Artykuł metodologiczny

Analiza migracji komórek in vivo przy użyciu przeszczepów komórek i obrazowania poklatkowego w zarodkach danio pręgowanego

DOI:

10.3791/53792

⸱

29 kwietnia 2016

 ,  , 
1CNRS UMR8197 – INSERM U1024, IBENS, Institut de Biologie de l'École Normale Supérieure, 2Department of Physiology Development and Neuroscience, University of Cambridge

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Łącząc transplantację komórek, znakowanie cytoszkieletu i podejście do utraty/wzmocnienia funkcji, ten protokół opisuje, w jaki sposób migrująca prospektywna płytka przedstrunowa danio pręgowanego może być wykorzystana do analizy funkcji genu kandydującego w migracji komórek in vivo.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Migracja komórek jest kluczem do wielu fizjologicznych i patologicznych stanów, w tym przerzutów raka. Komórkowe i molekularne podstawy migracji komórek zostały dokładnie przeanalizowane in vitro. Jednak migracja komórek in vivo w jakiś sposób różni się od migracji in vitro i okazała się trudniejsza do analizy, ponieważ jest mniej dostępna do bezpośredniej obserwacji i manipulacji. Protokół ten wykorzystuje migrację prospektywnej płytki przedstrunowej we wczesnym zarodku danio pręgowanego jako system modelowy do badania funkcji genów kandydujących w migracji komórek. Przodkowie płytki przedstrunowej tworzą grupę komórek, która podczas gastrulacji ulega ukierunkowanej migracji z organizatora zarodka do bieguna zwierzęcego zarodka. Proponowany protokół wykorzystuje przeszczep komórek do tworzenia mozaikowych zarodków. Daje to połączone korzyści w postaci znakowania izolowanych komórek, co jest kluczem do dobrego obrazowania, oraz ograniczania efektów wzmocnienia/utraty funkcji do obserwowanych komórek, zapewniając w ten sposób efekty autonomiczne dla komórek. Opisujemy tutaj, w jaki sposób oceniliśmy funkcję składnika TORC2 Sin1 w migracji komórek, ale protokół można wykorzystać do analizy funkcji dowolnego genu kandydującego w kontrolowaniu migracji komórek in vivo.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W organizmach wielokomórkowych migracja komórek jest niezbędna zarówno dla rozwoju zarodka, gdzie zapewnia organizację komórek w tkanki i organy, jak i dla dorosłego życia, gdzie bierze udział w homeostazie tkanek (gojeniu się ran) i odporności. Oprócz tych funkcji fizjologicznych migracja komórek jest również zaangażowana w różne sytuacje patologiczne, w tym w szczególności w przerzuty raka.

Migracja komórek jest analizowana in vitro od dziesięcioleci, dostarczając ogólnego zrozumienia mechanizmów molekularnych zapewniających ruchy komórek na płaskich powierzchniach. Jednak in vivo komórki mają do czynienia z bardziej złożonym środowiskiem. W ostatnich latach wyraźnie okazało się, że na migrację wewnątrz organizmu mogą wpływać sygnały zewnętrzne, takie jak macierz zewnątrzkomórkowa, sąsiednie komórki lub wydzielane chemokiny kierujące migracją, oraz że mechanizmy kierujące migracją komórek mogą różnić się od tych, które opisano in vitro1,2. Mechanizmom zapewniającym migrację komórek in vivo poświęcono dotychczas mniej uwagi, głównie ze względu na zwiększone trudności techniczne w porównaniu z badaniami in vitro. Analiza migracji komórek in vivo wymaga w szczególności bezpośredniego dostępu optycznego do migrujących komórek, technik znakowania unikalnych komórek w celu zobaczenia ich dynamiki i morfologii, a także podejść polegających na uzyskiwaniu lub tracie funkcji w celu zbadania roli genów kandydujących. Do tej pory tylko kilka układów modelowych posiadających te cechy wykorzystano do analizy migracji komórek in vivo 3.

Niedawno wykorzystaliśmy migrację prospektywnej płytki przedstrunowej we wczesnych zarodkach zebry danio pręgowanego jako nowy wygodny system modelowy do oceny funkcji genów kandydujących w kontrolowaniu migracji komórek in vivo 4,5. Prospektywna płytka przedstrunowa (znana również jako mezendoderma przednia) to grupa komórek tworzących się na początku gastrulacji po grzbietowej stronie zarodka. Podczas gastrulacji grupa ta kolektywnie migruje w kierunku bieguna zwierzęcego zarodka6-8, tworząc płytkę przedstrunową, zgrubienie mezendodermalne, przed struną grzbietową i poniżej płytki nerwowej. Przednia część płytki przedstrunowej spowoduje powstanie gruczołu wylęgowego, podczas gdy jego tylna część prawdopodobnie przyczynia się do mezodermy głowy9. Dzięki zewnętrznemu rozwojowi i przejrzystości optycznej zarodka ryby, migrację komórek można bezpośrednio i łatwo zaobserwować w tej strukturze.

Przeszczep komórek jest bardzo skuteczną techniką, która pozwala na szybkie i łatwe tworzenie mozaikowych zarodków10. Ekspresja fluorescencyjnych markerów cytoszkieletu w przeszczepionych komórkach powoduje znakowanie izolowanych komórek, których morfologię i dynamikę można łatwo zaobserwować. Połączenie tego z podejściem opartym na utracie lub wzmocnieniu funkcji pozwala na analizę autonomicznych funkcji genu kandydującego.

Prezentowany protokół opisuje, jak oceniliśmy funkcję składnika TORC2 Sin1 w kontrolowaniu migracji komórek i dynamiki aktyny in vivo5. Ale, jak wspomniano w wynikach i omówiono dalej, można go wykorzystać do analizy potencjalnego wpływu dowolnego genu kandydującego na kontrolowanie migracji komórek in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga: Rysunek 1 przedstawia zarys protokołu.

1. Przygotowanie igieł do iniekcji i transplantacji

Uwaga: Igły można przygotować w dowolnym momencie i przechowywać. Trzymaj je na szalce Petriego, na pasie z plasteliny. Uszczelnij naczynie parafilmem, aby chronić je przed kurzem.

  1. W przypadku igieł do wstrzykiwań należy pociągnąć szklaną kapilarnę (średnica zewnętrzna 1,0 mm, średnica wewnętrzna 0,58 mm, bez filamentu (patrz lista materiałów)) za pomocą ściągacza do mikropipet (patrz lista materiałów). Preferuj krótkie i cienkie igły (zwężająca się część około 5 mm), ponieważ są one bardziej skuteczne w przekłuwaniu kosmówki.
    Uwaga: Igły iniekcyjne są jednorazowego użytku.
  2. Igła do przeszczepu komórek
    1. Pociągnij szklaną kapilarnę (średnica zewnętrzna 1,0 mm, średnica wewnętrzna 0,78 mm, bez filamentu (patrz lista materiałów)) za pomocą ściągacza do mikropipet.
    2. Za pomocą mikrokuźni (patrz lista materiałów) odetnij końcówkę igły w miejscu, w którym średnica wewnętrzna wynosi 35 μm (nieco więcej niż średnica komórek, które mają być przeszczepione).
    3. Ukosuj przecięty koniec kapilary za pomocą mikroszlifierki (patrz lista materiałów) pod kątem 45°.
    4. Opcjonalnie pociągnij zadzior na końcu igły za pomocą mikrokuźni. W tym celu dotknij gorącego włókna końcówką skosu i szybko go odciągnij, tworząc zadzior, który może pomóc w penetracji zarodka.
    5. Zamontować igłę na uchwycie igły przymocowanym do strzykawki. Za pomocą strzykawki przepłukać wnętrze igły trzykrotnie 2% kwasem fluorowodorowym w celu usunięcia resztek szkła, a następnie trzykrotnie spłukać acetonem.
      Uwaga: kwas fluorowodorowy jest toksyczny, manipuluj pod maską, w rękawiczkach.
      Uwaga: Igły do przeszczepu komórek mogą być używane kilka razy.

2. Przygotowanie potraw do iniekcji i przeszczepu komórek

  1. Podgrzej 50 ml pożywki dla zarodków11 zawierającej 0,5 g agarozy w kuchence mikrofalowej przez 1 minutę z pełną mocą, aby uzyskać 1% agarozy w pożywce dla zarodków. Schłodzić żel agarozowy do temperatury około 60 °C i wlać 50 ml na szalkę Petriego o średnicy 90 mm. Umieścić na powierzchni żelu specjalnie zaprojektowaną formę (patrz wykaz materiałów), z liniami do naczynia iniekcyjnego lub z dołkami do naczynia do przeszczepu komórek.
    1. Obserwuj, jak pleśń unosi się na agarozie, jeśli agaroza nie jest zbyt gorąca. Po związaniu żelu agarozowego usuń formę za pomocą kleszczyków (Rysunek 2A-B).
      Uwaga: potrawy można przechowywać w temperaturze 4 °C, do kilku tygodni. Przechowuj je w zamkniętym mokrym pudełku, aby uniknąć wyschnięcia.
  2. Umieścić naczynie w inkubatorze w temperaturze 28 °C na 30 minut przed użyciem.

3. Pobieranie zarodków i iniekcja

  1. Przygotowanie roztworu do wstrzykiwań
    Uwaga: Domena wiążąca aktynę drożdżowego białka wiążącego aktynę 140 (ABP-140), taka jak Lifeact związana z mCherry (określana jako ABP140-mCherry) służy do wizualizacji spolimeryzowanej aktyny w komórce, w celu analizy aktywności wystającej. Dodaj inny związek, aby przetestować funkcję genu kandydującego (np. mRNA dominującego konstruktu ujemnego lub konstytutywnie aktywnego lub oligonukleotydy morfolino). Aby ocenić funkcje Sin1 opisane w wynikach (ryc. 3), użyliśmy oligonukleotydów morfolino. Jako kontrolę użyliśmy morfolina identycznego z morfolinem sin1, ale dla 5 nukleotydów rozmieszczonych wzdłuż sekwencji, tak że ten kontrolny morfolino nie pasuje do docelowego RNA.
    1. Rozmrozić morfoliny kontrolne sin1 i 5-niedopasowania (roztwory podstawowe 2 mM) oraz mRNA ABP140-mCherry na lodzie. Dodać 375 ng mRNA (75 ng / μl końcowy) i 0,75 μl morfolina kontrolnego sin1 lub 5-niezgodności (0,3 mM końcowy) w buforze Danieau (58 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,4 mM MgSO4, 0,6 mM Ca(NO3)2, 5,0 mM HEPES pH 7,6), aby uzyskać całkowitą objętość 5 μl.
  2. Pobieranie zarodków
    Uwaga: w tym zestawie eksperymentalnym zarówno zarodki dawcy, jak i gospodarza są transgeniczne, wykazując ekspresję GFP pod kontrolą promotora gęsi (gsc) w celu uwidocznienia potencjalnej płytki przedstrunowej11.
    1. Zbierz jaja Tg(gsc:gfp). Umieścić około 80 jaj na szalce Petriego o średnicy 90 mm wypełnionej pożywką dla zarodków i inkubować w temperaturze 28 °C.
  3. Wstrzykiwanie zarodków dawcy
    1. Pod mikroskopem stereoskopowym delikatnie wyciśnij pobrane zarodki kleszczami w linie naczynia iniekcyjnego wypełnionego pożywką dla zarodków. Za pomocą kleszczy ustaw zarodki tak, aby komórki były skierowane do góry. Umieścić naczynie iniekcyjne w inkubatorze w temperaturze 28 °C do momentu, gdy zarodki osiągną stadium 4-komórkowe (1 godzinę po zapłodnieniu).
    2. Na igłę do wstrzykiwań należy wlać 2 μl roztworu do wstrzykiwań. Włóż igłę do uchwytu igły (patrz lista materiałów), który jest umieszczony w mikromanipulatorze (patrz lista materiałów) i połączony rurką z politetrafluoroetylenu (PTFE) (patrz lista materiałów) z transjektorem powietrznym (patrz lista materiałów).
    3. Otwórz kapilarę, delikatnie dotykając końcówki drobnymi kleszkami. W razie potrzeby rozetnij kapilarę, ściskając jej koniec.
    4. Wprowadzić igłę do jednej z czterech komórek i wstrzyknąć roztwór do wnętrza komórki, aby wypełnić 70% objętości komórki (2 nl). Wstrzyknąć 30 zarodków.
      Uwaga: Wprowadzenie igły do komórki może być trudne, ponieważ błona plazmatyczna jest miękka. Celowanie w połączenie między komórką a żółtkiem ułatwia penetrację igły.
    5. Umieścić zarodki w inkubatorze w temperaturze 28 °C do momentu, gdy osiągną stadium kuli (4 godziny po zapłodnieniu).

4. Przygotowanie zarodków do przeszczepu komórek

  1. Przygotować 20 ml pożywki zarodkowej z 200 μl penicyliny/streptomycyny (patrz wykaz materiałów) (wstrzykiwacz/Strep EM).
  2. Dechorionacja zarodków w fazie kulistej (4 godziny po zapłodnieniu)
    Uwaga: Zarodki z odkorzędowaną kosmówką są bardzo delikatne i eksplodują w przypadku kontaktu z powietrzem lub plastikiem. W związku z tym należy je umieścić w naczyniach pokrytych agarozą i przenieść za pomocą pipet Pasteura z polerowanego ogniowo szkła.
    1. Za pomocą plastikowej pipety Pasteura przenieść zarodki gospodarza pobrane w kroku 3.2 i zarodki dawcy wstrzyknięte w kroku 3.3 na dwie 35-milimetrowe szalki Petriego pokryte 1% agarozą w pożywce dla zarodków i wypełnione wstrzykiwaczem/Strep EM. Przechowuj zarodki gospodarza i zarodki dawcy w dwóch oddzielnych naczyniach.
    2. Ręcznie wyekstrahuj zarodki z ich kosmówki za pomocą cienkiej pęsety (patrz lista materiałów).
    3. Umieścić zarodki w inkubatorze w temperaturze 28 °C do momentu, gdy osiągną etap osłony (6 godzin po zapłodnieniu).

5. Przeszczep komórek

  1. Ułóż zarodki do przeszczepu komórek.
    1. Pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym wybierz zarodki dawcy wykazujące ekspresję ABP140-mCherry (czerwony) w tarczy (zielony).
    2. Za pomocą wypolerowanej na gorąco pipety Pasteura przenieś zarodki do dołków naczynia do przeszczepu komórek wypełnionego Pen/Strep EM. Umieść zarodki gospodarza w jednym rzędzie, a zarodki dawcy w sąsiednim rzędzie.
    3. Za pomocą rzęsy ostrożnie ułóż zarodki z tarczą do góry.
      Uwaga: położenie tarczy można ocenić za pomocą ekspresji GFP lub anatomicznie.
  2. Konfiguracja systemu transplantacji.
    Uwaga: System transplantacyjny składa się z uchwytu na igłę (patrz lista materiałów) połączonego z rurką PTFE (patrz lista materiałów) oraz łącznika rurki (patrz lista materiałów) do strzykawki Hamilton wyposażonej w mikronapęd (patrz lista materiałów). Uchwyt igły jest zamontowany na mikromanipulatorze 3-kierunkowym (patrz lista materiałów).
    1. Za pomocą uchwytu na igłę dołączonego do strzykawki, przepłukać igłę do przeszczepu komórek 70% etanolem. Wysuszyć przez zassanie powietrza do igły. Nie suszyć przez, ponieważ może to spowodować utknięcie kurzu w stożkowej części igły.
    2. Włożyć igłę do uchwytu igły połączonego ze strzykawką Hamiltona, skosem do góry.
  3. Przeszczep komórek od tarczy do tarczy
    1. Wprowadź do tarczy zarodka dawcy za pomocą igły do przeszczepu i pobierz około 10-20 komórek oznaczonych ABP140-mCherry. Ostrożnie unikaj rysowania żółtka.
    2. Przeszczep komórki do tarczy zarodka gospodarza. Powtarzaj tę czynność, aż wszystkie zarodki gospodarza zostaną przeszczepione.
    3. Usuń wszelkie uszkodzone zarodki za pomocą wypolerowanej ogniowo pipety Pasteura. Umieścić przeszczepione zarodki w inkubatorze w temperaturze 28 °C i pozostawić do zregenerowania przez około 30 minut.
    4. Za pomocą uchwytu na igłę dołączonego do strzykawki spłucz igłę do przeszczepu komórek wodą i umieść ją z powrotem na szalce Petriego na taśmie z plasteliny. Uszczelnij naczynie parafilmem.

6. (OPCJONALNIE) Przeszczep pojedynczej komórki

Uwaga: W zarodku komórki przylegają do siebie, tak że trudno jest pobrać tylko jedną komórkę do igły do przeszczepu. Opracowaliśmy zmodyfikowany protokół, aby łatwo przeszczepić pojedyncze komórki progenitorowe płytki przedstrunowej. Chodzi o to, aby oddzielić komórki przed przeszczepem. Ponieważ izolowane komórki progenitorowe płytki przedstrunowej mają tendencję do utraty swojej tożsamości, genetycznie narzucamy im potencjalną tożsamość płytki przedstrunowej, aktywując węzłowy szlak sygnałowy, przy braku czynnika transkrypcyjnego Sox32. Sprawdziliśmy, że te indukowane komórki zachowują się jak endogenne komórki progenitorowe płytki przedstrunowej8. Poniżej znajdują się konkretne kroki, które należy wykonać, aby wykonać przeszczepy pojedynczych komórek. Dysocjację komórek uzyskuje się poprzez umieszczenie zarodków w bezwapniowym Ringer11, rozcięcie eksplantatu i mechaniczne jego wymieszanie.

  1. W kroku 2.1 przygotuj naczynie do przeszczepu z 1% agarozą w bezwapniowym Ringerze zamiast na pożywce dla zarodków.
  2. W kroku 3.1, oprócz ABP140-mCherry RNA i sin1 morpholino, dodaj 3 ng RNA kodujących aktywną formę receptora węzłowego Taram-A (0,6 ng / μl końcowy) i 1,25 μl morfolina przeciwko sox32 (roztwór podstawowy w 2 mM, stąd 0,5 mM końcowy).
  3. Po kroku 4 przenieś trzy wybrane zarodki dawcy do naczynia do przeszczepu komórek wypełnionego wstrzykiwaczem/paciorkowcowym Dzwonkiem bez wapnia za pomocą wypolerowanej ogniowo pipety Pasteura. Za pomocą cienkiej pęsety wypreparuj eksplant zawierający wstrzyknięte komórki (komórki oznaczone ABP140-mCherry). Szybko wyrzuć resztę zarodków.
  4. Rzęsą delikatnie mieszaj eksplantat, aż komórki się rozdzielą.
  5. Pobrać pojedynczą izolowaną komórkę w igłę do przeszczepu i przeszczepić ją do tarczy zarodka gospodarza.
  6. Za pomocą wypolerowanej na gorąco pipety Pasteura przenieś zarodki do naczynia pokrytego agarozą wypełnionego Pen/Strep EM. Umieścić zarodki w inkubatorze w temperaturze 28 °C na 30 minut.

7. Montaż zarodka

  1. Komora obrazowania
    1. Metoda 1: użyj komory obrazowania składającej się z plastikowego szkiełka (75*25*0,5 mm) przebitego 4 otworami (średnica 5,5 mm), z krawędziami o wysokości 3 mm po jednej stronie (rysunek 2C-D). Przyklej szklane szkiełko nakrywkowe z tyłu za pomocą kleju cyjanoakrylowego (super klej).
      Uwaga: Pod koniec eksperymentu umieść komorę w wodzie na jedną noc, aby usunąć szkiełko nakrywkowe i pozbyć się resztek kleju papierem ściernym.
    2. Metoda 2: użyj naczyń ze szklanym dnem MatTek o średnicy 35 mm (patrz lista materiałów) z otworem 10 mm.
  2. Montowanie zarodków
    1. Napełnić szklaną fiolkę 1 ml gorącej 0,2% agarozy w pożywce dla zarodków. Przechowywać w temperaturze 42 °C w bloku grzewczym.
    2. Pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym wybierz zarodek, w którym przeszczepione na czerwono komórki są częścią prospektywnej płytki przedstrunowej oznaczonej na zielono (tj. przeszczepione czerwone komórki znajdują się w zielonej prospektywnej płytce przedstrunowej i zaczęły migrować w kierunku bieguna zwierzęcego).
    3. Przenieś wybrany zarodek do roztworu agarozy za pomocą wypolerowanej ogniowo pipety Pasteura. Wyrzucić nadmiar pożywki zarodkowej z pipety. Narysuj zarodek w pipecie z agarozą i przenieś zarodek do komory obrazowania, deponując kroplę agarozy. Przed zawiązaniem agarozy zorientuj zarodek rzęsą. Umieść prospektywną płytkę przedstrunową do góry w celu obrazowania za pomocą mikroskopu pionowego lub na szklanym dnie w przypadku obrazowania za pomocą mikroskopu odwróconego. Poczekaj, aż agaroza się zetnieje (około 1 minuty, w zależności od temperatury pokojowej) przed umieszczeniem kolejnego zarodka w następnym dołku komory.
      Uwaga: komora obrazowania zawierająca 4 dołki pozwala na zamontowanie do 4 zarodków.
    4. Gdy agaroza jest zestalona, napełnij komorę Pen/Strep EM, aby uniknąć wysuszenia.

8. Obrazowanie na żywo

  1. Użyj 40-krotnego obiektywu dalekiego zasięgu zanurzonego w wodzie. Użyj odpowiednich zestawów filtrów do obrazowania GFP i mCherry (dla GFP: wzbudzenie BP 470/40, rozdzielacz wiązki FT 510 i emisja BP 540/50; dla mCherry: wzbudzenie BP 578/21, rozdzielacz wiązki FT 596 i emisja LP 641/75). Dostosuj czas ekspozycji, aby zoptymalizować dynamikę obrazu.
  2. Aby zobrazować wszystkie komórki na płytce, należy uzyskać stosy z, zaczynając kilka μm powyżej prospektywnej płytki przedstrunowej (w ektodermie) i kończąc kilka μm poniżej prospektywnej płytki przedstrunowej (w żółtku). Użyj kroku Z o wartości 2 μm. Aby zoptymalizować szybkość akwizycji, przełączaj kolory między stosami z, a nie między ramkami.
    Uwaga: Może to prowadzić do niewielkich różnic między zielonym i czerwonym obrazem, ale nie stanowi problemu, ponieważ nie jest wymagana precyzyjna kolokalizacja między zielonymi i czerwonymi sygnałami. Aby skrócić czas dalszego obrazowania i ekspozycji na światło, kolor zielony można uzyskać tylko raz na 5 punktów czasowych, co jest wystarczające do identyfikacji komórek progenitorowych płytki przedstrunowej.
  3. Korzystając z takich ustawień, zobrazuj do 4 zarodków w dwuminutowym odstępie czasu, który jest niezbędny do analizy częstotliwości i orientacji wypukłości. W celu analizy czasu życia występu skróć interwał czasu do 30 sekund, aby uzyskać wyższą rozdzielczość czasową. Obraz od 60% epibolii do 80% epibolii.

9. Analiza dynamiki komórek

  1. Wczytywanie obrazów 4D w formacie ImageJ
    Uwaga: W zależności od oprogramowania użytego do akwizycji, obrazy są przechowywane w różnych formatach (jeden plik na obraz, jeden plik na stos z, jeden plik na cały eksperyment). Niektóre wtyczki ImageJ są dostępne online do otwierania stosów 4D. Nasze dane są przechowywane jako jeden plik na z-stack. Ponieważ zbiór danych może być duży, wygodne może być otwarcie tylko jego części (niektórych punktów czasowych lub podczęści stosu z lub 8-bitowych przekonwertowanych obrazów...). Używamy do tego niestandardowej wtyczki ImageJ, którą z przyjemnością rozdystrybuujemy na życzenie.
  2. Analiza orientacji i częstości występowania wypukłości komórek
    1. Użyj obrazów GFP, aby określić główny kierunek potencjalnej migracji płytki przedstrunowej. Potraktuj to jako odniesienie do pomiarów kąta występów komórek. Obróć stos tak, aby ten kierunek odniesienia był równoległy do jednej strony obrazu.
    2. Podążaj za jedną komórką. Wybierz narzędzie kąta. Dla każdej ramy i każdego występu użyj narzędzia kąta, aby zmierzyć kąt między występem a kierunkiem odniesienia (Rysunek 3A). Użyj polecenia Analizuj/Mierz, aby zapisać wartość (lub naciśnij M na klawiaturze). Zapisz wyniki jako plik txt. Powtórz te czynności z następną komórką.
    3. Zaimportuj dane do formatu R i wykreśl rozkład kątów jako histogramy. Użyj testu Kołmogorowa-Smirnowa (ks.test w R), aby porównać różne warunki.
      Uwaga: Narzędzie kąta podaje wartości z zakresu od 0° do 180°, co pozwala na korzystanie z klasycznych testów statystycznych, a nie testów kołowych.
    4. Korzystając z tego zestawu danych, oblicz częstotliwość emisji jako liczbę wystających elementów na komórkę na minutę. Użyj testu T Studenta (test t.test w R), aby porównać różne warunki.
  3. Analiza czasu życia wypukłości ogniw
    1. Dla każdej komórki i każdego występu zmierz czas trwania wystania (liczba klatek, podczas których występ jest obecny x odstęp czasu między klatkami).
    2. Zaimportuj dane do R. Użyj testu T-Studenta (t.test w R), aby porównać różne warunki.
      Uwaga: Inne funkcje migracji mogą być interesujące do przeanalizowania w celu scharakteryzowania migracji komórek. Należą do nich ślady komórek, do pomiarów prędkości, kierunku i trwałości lub morfologii komórek. Niektóre komercyjne aplikacje są dostępne do pomiaru tych cech, ale dostępna jest również duża liczba aplikacji typu open source i wtyczek ImageJ, takich jak na przykład ADAPT do analizy morfodynamiki12, DiPer do analizy trajektorii komórek i trwałości kierunkowej13, CellTrack do śledzenia granic komórek podczas migracji14.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona technika została wykorzystana do analizy roli Sin1, jednego z podstawowych składników kompleksu Tor 2 (TORC2), w kontrolowaniu migracji komórek in vivo. Zastosowanie przeszczepu komórek pozwala na znakowanie wyizolowanych komórek i analizę efektów autonomicznych komórek. Film S1 przedstawia migrację przeszczepionych komórek progenitorowych płytki przedstrunowej. Znakowanie aktyny za pomocą ABP140 umożliwia łatwą wizualizację cytoplazmatycznych wypukłości bogatych w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten przedstawia łatwy sposób badania roli genu kandydującego w migracji komórek in vivo, łącząc tworzenie chimerycznych zarodków za pomocą przeszczepu komórek z obrazowaniem na żywo.

Tworzenie zarodków mozaikowych

Badanie dynamiki komórki wymaga wizualizacji jej konturu w celu analizy rozszerzeń cytoplazmatycznych. Można to osiągnąć poprzez znakowanie wyizolowanych komórek w innym nieoznakowanym – lub inaczej oznakowanym – środowisku, oferując w te...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy F. Bouallague i instytucjom IBENS za doskonałą opiekę nad danio pręgowanym. Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez Fundację ARC pour la recherche sur le cancer, granty nr SFI20111203770 i nr PJA 20131200143.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kapilary szklane (średnica zewnętrzna 1,0 mm, średnica wewnętrzna 0,58  mm)Aparat Harvard300085standardowej grubości
Kapilary szklane (średnica zewnętrzna 1,0 mm, średnica wewnętrzna 0,78 mm)Aparat Harvard300085cienkościenna
penicylina-streptomycynaSigma-AldrichP433310  000  jednostki penicyliny i 10  mg streptomycyna na ml
drobna pęsetaDumont Fine Science Tools11254-205F
naczynia ze szklanym dnemMatTekP35G-0-10-C
Transformator powietrznyEppendorf5246
Micro-forgeNarishigeMF-900
MikroszlifierkaNarishigeEG-44
Mikromanipulator (do wstrzykiwań)Mikromanipulator NarishigeMN-151
(do przeszczepu komórek)MikromanipulatorLeica
Strzykawka Hammilton ŚciągaczNarishigeIM-9B
David Kopf InstrumentsModel 720
Forma transplantacyjnaAdaptacyjne narzędzia naukowePT-1
Uchwytna igłęNarishigeHI-7
Łącznik rurowyNarishigeCI-1
Rurka PTFENarishigeCT-1
Leica do mikropipet

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Charras, G., Sahai, E. Physical influences of the extracellular environment on cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 813-824 (2014).
  2. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model. Journal of Cell Biology. 188 (1), 11-19 (2010).
  3. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature reviews. Molecular cell biology. 10 (7), 445-457 (2009).
  4. Dang, I., Gorelik, R., et al. Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration. Nature. , (2013).
  5. Dumortier, J. G., David, N. B. The TORC2 Component, Sin1, Controls Migration of Anterior Mesendoderm during Zebrafish Gastrulation. Plos One. 10, e0118474(2015).
  6. Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish. BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).
  7. Ulrich, F., Concha, M. L., et al. Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation. Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).
  8. Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 1-6 (2012).
  9. Gritsman, K., Talbot, W. S., Schier, A. F. Nodal signaling patterns the organizer. Development. 127 (5), Cambridge, England 921-932 (2000).
  10. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of visualized experiments : JoVE. (29), (2009).
  11. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
  12. Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
  13. Gorelik, R., Gautreau, A. Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration. Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).
  14. Sacan, A., Ferhatosmanoglu, H., Coskun, H. CellTrack: An open-source software for cell tracking and motility analysis. Bioinformatics. 24 (14), 1647-1649 (2008).
  15. Tahinci, E., Symes, K. Distinct functions of Rho and Rac are required for convergent extension during Xenopus gastrulation. Developmental biology. 259 (2), 318-335 (2003).
  16. Zhang, T., Yin, C., et al. Stat3-Efemp2a modulates the fibrillar matrix for cohesive movement of prechordal plate progenitors. Development. 141 (22), 4332-4342 (2014).
  17. Riedl, J., Crevenna, A. H., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  18. Burkel, B. M., Von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (11), 822-832 (2007).
  19. Yoo, S. K., Deng, Q., Cavnar, P. J., Wu, Y. I., Hahn, K. M., Huttenlocher, A. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Developmental cell. 18 (2), 226-236 (2010).
  20. Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental biology. 393 (2), 209-226 (2014).
  21. Johnson, H. W., Schell, M. J. Neuronal IP3 3-kinase is an F-actin-bundling protein: role in dendritic targeting and regulation of spine morphology. Molecular biology of the Cell. 20 (24), 5166-5180 (2009).
  22. Yi, J., Wu, X. S., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

transplantacja kom rekp ytka przedstrynowaobrazowanie in vivoanaliza wypustek aktynowychfunkcja Sin1komponent TORC2konfokalna mikroskopia ywych kom rek

Powiązane artykuły