Artykuł metodologiczny

Obrazowanie przestrzennej reorganizacji szlaku sygnałowego MAPK przy użyciu systemu przejściowej ekspresji tytoniu

DOI:

10.3791/53790

⸱

20 marca 2016

 , 
1The Waksman Institute of Microbiology, Rutgers, The State University of New Jersey, 2The Department of Plant Biology and Pathology, Rutgers, The State University of New Jersey

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na poziomie subkomórkowym, zdarzenia sygnalizacyjne są dynamicznie modulowane przez sygnały rozwojowe i środowiskowe. W tym miejscu opisujemy protokół, który wykorzystuje system przejściowej ekspresji tytoniu do monitorowania dynamicznej interakcji białko-białko i ujawniania przestrzennej organizacji transdukcji sygnału w komórkach roślinnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wizualizacja dynamicznych zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach była wyzwaniem. Rozszerzyliśmy ustalony system ekspresji przejściowej, test biomolekularnej komplementacji fluorescencyjnej (BiFC) w komórkach naskórka tytoniu, z testowania interakcji białko-białko do monitorowania przestrzennego rozkładu transdukcji sygnału w komórkach roślinnych. W tym protokole użyliśmy testu BiFC, aby pokazać, że interakcja i sygnalizacja między Arabidopsis MAPKKK YODA i MAPK6 zachodzą na błonie plazmatycznej. Gdy białko rusztowania BASL uległo jednoczesnej ekspresji, interakcja YODA-MAPK uległa redystrybucji i przestrzennej kopolaryzacji z CFP-BASL. Ten zmodyfikowany system ekspresji tytoniu pozwala na szybkie badanie lokalizacji sygnalizacji i zmian dynamicznych (mniej niż 4 dni) i może pomieścić wiele kolorów białek fluorescencyjnych (co najmniej trzy). Przedstawiliśmy również szczegółowe metody ilościowego określania rozmieszczenia białek (asymetryczna lokalizacja przestrzenna lub "polaryzacja") w komórkach tytoniowych. Ten zaawansowany system ekspresji tytoniu może być szeroko stosowany do szybkiego testowania dynamicznych zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach roślinnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka oddziałują na siebie w skomplikowanej hierarchicznej sieci i tworzą kompleksy, które odgrywają kluczową rolę w prawie wszystkich procesach biologicznych zachodzących w nieprzewidywalnym środowisku komórkowym. Jednak od rozwoju roślin po reakcje wzrostowe brakuje wygodnych narzędzi, które mogą nie tylko szybko, ale także skutecznie identyfikować i monitorować te dynamiczne zdarzenia sygnalizacyjne na poziomie subkomórkowym.

System przejściowej ekspresji białek w naskórku liści tytoniu ma atrakcyjne zalety do wizualizacji białek fluorescencyjnych w żywych komórkach. System ten zapewnia warunki semi-in vivo, które umożliwiają potranslacyjną modyfikację białek i szybkie badanie lokalizacji białek. Badając uzupełniony sygnał YFP, test dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencyjnej (BiFC) informuje o możliwości interakcji białko-białko w komórkach roślinnych. W porównaniu z innymi metodami, np. hybrydą drożdży-dwa (Y2H) i koimmunoprecypitacją (Co-IP), BiFC zapewnia również potężny sposób wizualizacji przedziałów, w których mogą zachodzić interakcje białko-białko na poziomie subkomórkowym.

Ponieważ asymetryczny podział komórek (ACD) utrzymuje populację komórek macierzystych, jednocześnie generując nowe typy komórek do tworzenia tkanek/narządów, jest to niezbędny mechanizm do promowania wielokomórkowości eukariotycznej. Rozwój aparatów szparkowych rzodkiewnika został wykorzystany jako system modelowy do badania ACD u roślin. Komórka prekursorowa, merystemoidalna komórka macierzysta, dzieli się asymetrycznie, tworząc dwie różne komórki potomne, merystremoid (ulega podziałom podobnym do komórek macierzystych przed zakończeniem w parę komórek ochronnych) i komórka naziemna linii szparkowej (SLGC) (może dzielić się i różnicować w komórkę chodnika) odpowiednio (ryc. 1). W aparatach szparkowych ACD nowe białko Breaking of Asymmetry in the Stomatal Lineage (BASL) jest spolaryzowane pretotycznie, aby napędzać asymetrie podziału, które obejmują asymetrię fizyczną i asymetrię losu komórki1. Kaskada MAPK złożona z MAPKKK YODA i MAPK, MPK3 i 6 ma kluczowe znaczenie dla wzorca podziału aparatów szparkowych i przyjęcia losu2,3, 4,5.

Niedawno, Zhang et al. powiązali białko polaryzacji BASL ze szlakiem sygnałowym YDA-MAPK w aparacie szparkowym Arabidopsis ACD 6. Kanoniczny szlak YODA-MAPK, poprzez MPK3/6, fosforyluje BASL i aktywuje jego polaryzację. Fosforylowany BASL działa jak rusztowanie i rekrutuje YODA (YDA) i MPK3/6 do tworzenia kompleksu białkowego i koncentracji sygnalizacji w korze komórkowej6. Polaryzacja składników MAPK i pętla dodatniego sprzężenia zwrotnego między BASL a szlakiem YDA-MAPK stanowi nowy mechanizm polaryzacji białek w komórkach roślinnych. Przypuszcza się, że lokalnie wzbogacona sygnalizacja MAPK jest ściśle związana z różnicowaniem losu komórki w aparatach szparkowych ACD6 (Figura 1). Jedne z kluczowych danych eksperymentalnych, które wspierały ten model, pochodziły z testów tytoniowych, które wykazały przestrzenną redystrybucję MAPK indukowaną przez ekspresję BASL6.

Ogólnie rzecz biorąc, nie jest łatwo monitorować, gdzie występuje sygnalizacja MAPK, ponieważ cząsteczki MAPK często znajdowały się wszędzie wewnątrz komórki. W tym badaniu wykorzystaliśmy system split-YFP do wizualizacji interakcji między kinazą w górę a kinazą, aby zasugerować, gdzie występuje przekaźnik sygnałowy. Rozszerzyliśmy zastosowanie systemu BiFC poprzez koekspresję trzeciego białka (znakowanego CFP) z podzieloną parą YFP (sugerującą interakcję białko-białko), aby zwizualizować, czy i jak dopełniony YFP może być przestrzennie modulowany przez koeksprymowane białko CFP. W ten sposób wykazaliśmy, że koekspresja CFP-BASL indukowała przestrzenną reorganizację interakcji między YDA i MPK6, od równomiernego rozkładu do spolaryzowanego wzorca w korze komórkowej komórek naskórka tytoniu. System ten ma zatem potencjał do opracowania w celu monitorowania dynamicznych zdarzeń sygnalizacyjnych w komórkach roślinnych w warunkach, w których komórki są prowokowane przez bodźce wewnętrzne lub zewnętrzne (np. koekspresja innych białek, zastosowanie chemiczne, atak patogenu lub zmiany środowiskowe itp.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Budowa plazmidu

  1. Wygeneruj konstrukty za pomocą technologii klonowania, jak opisano wcześniej1,6.
    1. Najpierw użyj polimerazy DNA o wysokiej wierności z odpowiednimi starterami, aby amplifikować sekwencje kodujące BASL, YDA i MPK6 i sklonować je do wektorów wejściowych. Szczegółowy protokół znajduje się w 7.
    2. Aby wygenerować dominujące ujemne wersje MPK6 i YDA (odpowiednio DNmpk68 i DNyda4), użyj plazmidów wejściowych MPK6 i YDA jako matrycy i wprowadź mutacje punktowe metodą mutagenezy ukierunkowanejna miejsce 9.
  2. Aby zbudować konstrukty do testów stanów przejściowych tytoniu, należy przeprowadzić standardowe reakcje LR (rekombinacja attL x attR) (szczegółowa procedura w 7) w celu zintegrowania BASL z pH35CG10, DNyda i DNmpk6 odpowiednio z wektorami pXNGW i pXCGW11.
    1. Potwierdź powstałe plazmidy przez trawienie enzymatyczne i sekwencjonowanie. Po pomyślnym zakończeniu przekształć konstrukty binarne w szczep Agrobacterium tumefaciens GV310112 i hoduj je na płytkach selekcyjnych w temperaturze 28 °C przez 2-3 dni.

2. Przygotowanie roztworu infiltracji Agrobacterium

  1. Zaszczepić kilka świeżo przekształconych kolonii Agrobacterium w 10 ml pożywki Luria-Bertani (LB) odpowiednimi antybiotykami (Gentamycyna 25 μg/ml, Ryfamycyna 25 μg/ml, Spektynomycyna 100 μg/ml dla konstruktów pH35CG, pXNGW i pXCGW; te same stężenia Gentamycyny i Ryfamycyny z Kanamycyną 50 μg/ml dla P19 (ekspresja białek przeciwko wyciszaniu transgenicznemu)13.
  2. Hodować kultury Agrobacterium w wytrząsarce o temperaturze 28 °C z prędkością 200 obr./min przez około 16 godzin, a następnie zmierzyć OD600 (szacowany na 1,5 - 1,8) (rysunek 2A-B). Wirować kultury w temperaturze 2 500 x g przez 10 minut. Ponownie zawiesić i przemyć granulki komórek 10 mM MgCl2 (roztwór infiltracyjny).
  3. Ponownie odwirować kultury i ponownie zawiesić granulki z odpowiednią ilością roztworu infiltracyjnego, aby osiągnąć końcową średnicę zewnętrzną600 = 0,5 (rysunek 2C-D). Przed infiltracją roślin pozostaw mieszaniny komórek w temperaturze pokojowej na 1 - 3 godziny. Ten krok pomaga utrzymać homeostazę komórkową.

3. Iniekcja roślin tytoniu i liści

  1. Do iniekcji liści należy używać roślin tytoniu (Nicotiana benthamiana), uprawianych w wieku 4-5 tygodni w standardowej komorze do wzrostu roślin (23 °C z cyklami 16 godzin światła / 8 godzin ciemności)14.
    Uwaga: Na tym etapie rośliny tytoniu mają zazwyczaj 6 liści (2 duże, 2 średnie i 2 małe). Dwa średniej wielkości liście są najbardziej optymalne do iniekcji liści (dwa duże są za stare, podczas gdy dwa małe są często za młode).
  2. Przed dniem infiltracji podlej rośliny tytoniu, aby nasycić glebę.
  3. W dniu infiltracji należy wstępnie inkubować rośliny w ciemności przez 1 - 3 godziny. Ten krok pozwala na szerokie otwarcie aparatów szparkowych w naskórku, co znacznie ułatwia Agrobacterium wnikanie do komórek naskórka liścia.
  4. Używając kolorowych taśm oznaczonych datami, oznacz liście, które mają zostać przeniknięte. Oznacz obszary, które mają zostać zinfiltrowane, czarnym grubym sharpie (opcjonalnie; infiltrowane obszary są widoczne po zainfekowaniu).
  5. Pobrać równe objętości zawiesiny Agrobacterium i wymieszać je na szalce Petriego o wymiarach 100 x 15 mm, delikatnie obracając (ryc. 2E). Uwaga: W naszym przypadku zmieszaliśmy 1 ml p19 z 1 ml CFP-BASL, 1 ml DNyda-nYFP i 1 ml DNmpk-cYFP.
  6. W trakcie infiltracji napełnić 3 ml strzykawkę bezigłową mieszaniną infiltracyjną (1 - 2 ml) i wepchnąć w dolną stronę (abaksjalną) liścia tytoniu (ryc. 2F). Podczas infiltracji pomocne jest używanie jednej ręki do pchania, a drugiej do delikatnego podpierania górnej strony (adaksjalnie, wbrew sile pchania).
    Uwaga: Po pomyślnym wstrzyknięciu mieszaniny naciekowej zainfekowane obszary staną się łatwo rozpoznawalne w naskórku. Jednak infiltracja może się nie powieść z powodu ostrego wstrzyknięcia (uszkodzenie tkanki) lub niewystarczającego pchnięcia (brak penetracji cieczy). Do każdego badania sugerujemy co najmniej dwa zastrzyki w dwa niezależne liście (z różnych roślin).
  7. Umieść zainfekowane rośliny z powrotem w komorze wzrostowej. Ogólnie rzecz biorąc, ekspresje białek są wykrywalne po 48 godzinach od infiltracji.

4. Obrazowanie konfokalne

  1. Po 48 godzinach od infiltracji należy użyć dziurkacza, aby wyciąć krążek liściowy z obszaru wstrzyknięcia (zwykle można wyprodukować 3 - 4 krążki/obszar) (Rysunek 2G). Za pomocą pęsety delikatnie przenieś krążki liściowe na zjeżdżalnię (stroną z abaxialnym do góry) i zamontuj je za pomocą kropli wody. Unikaj zbyt mocnego naciskania na szkiełko nakrywkowe, ponieważ ściśnięte/uszkodzone komórki nie będą dobrze widoczne pod mikroskopem konfokalnym (ryc. 2H).
  2. Przed obrazowaniem konfokalnym zeskanuj zamontowane próbki pod mikroskopem epifluorescencyjnym w celu sprawdzenia poziomów ekspresji. Uwaga: Opierając się na naszym doświadczeniu, komórki, które wykazują pośrednie poziomy ekspresji, są najlepiej reprezentowane pod mikroskopem konfokalnym.
  3. Zacznij od soczewki 40X (NA 1.3) w mikroskopie konfokalnym. Ustaw szkiełko w żądanej pozycji, tak aby komórki wyrażające średnie poziomy białka fluorescencyjnego pozostały w środku. Widma wzbudzenia/emisji dla CFP i YFP wynoszą odpowiednio 458 nm / 480 - 500 nm i 514 nm / 520 - 540 nm.
  4. Aktywuj przycisk "Na żywo", aby wyświetlić podgląd obrazów, a następnie dostosuj intensywność lasera i inteligentne wzmocnienie, aby uzyskać najbardziej zrównoważony stosunek intensywności fluorescencji do szumu. Aby poprawić jakość obrazowania, zwiększ liczbę skanowanych pikseli i/lub średnią klatki/linii. Na koniec wyreguluj pokrętło ostrości, aby dotrzeć do środkowej płaszczyzny ogniskowej i kliknij "Przechwyć", aby zrobić zdjęcie.
    Uwaga: Obrazy CFP i YFP mogą być rejestrowane sekwencyjnie lub równocześnie, zaznaczając odpowiednio opcję "sekwencyjnego" trybu skanowania.
  5. Gdy projekcja Z jest pożądana w celu uzyskania dogłębnego widoku komórek, wybierz tryb obrazowania "xyz", określ głębokość zakresu skanowania (10 - 15 μm) i zbierz obrazy od góry do dołu komórki docelowej. Skompiluj uzyskane obrazy za pomocą oprogramowania Leica, klikając prawym przyciskiem myszy plik obrazu, aby wybrać "zmień nazwę" i wyeksportować obrazy jako pliki .tiff.
  6. Obraz 30 - 40 komórek do analizy ilościowej.

5. Przetwarzanie obrazu i analiza ilościowa

  1. Użyj oprogramowania Fiji (http://fiji.sc/Fiji) do przetwarzania obrazów i przeprowadzania kwantyfikacji.
    1. Wykreśl wykresy intensywności fluorescencji.
      1. Aby lepiej zobrazować, czy ekspresja CFP/YFP jest równomiernie rozłożona, użyj Fidżi do zademonstrowania siły sygnału CFP i YFP wzdłuż obwodu komórki. Aby to osiągnąć, najpierw uruchom Fidżi, a następnie wybierz "Plik" i "Otwórz", aby uruchomić obraz. Kliknij "linia" w menu narzędzi i wybierz "Linia segmentowa", klikając prawym przyciskiem myszy. Wybierz obszar zainteresowania i narysuj linię wzdłuż obwodu komórki, aby prześledzić sygnał CFP lub YFP (rysunek 3A-C).
        Uwaga: Fidżi mierzy bezwzględną wartość intensywności fluorescencji wzdłuż linii segmentowych.
      2. Wybierz menu rozwijane "Analizuj" i "Profil wykresu", aby wygenerować wykres z wartościami pozycji i intensywności, które reprezentują poziomy CFP/YFP wzdłuż linii segmentowej. W razie potrzeby zduplikuj wartości intensywności (wybierając menu "Kopiuj") do programu EXCEL lub innego oprogramowania graficznego, aby wygenerować porównywalne wykresy intensywności.
    2. Określ ilościowo stopień polaryzacji.
      1. Zbierz około 20 reprezentatywnych komórek z 3 powtórzonych eksperymentów, aby ocenić stopień polarności CFP i YFP w komórkach tytoniowych. Obliczyć stopień polaryzacji na podstawie stosunku wysokiej intensywności fluorescencji (zdefiniowanej jako H) do niskiej intensywności fluorescencji (zdefiniowanej jako L). Uwaga: Metodę oznaczania ilościowego wyjaśniono na rysunku 3.
        1. Aby zmierzyć wartości H i L, narysuj linię segmentową wzdłuż zainteresowanego obszaru na obrzeżach komórki (opisanej powyżej), kliknij "Analizuj" z menu rozwijanego, a następnie wybierz "Zmierz". Gdy pojawi się okno "Wyniki", użyj wartości "Średnia", aby przeprowadzić kwantyfikację.
        2. Z komórek wykazujących względnie jednolitą ekspresję CFP i YFP, np. CFP-BASL (Figura 3A) lub YFP uzupełniony z koekspresji DNyda-nYFP i DNmpk6-cYFP (Figura 3B), uzyskaj wartości H i L, mierząc dwa losowo wybrane segmenty obwodowe o równej długości.
        3. Z komórek wykazujących oczywistą polarną akumulację białek fluorescencyjnych, w tym przypadku koekspresję CFP-BASL, DNyda-nYFP i DNmpk6-cYFP (Figura 3C), zbierz wartości H z regionów peryferyjnych ze wzbogaconymi sygnałami fluorescencji i L z regionów o niskiej / zerowej akumulacji fluorescencji.
        4. Zbierz ze sobą wynikowe proporcje H/L z 20 komórek i przetestuj rozkład normalny. Oblicz wartości p za pomocą testu Studenta t (dla rozkładu normalnego) lub testu Kołmogorowa-Smirnowa (K-S) (dla rozkładu nienormalnego).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zapobiec śmierci komórki wywołanej przez nadpobudliwą sygnalizację MAPK, w teście koekspresji w komórkach tytoniowych użyto nieaktywnych wersji kinazy YDA (DNyda) i MPK6 (DNmpk6). Ani interakcja między DNyda i DNmpk6 ujawniona przez BiFC, ani sama CFP-BASL nie wygenerowały nierównomiernego wzorca dystrybucji (ryc. 3A-B). Jednakże, gdy CFP-BASL został wprowadzony do pary interakcji DNyda-DNmpk6, zarówno sygnały CFP, jak i YFP zostały redystrybuowane w sposób wysoce spo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólne zastosowanie i możliwe modyfikacje systemu ekspresji tytoniu w stanach przejściowych do transdukcji sygnału: Nadekspresja białek fluorescencyjnych (FP) znakowanych białkiem (FP) w naskórku tytoniu została z powodzeniem wykorzystana do szybkiego badania lokalizacji subkomórkowej białek w komórkach roślinnych. Jednak badanie dynamicznego rozkładu sygnalizacji kompleksu białkowego w roślinie jest trudnym tematem ze względu na skomplikowane konteksty subkomórkowe, przejściowe interakcje białk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Yumeng (Helen) Xia (Rutgers University) za redakcję manuskryptu. Prace nad powstawaniem polaryzacji BASL są wspierane przez granty z amerykańskiego Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych dla J.D. (R01GM109080) i Rutgers University.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Polimeraza DNA PhusionNew England BiolabsM0530S
pENTR/D/TOPOLife TechnologiesK2400-20
QuickChange II XL Zestaw do mutagenezy ukierunkowanej na miejsceAgilent Technology200521
LB bulionAMRESCOJ106-2KG
Agar BactoAMRESCOJ673-1KG
GentamycynaSigma-AldrichG3632-1G
RyfampicynaSigma-AldrichR3501-1G
KanamycynaSigma-AldrichK4000-25G
SpektynomycynaSigma-AldrichS4014-5G
MgCl2Sigma-AldrichM8266-100G
25 x 75 mm ProwadnicaVWR16004-382
24 x 50 mm Szkło osłonoweVWR48393-241
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalnyLeica Oprogramowanie TCS SP5II LAS AF Lite
Obiektyw 40XLeicaHCX  Plan APO HCX  Plan APO, NA 1.30
WirówkaThermo ScientificSORVALL 6+
DziurkaczZszywki
50 ml probówki sokołaGenesee Scientific21-108
No. 5 KleszczeCanemco & Marivac205EQA-Specyfikacja

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis. Cell. 137, 1320-1330 (2009).
  2. Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis. Cell. 116, 109-119 (2004).
  3. Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304, 1494-1497 (2004).
  4. Lampard, G. R., Lukowitz, W., Ellis, B. E., Bergmann, D. C. Novel and expanded roles for MAPK signaling in Arabidopsis stomatal cell fate revealed by cell type-specific manipulations. Plant Cell. 21, 3506-3517 (2009).
  5. Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19, 63-73 (2007).
  6. Zhang, Y., Wang, P., Shao, W., Zhu, J. K., Dong, J. The BASL Polarity Protein Controls a MAPK Signaling Feedback Loop in Asymmetric Cell Division. Dev Cell. 33, 136-149 (2015).
  7. Xu, R., Li, Q. Q. Protocol: Streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway(R) TOPO vector system. Plant methods. 4, 4(2008).
  8. Bush, S. M., Krysan, P. J. Mutational evidence that the Arabidopsis MAP kinase MPK6 is involved in anther, inflorescence, and embryo development. J Exp Bot. 58, 2181-2191 (2007).
  9. Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harbor protocols. , 738-742 (2013).
  10. Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes Dev. 19, 1855-1860 (2005).
  11. Yuan, L., et al. Allosteric regulation of transport activity by heterotrimerization of Arabidopsis ammonium transporter complexes in vivo. Plant Cell. 25, 974-984 (2013).
  12. Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH protocols. 2006 (7), (2006).
  13. Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. Plant J. 33, 949-956 (2003).
  14. Rivero, L., et al. Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods in molecular biology. 1062, Clifton, N.J. 3-25 (2014).
  15. Yang, Z. Cell polarity signaling in Arabidopsis. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 551-575 (2008).
  16. Zhang, J., Nodzynski, T., Pencik, A., Rolcik, J., Friml, J. PIN phosphorylation is sufficient to mediate PIN polarity and direct auxin transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 918-922 (2010).
  17. Furutani, M., et al. Polar-localized NPH3-like proteins regulate polarity and endocytosis of PIN-FORMED auxin efflux carriers. Development. 138, 2069-2078 (2011).
  18. Takano, J., et al. Polar localization and degradation of Arabidopsis boron transporters through distinct trafficking pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 5220-5225 (2010).
  19. Truernit, E., Bauby, H., Belcram, K., Barthelemy, J., Palauqui, J. C. OCTOPUS, a polarly localised membrane-associated protein, regulates phloem differentiation entry in Arabidopsis thaliana. Development. 139, 1306-1315 (2012).
  20. Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis. Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).
  21. Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth. Nature. 443, 458-461 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Test BiFCsystem ekspresji tytoniowejoddzia ywanie bia ko bia kob ona plazmatycznabia ko rusztowaniowe BASLkolory bia ek fluorescencyjnychkwantyfikacja rozk adu bia ek

Powiązane artykuły