Na poziomie subkomórkowym, zdarzenia sygnalizacyjne są dynamicznie modulowane przez sygnały rozwojowe i środowiskowe. W tym miejscu opisujemy protokół, który wykorzystuje system przejściowej ekspresji tytoniu do monitorowania dynamicznej interakcji białko-białko i ujawniania przestrzennej organizacji transdukcji sygnału w komórkach roślinnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie przestrzennej reorganizacji szlaku sygnałowego MAPK przy użyciu systemu przejściowej ekspresji tytoniu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wizualizacja dynamicznych zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach była wyzwaniem. Rozszerzyliśmy ustalony system ekspresji przejściowej, test biomolekularnej komplementacji fluorescencyjnej (BiFC) w komórkach naskórka tytoniu, z testowania interakcji białko-białko do monitorowania przestrzennego rozkładu transdukcji sygnału w komórkach roślinnych. W tym protokole użyliśmy testu BiFC, aby pokazać, że interakcja i sygnalizacja między Arabidopsis MAPKKK YODA i MAPK6 zachodzą na błonie plazmatycznej. Gdy białko rusztowania BASL uległo jednoczesnej ekspresji, interakcja YODA-MAPK uległa redystrybucji i przestrzennej kopolaryzacji z CFP-BASL. Ten zmodyfikowany system ekspresji tytoniu pozwala na szybkie badanie lokalizacji sygnalizacji i zmian dynamicznych (mniej niż 4 dni) i może pomieścić wiele kolorów białek fluorescencyjnych (co najmniej trzy). Przedstawiliśmy również szczegółowe metody ilościowego określania rozmieszczenia białek (asymetryczna lokalizacja przestrzenna lub "polaryzacja") w komórkach tytoniowych. Ten zaawansowany system ekspresji tytoniu może być szeroko stosowany do szybkiego testowania dynamicznych zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach roślinnych.
Wprowadzenie
Białka oddziałują na siebie w skomplikowanej hierarchicznej sieci i tworzą kompleksy, które odgrywają kluczową rolę w prawie wszystkich procesach biologicznych zachodzących w nieprzewidywalnym środowisku komórkowym. Jednak od rozwoju roślin po reakcje wzrostowe brakuje wygodnych narzędzi, które mogą nie tylko szybko, ale także skutecznie identyfikować i monitorować te dynamiczne zdarzenia sygnalizacyjne na poziomie subkomórkowym.
System przejściowej ekspresji białek w naskórku liści tytoniu ma atrakcyjne zalety do wizualizacji białek fluorescencyjnych w żywych komórkach. System ten zapewnia warunki semi-in vivo, które umożliwiają p....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Budowa plazmidu
- Wygeneruj konstrukty za pomocą technologii klonowania, jak opisano wcześniej1,6.
- Najpierw użyj polimerazy DNA o wysokiej wierności z odpowiednimi starterami, aby amplifikować sekwencje kodujące BASL, YDA i MPK6 i sklonować je do wektorów wejściowych. Szczegółowy protokół znajduje się w 7.
- Aby wygenerować dominujące ujemne wersje MPK6 i YDA (odpowiednio DNmpk68 i DNyda4), użyj plazmidów wejściowych MPK6 i YDA jako matrycy i wprowadź mutacje punktowe metodą mutagenezy ukierunkowanejna miejsce 9.
- Aby zbudować konstrukty do testów stanów prz....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby zapobiec śmierci komórek indukowanej przez nadaktywny szlak sygnałowy MAPK, w badaniu koekspresji w komórkach tytoniu zastosowano nieaktywne kinazowo wersje YDA (DNyda) oraz MPK6 (DNmpk6). Ani oddziaływanie pomiędzy DNyda a DNmpk6 ujawnione za pomocą BiFC, ani sam CFP-BASL nie wywołały nierównomiernego wzorca rozmieszczenia (Rycina 3A-B). Jednakże, po wprowadzeniu CFP-BASL do pary oddziałującej DNyda-DNmpk6, sygnały CFP i YFP uległy redystrybucji w sposób silnie spola.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ogólne zastosowanie i możliwe modyfikacje systemu ekspresji tytoniu w stanach przejściowych do transdukcji sygnału: Nadekspresja białek fluorescencyjnych (FP) znakowanych białkiem (FP) w naskórku tytoniu została z powodzeniem wykorzystana do szybkiego badania lokalizacji subkomórkowej białek w komórkach roślinnych. Jednak badanie dynamicznego rozkładu sygnalizacji kompleksu białkowego w roślinie jest trudnym tematem ze względu na skomplikowane konteksty subkomórkowe, przejściowe interakcje białk.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie stwierdzono konfliktu interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Yumeng (Helen) Xia (Rutgers University) za redakcję manuskryptu. Prace nad powstawaniem polaryzacji BASL są wspierane przez granty z amerykańskiego Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych dla J.D. (R01GM109080) i Rutgers University.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Polimeraza DNA Phusion | New England Biolabs | M0530S | |
| pENTR/D/TOPO | Life Technologies | K2400-20 | |
| QuickChange II XL Zestaw do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce | Agilent Technology | 200521 | |
| LB bulion | AMRESCO | J106-2KG | |
| Agar Bacto | AMRESCO | J673-1KG | |
| Gentamycyna | Sigma-Aldrich | G3632-1G | |
| Ryfampicyna | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| Kanamycyna | Sigma-Aldrich | K4000-25G | |
| Spektynomycyna | Sigma-Aldrich | S4014-5G | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| 25 x 75 mm Prowadnica | VWR | 16004-382 | |
| 24 x 50 mm Szkło osłonowe | VWR | 48393-241 | |
| Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny | Leica | Oprogramowanie TCS SP5 | II LAS AF Lite |
| Obiektyw 40X | Leica | HCX Plan APO | HCX Plan APO, NA 1.30 |
| Wirówka | Thermo Scientific | SORVALL 6+ | |
| Dziurkacz | Zszywki | ||
| 50 ml probówki sokoła | Genesee Scientific | 21-108 | |
| No. 5 Kleszcze | Canemco & Marivac | 205EQA-Specyfikacja |
Bibliografia
- Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis. Cell. 137, 1320-1330 (2009).
- Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis. Cell. 116, 109-119 (200....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
