Ten artykuł przedstawia szybką i prostą metodę podawania bleomycyny bezpośrednio do tchawicy myszy poprzez intubację. Kluczowymi zaletami tej metody jest to, że jest wysoce powtarzalna, łatwa do opanowania i nie wymaga specjalistycznego sprzętu ani długiego czasu rekonwalescencji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ulepszona metoda szybkiej intubacji tchawicy u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pomimo pewnych różnic anatomicznych i fizjologicznych, modele mysie nadal są podstawowym narzędziem do badania chorób płuc u ludzi. Toksyczność bleomycyny jest powszechnie stosowanym modelem do badania zarówno ostrego uszkodzenia płuc, jak i zwłóknienia, a także opracowano wiele metod podawania bleomycyny (i innych środków toksycznych) do płuc. Jednak wiele z tych podejść, takich jak wkraplanie przez tchawicę, ma nieodłączne wady, w tym konieczność stosowania silnych środków znieczulających i operacji przetrwania. W artykule opisano szybką, powtarzalną metodę intubacji dotchawiczej, która obejmuje łagodne znieczulenie wziewne, wizualizację tchawicy i użycie zastępczego spirometru w celu potwierdzenia ekspozycji. Jako dowód słuszności koncepcji, 8-12-tygodniowym myszom C57BL/6 podawano 2,0 U/kg bleomycyny lub równoważną objętość PBS, a po ekspozycji mierzono zarówno uszkodzenia, jak i zwłóknienia. Procedura ta pozwala naukowcom leczyć dużą kohortę myszy w stosunkowo krótkim czasie przy niewielkich kosztach i minimalnej opiece pozabiegowej.
Wprowadzenie
Pomimo pewnych różnic anatomicznych i fizjologicznych,1 modele mysie nadal są nieocenione w modelowaniu ludzkiej biologii i patogenezy chorób. 2 Z hodowlanego punktu widzenia myszy są łatwe w obsłudze, mają krótki czas rozrodu, przyspieszoną długość życia i są stosunkowo niedrogie w utrzymaniu. Wraz z rozwojem różnorodnych szczepów i strategii genetycznych (np. warunkowe nokaut, myszy reporterowe, metody śledzenia linii itp.), a także szerokiej gamy dostępnych odczynników (np. przeciwciał, rekombinowanych białek, inhibitorów itp.), myszy stały się niezbędnym modelowym organizmem kręgowców do odkrywania ludzkiej homeostazy i procesów chorobowych. 3
Myszy były szczególnie cenne do badania chorób płuc, w tym ostrego uszkodzenia płuc (ALI) i zwłóknienia płuc. 4 ALI u ludzi może być spowodowany urazem, urazem lub posocznicą i charakteryzuje się przeciekiem nabłonka i śródbłonka (tj. obrzękiem), stanem zapalnym i rodzącym się zwłóknieniem. U wielu pacjentów ALI rozwija się do ciężkiej postaci, zespołu ostrej niewydolności oddechowej (ARDS), który często prowadzi do zwłóknienia i śmierci z powodu niewydolności oddechowej. 5,6 Zwłóknienie płuc jest postępującą, śmiertelną patologią charakteryzującą się nadmiernym odkładaniem się macierzy zewnątrzkomórkowej, w szczególności kolagenu typu I, prowadzącym do upośledzenia czynności płuc. 7,8 Podawanie bleomycyny (BLM) jest najpowszechniej stosowanym i najlepiej scharakteryzowanym modelem indukowania ALI i zwłóknienia u zwierząt doświadczalnych. 9 Chociaż zwłóknienie płuc wywołane BLM u gryzoni nie oddaje w pełni fenotypów ludzkiego zwłóknienia,10 badania na myszach z tym modelem doprowadziły do odkrycia wielu ważnych czynników wpływających na początek i postęp choroby. 11
Chociaż dokładne mechanizmy stojące za fibrogenezą wywołaną przez BLM są nieznane, uważa się, że uraz inicjujący wynika z zależnych od kontaktu pęknięć nici DNA w komórkach nabłonka wyściełających drogi oddechowe i pęcherzyki płucne, a w szczególności pneumocytów typu 1. 12 Potrzeba bezpośredniego kontaktu między BLM a nabłonkiem płucnym podkreśla znaczenie solidnej drogi porodu, a obawy te dotyczą również szerokiego zakresu leczenia ukierunkowanego na dystalne drogi oddechowe, w tym rekombinowane białka, przeciwciała, siRNA, wirusy, bakterie, cząstki stałe i inne. Aspiracja ustno-gardłowa (OPA) jest szeroko stosowana w tym celu13, ale główną wadą OPA jest to, że pewna część dostarczonego czynnika może zostać połknięta do przewodu pokarmowego, co prowadzi do niedokładności podawanej dawki. Innym szeroko stosowanym podejściem jest wkraplanie transchawicze, które polega na tracheostomii w silnym znieczuleniu w celu odsłonięcia tchawicy i wkroplenia środka bezpośrednio do dróg oddechowych. 14 Jednakże taki zabieg może być nie tylko niepożądany ze względu na jego inwazyjność, ale także czasochłonny, wymagający sporego przeszkolenia i powodujący poważne uszkodzenie dróg oddechowych. 15,16 Opracowano kilka protokołów, które obejmują bezpośrednie podawanie środków do tchawicy bez konieczności interwencji chirurgicznej,16,17,18,19,20 ale metody te wiążą się z wydłużonym czasem rekonwalescencji spowodowanym silnymi środkami znieczulającymi, użyciem drogiego sprzętu (tj. otoskopu/laryngoskopu, dostępnych na rynku tablic zabiegowych, przewodów światłowodowych itp.), nadmiarem manipulacji w jamie ustnej, i niepewność co do dawkowania.
Ten artykuł opisuje stosunkowo łatwą metodę podawania poprzez intubację, która pozwala badaczowi szybko, tanio i niezawodnie wprowadzić odczynnik do płuca myszy przy ograniczonym ryzyku szczątkowego uszkodzenia otaczających tkanek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania (IACUC) na Uniwersytecie Waszyngtońskim i Centrum Medycznym Cedars-Sinai zatwierdziły prace na zwierzętach niezbędne do przeprowadzenia tych badań.
1. Przygotowanie
- Sterylizuj zarówno kleszcze z końcami, jak i depresor w autoklawie.
- Korzystając z komory bezpieczeństwa biologicznego, przygotuj zapas roboczy BLM w PBS z liofilizowanego proszku. Sonikuj roztwór przez 10 minut przy 35 kHz, aby zapewnić równomierne mieszanie.
Uwaga: Zalecana jest całkowita objętość od 30 do 45 μl, aby zapobiec wahaniom pipetowania w dolnym zakresie i uduszeniu się większymi objętościami. - Przygotuj czyste miejsce pracy, które obejmuje około 1m2 na sam zabieg, a także wyznaczone miejsca na klatki zarówno przed, jak i po zabiegu.
- Przymocuj podstawę tablicy zabiegowej do ławki bezpośrednio przed badaczem, układając 2 lub 3 paski taśmy laboratoryjnej w poprzek podstawy i znajdującej się pod nią ławki. Zobacz rysunek 1, aby uzyskać więcej specyfikacji dotyczących tworzenia płytki.
- Zawiąż pojedynczą długość nici do szwów w rozmiarze 4,0 między dwiema pozycjonującymi tablicy zabiegowej.
- Stwórz prowizoryczny spirometr, wyjmując i wyrzucając tłok z trzech strzykawek o pojemności 1 ml i umieszczając 60 μl PBS w górnej części każdej beczki, aby utworzyć hermetyczne zamknięcie. Przymocować piastę cewnika luźno do jednej ze strzykawek i umieścić ją po jednej stronie płytki.
- Zassać 300 μl powietrza do strzykawki o pojemności 1 ml i umieścić ją z jednej strony płytki.
- Wytnij dodatkowy kawałek taśmy o długości około 6 cali i odłóż na bok. Zostanie to wykorzystane do przymocowania zwierzęcia do deski w kroku 2.4.
- Skonfiguruj komorę izofulanową. Podłączyć O2, izofluran i podciśnienie do odpowiednich portów zarówno w komorze ekspozycyjnej, jak i w próżni odstępu. Alternatywnie, podać środek znieczulający w komorze bezpieczeństwa biologicznego zgodnej z izofluranem.
2. Intubacja
- Znieczulij mysz izofluranem w komorze, aż straci przytomność, a oddech zwolni do odpowiedniego tempa. Typowa ekspozycja obejmuje 4% izofluranu i 2%O2 przez 3 do 4 minut, a idealnym wynikiem jest 2 do 2,5 minuty sedacji. Odpowiada to częstości oddechów wynoszącej 1 oddech co 2 sekundy.
- Czekając na sedację, odessać od 30 do 45 μl BLM do pipety i odłożyć na bok.
- Gdy będzie gotowa, zawieś uspokojoną mysz za górne siekacze na gwincie przymocowanym do pozycjonujących platformy zabiegowej. Upewnij się, że grzbiet zwierzęcia leży płasko na powierzchni platformy.
- Uważając, aby nie ograniczać wentylacji, umieść luźno kawałek taśmy w poprzek dolnej (ogonowej) części klatki piersiowej, tuż nad przeponą. Umiejscowienie powinno być na tyle ciasne, aby utrzymać prawidłowe ułożenie podczas zabiegu, ale nie na tyle ciasne, aby ograniczało oddychanie.
- Włącz oświetlacz na intensywność od 80% do 100% i ustaw gęsią szyję tak, aby znajdowała się od 1 do 2 cm od powierzchni skóry, w pobliżu splotu słonecznego. Okresowo sprawdzaj końcówkę gęsiej szyi pod kątem ciepła, aby upewnić się, że nie zrani myszy.
- Stojąc za platformą, użyj sterylnych, kleszczy, aby zlokalizować język. Uważając, aby ominąć dolne siekacze, delikatnie chwyć i wyciągnij język z jamy ustnej.
- Drugą ręką włóż depresor i użyj go, aby spłaszczyć język o dno jamy ustnej. Zwolnij kleszcze, ale pozostaw depresor na miejscu na następne dwa kroki.
- Ustaw światło tak, aby tchawica była widoczna, prowadząc gęsią szyję proksymalnie od poziomu splotu słonecznego, aż osiągnie poziom oskrzeli pnia głównego.
Uwaga: Tchawicę można łatwo odróżnić po działaniu oddychania, które powoduje wahania intensywności emitowanego światła. Po prawidłowym ustawieniu struktura ta będzie widoczna w płaszczyźnie osiowej jako centralnie umieszczony sworzeń światła z minimalnym światłem otoczenia w samej jamie ustnej. - Ustawić strzykawkę pod kątem tak, aby podążała za naturalną ścieżką tchawicy i opuścić końcówkę cewnika 22-G z dołączoną strzykawką zawierającą kroplę prosto do światła. Bańka PBS zacznie się unosić i opadać z każdym oddechem po udanym umieszczeniu.
Uwaga: To działanie może być opóźnione o kilka sekund w wyniku głębokiego sedacji. - Nałóż cewnik na dodatkowe 5 mm. Usuń depresor języka.
- Przesunąć strzykawkę do przeciwnej ręki i chwytając piastę, delikatnie wyjąć strzykawkę.
- Umieść od 30 do 45 μl BLM w środku wnętrza piasty cewnika, podłącz drugą strzykawkę i dozuj 300 μl powietrza do piasty.
- Wymienić drugą strzykawkę na pierwszą zawierającą pęcherzyk PBS. Bańka będzie nadal się unosić i opadać, jeśli zabieg został wykonany pomyślnie.
3. Opieka pozabiegowa
- Usuń cewnik i taśmę, a następnie umieść zwierzę w suchym, ciepłym miejscu, aż odzyska przytomność - zwykle w ciągu kilku minut.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Intubowane myszy monitorowano codziennie pod kątem utraty masy ciała i oznak stresu, a następnie uśmiercono po 4, 10 lub 17 dniach poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe 2,5% 2,2,2-tribromoetanolu. Płukanie pęcherzykowo-oskrzelowe (BAL) pobierano w trzech cyklach płukania PBS zgodnie z opisem zamieszczonym w innym opracowaniu 21, a prawy płuc utrwalono w 10% formalinie, zatopiono w parafinie i zabarwiono trichromem Massona w University of Washington Histology and ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W przypadkach, gdy aerozolizacja jest niepraktyczna ze względu na ograniczoną dostępność odczynników, bezpieczeństwo lub koszty, bezpośrednie podawanie tchawicy jest lepszą metodą dostarczania środków egzogennych do płuc. 16 W tym celu szeroko stosuje się wkraplanie transtchawicze; Jednak, podobnie jak w przypadku każdej interwencji chirurgicznej, niesie ona ze sobą również możliwość wystąpienia powikłań spowodowanych samym zabiegiem, a niekoniecznie wkraplanym środkiem. 13 Z tych p...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują Brianowi Johnsonowi z Histologii i Obrazowania Uniwersytetu Waszyngtońskiego za pomoc w barwieniu i analizie trichromów. Prace te były wspierane przez granty NIH HL098067 i HL089455.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Bleomycyna do wstrzykiwań, 30 jednostek/fiolkę | APP Pharmaceuticals, LLC | 103720 | Aby uzyskać najlepsze wyniki, BLM powinien być zawieszony w PBS, podany i przechowywany jako jednorazowe liofilizowane podwielokrotności |
| Kleszcze | |||
| Depresor języka (tj. wygięta elektroda ostrza Valleylab, 2,4 ") | Covidien | E1551G | Przed użyciem wykonaj zgięcie pod kątem 45 stopni 1,5 cm od końcówki ostrza. Odpowiedni depresor można również stworzyć z dowolnego metalowego narzędzia o podobnych wymiarach. |
| Cewnik Exel Safelet 22G X 1" | Exel International | 26746 | |
| 1 ml jednorazowa strzykawka tuberkulinowa z końcówką wsuwaną (200/sp, 1600/ca) | BD | 309659 | |
| 0,2 ml Końcówki do pipet i filtrów | |||
| Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 współpracujący ze standardowym podwójnym oświetlaczem na gęsiej szyi | Dolan Jenner Industries, Inc. | 181-1 | Nie zaleca się stosowania oświetlaczy LED o niższej mocy, ponieważ nie oświetlają one wystarczająco tchawicy. |
| intubacyjna | Patrz rysunek 1. | ||
| Kolorowa taśma etykietowa: 0,5 w. Szeroki | Fisherbrand | 15-901-15A | |
| Tlen | |||
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 1X | Corning | 21-040-CV | Produkt powinien być sterylny |
| Niesterylna szpula do szwów z czarnego jedwabiu, 91,4 m, rozmiar 4-0 | Aparat Harvard | 517698 | |
| stołowa maszyna anestezjologiczna Isoflurane | Highland Sprzęt | http://www.highlandmedical.net/ | |
| Slide Top Indukcyjna komora | izofluranu dla myszyMIP / Anesthesia Technologies | AS-01-0530-SM | |
| FORANE (izofluran, USP) Płyn do inhalacji 100 ml | Baxter | 1001936040 | |
| Cyfrowy system patomorfologiczny Nanozoomer | IgM Hamamatsu | ||
| Laboratoria Bethyl | E90-101 |
Bibliografia
- Hyde, D. M., Hamid, Q., Irvin, C. G. Anatomy, pathology, and physiology of the tracheobronchial tree: emphasis on the distal airways. J Allergy Clin Immunol. 124, S72-S77 (2009).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat Cell Biol. 9, 993-999 (2007).
- Peters, L. L., et al. The mouse as a model for human biology: a resource guide for complex trait analysis. Nat Rev Genet. 8, 58-69 (2007).
- Baron, R. M., Choi, A. J., Owen, C. A., Choi, A. M. Genetically manipulated mouse models of lung disease: potential and pitfalls. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, 485-497 (2012).
- Sharma, S. Acute respiratory distress syndrome. BMJ Clin Evid. 2010, (2010).
- Saguil, A., Fargo, M. Acute respiratory distress syndrome: diagnosis and management. Am Fam Physician. 85, 352-358 (2012).
- Wilson, M. S., Wynn, T. A. Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation. Mucosal Immunol. 2, 103-121 (2009).
- Wuyts, W. A., et al. The pathogenesis of pulmonary fibrosis: a moving target. Eur Respir J. 41, 1207-1218 (2013).
- Mouratis, M. A., Aidinis, V. Modeling pulmonary fibrosis with bleomycin. Curr Opin Pulm Med. 17, 355-361 (2011).
- Moeller, A., Ask, K., Warburton, D., Gauldie, J., Kolb, M. The bleomycin animal model: a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis? Int J Biochem Cell Biol. 40, 362-382 (2008).
- Myllärniemi, M., Kaarteenaho, R. Pharmacological treatment of idiopathic pulmonary fibrosis - preclinical and clinical studies of pirfenidone, nintedanib, and N-acetylcysteine. European Clinical Respiratory Journal. 2, (2015).
- Reinert, T., Baldotto, C. S. dR., Nunes, F. A. P., Scheliga, A. A. dS. Bleomycin-Induced Lung Injury. Journal of Cancer Research. 2013, 1-9 (2013).
- Lakatos, H. F., et al. Oropharyngeal aspiration of a silica suspension produces a superior model of silicosis in the mouse when compared to intratracheal instillation. Exp Lung Res. 32, 181-199 (2006).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J Vis Exp. , (2010).
- Osier, M., Oberdorster, G. Intratracheal inhalation vs intratracheal instillation: differences in particle effects. Fundam Appl Toxicol. 40, 220-227 (1997).
- Driscoll, K. E., et al. Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: Uses and Limitations. Toxicol Sci. 55, 24-35 (2000).
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. J Appl Physiol (1985). 106, 984-987 (1985).
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Lab Anim. 41, 128-135 (2007).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. J Vis Exp. , e50601(2013).
- Starcher, B., WIlliams, I. A method for intratracheal instillation of endotoxin into the lungs of mice. Lab Anim. 23, 234-240 (1989).
- Daubeuf, F., Frossard, N. Performing bronchoalveolar lavage in the mouse. Curr Protoc Mouse Biol. 2, 167-175 (2012).
- Li, Y., et al. Severe lung fibrosis requires an invasive fibroblast phenotype regulated by hyaluronan and CD44. J Exp Med. 208, 1459-1471 (2011).
- Grazioli, S., et al. CYR61 (CCN1) overexpression induces lung injury in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 308, L759-L765 (2015).
- Redente, E. F., et al. Tumor necrosis factor-alpha accelerates the resolution of established pulmonary fibrosis in mice by targeting profibrotic lung macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 50, 825-837 (2014).
- Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. J Vis Exp. , e52261(2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
