencyjnego
