Zaporodowe wkraplanie gruczołu podżuchwowego i miejscowe frakcjonowane napromienianie w szczurzym modelu niedoczynności śliny

Przypadkowe niszczenie zdrowych tkanek odpowiada za szereg szkodliwych skutków ubocznych leczenia raka. Część lub całość głównych gruczołów ślinowych, które leżą w polu promieniowania, jest nieuchronnie niszczona. Dlatego większość pacjentów poddawanych radioterapii z powodu raka głowy i szyi, chłoniaka szyjki macicy lub naświetlania całego ciała przed przeszczepem szpiku kostnego cierpi na jedno z najczęstszych i najbardziej uporczywych działań niepożądanych promieniowania, niedoczynność gruczołów ślinowych^2-6.

Produkujące płyny komórki groniaste gruczołów ślinowych są bardzo wrażliwe na promieniowanie. Uszkodzenie gruczołów ślinowych powoduje drastyczne zmniejszenie przepływu śliny, stan określany jako niedoczynność śliny. Przewlekłe zmniejszenie przepływu śliny upośledza kluczowe czynności jamy ustnej, takie jak żucie, połykanie, mowa i smak, ale chorobliwe następstwa intensywnego bólu, rozdarcia błony śluzowej, dysfagii, infekcji oportunistycznych i próchnicy zębów pogarszają samopoczucie i funkcjonowanie pacjenta^2,3.

Ponieważ utrata komórek ślinowych związana z radioterapią jest nieodwracalna, nie ma leczenia korekcyjnego kserostomii. Obecne leczenie, które koncentruje się na łagodzeniu objawów za pomocą sztucznych substytutów śliny i leków wydzielniczych, jest nieskuteczne w długotrwałej łagodzeniu⁶. Chociaż ulepszone techniki dostarczania promieniowania pomogły zmniejszyć nasilenie stanu, normalna toksyczność tkankowa i jej powikłania pozostają czynnikiem ograniczającym w leczeniu raka^6,7. W związku z tym środki zapobiegawcze mające na celu zapobieganie powikłaniom związanym z radioterapią stają się normą. Środki radioprotekcyjne, które wymiatają wolne rodniki tlenowe, wspomagają repopulację komórek lub poprawiają naprawę DNA, są badane w celu uniknięcia niedoczynności śliny ^8-11.

Wydzieliny zewnątrzwydzielniczych gruczołów ślinowych spływają do ust przez główne kanały wydalnicze. Kaniulacja wewnątrzustna przewodów wydalniczych w celu wstrzyknięcia środków kontrastowych jest wykonywana rutynowo jako zabieg ambulatoryjny. Stosując podobne podejście, gruczoły ślinowe mogą być bezpośrednio ukierunkowane na leczenie miejscowe¹². Oprócz zmniejszenia ryzyka wystąpienia ogólnoustrojowych skutków ubocznych, wkraplanie gruczołu wstecznego ma dodatkowe korzyści. Jednowarstwowe ułożenie komórek ślinowych wokół drzewa przewodowego umożliwia celowanie we wszystkie komórki nabłonka śliny, a włókniste otoczenie gruczołu działa jak bariera ograniczająca niepożądane rozprzestrzenianie się terapeutyczne. W istocie, gruczoły ślinowe są optymalnie przystosowane do celowanego leczenia dolegliwości gruczołów, takich jak niedoczynność śliny wywołana promieniowaniem.

Konwencjonalne promieniowanie w leczeniu raka jest dostarczane w małych dawkach (1,8 - 2,5 Gy/frakcję/dzień, pięć dni w tygodniu) przez okres tygodni. W związku z tym radioprotekcyjny środek terapeutyczny, który wykazuje skuteczność przeciwko długotrwałemu schematowi promieniowania w modelach eksperymentalnych, ma większe znaczenie kliniczne. Upośledzoną funkcję śliny po frakcjonowanym promieniowaniu odnotowano u małych zwierząt, ale źródło promieniowania, frakcja dawki i stosowane protokoły są zróżnicowane^9,10,13.

Ten raport ustanawia metody wstecznego dostarczania i miejscowego promieniowania gruczołów podżuchwowych szczurów przy użyciu odpowiedniego dla pacjenta źródła promieniowania i frakcji dawki.

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez LSU Health, Shreveport, Animal Care and Use Committee i były zgodne z wytycznymi NIH dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Kaniulacja gruczołów ślinowych podżuchwowych szczura

1. Przygotowanie zespołu rurki strzykawkowej
   1. Wytnij skalpelem rurkę z polietylenu PE10 o długości 10 cm. Przytrzymaj oba końce rurki między palcem wskazującym a kciukiem. Podgrzej środkową część rurki nad delikatnym płomieniem i delikatnie rozciągnij zmiękczoną rurkę, aby podwoić jej długość, ciągnąc za obie strony.
   2. Przetnij rurkę na środku skalpelem pod kątem 45^o, aby uzyskać 2 kaniule - każda ze zwężającym się końcem. Rozpręż niestożkowy koniec kaniuli, umieszczając ją na igle 29 G i strzykawce insulinowej o pojemności 0,5 cm3.
   3. Wyjąć kaniulę i pobrać do strzykawki 220 μl roztworu soli fizjologicznej. Stuknij, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Załóż kaniulę na igłę i naciśnij tłok strzykawki, aby usunąć powietrze i zapewnić swobodny przepływ roztworu przez kaniulę. Dostosuj głośność do 200 μl.
2. Kaniulacja wewnątrzustna przewodu podżuchwowego
   UWAGA: Autoklaw narzędzia przed zabiegiem i sterylizuj między zabiegami w sterylizatorze z gorącymi kulkami.
   1. Zważyć szczura rasy Sprague Dawley i odmierzyć obliczoną objętość mieszanki ketaminy (42 mg/kg)/ksylazyny (8 mg/kg)/acepromazyny (1,4 mg/kg) w strzykawce podskórnej.
   2. Powstrzymaj zwierzę, chwytając podstawę ogona między palcem wskazującym a kciukiem jednej ręki i przesuwając drugą ręką po ciele, aby je chwycić. Oprzyj palce wskazujący i środkowy wzdłuż boków głowy, jednocześnie przytrzymując tułów kciukiem i pozostałymi palcami.
   3. Wstrzyknąć środek znieczulający w mięśnie kończyn tylnych. Potwierdź głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi i odruch powiekowy. Zastosuj lubrykant do oczu, aby zapobiec wysuszeniu, gdy zwierzę jest pod narkozą.
   4. Umieść zwierzę na specjalnie zaprojektowanej platformie (ryc. 1) i zaczep górne siekacze o pręt poprzeczny. Pociągnij dolną szczękę w dół, owijając gumkę wokół dolnych siekaczy i zakotwiczając ją do platformy.
   5. Przełóż sterylny szew przez język i podnieś go, aby podnieść dno jamy ustnej. Zacisnąć szwy hemostatem i przeciągnąć go przez poprzeczny pręt.
   6. Rozszerz policzki za pomocą specjalnie zbudowanego rozsiewacza policzków (ryc. 1), a następnie pod mikroskopem preparacyjnym zlokalizuj brodawki podjęzykowe na dnie jamy ustnej.
   7. Chwyć stożkowy koniec wstępnie uformowanej rurki PE10 za pomocą delikatnych kleszczyków. Delikatnie wciśnij końcówkę kaniuli w otwór przewodowy na brodawkach podjęzykowych. Potwierdź umieszczenie kaniuli, wkręcając ją 3 - 5 mm w kanał; Upewnij się, że przechodzi bez żadnych przeszkód.
3. Wkraplanie gruczołu podżuchwowego
   1. Wstrzyknąć atropinę (0,5 mg/kg) podskórnie w kark szyi i odczekać 10 minut na zmniejszenie wydzielania śliny.
   2. Przymocuj kaniulę do otworu kanału za pomocą kropli cyjanoakrylanu (kleju) i pozostaw do wyschnięcia. Wkroplić roztwór do gruczołu (200 μl/gruczoł), powoli naciskając tłok strzykawki z szybkością ~ 50 μl/min.
   3. Zmiażdżyć rurkę hemostatem i ostrożnie wyjąć strzykawkę. Trzymaj rurkę w kanale przez 30 - 60 minut, aż zwierzę odzyska przytomność. Usuń szew, który przytrzymuje język.
   4. Przenieś zwierzę do osobnej klatki i użyj lampy grzewczej, aby utrzymać je w cieple podczas rekonwalescencji. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka.
   5. Gdy zwierzę jest już w pełni zdolne do poruszania się, umieść je w wiwarium z nieograniczonym dostępem do jedzenia i wody.

2. Miejscowe frakcjonowane napromienianie gruczołów podżuchwowych

1. Unieruchomić zwierzę w sposób opisany wcześniej i znieczulić je domięśniowo mieszanką ketaminy (33 mg/kg) / ksylazyny (6 mg / kg) / acepromazyny (1 mg / kg) w kończynę tylną. Potwierdź głębokość znieczulenia i nałóż lubrykant na oczy.
2. Połóż zwierzę na wznak na blacie akceleratora liniowego i wyprostuj jego szyję, przechylając głowę. Skolimuj pole promieniowania (szerokość szczeliny 3 cm), aby objąć obszar od dolnej granicy żuchwy do górnej części mostka.
3. Umieść 1 cm bolus odpowiadający tkankom w okolicy i dostosuj odległość między źródłem promieniowania a górną częścią bolusa do 100 cm.
4. Napromieniować zwierzę (2,5 Gy) za pomocą wiązki fotonów o mocy 6 MV z akceleratora liniowego. Szybkość dawki, wielkość pola i odległość od źródła promieniowania do powierzchni bolusa będą decydować o czasie ekspozycji. W obecnej konfiguracji zwierzęta były napromieniane dawką ~ 1 Gy/min.
5. Powtórz ekspozycję; 2,5 Gy/dzień przez łącznie 8 dni; 4 dni w tygodniu z 2-dniową przerwą pomiędzy nimi. Utrzymuj zwierzę w cieple podczas rekonwalescencji. Przenieś zwierzę do wiwarium po tym, jak będzie w pełni zdolne do chodzenia.
6. Zbierz stymulowaną ślinę gruczołu podżuchwowego 8 tygodni po promieniowaniu, aby zmierzyć czynność gruczołów¹⁴. Eutanazja zwierząt pod narkozą przez perfuzję serca zimnego 4% paraformaldehydu / soli fizjologicznej buforowanej fosforanem pH 7,2. Usuwanie gruczołów podżuchwowych do analiz histologicznych i immunohistochemicznych¹⁴.

Adaptacja minimalnie inwazyjnej techniki sialografii, możliwe jest miejscowe leczenie głównych gruczołów ślinowych. Podanie wsteczne w podżuchwowych gruczołach ślinowych szczura próbowano przez wewnątrzustną kaniulację przewodów Whartona (ryc. 2). Przewody ślinowe Whartona otwierają się na brodawkach podjęzykowych znajdujących się na dnie jamy ustnej, ale otwory nie są łatwo widoczne. Wprowadzenie kaniuli odbyło się zatem poprzez delikatne sondowanie. Aby uniknąć niepożądanego krwawienia lub perforacji kanału, nie użyto siły podczas zakładania kaniuli. Płynny, pozbawiony oporu przebieg kaniuli w kanale został potwierdzony delikatnym ruchem rurki w przód i w tył.

Kaniulacja podczas początkowych eksperymentów została potwierdzona przez nasączenie gruczołu roztworem hematoksyliny lub błękitu trypanowego i ocenę barwienia gruczołów u zwierząt poddanych eutanazji (Rysunek 3). Objętość wypełnienia gruczołów ustalono poprzez wizualizację zabarwienia drzewa przewodowego w wytępionych gruczołach. W przypadku zwierząt o masie ciała 150 - 250 g całkowite wypełnienie gruczołu uzyskano za pomocą 200 - 250 μl roztworu. Szybka infuzja może zwiększyć ciśnienie w gruczole i zwiększyć ryzyko urazu i biorozprzestrzeniania się. Aby uniknąć zniszczenia tkanek, roztwór podawano stopniowo z szybkością ~ 50 μl/min

Gruczoły podżuchwowe szczurów są porównywalne do ślinianek przyusznych pod względem wrażliwości na promieniowanie15. Badano gruczoły podżuchwowe, ponieważ można je selektywnie napromieniać bez powodowania poważnych skutków ubocznych (ryc. 4). Oszczędzenie jamy ustnej i duża objętość ślinianek przyusznych zminimalizowały wpływ zapalenia błony śluzowej jamy ustnej i ostrej kserostomii na zdrowie zwierząt i wyniki eksperymentalne. Nasze wcześniejsze badania na szczurach przeprowadzono z pojedynczymi, dużymi dawkami promieniowania11,16, ale dawkowanie frakcjonowane jest bardziej odpowiednie dla praktyki klinicznej. Okolice szyi zwierzęcia były zatem codziennie narażone na małe dawki promieniowania. Aby uzyskać równomierne nagromadzenie dawki promieniowania w gruczołach podżuchwowych znajdujących się w pobliżu powierzchni skóry, podczas naświetlania na szyję umieszczono bolus odpowiadający tkance miękkiej wykonany z jednorodnego żelu o gęstości 1,03 g/cm3.

Wpływ schematu frakcjonowanego promieniowania na przepływ śliny, określony po 8 tygodniach od napromieniowania, pokazuje, że codzienna ekspozycja na przyrosty 2,5 Gy gwałtownie zmniejszyła przepływ śliny. U zwierząt napromienianych odnotowano prawie 10-krotne zmniejszenie wydzielania śliny w przeciwieństwie do zwierząt nienapromienianych (2-stronny test t-Studenta, p < 0,01; Rysunek 5)14. Wyniki potwierdziły wystąpienie niedoczynności śliny wywołanej promieniowaniem u zwierząt.

Rysunek 1. Budowa niestandardowej platformy i rozrzutnika policzkowego. Sztywny drut o średnicy 4 mm został wygięty w 3-kątny prostokąt (11 cm wysokości x 13 cm szerokości), jak pokazano, a poprzeczny pręt został wygięty pośrodku. Końce drutu zostały wygięte w pętle, a przez nie przepuszczono, aby przymocować zespół do plastikowej płyty (25 cm długości x 15 cm szerokości x 0,8 cm głębokości). Centralna śruba została włożona 5 cm z tyłu zespołu przewodów. Służył do zakotwiczenia gumowej taśmy, która otwierała dolną szczękę. wstawka: Specjalnie zbudowany rozpieracz policzków wykonany z jednorazowego drutu o grubości 1 mm wygiętego w kształt litery "U" z rozszerzanymi końcami. Plastikowe rurki zostały przepuszczone przez końce drutu, aby zapobiec uszkodzeniu błony śluzowej policzka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Kaniulacja przewodów wydalniczych gruczołu podżuchwowego szczura. Język jest podniesiony w celu uniesienia dna jamy ustnej, a kaniule polietylenowe zostały wprowadzone do otworów przewodu podżuchwowego znajdujących się na dnie jamy ustnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. wlew roztworu hematoksyliny do gruczołu podżuchwowego w celu potwierdzenia techniki. Zabarwienie gruczołów świadczy o pomyślnym podaniu roztworu w gruczole podżuchwowym. Zwróć uwagę, że gruczoł podjęzykowy w lewym górnym rogu nie jest poplamiony. Po lewej stronie pokazano nieinfuzję dławika kontrolnego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Umieszczenie zwierzęcia do napromieniowania. Zwierzę kładzie się na wznak na stole akceleratora liniowego, a głowę odchyla się do tyłu, aby wyprostować szyję. Szerokość skolimowanej szczeliny wynosiła 3 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Wpływ promieniowania frakcjonowanego na czynność gruczołu podżuchwowego. Sól fizjologiczna została wkroplona do gruczołów podżuchwowych przed promieniowaniem. Szyję zwierzęcia napromieniano we frakcjach 2,5 Gy/dzień przez 8 dni. Przedstawione dane są średnimi ± SEM stymulowanego przepływu śliny podżuchwowej 8 tygodni po zakończeniu schematu naświetlania. Rysunek jest reprodukowany za zgodą praw autorskich od Human Gene Therapy, Mary Ann Liebert, Inc., wydawcy15. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.