Wykorzystanie paska rozpuszczającego się w jamie ustnej do badań farmakologicznych i toksykologicznych: prosta i humanitarna alternatywa dla zgłębnika doustnego dla zwierząt

Podsumowanie

Poniższy protokół opisuje nowatorską metodę przewlekłego doustnego podawania leków przy użyciu paska rozpuszczającego się w jamie ustnej (ODS) zamiast częściej stosowanej metody doustnego zgłębnika. Wykazaliśmy, że przedkliniczne, doustne podawanie leków metodą ODS stanowi bezpieczną, wygodną i humanitarną alternatywę dla doustnego podawania przez zgłębnik.

Streszczenie

Przed testowaniem nowych terapii na ludziach, wymagane są krótko- i długoterminowe badania przedkliniczne (np. na zwierzętach), powtarzające się testy farmakologiczne i toksykologiczne. W większości przypadków preferowaną drogą podania jest dostawa doustna. W chwili obecnej poród doustny odbywa się głównie za pomocą procedury doustnego zgłębnika, częściowo dlatego, że można osiągnąć spójne i precyzyjne dawkowanie w modelu zwierzęcym. Chociaż ta metoda jest dobrze ugruntowana, wiąże się z komplikacjami, które mogą skutkować wysokim wskaźnikiem wyczerpania zwierząt. W tym celu przedstawiona tutaj procedura opisuje alternatywę dla metody doustnego zgłębnika, w której pożądany lek jest wprowadzany do smacznego, rozpuszczającego się w jamie ustnej paska (ODS), który można po prostu przedstawić zwierzęciu doświadczalnemu, gdzie jest następnie szybko wchłaniany przy minimalnej manipulacji badanym. W niniejszym artykule wykazujemy, że przedkliniczne, doustne podawanie leków metodą ODS stanowi bezpieczną, wygodną i humanitarną alternatywę dla podawania przez zgłębnik doustny.

Wprowadzenie

Aby pomyślnie przenieść lek z fazy przedklinicznej (testy na zwierzętach) do rozwoju klinicznego, należy przeprowadzić serię dobrze zdefiniowanych, ostrych i przewlekłych badań farmakologicznych i toksykologicznych na modelach zwierzęcych przy użyciu zamierzonej klinicznej drogi podania (która zwykle jest drogą doustną). Aby osiągnąć ten cel, większość badań przedklinicznych wykorzystuje obecnie procedurę doustnego zgłębnika, biorąc pod uwagę, że metoda ta skutkuje spójnym i precyzyjnym dostarczaniem badanego związku zwierzęciu. Jednak w wielu przypadkach zgłębnik oralny nie jest dobrze tolerowany przez zwierzę, a coraz więcej dowodów sugeruje, że metoda ta wiąże się ze znaczną indukcją stresu¹.

Jest to szczególnie prawdziwe w rozwoju metod leczenia przewlekłych chorób trwających całe życie, które wymagają długoterminowych badań przedklinicznych, jak to ma miejsce w przypadku prawie każdego zaburzenia neuropsychiatrycznego, ale nie tylko. Na przykład w transgenicznym mysim modelu choroby Alzheimera zasugerowano niedawno, że sama metoda gavage może zakłócić wyniki eksperymentalne z powodu stresu wywołanego dawkowaniem². Podobnie, w mysim modelu konsumpcji alkoholu, niepublikowane wyniki z naszego własnego laboratorium wykazały, że powtarzające się wkładanie rurki do zgłębnika - samo w sobie - może znacznie obniżyć poziom spożycia alkoholu do punktu, w którym zagraża integralności paradygmatu eksperymentalnego (patrz Rysunek 1).

Biorąc pod uwagę wyżej wymienione ograniczenia związane z procedurą doustnego podawania przez zgłębnik, włożono znaczne wysiłki w opracowanie nowych metod przedklinicznego doustnego dostarczania leków. Obecne alternatywne podejścia obejmują włączenie badanego związku do mieszanek masła orzechowego³, galaretowatych form^4-5, granulek czekolady⁶, wody pitnej⁷ i krakersów waflowych⁸, z których wszystkie są związane z różnym stopniem problemów, w tym niemożnością niezawodnego użycia w modelu zwierzęcym, brakiem przyjęcia badanego związku przez osobę badaną lub indywidualnymi preferencjami dotyczącymi smaku, które sprawiają, że lek jest mniej chętny do spożycia^{Rozdział 9}.

Procedura przedstawiona tutaj opisuje metodę, w której pożądany lek jest wprowadzany do aromatyzowanego, doustnie rozpuszczającego się paska (ODS), który może być łatwo i łatwo użyty do doustnego podawania badanego związku zwierzęciu testowemu. Niniejszy artykuł koncentruje się na wykazaniu skuteczności metody ODS na myszach. Nie ma jednak powodu, aby oczekiwać, że ta sama metoda nie będzie również przydatna u innych gryzoni, a także większych ssaków. Z klinicznego punktu widzenia stosowanie ODS zaczyna być stosowane u pacjentów pediatrycznych i geriatrycznych jako sposób na przezwyciężenie trudności w połykaniu¹⁰. Sugerujemy, że ODS może być również z powodzeniem stosowany w przedklinicznych programach odkrywania leków jako bezpieczna, wygodna i humanitarna alternatywa dla doustnego zgłębnika.

Protokół

Wszystkie opisane procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Południowej Kalifornii.

1. Obchodzenie się ze zwierzętami i ich habituacja

1. Wprowadzenie
   1. Pozwól myszom zaaklimatyzować się do warunków hodowli i techniki obchodzenia się z eksperymentem, aby zmniejszyć stres podczas kolejnych procedur podawania leku. W tym czasie zapisuj masę ciała i spożycie pokarmu przez każdą mysz; W razie potrzeby można je później wykorzystać jako nieinwazyjny punkt porównawczy do oceny toksyczności leku (opcjonalnie). Ten pierwszy może być również używany do określania dawkowania leków na podstawie masy.
      Uwaga: Anegdotycznie, długość okresu przyzwyczajenia powinna być określona na podstawie liczby eksperymentatorów wchodzących w interakcję ze zwierzęciem. Z naszego doświadczenia wynika, że myszy szczepu C57BL/6J mają problemy z przyzwyczajeniem się do obsługi przez więcej niż ~5 osób w naszym typowym tygodniowym okresie przyzwyczajenia. Jeśli to możliwe, eksperymentatorzy są również zachęcani do powstrzymania się od używania pachnących balsamów, mydeł i perfum przed kontaktem ze zwierzętami, ponieważ poprzednie raporty wskazują, że nowe bodźce, takie jak zapachy, mogą utrudniać okres przyzwyczajenia.
2. Kroki
   1. Rozpoczynając co najmniej 5 dni przed rozpoczęciem badania, przenieść zwierzęta do pomieszczenia, w którym będą miały miejsce kolejne eksperymenty.
   2. Zapisz wagę myszy, mocno chwytając środek ogona i delikatnie podnosząc zwierzę z klatki do łodzi obciążeniowej.
      1. Umieść mysz na wadze, gdy tylko zostanie wyjęta z klatki, pamiętając o prawidłowym uchwyceniu przyśrodkowej/proksymalnej części ogona, aby uniknąć obrażeń w rękawicach, które mogą wystąpić podczas chwytania dystalnej części ogona¹² .
      2. Zapisz wartość masy po bezpiecznym umieszczeniu myszy w łodzi wagowej.
   3. Zapisuj wagę żywności przez zalecane 2 kolejne dni, w celu ustalenia podstawowych poziomów spożycia żywności, które pomogą uchwycić potencjalne toksyczności podczas eksperymentu¹³.

2. Przygotowanie igły do karmienia, roztworu sacharozy i indywidualnych ODS

1. Użyj autoklawu do sterylizacji igieł do zgłębników ze stali nierdzewnej w ramach przygotowań do eksperymentu. Przygotuj 2 igły/grupę i 1 dodatkową igłę, które w razie potrzeby będą używane jako zapasowe.
   Uwaga: W tym badaniu wykorzystano 1,5-calową, zakrzywioną, 18-gramową igłę do karmienia ze stali nierdzewnej z kulką 2,25 mm na końcu igły.
2. Dodać 20 ml wody do 0,85 g sacharozy, aby uzyskać 4,25% (w/v) roztwór sacharozy.
   Uwaga: W zależności od ocenianych parametrów potencjalnie można również stosować inne niskie dawki sacharozy¹⁴.
3. Przygotuj doustny pasek do rozpuszczania (ODS) dla każdego zwierzęcia, przecinając standardowy prostokątny pasek testowy na kawałek o średnicy 0,5 cm za pomocą dostępnego w handlu dziurkacza z pojedynczym ćwierć cala. Prostokątny pasek testowy użyty w tej demonstracji został opracowany tak, aby zawierał 6 mg iwermektyny (IVM), a po przycięciu do tego rozmiaru przydziela dawkę 0,21 mg na każdy pojedynczy okrągły kawałek, co w przybliżeniu odpowiada dawce 10 mg / kg dla każdego zwierzęcia (nasza pożądana dawka / zwierzę). Dawkę tę można dostosować poprzez zagęszczenie/rozcieńczenie całego preparatu na prostokątnym pasku i/lub pocięcie paska na różne rozmiary.

3. Lek – Dostawa

1. Zapisz wartości masy zgodnie z wcześniejszym opisem w krokach 1.1-1.2.
2. Po zarejestrowaniu wagi przesuń mysz na górną część klatki z metalową siatką. Tam samym, używając kciuka dominującego, palca wskazującego i palca^3-ciego, delikatnie pociągnij ogon do tyłu. Spowoduje to, że mysz nieumyślnie chwyci górną część drucianej klatki i rozciągnie grzbiet, rozciągając swoje ciało z dala od eksperymentatora.
3. Chwyć kark szyi niedominującym kciukiem, palcem wskazującym i^3-cim palcem, aby wygodnie przytrzymać zwierzę bezpiecznym uchwytem.
   Uwaga: Eksperymentator z mniejszą ręką może również użyć^{czwartego palca tej} samej ręki, aby odciągnąć kark grzbietu i uzyskać pewny chwyt myszy. Dodatkowo, w zależności od indywidualnych preferencji, palec serdeczny i/lub mały palec może być również użyty do zabezpieczenia ogona, jednak nie jest to konieczne¹².
4. Trzymaj mysz w pozycji pionowej.
5. Uwaga: Obserwuj kolor błon śluzowych myszy. Fioletowo-niebieski wygląd wskazuje, że eksperymentator zbyt mocno zaciska kark i mysz nie może oddychać.
   1. Jeśli tak się stanie, natychmiast połóż mysz z powrotem na metalowej klatce i pozwól jej odpocząć przez ~ 2-3 minuty przed ponowną próbą powstrzymania zwierzęcia.
6. Zanurz końcówkę gruszki igły do zgłębnika w 4,25% roztworze sacharozy, aby posłużył jako smaczny klej do substancji zubożających warstwę ozonową.
7. Naciśnij wstępnie przycięty ODS końcówką gruszki igły do zgłębnika, aby przymocować pasek rozpuszczający się w jamie ustnej.
8. Przedstaw ODS myszy, umieszczając ją w pobliżu nozdrzy i/lub pyska, i pozwól zwierzęciu skonsumować folię. Alternatywnie, ODS może być dostarczany miejscowo do jamy ustnej, umieszczając cienki pasek bezpośrednio na języku, aby myszy mogły go połknąć.
9. Podczas sesji dawkowania leku należy wymienić igłę w środkowej części, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się infekcji.

Wyniki

W poniższych reprezentatywnych badaniach, picie towarzyskie było modelowane przy użyciu paradygmatu 24-godzinnego wyboru dwóch butelek (TBC), jak opisano wcześniej¹⁵. Krótko mówiąc, myszy miały dostęp do dwóch butelek roztworu, z których jedna zawierała wodę, a druga 10% (v/v) roztwór etanolu. Badani zostali następnie przydzieleni do grup leczenia farmakologicznego, tak aby średnie spożycie 10E (10% etanolu/90% wody v/v) było podobne we wszystkich grupach.

Dyskusja

Zgłębnik jamy ustnej wiąże się z licznymi powikłaniami, które skutkują potencjalnie zagrożonym gromadzeniem danych i wysokimi wskaźnikami wyczerpania zwierząt¹. Tutaj wprowadzono prostą metodę doustnego dostarczania leku, dzięki której myszy (i potencjalnie inne zwierzęta) mogą łatwo i niezawodnie spożywać wybrany lek za pomocą paska rozpuszczającego się w jamie ustnej (ODS). Warto zauważyć, że zastosowanie tej metody stanowi bezpieczną, wygodną i humanitarną alternatywę dla zgłębnika doustnego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pasek rozpuszczający się w jamie ustnej	Cure Pharmaceutical		Dostępny na specjalne zamówienie. Alternatywnie substancje zubożające warstwę ozonową mogą być również przygotowywane we własnym zakresie.
Igła do karmienia zgłębnika	VWR	7912	W naszych badaniach na gryzoniach wykorzystaliśmy igłę do karmienia o rozmiarze 18. Ten rozmiar może wymagać dostosowania do stosowania u innych gatunków sutków.
Sacharoza	Sigma Aldrich	S0389-500G