Artykuł metodologiczny

Technika celowania w mikrowstrzyknięcie do rozwijającej się nerki Xenopus

DOI:

10.3791/53799

⸱

3 maja 2016

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Pediatric Research Center, University of Texas McGovern Medical School, 2Program in Genes & Development, University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences, 3Program in Cell & Regulatory Biology, University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences, 4Department of Genetics, University of Texas MD Anderson Cancer Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do wykorzystania map losu i znaczników linii do celowania w zastrzyki do poszczególnych blastomerów, które dają początek nerkom zarodków Xenopus laevis.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embrionalna nerka Xenopus laevis (żaby), przednercze, składa się z pojedynczego nefronu i może być używana jako model choroby nerek. Zarodki Xenopus są duże, rozwijają się zewnętrznie i można nimi łatwo manipulować za pomocą mikroiniekcji lub zabiegów chirurgicznych. Ponadto ustalono mapy losów wczesnych zarodków Xenopus. Ukierunkowana mikroiniekcja do pojedynczego blastomeru, która ostatecznie doprowadzi do powstania narządu lub tkanki będącej przedmiotem zainteresowania, może być wykorzystana do selektywnej nadekspresji lub obniżenia ekspresji genów w tym ograniczonym regionie, zmniejszając skutki wtórne w pozostałej części rozwijającego się zarodka. W tym protokole opisujemy, w jaki sposób wykorzystać ustalone mapy losu Xenopus do celowania w rozwijającą się nerkę Xenopus (przednercze), poprzez mikroiniekcję do specyficznego blastomeru zarodków 4- i 8-komórkowych. Wstrzyknięcie znaczników linii pozwala na weryfikację konkretnego ukierunkowania wstrzyknięcia. Po tym, jak zarodki rozwiną się do stadium 38 - 40, stosuje się barwienie immunologiczne w całości w celu wizualizacji rozwoju pronefricznego i można ocenić udział komórek docelowych w przednerczu. Tę samą technikę można dostosować do celowania w inne typy tkanek oprócz przednerczy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nerka embrionalna Xenopus, przednercze, jest dobrym modelem do badania rozwoju i chorób nerek. Zarodki rozwijają się zewnętrznie, są duże, mogą być produkowane w dużych ilościach i można nimi łatwo manipulować za pomocą mikroiniekcji lub zabiegów chirurgicznych. Ponadto zachowane są geny rządzące rozwojem nerek u ssaków i. Nerki ssaków przechodzą przez trzy etapy: przednercze, śródnercze i śródnercze1, podczas gdy embrionalne mają przednercze, a dorosłe mają śródnercze. Podstawową jednostką filtrującą tych form nerkowych jest nefron, a zarówno ssaki, jak i wymagają tych samych kaskad sygnałowych i zdarzeń indukcyjnych, aby przejść nefrogenezę2, 3. Xenopus pronephros zawiera pojedynczy nefron złożony z kanalików proksymalnych, pośrednich, dystalnych i łączących oraz kłębuszka nerkowego (analogicznego do kłębuszka nerkowego ssaków)1, 4-6 (ryc. 1). Pojedynczy, duży nefron obecny w przednerczu Xenopus sprawia, że nadaje się on jako prosty model do badania genów zaangażowanych w rozwój nerek i procesy chorobowe.

Mapy losu komórek zostały stworzone dla wczesnych zarodków Xenopus i są dostępne za darmo online na Xenbase7-11. W tym miejscu opisujemy technikę mikroiniekcji znaczników linii w celu ukierunkowania na rozwijające się przednercze Xenopus, chociaż tę samą technikę można dostosować do celowania w inne tkanki, takie jak serce lub oczy. Znaczniki linii to znaczniki (w tym barwniki witalne, znakowany fluorescencyjnie dektrans, histochemicznie wykrywalne enzymy i mRNA kodujące białka fluorescencyjne), które można wstrzyknąć do wczesnego blastomeru, umożliwiając wizualizację potomstwa tej komórki podczas rozwoju. Protokół ten wykorzystuje mRNA MEM-RFP, kodujące białko czerwonej fluorescencji12 ukierunkowane na błonę, jako znacznik linii. Opisane tutaj techniki celowanej mikroiniekcji dla pojedynczych blastomerów w zarodkach 4- i 8-komórkowych mogą być wykorzystane do wstrzykiwania morfolinosów w celu obniżenia ekspresji genów lub egzogennego RNA w celu nadekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania. Poprzez wstrzyknięcie do brzusznego, roślinnego blastomeru, głównym celem będzie przednercze zarodka, pozostawiając przeciwległe przedejcze jako kontrolę rozwojową. Jednoczesne wstrzyknięcie znacznika sprawdza, czy wstrzyknięto właściwy blastomer i pokazuje, które tkanki w zarodku powstały z wstrzykniętego blastomeru, weryfikując celowanie w przednercze. Barwienie immunologiczne przednerczy umożliwia wizualizację, jak dobrze kanaliki pronefriczne zostały namierzone. Efekty nadekspresji i knockdown można następnie ocenić na przeciwległej stronie zarodka, która służy jako kontrola rozwojowa i może być wykorzystana do obliczenia wskaźnika pronerkowego13. Dostępność map losu komórek pozwala na zastosowanie tej ukierunkowanej techniki mikroiniekcji do celowania w tkanki inne niż przednercze, a jednoczesne wstrzyknięcie znacznika fluorescencyjnego pozwala na weryfikację celowanej mikroiniekcji do każdej tkanki przed analizą.

Podczas mikroiniekcji zarodka, temperatura rozwoju powinna być ściśle regulowana, biorąc pod uwagę, że tempo rozwoju Xenopus jest od niego wysoce zależne14. Zarodki powinny być inkubowane w niższych temperaturach (14 - 16 °C) w przypadku wstrzyknięć 4- i 8-komórkowych, ponieważ czas rozwoju jest spowolniony. W temperaturze 22 °C czas rozwoju od etapu 1 (1 komórka) do etapu 3 (4 komórki) wynosi około 2 godzin, podczas gdy w temperaturze 16 °C czas rozwoju do etapu 3 wynosi około 4 godzin. Przejście od zarodka 4-komórkowego do zarodka 8-komórkowego (stadium 4) w temperaturze 22 °C zajmuje około 15 minut, ale w temperaturze 16 °C zajmuje około 30 minut. Podobnie, w temperaturze 22 °C, wystarczy 30 minut, aby 8-komórkowy zarodek rozwinął się w 16-komórkowy zarodek (etap 5). Czas ten wydłuża się do 45 minut w temperaturze 16 °C. Dlatego przydatne jest spowolnienie tempa rozwoju zarodków, aby zapewnić wystarczająco dużo czasu na wstrzyknięcia w stadium 8-komórkowym, zanim zarodki przejdą do stadium 16-komórkowego. Dodatkowo temperatury wzrostu mogą być modulowane w celu przyspieszenia lub spowolnienia rozwoju embrionalnego, aż nerka w pełni się rozwinie.

Naskórek zarodków Xenopus w stadium kijanki jest względnie przezroczysty, co pozwala na łatwe obrazowanie rozwijającego się przednercza bez preparowania lub oczyszczania tkanki15. Ze względu na względną przezroczystość zarodków Xenopus, możliwe jest również obrazowanie żywych komórek16,17. Barwienie immunologiczne w całości w celu uwidocznienia przednerczy jest możliwe dzięki ustalonym przeciwciałom, które znakują kanaliki proksymalne, pośrednie, dystalne i łączące zarodków w stadium 38 - 40, co pozwala na ocenę rozwoju pronercza po ukierunkowanej manipulacji ekspresją genów w zarodkach Xenopus 18-20.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniższy protokół został zatwierdzony przez Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Teksańskiego w Houston's Center for Laboratory Animal Medicine Animal Welfare Committee, który służy jako Komitet ds. Opieki Instytucjonalnej i Użytkowania (protokół #: HSC-AWC-13-135).

1. Identyfikacja i wybór blastomerów do iniekcji ukierunkowanych na nerki

  1. Przed wygenerowaniem zarodków należy skorzystać z Tabeli Normalnej Rozwoju Xenopus 21, aby zrozumieć orientację wczesnych podziałów komórkowych w zarodku. Alternatywnie, uzyskaj dostęp do diagramów wczesnych etapów rozwoju Xenopus na Xenbase 11.
  2. Uzyskaj dostęp do interaktywnych map losu komórek Xenopus w Xenbase11, aby wybrać, który blastomer będzie przeznaczony do mikroiniekcji.
  3. Zauważ, że zarodek jednokomórkowy ma ciemno zabarwiony biegun zwierzęcy i biegun roślinny, który jest biały i żółtkowy. Należy pamiętać, że błona ochronna, znana jako otoczka witelinowa, pokrywa zarodek.
  4. Zauważ, że pierwsze rozszczepienie zwykle występuje między lewą i prawą stroną zarodka. Komórki te w równym stopniu przyczyniają się do linii pronefryjskiej.
  5. Zauważ, że drugie rozszczepienie dzieli grzbietową i brzuszną połowę zarodka, prowadząc do 4-komórkowego zarodka. Komórki grzbietowe są mniejsze i mają mniej pigmentu niż komórki brzuszne (ryc. 2A i ryc. 3A).
    1. Zidentyfikuj blastomery brzuszne (V; duże, ciemne komórki) po lewej i prawej stronie, które bardziej przyczyniają się do rozwoju nerki niż blastomery grzbietowe (D; małe, jasne komórki) (ryc. 2A).
    2. W przypadku wstrzykiwania do 4-komórkowego zarodka, wstrzyknij lewy blastomer brzuszny, aby celować w lewą nerkę (ryc. 3A i sekcja 3).
  6. Trzecie rozszczepienie przecina na pół stronę zwierzęcą i roślinną, w wyniku czego powstaje ośmiokomórkowy zarodek. W tym momencie znajdują się cztery blastomery zwierzęce [lewy i prawy brzuszny (V1) i grzbietowy (D1)] oraz cztery blastomery roślinne [lewy i prawy brzuszny (V2) i grzbietowy (D2)] (ryc. 2B i ryc. 3B).
    1. Zlokalizuj brzuszne, roślinne blastomery (V2). Te blastomery bardziej przyczyniają się do rozwoju nerki niż inne komórki na tym etapie (ryc. 2B). Aby celować w lewą nerkę 8-komórkowego zarodka, wstrzyknąć do lewego blastomeru V2 (Figura 3B i sekcja 3).
  7. Zauważ, że czwarte i piąte rozszczepienie przecinają blastomery zwierzęce i roślinne. Z każdego blastomeru generowane jest dwoje potomstwa, w wyniku czego powstaje 16-komórkowy zarodek. Komórki noszą nazwy swoich poprzedników. Na przykład blastomer V2 z etapu 8-komórkowego daje początek potomstwu V2.1 i V2.2 na etapie 16-komórkowym (Figura 2C). Komórka V2.2 w stadium 16-komórkowym zapewnia większość komórek przyczyniających się do rozwoju nerki.
  8. Zauważ, że szóste i siódme rozszczepienie dają 32-komórkowy zarodek. Ponownie, z każdego blastomeru generowane jest dwa potomstwo, które nosi nazwę pochodzącą od swojego poprzednika. Na przykład blastomer V2.2 z etapu 16-komórkowego powoduje powstanie V2.2.1 i V2.2.2 w stadium 32-komórkowym. Istnieje alternatywny system nazewnictwa na etapie 32 komórek, w którym komórki są identyfikowane w czterech rzędach jako A, B, C i D (od zwierzęcych do roślinnych) oraz w czterech kolumnach jako 1, 2, 3 i 4 (od grzbietowej do brzusznej). Tak więc blastomer V2.2.2, który w największym stopniu przyczynia się do rozwoju przednercza, nazywany jest C3 w tym alternatywnym systemie nazewnictwa (ryc. 2D).

2. Przygotowanie zarodków

  1. Przygotuj 50 ml roztworu dejelly (2% cysteiny, NaOH do pH 8,0).
  2. Wyizoluj oba jądra od jednego samca żaby zgodnie ze standardowymi protokołami14. Umieścić jądra na szalce Petriego o średnicy 60 mm wypełnionej 10 ml roztworu do przechowywania jąder (1x zmodyfikowany Dzwonek Marca [MMR; 0,1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 8, 0,1 mM EDTA]12, 1% albumina surowicy bydlęcej, 50 μg/ml gentamycyny). Przechowywać jądra w temperaturze 4 °C.
    Uwaga: Jądra mogą być przechowywane przez około 7 - 10 dni w temperaturze 4 °C, ale skuteczność nawożenia będzie się zmniejszać, im dłużej jądra będą przechowywane.
  3. Ściśnij samicę żaby, aby uzyskać jaja zgodnie ze standardowymi protokołami14. Zbierz jajka na szalce Petriego o średnicy 100 mm. Odlej nadmiar wody.
  4. Odetnij 1/4 jądra, gdy jest w roztworze do przechowywania jąder za pomocą kleszczy i żyletki. Przenieś kawałek jądra na szalkę Petriego zawierającą jaja. Dostosuj wielkość użytej części jądra, aby uwzględnić wielkość jądra, czas przechowywania jądra i liczbę jaj, które mają zostać zapłodnione. Zwykle używa się od 1/4 do 1/3 świeżo wypreparowanego jądra do zapłodnienia jednego lęgu jaj.
  5. Pokrój część jądra na małe kawałki za pomocą kleszczy i żyletki. Dodać tyle 0,3 x MMR + 30 mg/ml gentamycyny do szalki Petriego, aby przykryć jaja. Zakręć MMR w naczyniu, aby wymieszać.
  6. Odczekaj około 30 minut, aż nawożenie nastąpi w temperaturze pokojowej. Należy pamiętać, że półkula zwierzęca (pigmentowana strona zarodka) usiądzie na zarodku po skutecznym zapłodnieniu. Następnie usunąć MMR z szalki Petriego za pomocą pipety transferowej. Dodaj tyle roztworu Dejelly do naczynia, aby przykryć zarodki.
  7. Przez następne kilka minut delikatnie obracaj naczynie z przerwami. Energiczne potrząsanie naczyniami w tym czasie może spowodować wady osi.  Galaretowa powłoka na zarodkach rozpuści się, a zarodki zgromadzą się w środku naczynia podczas wirowania. Gdy zarodki ściśle stykają się ze sobą na środku naczynia, usuń roztwór Dejelly za pomocą pipety transferowej. Nie pozostawiaj zarodków w roztworze Dejelly na dłużej niż 5 minut, ponieważ może to spowodować uszkodzenie zarodków.
  8. Umyj zarodki 3 - 5 razy w 0,3x MMR + 30 mg/ml gentamycyny, ostrożnie wylewając lub pipetując MMR i napełniając naczynie nowym MMR. Nie należy usuwać całej szczepionki MMR z naczynia, ponieważ może to spowodować uszkodzenie zarodków.
  9. Usunąć wszelkie niezapłodnione jaja lub kawałki jąder z szalki Petriego za pomocą pipety do przenoszenia.
  10. Inkubować zarodki w temperaturze od 14 do 22 °C.
    Uwaga: Zarodki hodowane w niższych temperaturach rozwijają się wolniej niż zarodki hodowane w wyższych temperaturach. Czas etapów rozwoju można znaleźć na Xenbase22.
    1. Aby rozłożyć ich rozwój w czasie, należy umieścić połowę zarodków z pojedynczego zapłodnienia na szalce Petriego przechowywanej w temperaturze 14 °C, a drugą połowę zarodków na szalce Petriego utrzymywanej w temperaturze 18 °C. Pozwala to na wykonanie dwóch zestawów iniekcji do zarodków 4- lub 8-komórkowych z jednego zapłodnienia.

3. Przygotowanie roztworów iniekcyjnych i mikroiniekcja zarodków

  1. Przygotować roztwór do wstrzykiwań zawierający mRNA9 białka czerwonej fluorescencji (MEM-RFP) o stężeniu 0,01 ng/nl, podczas gdy zarodki rozwijają się do stadium 4- lub 8-komórkowego. Roztwór do wstrzykiwań należy przechowywać na lodzie do czasu przygotowania go do wstrzyknięcia.
  2. Załaduj 7-calową wymienną szklaną rurkę kapilarną do ściągacza igieł, tak aby górna część wymiennej rurki była wyrównana z górną częścią obudowy ściągacza do igieł. Ustaw wartość ciepła #2 na 800, a wartość ściągania na 650. Naciśnij przycisk "pull", aby wyciągnąć igłę. Spowoduje to utworzenie 2 igieł z pojedynczej 7-calowej szklanej rurki kapilarnej.
  3. Odetnij końcówkę wyciągniętej igły za pomocą kleszczy Dumont.
    Uwaga: Po wyciągnięciu igły końcówka jest szczelnie zamknięta i należy ją rozciąć. Im bliżej punktu igły, w którym jest ona cięta, tym mniejsza średnica będzie miała końcówka igły. Chociaż średnica końcówki nie będzie miała wpływu na objętość wstrzyknięcia w przypadku zastosowanego tutaj systemu mikroiniekcji, końcówka o większej średnicy jest bardziej podatna na uszkodzenie zarodka.
  4. Wsuń tuleję zaciskową mikropipety na tylną część igły. Następnie wsuń O-ring z dużym otworem na tył igły za tuleją zaciskową.
  5. Napełnij igłę olejem mineralnym za pomocą igły podskórnej o rozmiarze 27, uważając, aby nie dostały się pęcherzyki powietrza do igły.
  6. Wsunąć igłę na tłok mikrowstrzykiwacza, osadzając igłę w dużym otworze w białym plastikowym przekładce zainstalowanym na tłoku. Tłok powinien mieć mały O-ring znajdujący się najbliżej korpusu mikrowtryskiwacza, a następnie białą przekładkę, O-ring z dużym otworem i tuleję zaciskową. Zabezpiecz igłę, dokręcając tuleję zaciskową. Delikatnie pociągnąć za igłę, aby upewnić się, że jest prawidłowo zabezpieczona.
  7. Naciśnij i przytrzymaj przycisk "opróżnij" na skrzynce sterowniczej mikrowtryskiwacza, aż usłyszysz dwa sygnały dźwiękowe.
  8. Odpipetować 3 μl roztworu do wstrzykiwań na kawałek Parafilmu. Włożyć końcówkę igły do kulki roztworu do wstrzykiwań na Parafilm. Naciśnij i przytrzymaj przycisk "napełniania" na skrzynce sterowniczej mikrowstrzykiwacza, aby pobrać roztwór do wstrzykiwań do igły.
  9. Napełnij szalkę Petriego o średnicy 60 mm wyłożoną siatką poliestrową o grubości 500 mikronów z 5% Ficollu w 0,3x MMR + 30 mg/ml gentamycyny. Ostrożnie pipetować 20 - 30 4- lub 8-komórkowych zarodków do naczynia.
  10. Za pomocą pętli do włosów14 manipuluj zarodkami tak, aby blastomer do wstrzyknięcia był skierowany w stronę igły. Aby celować w lewą nerkę, ustaw zarodki tak, aby lewe brzuszne blastomery zarodków 4-komórkowych lub lewe blastomery V2 zarodków 8-komórkowych były skierowane w stronę igły.
  11. Wstrzyknąć 10 nl roztworu do wstrzykiwań do wybranego blastomeru każdego zarodka w naczyniu.
    Uwaga: Siatka na dnie szalki Petriego stabilizuje zarodki i zapobiega ich zwijaniu się, umożliwiając ich wstrzyknięcie bez użycia pętli włosowej do stabilizacji.
  12. Przenieść wstrzyknięte zarodki do studzienek płytki hodowlanej, które zostały wypełnione 5% Ficollem w 0,3x MMR + 30 mg/ml gentamycyny. Inkubować wstrzyknięte zarodki w temperaturze 16 °C przez co najmniej jedną godzinę, aby umożliwić zagojenie się wstrzykniętych blastomerów.
  13. Przenieś zagojone zarodki do studzienek nowej płytki hodowlanej, które zostały wypełnione 0,3x MMR + 30 mg/ml gentamycyny do etapu 9 (przed gastrulacją).
  14. Inkubować zarodki w temperaturze 14 - 22 °C aż do osiągnięcia przez zarodki stadium 38 - 4021.

4. Utrwalanie i barwienie immunologiczne zarodków

  1. Przygotować 50 ml MOPS/EGTA/siarczanu magnezu/buforu formaldehydowego [MEMFA: 100 mM MOPS (pH 7,4), 2 mM EGTA, 1 mMMgSO4, 3,7% (v/v) formaldehydu].
  2. Za pomocą pipety transferowej umieścić 10 - 20 zarodków w stadium 38 - 40 w szklanej fiolce. Dodać 10 μl 5% benzokainy w 100% etanolu do fiolki i wymieszać fiolkę do wymieszania. Odczekaj 10 minut, aby znieczulić zarodki.
  3. Wyjąć szczepionkę MMR z fiolki za pomocą szklanej pipety. W przypadku przetwarzania wielu fiolek w tym samym czasie, fiolki można trzymać pionowo na 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej.
  4. Za pomocą szklanej pipety napełnić fiolkę olejem MEMFA. Umieścić fiolkę na trójwymiarowej platformie bujanej na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  5. Wyjąć MEMFA z fiolki za pomocą szklanej pipety. Napełnij fiolkę 100% metanolem. Umieścić fiolkę na trójwymiarowej platformie bujanej na 10 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz ten etap mycia jeszcze raz i przechowuj zarodki w 100% metanolu przez noc w temperaturze -20 °C.
  6. Przygotuj 1x Albumina Albuminy Trytonowej (PBT) z solą fizjologiczną buforowaną fosforanem w surowicy bydlęcej: 1x PBS, 2 mg / ml białka surowicy bydlęcej, 0,1% Triton X-100.
  7. Przygotuj pierwszorzędowy roztwór przeciwciała: 1x PBT z 10% kozią surowicą z rozcieńczeniem 1:5 mysiego przeciwciała monoklonalnego 4A6 (do znakowania błon pośrednich, dystalnych i łączących kanalików20), rozcieńczenie 1:30 mysiego przeciwciała monoklonalnego 3G8 (do znakowania światła kanalików proksymalnych20) i rozcieńczenie 1:250 króliczego poliklonalnego przeciwciała RFP (do znakowania znacznika MEM-RFP). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  8. Przygotuj roztwór przeciwciał drugorzędowych: 1x PBT z 10% surowicą kozą, 1:500 Alexa 488 kozia anty-mysia IgG (stężenie podstawowe 2 mg / ml; do oznaczania 4A6 i 3G8) i 1:500 Alexa 555 kozia anty-królicza IgG (stężenie podstawowe 2 mg / ml; do oznaczania znacznika MEM-RFP). Przechowywać w temperaturze 4 °C, przykrywając probówkę folią w celu ochrony przed światłem.
  9. Alternatywnie, należy zebrać przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe po barwieniu i zachować w temperaturze 4 °C do ponownego wykorzystania w przyszłych eksperymentach. Jeśli przeciwciało ma zostać zachowane do ponownego użycia, należy dodać 0,01% azydku sodu.
  10. Barwienie immunologiczne zarodków przy użyciu ustalonych protokołów18.

5. Wizualizacja zarodków i analiza docelowej tkanki pronefric

  1. Przeprowadź badania przesiewowe zarodków wybarwionych immunologicznie, aby sprawdzić, czy wstrzyknięto prawidłowy blastomer, oglądając fluorescencję znacznika pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym przy powiększeniu 1X (aby zobaczyć cały zarodek) i 5X (aby zobaczyć nerkę). Umieść zarodki na szklanej płytce wielodołkowej z dołkami wypełnionymi 1x PBT za pomocą pipety transferowej z odciętą końcówką. Manipuluj zarodkami za pomocą pętli do włosów. Do analizy nadekspresji genów lub knockdownu należy używać wyłącznie zarodków, w których znacznik z wstrzyknięciem jest obecny w przednerczu po lewej stronie zarodka (ryc. 3C, F i ryc. 4C, F).
  2. Alternatywnie, wyczyść zarodki w Murray's Clear (2 części benzoesanu benzylu: 1 część alkoholu benzylowego), umieszczając zarodki w szklanej fiolce i wypełniając fiolkę Murray's Clear. Wizualizacja zarodków za pomocą szklanej płytki dołka.
    Uwaga: Murray's Clear jest rozpuszczalnikiem organicznym i należy obchodzić się z nim ostrożnie. Nosić rękawice i używać wyłącznie szklanych fiolek i pipet z Murray's Clear.
  3. Przechowuj zarodki w temperaturze 4 °C w 1x PBT przez 2 - 3 tygodnie. W przypadku długotrwałego przechowywania zarodków należy je odwodnić, myjąc je dwukrotnie w 100% metanolu w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Przechowywać zarodki w temperaturze -20 °C w 100% metanolu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroiniekcje 4- i 8-komórkowych zarodków Xenopus za pomocą mRNA MEM-RFP wykazują różne poziomy ukierunkowania na przednercze. Rycina 4 przedstawia zarodki w stadium 40 z prawidłowymi wzorcami ekspresji mRNA MEM-RFP. Zarodki wstrzyknięto do lewego brzusznego blastomeru (ryc. 4A) i posortowano pod kątem prawidłowego wzorca ekspresji mRNA MEM-RFP. Oprócz ekspresji MEM-RFP w kanalikach proksymalnych, pośrednich, dystalnych i łączących nerki, oczekuj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celowanie w przednercze rozwijających się zarodków Xenopus polega na identyfikacji i wstrzyknięciu prawidłowego blastomeru. Wstrzyknięcie blastomeru V2 8-komórkowych zarodków jest ukierunkowane na lewe przednercze18. To pozostawia kontralateralne prawe przednercze jako kontrolę wewnętrzną. Jeśli knockdown morpholino lub nadekspresja RNA jest używana do zmiany rozwoju nerek, przeciwległe prawe przednercze można wykorzystać do porównania skutków knockdownu lub nadekspresji genu na lewym przedpleczu. W t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant National Institutes of Health NIDDK (K01DK092320) oraz fundusze na rozpoczęcie działalności przez Wydział Pediatrii Uniwersytetu Teksańskiego McGovern Medical School.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorek soduFisherS271-3
Chlorek potasuFisherP217-500
Siarczan magnezu FisherM63-500
Chlorek wapniaFisherC79-500
HEPESFisherBP310-500
EDTAFisherS311-500
Roztwór gentamycyny, 50 mg/mlAmrescoE737-20ML
L-cysteina, 99%+Acros Organics52-90-4
FicollFisherBP525-100 100
mm x 15 mm szalka PetriegoFisherFB0875712
Mini Lodówka IIBoekel260009Inkubator stołowy do zarodków.
Gap43-RFPDo wytwarzania śladowego RNA. Patrz: Davidson et al., 2006.
Dekstran rodaminy, 10 000 M.W.InvitrogenD1817Tracer.
Klasa biologii molekularnej, sterylna oczyszczona woda USPCorning46-000-CI 7-calowe
rurki zamienneDrummond Drummond3-000-203-G/XLIgły do mikroiniekcji.
Ściągacz igiełSutter InstrumentsP-30
Kleszcze drobnoziarnisteDumont11252-30Do łamania końcówki igły do mikroiniekcji.
Nanoject IIDrummond3-000-204Mikrowtryskiwacz.
Olej mineralny, ciężkiFisherCAS 8042-47-5Olej do igieł.
27 G Igła podskórna MonojectCovidien8881200508Do ładowania oleju mineralnego do igły do mikroiniekcji.
Strzykawka 5 ml Luer-LokBD309646Do ładowania oleju mineralnego do igły do mikroiniekcji.
60 mm x 15 mm szalka PetriegoFisherFB0875713A
800 mikronów Siatka poliestrowaMałe częściCMY-0800-C
Pipety transferoweFisher13-711-7MDo transferu zarodków. Odetnij końcówkę, aby zarodki zostały łatwo pobrane przez pipetę.
6-dołkowa płytka do hodowli komórkowejNest Biotechnology
MOPSFisherBP308-500
EGTAAcros Organics67-42-5
FormaldehydFisherBP531-500
15 mm x 45 mm Fiolka z gwintem śrubowymFisher03-339-25BDo utrwalania, barwienia i przechowywania zarodków.
24-dołkowa płytka do hodowli komórekNest Biotechnology
Widmo benzokainyBE130
EtanolFisherBP2818-4
MetanolFisherA412-4
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 1x proszekFisherBP661-50
Białko surowicy bydlęcejFisherBP1600-100
Triton X-100FisherBP151-500
3D Mini rocker, model 135Denville Scientific57281
Surowica kozia, pochodzenie z Nowej ZelandiiInvitrogen16210064
Azydek soduFisherS227I-25
Przeciwciało monoklonalne 3G8Europejskie CentrumPrzeciwciało pierwszorzędowe do znakowania proksymalnego Kanalików.
Przeciwciało monoklonalne 4A6Europejskie CentrumPrzeciwciało pierwszorzędowe do znakowania kanalików pośrednich, dystalnych i łączących.
anty-RFP pAb, oczyszczone IgG / królikMBLPM005Przeciwciało pierwszorzędowe do znakowania znacznika Gap43-RFP.
Alexa Fluor 488 kozia anty-mysia IgGLife TechnologiesA11001Przeciwciało wtórne do znakowania kanalików nerkowych.
Alexa Fluor 555 kozia anty-królicza IgGLife TechnologiesA21428Przeciwciało wtórne do znakowania znacznika Gap43-RFP.
9 Płytka punktowa wnękiCorning7220-85
Benzoesan benzyluFisher105862500Opcjonalnie - do usuwania zarodków
Alkohol benzylowyFisherA396-500Opcjonalnie - do usuwania zarodków
Plazmid Zasobów Xenopus Zasobów Xenopus

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vize, P. D., Seufert, D. W., Carroll, T. J., Wallingford, J. B. Model systems for the study of kidney development: Use of the pronephros in the analysis of organ induction and patterning. Dev. Biol. 188 (2), 189-204 (1997).
  2. Brandli, A. W. Towards a molecular anatomy of the Xenopus pronephric kidney. Int. J. Dev. Biol. 43 (5), 381-395 (1999).
  3. Hensey, C., Dolan, V., Brady, H. R. The Xenopus pronephros as a model system for the study of kidney development and pathophysiology. Nephrol. Dial. Transplant. 17, (Suppl 9) 73-74 (2002).
  4. Carroll, T., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
  5. Zhou, X., Vize, P. D. Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric tubules. Dev. Biol. 271 (2), 322-338 (2004).
  6. Raciti, D., et al. Organization of the pronephric kidney revealed by large-scale gene expression mapping. Genome Biol. 9 (5), 84(2008).
  7. Moody, S. A., Kline, M. J. Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres. Anat. Embryol. Berl. 182 (4), 347-362 (1990).
  8. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).
  9. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
  10. Bauer, D. V., Huang, S., Moody, S. A. The cleavage stage origin of Spemann's Organizer: Analysis of the movements of blastomere clones before and during gastrulation in Xenopus. Dev. 120 (5), 1179-1189 (1994).
  11. Karpinka, J. B., et al. Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Res. 43, 756-763 (2015).
  12. Davidson, L. A., Marsden, M., Keller, R., Desimone, D. W. Integrin alpha5beta1 and fibronectin regulate polarized cell protrusions required for Xenopus convergence and extension. Curr. Biol. 16 (9), 833-844 (2006).
  13. Wallingford, J. B., Carroll, T. J., Vize, P. D. Precocious expression of the Wilms' tumor gene xWT1 inhibits embryonic kidney development in Xenopus laevis. Dev. Biol. 202, 103-112 (1998).
  14. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
  15. Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. The Xenopus pronephros: A kidney model making leaps toward understanding tubule development. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley. 215-238 (2014).
  16. Lienkamp, S. S., et al. Vertebrate kidney tubules elongate using a planar cell polarity-dependent rosette-based mechanism of convergent extension. Nat. Genet. 44 (12), 1382-1387 (2012).
  17. Lyons, J. P., et al. Requirement of Wnt/β-catenin signaling in pronephric kidney development. Mech. Dev. 126 (3-4), 142-159 (2009).
  18. Miller, R. K., et al. Pronephric tubulogenesis requires Daam1-mediated planar cell polarity signaling. J. Am. Soc. Nephrol. 22, 1654-1667 (2011).
  19. Vize, P. D., Jones, E. A., Pfister, R. Development of the Xenopus pronephric system. Dev. Biol. 171 (2), 531-540 (1995).
  20. Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. Chapter 12: The Xenopus Pronephros: A Kidney Model Making Leaps toward Understanding Tubule Development. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley and Sons. Oxford. (2014).
  21. Taira, M., Otani, H., Jamrich, M., Dawid, I. B. Expression of the LIM class homeobox gene Xlim-1 in pronephros and CNS cell lineages of Xenopus embryos is affected by retinoic acid and exogastrulation. Development. 120, 1525-1536 (1994).
  22. Weber, H., et al. Regulation and function of the tissue-specific transcription factor HNF1 alpha (LFB1) during Xenopus development. Int. Dev. Biol. 40 (1), 297-304 (1996).
  23. Carroll, T. J., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
  24. Etkin, L. D., Pearman, B., Ansah-Yiadom, R. Replication of injected DNA templates in Xenopus embryos. Exp. Cell Res. 169 (2), 468-477 (1987).
  25. Vize, P. D. The chloride conductance channel ClC-K is a specific marker for the Xenopus pronephric distal tubule and duct. Gene Expr. Patterns. 3 (3), 347-350 (2003).
  26. Uochi, T. S., Takahashi, S., Ninomiya, H., Fukui, A., Asashima, M. The Na+, K+-ATPase alpha subunit requires gastrulation in the Xenopus embryo. Dev. Growth Differ. 39 (5), 571-580 (1997).
  27. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical & chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Publishing, Inc. NY. (1994).
  28. Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs. J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).
  29. Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage. Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).
  30. Colman, A., Drummond, D. The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos. J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zarodek Xenopustechnika mikrowstrzykiwaniarozw j pronefrosucelowanie w blastomerywykorzystanie mapy los wimmunobarwienie ca ego preparatumikroskopia konfokalnab onowe czerwone bia ko fluorescencyjnestadiowanie zarodk wwstrzykiwanie tkankowo specyficzne

Powiązane artykuły