Artykuł metodologiczny

Kapsułkowanie cytochromu c w nanoarchitekturach aerożelu krzemionkowego bez nanocząstek metalu przy jednoczesnym zachowaniu bioaktywności w fazie gazowej

11.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53802

⸱

1 marca 2016

 ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, Fairfield University

W tym artykule

Podsumowanie

Ta procedura opisuje, jak kapsułkować cytochrom c (cyt. c) w zol-żelach krzemionkowych (SiO2) przetworzyć te żele na bioaerożele i użyć tych bioaerożeli do szybkiego rozpoznania tlenku azotu (NO) w reakcji w fazie gazowej. Ten rodzaj protokołu może pomóc w przyszłym rozwoju biosensorów lub innych urządzeń bioanalitycznych.

Streszczenie

Aplikacje takie jak czujniki, baterie i ogniwa paliwowe zostały ulepszone dzięki zastosowaniu wysoce porowatych aerożeli, gdy funkcjonalne związki są zamknięte w aerożelach. Istnieje jednak niewiele doniesień na temat białek kapsułkujących w zol-żelach, które są przetwarzane w celu wytworzenia aerożeli. Procedura kapsułkowania cytochromu c (cyt. c) w krzemionce (SiO2) przedstawiono zol-żele, które są przetwarzane nadkrytycznie w celu wytworzenia bioaerożeli o aktywności w fazie gazowej dla tlenku azotu (NO). Cyt. C dodaje się do mieszanego zolu krzemionkowego w warunkach kontrolowanego stężenia białka i siły buforu. Mieszanina zolu jest następnie żelowana, a ciecz wypełniająca pory żelu jest zastępowana poprzez serię wymian rozpuszczalnika z ciekłym dwutlenkiem węgla. Dwutlenek węgla jest doprowadzany do punktu krytycznego i odprowadzany, tworząc suche aerożele z cyt. c zamknięty w środku. Bioaerożele te charakteryzują się spektroskopią w zakresie widzialnym UV i spektroskopią dichroizmu kołowego i mogą być stosowane do wykrywania obecności tlenku azotu w fazie gazowej. Powodzenie tej procedury zależy od regulacji cyt. C i stężenie buforowe i nie wymaga innych składników, takich jak nanocząstki metali. Być może uda się otorbić inne białka przy użyciu podobnego podejścia, co sprawia, że procedura ta jest ważna dla potencjalnego przyszłego rozwoju urządzeń bioanalitycznych.

Wprowadzenie

Cytochrom c (cyt. c) jest kluczowym białkiem przenoszącym elektrony biorącym udział w reakcjach oddychania komórkowego organizmu. Wykazano, że bierze udział w apoptozie, kontrolowanej formie śmierci komórki, i może wykrywać takie małe toksyczne cząsteczki, jak tlenek azotu i tlenek węgla1-3. Tlenek azotu (NO) odgrywa rolę w wielu procesach fizjologicznych zachodzących w układzie nerwowym, sercowo-naczyniowym i odpornościowym. Podczas gdy cyt. c zazwyczaj wymaga środowiska wodnego buforowanego do wartości neutralnych pH, aby pozostać strukturalnie nienaruszonym i aktywnym, badania wykazały, że cyt. C może zachować swoją strukturę i funkcję w materiałach stałych znanych jako aerożele w pewnych warunkach4-9.

Aerożele to wysoce porowate materiały, często tworzone przez syntezę tlenków metali zol-żel(Podczas gdy aerożele z tlenków metali są bardzo powszechne, zsyntetyzowano węgiel i inne rodzaje aerożeli. Jednym z przykładów są aerożele InP)10 i suszenie tych zol-żeli w taki sposób, że porowata matryca stała pozostaje niezmieniona11-14. Wszystkie pory w aerożelach stałych powodują dużą dostępną powierzchnię, co sprawia, że aerożele są niezwykle przydatne we wszelkich zastosowaniach, w których ważne są reakcje powierzchniowe. Gdy funkcjonalność chemiczna lub biochemiczna zostanie zestawiona w nanoarchitekturze aerożelu, wykazano, że porowatość fizyczna i zwiększona powierzchnia aerożeli pomagają ulepszyć czujniki, a także elektrody do zastosowań w akumulatorach, ogniwach paliwowych i superkondensatorach11,15-23. Aby wysuszyć aerożele w sposób, który pozostawia porowatą matrycę stałą w niezmienionej postaci, typowe jest usunięcie rozpuszczalnika, który pozostaje w porach po syntezie zol-żel poprzez ekstrakcję rozpuszczalnikiem w stanie nadkrytycznym. Wszelkie zapadanie się porów, które może być spowodowane siłami napięcia powierzchniowego, gdy rozpuszczalnik odparowuje z żelu, jest zminimalizowane, ponieważ podczas suszenia nadkrytycznego nigdy nie tworzy się granica faz ciecz-para.

Istnieje wiele doniesień o białkach hemowych, takich jak cyt. c jest zamknięty w zol-żelach, które były utrzymywane w stanie mokrym lub które zostały wysuszone w temperaturze otoczenia24-30. Doniesienia o kapsułkowaniu biomolekuł w zol-żelach, które są następnie suszone nadkrytycznie w celu utworzenia aerożeli, są rzadsze ze względu na niezbędne przetwarzanie, które może być szkodliwe dla struktury wielu białek. W przypadku cyt. c, pewne warunki umożliwiają zachowanie zdolności CYT. c do wykrywania i reagowania na tlenek azotu w fazie gazowej w aerożelach. Po ustabilizowaniu w aerożelu, wysokiej jakości struktura porów aerożelu ułatwia reakcję między cytami. C i tlenek azotu4,8,9. Cyt. C można otoczyć aerożelami, najpierw łącząc go w wielu warstwach wokół nanocząstek złota lub srebra w roztworze4-8. Te wielowarstwowe nadbudowy służą do ochrony białka w matrycy aerożelu. W najnowszym podejściu, które opracowaliśmy, gdy stężenie białka i siła buforu są kontrolowane wraz z innymi warunkami syntetycznymi, cyt. C zachowuje integralność w aerożelach nawet bez początkowego skojarzenia nanocząstek metalu9.

Synteza rozpoczyna się, gdy wiele syntez aerożeli rozpoczyna się od mieszania prekursorów zol krzemionkowy i żelu przez określony okres czasu. Dopiero po ustalonym czasie mieszania cyt. C dodaje się do mieszaniny w postaci roztworu buforowego. Następnie następuje żelowanie, tworząc porowatą strukturę stałą krzemionki, w której pory są wypełnione wodą, metanolem, pozostałymi reagentami i produktami ubocznymi. Ta ciecz, która wypełnia pory, może być wypłukana różnymi rozpuszczalnikami poprzez szereg wymian rozpuszczalników, przy czym ostatnia wymiana z ciekłym dwutlenkiem węgla odbywa się w aparacie do suszenia w punkcie krytycznym utrzymywanym w niskiej temperaturze. Doprowadzenie żeli powyżej temperatury krytycznej (31,1 °C) dwutlenku węgla ułatwia tworzenie się płynu nadkrytycznego wewnątrz aparatury ciśnieniowej, który może być odprowadzany w celu utworzenia suchych, wysoce porowatych aerożeli. Stosunkowo niska temperatura wymagana, aby dwutlenek węgla mógł utworzyć płyn nadkrytyczny, jest korzystna w porównaniu z innymi rozpuszczalnikami, ponieważ utrzymuje białko poniżej temperatury, w której może ulec denaturacji.

Nasze podejście do hermetyzacji cyt bez nanocząsteczek metalu. C w aerożelach jest korzystne, ponieważ jest to prosta procedura, która może prowadzić do opracowania bardziej ogólnie stosowanego protokołu kapsułkowania również innych białek. Wiele białek może nie wchodzić w interakcje z nanocząstkami metali w taki sam sposób, jak cyt. C DOES i synteza lub zakup nanocząstek metali zwiększają czas i koszty procedury. Nieliczne doniesienia na temat białek enkapsulujących w aerożelach sprawiają, że opracowanie tej procedury jest znaczącym krokiem naprzód w kierunku znalezienia bardziej ogólnej procedury kapsułkowania innych białek w aerożelach, która może pomóc w potencjalnych przyszłych urządzeniach bioanalitycznych.

Sekcja protokołu tego manuskryptu opisuje, jak syntetyzować zol-żele krzemionkowe, kapsułkować cyt. c do tych zol-żeli, wysuszyć te kompozytowe zol-żele do wytworzenia aerożeli, scharakteryzować te bioaerożele za pomocą spektroskopii dichroizmu UV i kołowego i wykryć obecność tlenku azotu w fazie gazowej za pomocą tych bioaerożeli. Cyt. c został z powodzeniem zamknięty w aerożelach po pierwszym rozpuszczeniu w wodnych roztworach buforu fosforanowego o stężeniu od 4,4 do 70 mM. Stwierdzono jednak, że zoptymalizowana struktura białek w aerożelach powstaje podczas kapsułkowania 40 mM roztworów buforowanych fosforanami cyt. C wytwarzający załadowany aerożel cyt. c stężeń w zakresie od 5 do 15 μM9. Dlatego poniższy protokół polega na syntezie aerożeli przy użyciu 40 mM roztworów buforowanych fosforanem cyt. c co daje załadowany cyt. c stężenie w aerożelach 15 μM.

Protokół

Okulary lub gogle ochronne, fartuch laboratoryjny i rękawice laboratoryjne powinny być noszone przez cały czas trwania zabiegu. Nigdy nie używaj urządzenia do suszenia w punkcie krytycznym bez okularów lub okularów ochronnych. Wszystkie roztwory zawierające tetrametoksysilan, metanol, etanol, aceton i amoniak powinny być przetwarzane w dygestorium.

1. Utwórz bufor i cyt. c Rozwiązania

  1. Aby uzyskać ~750 ml buforu fosforanu potasu o pH 7, 40 mM, najpierw przygotuj 500 ml 0,04 M jednozasadowego fosforanu potasu, odważając 2,72 g jednozasadowego fosforanu potasu i rozpuszczając w wodzie za pomocą kolby miarowej o pojemności 500 ml.
  2. Przygotować 500 ml 0,04 M dwuzasadowego fosforanu potasu, odważając 3,48 g dwuzasadowego fosforanu potasu i rozpuszczając w wodzie przy użyciu kolby miarowej o pojemności 500 ml.
  3. Wlej dwuzasadowy roztwór soli do dużej zlewki z mieszadłem i zacznij mieszać roztwór na płytce do mieszania.
  4. Powoli dodawać porcje roztworu soli jednozasadowej do roztworu soli dwuzasadowej, monitorując pH za pomocą elektrody pH i miernika, aż pH osiągnie wartość 7,00. Zostanie użyte około 250-300 ml monozasadowego roztworu soli.
  5. Odważyć około 0,023 g cyt. c i umieścić w szklanej fiolce scyntylacyjnej. Dodać 2 000 μl przygotowanego buforu fosforanu potasu za pomocą mikropipety, a następnie delikatnie zamieszać roztwór, aby wymieszać aż do uzyskania całego stałego, czerwonego cytu. C rozpuścił się w roztworze i nie pozostały żadne cząstki stałe.
  6. Weź 20 μl przygotowanego cyt. c roztwór i dodać do plastikowej kuwety o długości 1 cm. Dodać 3 ml przygotowanego buforu.
  7. Weź widmo UV-vis od 300-700 nm za pomocą bufora w komórce referencyjnej. Za pomocą cyt. c absorbancja (A) przy 409 nm, współczynnik ekstynkcji31 (ε) wynoszący 106 100 M-1 cm-1, długość drogi kuwety (l) oraz prawo Beera-Lamberta do określenia stężenia (c) roztworu (A = εlc).
  8. Wstecz obliczyć stężenie pierwotnie przygotowanego roztworu. Z 2 ml przygotowanego cyt. c roztwór ma zwykle stężenie od 0,7 do 0,9 mM.
  9. Rozcieńczyć oryginalnie przygotowany cyt. c roztwór do 800 μl 0,105 mM przez pipetowanie 117 μl 0,72 mM przygotowanego cyt. c do fiolki scyntylacyjnej. Następnie dodać pozostałą część 800 μl (w tym przypadku 683 μl) przygotowanego buforu. Zamieszaj, aby wymieszać. Dokładne objętości będą się różnić w zależności od dokładnego stężenia oryginalnie przygotowanego cyt. c roztwór jako objętość cyt. c do pipety oblicza się jako (800 μl * 0,105 mM)/(oryginalny cyt. c stężenie w mM).
  10. Przechowywać oryginalnie przygotowany i rozcieńczony cyt. c roztwory w temperaturze 2-8 °C w lodówce do momentu przygotowania do użycia przez okres do dwóch tygodni.

2. Synteza krzemionki (SiO2) Sol

  1. Jednorazową zlewkę polipropylenową o pojemności 50 ml oznaczyć etykietą "Zlewka A". Umieścić zlewkę na szalce wagi analitycznej i za pomocą szklanej pipety Pasteura dodać do niej 1,88 g tetrametoksysilanu. Wyzerować wagę, a następnie odpipetować 2,88 g metanolu do "zlewki A".
  2. Okładka 'Beaker A' z Parafilmem.
  3. Jednorazową zlewkę polipropylenową o pojemności 50 ml oznaczyć etykietą "Zlewka B". Dodaj mieszadło magnetyczne i umieść na szalce wagi analitycznej. Za pomocą szklanej pipety dodaj 0,75 g wody i 3,00 g metanolu.
  4. Przykryj 'Beaker B' parafilmem.
  5. Rozpocząć mieszanie zawartości zlewki "B" na płytce mieszającej w dygestorium, a następnie za pomocą strzykawki wprowadzić do mieszaniny 5 μl 28,0-30,0% roztworu wodorotlenku amonu przez osłonę Parafilm, mieszając.
  6. Po zakończeniu etapu 2.5 dodaj zawartość zlewki "A" do zlewki B. Mieszaj mieszaninę przez 20 minut, będąc pokrytą Parafilmem.

3. Przygotuj formy żelowe

Uwaga: Jest czas na przygotowanie form żelowych podczas mieszania mieszaniny zolu krzemionkowego w kroku 2.6.

  1. Zaopatrzyć się w 8-9 polipropylenowych fiolek scyntylacyjnych (16 mm x 57 mm, objętość 6,5 ml, z odciętymi dnami) i odpowiednimi nakrętkami. Na końcu fiolki należy owinąć folią folię spożywczą, aby utworzyć płaską powierzchnię, na której tworzy się żel, i umieścić na niej nakrętkę, upewniając się, że folia pozostaje nienaruszona wewnątrz nakrętki.
  2. Wyrównaj fiolki z nakrętką skierowaną w dół na górze ławki i otwartymi dnami skierowanymi do góry.

4. Przygotuj Cyt. Zol-żele c-krzemionkowe

  1. Po zakończeniu mieszania zolu (etap 2.6) dodać 3 ml mieszaniny zolu do czystej, jednorazowej zlewki polipropylenowej o pojemności 50 ml.
  2. Za pomocą szklanej pipety Pasteura powoli upuścić 500 μl rozcieńczonego cyt o stężeniu 0,105 mM. C (sporządzony w kroku 1.9) do 3 ml mieszaniny zolowej w ciągu ~1 min. Upewnij się, że delikatnie zamieszałeś mieszaninę podczas dodawania cyt. c, aby uniknąć tworzenia się dużych czerwonych grudek. Zakładając, że objętości są addytywne, rozcieńczając 500 μl 0,105 mM cyt. C do 3 500 μl, cyt. c stężenie teraz w solu wynosi teoretycznie 15 μM.
  3. Odpipetować 0,5 ml otrzymanego cyt. c zol krzemionkowy do każdej przygotowanej formy. Odpipetować również 0,5 ml pozostałego "zwykłego" zolu krzemionkowego do jednej lub dwóch form, aby użyć go jako próbki kontrolne podczas procesu suszenia w stanie nadkrytycznym.
  4. Przykryj zakryte zakryte otwory foremek Parafilm i wstaw do lodówki (~2-8 °C) na noc lub na co najmniej 12 godzin, aby uzyskać zol-żele.
  5. Wyjmij foremki z lodówki. Usuń Parafilm z górnej części jednej formy zawierającej cyt. c zol-żel; Zdejmij również nakrętkę i folię z dołu.
  6. Po dodaniu do formy odrobiny etanolu z butelki do mycia, użyj okrągłego końca tłoka strzykawki, aby ostrożnie wypchnąć żel z formy do czystej 20 ml szklanej fiolki scyntylacyjnej zawierającej około 5 ml etanolu.
  7. Powtórz tę procedurę usuwania żelu (kroki 4.5 i 4.6), aż wszystkie cyt. C Żele dodaje się do fiolki, a wszystkie żele krzemionkowe dodaje się do oddzielnej fiolki. Jeśli więcej niż jedno stężenie cyt. C żel został wyprodukowany, należy przechowywać jak żele razem w oddzielnych fiolkach. Następnie napełnić fiolki do góry etanolem, zakręcić i przechowywać w temperaturze 2-8 °C.
  8. Co cztery godziny w ciągu dnia wyjmuj żele z lodówki, dekantuj etanol z żeli i zastąp go świeżym etanolem.
  9. Przez dodatkowe trzy dni zanurzaj mokre żele zolowe w acetonie, dekantując i dodając świeży aceton trzy razy dziennie.

5. Nadkrytycznie suchy cyt. Zol-żele c-krzemionkowe

  1. Schłodzić urządzenie do suszenia w punkcie krytycznym (patrz rysunek 1) do 10 °C, ustawiając temperaturę dołączonej pompy cyrkulacyjnej na 8 °C.
  2. Gdy aparatura osiągnie temperaturę 10 °C, należy przeprowadzić próbę szczelności aparatu, napełniając łódkę transferową acetonem i zamykając ją wewnątrz aparatu.
    1. Otwórz zawór napełniający aparatu i dodawaj dwutlenek węgla, aż urządzenie będzie pełne do połowy.
    2. Zamknij zawór napełniający i uważnie nasłuchuj, czy nie słychać syczenia w drzwiach i zaworach, w których mogą ulegać zniszczeniu O-ringi lub uszczelki.
    3. Wymień wszystkie O-ringi lub uszczelki w przypadku stwierdzenia nieszczelności.
  3. Po zakończeniu testu szczelności otwórz zawór spustowy, aby uwolnić aceton i dwutlenek węgla do odpływu dygestoriów. Następnie wyjmij łódź transferową z aparatu.
  4. Po upewnieniu się, że aparatura jest szczelna, ostrożnie wlać mokre żele z fiolek scyntylacyjnych wraz z większością acetonu do trzech długich sekcji łodzi transferowej (kosze na próbki lub osłonki z gazy nie są konieczne). Delikatnie popychaj i przesuwaj żele w łodzi za pomocą kleszczy, aby upewnić się, że wszystkie żele są całkowicie zanurzone w acetonie. W razie potrzeby dodaj więcej acetonu przed uszczelnieniem łodzi wewnątrz urządzenia.
  5. Otwórz zawór napełniający aparatu, aby dodać dwutlenek węgla, a następnie otwórz zawór spustowy, aby uwolnić aceton na pięć minut, gdy tylko aceton mieszający się z dwutlenkiem węgla zauważy, że opada na dno aparatu przez okienko aparatu. To przesiąkanie acetonu do dna nastąpi przed całkowitym napełnieniem urządzenia dwutlenkiem węgla, dlatego zawór napełniający powinien pozostać otwarty w niezbędnym stopniu podczas opróżniania, aby aparat był nadal napełniany, nawet gdy odpływ jest otwarty.
  6. Zamknij zawór spustowy. Trzymaj zawór napełniający lekko otwarty.
  7. Pięć minut później ponownie otwórz zawór spustowy na pięć minut i wyreguluj zawór napełniający, aby otworzył się na tyle, aby urządzenie pozostało pełne przez cały czas opróżniania. Zamknij zawór spustowy, pozostaw zawór napełniający otwarty, a następnie powtórz ten krok opróżniania jeszcze raz pięć minut później.
  8. Postępując zgodnie z tymi pierwszymi trzema krokami drenażu, otwórz odpływ na 5 minut na raz mniej więcej co 40 minut przez co najmniej sześć godzin, aby zapewnić całkowite zastąpienie acetonu ciekłym dwutlenkiem węgla w żelach. Zawsze reguluj zawór napełniający tak, aby był wystarczająco otwarty podczas każdego opróżniania, aby poziom cieczy w aparacie nigdy nie spadł poniżej górnej części łodzi podczas opróżniania.
  9. Po zakończeniu etapów opróżniania zamknij zawór napełniania i spuść ciekły dwutlenek węgla, tak aby poziom pozostał widoczny tuż nad zębami łodzi, patrząc przez okno aparatu.
  10. Ustawić temperaturę podłączonego do aparatu cyrkulacyjnego na 40 °C, aby zapewnić, że ciekły dwutlenek węgla wzrośnie powyżej swojej krytycznej temperatury i ciśnienia (Tc = 31 °C; Pc = 7,4 MPa).
  11. Po około 15 minutach obserwuj przejście z cieczy do cieczy nadkrytycznej przez okienko aparatu, gdy ciekła menisk powyżej zębów łodzi znika. Odczekaj co najmniej 15 minut czasu równowagi, a następnie otwórz niewielką ilość zaworu odpowietrzającego, aby rozpocząć uwalnianie płynu w stanie nadkrytycznym.
  12. W ciągu około 45 minut kontynuuj stopniowe otwieranie zaworu odpowietrzającego coraz szerzej, tak aby słychać było jednostajny, ale bardzo niski syk uwalniającego się płynu i zaobserwowano, że manometr powoli spada do zera.
  13. Gdy ciśnienie w aparacie spadnie do zera, otwórz drzwi aparatu, wyjmij łódź i użyj kleszczy, aby umieścić nowo wysuszone aerożele w czystych szklanych fiolkach scyntylacyjnych.

6. Scharakteryzować Cyt. Aerożele krzemionkowe c ze spektroskopią w zakresie widzialnym UV i dichroizmem kołowym (CD)

  1. Przygotuj tekturową platformę do trzymania monolitów aerożelu na ścieżce wiązki spektrofotometru UV-Visible lub spektrometru CD.
    1. Wytnij kawałek lekkiego kartonu o wymiarach 2,5 cm x 2,5 cm (takiego jak karton z pudełka z chusteczką laboratoryjną), złóż go na pół, przetnij do połowy na zagięciu, a następnie złóż z powrotem dwie klapki, utworzone przez przecięcie.
    2. Wytnij kawałek lekkiej tektury o wymiarach 5 cm x 5 cm, z kwadratowym otworem o wymiarach 1,5 cm x 1,5 cm pośrodku. Następnie użyj czarnej taśmy izolacyjnej, aby zmniejszyć rozmiar ładowni do 0,5 cm x 0,5 cm.
    3. Przyklej klapki złożonego i pociętego kartonu do kawałka tektury o wymiarach 5 cm x 5 cm, tak aby powstała niewielka wygięta powierzchnia, na której monolit aerożelowy będzie mógł usiąść bezpośrednio przed otworem o wymiarach 0,5 cm x 0,5 cm (patrz rysunek 2). Następnie przyklej tylny kawałek tektury do spektrofotometru widzialnego w promieniowaniu UV, tak aby otwór znajdował się w jednej linii ze ścieżką wiązki.
  2. Zmierz grubość żeli, które będą używane do długości ścieżek, za pomocą mikrometru.
  3. Umieść jeden żel na tekturowej platformie i zmierz widmo od 300-800 nm z powietrzem w komorze referencyjnej spektrofotometru widzialnego UV.
  4. Dopasuj wielomian, A = aλn, do obszaru długości fali (λ), w którym absorbancja (A) wynika głównie z rozpraszania tła, ~700-800 nm. Współczynnik a jest zwykle dopasowany do liczby z zakresu od ~1 x 108 do 1 x 106, a współczynnik n jest zwykle dopasowany do liczby z zakresu od ~2 do 3.
  5. Oblicz rozproszenie na innych długościach fal, używając współczynników a i n uzyskanych z dopasowania.
  6. Odejmij tę obliczoną absorbancję tła rozproszenia od surowego widma, aby uzyskać widmo skorygowane o rozproszenie.
  7. Dopasuj widmo odejmowane rozproszeniem do krzywej Gaussa w zakresie od 370 do 490 nm za pomocą odpowiedniego oprogramowania (GRAMS/AI 8.0) w celu określenia wysokości piku, środka piku i szerokości piku Soreta aerożelu.
  8. Zastosuj prawo Beera-Lamberta, używając zmierzonej grubości żelu dla długości drogi (l), współczynnika ekstynkcji31 (ε) wynoszącego 106 100 M-1 cm-1 i wysokości piku Soreta (A), aby obliczyć stężenie (c) cyt. c w aerożelu (A = εlc).
  9. Porównaj obliczoną wartość cyt. c do stężenia teoretycznie w żelu (15 μM) w celu ustalenia żywotności CYT. c w aerożelu. Typowa rentowność procentowa jest bliska 100%, ale należy zauważyć, że te żywotności są tylko szacunkowe, ponieważ obliczenia opierają się na współczynniku ekstynkcji cyt. C w roztworze31, co do którego przypuszcza się, że jest nieco inny niż współczynnik ekstynkcji CYT. c w aerożelach, co nie jest znane.
  10. Uruchom azot w instrumencie CD co najmniej 5 minut przed włączeniem lampy.
  11. Przyklej kartonowy uchwyt do spektrometru CD tak, aby otwór znajdował się w jednej linii ze ścieżką wiązki.
  12. Zmierz ciągłe widmo ślepej długości fali bez niczego w kartonowym uchwycie od 350 do 500 nm przy 100 nm/min, wykonując średnio trzy skany.
  13. Umieść jeden żel (grubość zmierzona wcześniej w kroku 6.2) na tekturowej platformie i zmierz widmo w zakresie 350-500 nm przy 100 nm/min, wykonując średnio trzy skany.
  14. Powtórz pomiary widzialności UV i CD dla wszystkich interesujących monolitów aerożelowych.

7. Wykryj obecność gazowego tlenku azotu (NO) za pomocą Cyt. Aerożele z krzemionki c

UWAGA: Praca z NO jest niebezpieczna, a wszystkie gazy NO powinny być przenoszone przez wyciąg lub odprowadzane do dygestorium. Długotrwałe narażenie na NO jest toksyczne dla tkanek, ponieważ silnie trujący dwutlenek azotu i/lub tetratlenek azotu powstają, gdy NO wejdzie w kontakt z powietrzem. Ciepło i opary powstają również w kontakcie NO z wodą.

  1. Umieść 8-litrową butlę z tlenkiem azotu (10% tlenku azotu, 90% azotu) w dobrze wentylowanym dygestorium i dostosuj ciśnienie do 4 psi.
  2. Podłącz rurkę zarówno do butli z tlenkiem azotu, jak i do butli z azotem (ciśnienie ustawione na 6 psi) i połącz końce rurki z zaworem T (patrz rysunek 3a).
  3. Wybierz monolit aerożelowy do eksperymentu i zmierz grubość (lub długość ścieżki) za pomocą mikrometru.
  4. Umieść aerożel (o grubości ~3 mm) w jednorazowej kuwecie z plastikową nasadką i włóż kuwet do spektrofotometru. W razie potrzeby lekko przyciąć aerożel, aby zmieścił się w kuwecie.
  5. Włóż dwie igły strzykawki do plastikowej nasadki kuwety, jedną podłączoną do wyjścia zaworu T, a drugą podłączoną do rurki, która służy jako wydech do okapu wyciągowego (patrz rysunek 3b). Użyj Parafilm, aby uszczelnić igły do rurki i nasadkę do kuwety.
  6. Umieść pustą jednorazową kuwetę w celi referencyjnej.
  7. Dostosuj pozycję kuwety aerożelowej, aby upewnić się, że aerożel leży na ścieżce wiązki przed rozpoczęciem eksperymentu.
  8. Przyjmij początkowe widmo od 800 do 300 nm.
  9. Monitorować różnicę między absorbancją przy 414 nm a absorbancją przy 408 nm, obracając zawór T, aby przełączać się między azotem a mieszaniną tlenku azotu/azotu w określonych odstępach czasu, upewniając się, że w żadnym momencie natężenie przepływu azotu lub mieszaniny tlenku azotu i azotu nie jest tak wysokie, że aerożel porusza się w kuwecie.
  10. Weź końcowe widmo od 800 do 300 nm, po zakończeniu cykli ekspozycji.
  11. Powtórz procedurę z trzema do czterech monolitów, aby uzyskać średnią odpowiedź na wyczuwanie.

Wyniki

Opisana procedura prowadzi do otrzymania aerogeli zawierających żywotne cyt. c. Jak określono na końcu wprowadzenia, cyt. c może być inkapsułowany z wodnych roztworów buforowych o stężeniu fosforanów w zakresie od 4,4 do 70 mM. Przykłady aerogeli cyt. c-krzemionka (cyt. c-SiO2) otrzymanych z roztworów o różnych stężeniach buforu przedstawiono na ryc. 4. Wszystkie żele są stosunkowo półprzezroczyste, przy czym żele otrzymane z buforu 70 mM są najbardziej nieprzezroczyste.

Porównanie spektroskopii cyt. c w różnych warunkach przedstawiono na rysunku 5. Typowy widmo (rysunku 5c) wykazuje dużą wypukłość Soret w okolicach 408 nm dla aerogeli cyt. c-SiO2 i jest bardzo podobne do widma cyt. c w roztworze (rysunku 5a). Dodatkowo pokazano widmo cyt. c uwięzionego w aerogelach z nanocząstkami metalu (rysunku 5b), a widmo aerogelu cyt. c-SiO2 jest również podobne do tego widma. Gdy aerogel cyt. c-SiO2 jest wystawiony na działanie tlenku azotu, obserwuje się typowe przesunięcie wypukłości Soret (rysunku 5d).

Spectra UV-vis dla żeli przygotowanych z roztworów cyt. c w roztworach buforowych o różnym stężeniu przedstawiono na ryc. 6. Wszystkie te żele wykazują charakterystyczne cechy spektroskopowe w zakresie UV-vis, wskazujące, że cyt. c nie znajduje się w żelach w stanie zdenaturowanym. Jednak zmniejszona przejrzystość żeli przygotowanych z buforu o stężeniu 70 mM prowadzi do obniżenia stosunku sygnału do szumu w tych spektrach.

Spektra CD aerogeli cyt. c-SiO2 są podobne do spektrum cyt. c uwięzionego w aerogelach z nanocząstkami metalu, podczas gdy oba typy spektrów aerogeli różnią się od spektrum cyt. c w roztworze buforowym (Rycina 7).

Rycina 8 przedstawia typową odpowiedź monitorowania tlenku azotu dla aerogeli cyt. c-SiO2 oraz odpowiadających im aerogeli zawierających dodatkowo nanocząstki metaliczne oprócz cyt. c. Różnica między absorbancją przy 414 nm a absorbancją przy 408 nm wzrasta, a następnie maleje, gdy żele są naprzemiennie narażane na tlenek azotu, a następnie na azot.

Jeśli nadkrytyczny dwutlenek węgla nie zostanie uwolniony wystarczająco powoli, żywotność cyt. c w utworzonych aerogelach zostanie naruszona. Jest to widoczne po porównaniu uzyskanych widm UV-Vis po utworzeniu żeli przez uwalnianie dwutlenku węgla z różnymi szybkościami (Rysunek 9).

Układ komory próżniowej do analizy spektroskopowej z manometrami i złączami.
Rycina 1: Aparatura do suszenia w punkcie krytycznym. Aparatura do suszenia w punkcie krytycznym widok od (A) przodu i (B) tyłu, z łodzią transferową i drzwiczkami aparatu umieszczonymi obok tylnej części urządzenia.

Schemat mikrofluidycznej kartki opartej na urządzeniu do testu chemicznego, pokazujący ścieżkę przepływu cieczy i strefy reakcji.
Rycina 2: Platforma z tektury. Złożona platforma z tektury do umocowania aerogelu na drodze wiązki przyrządu pomiarowego.

Układ z butlą gazową i aparat do chromatografii kolumnowej do doświadczenia rozdzielania chemicznego.
Rycina 3: Układ do wykrywania tlenku azotu. Pokazano układ do wykrywania tlenku azotu, w tym (A) okap z butlą zawierającą 10% tlenku azotu i 90% azotu, rurki oraz zawór typu T oraz (B) kuwetę z wpiętymi igłami.

Wpływ stężenia buforu na przepuszczalność błony; układ eksperymentalny z tłem w szachownicę.
Rycina 4: Przykładowe cyt. c-SiO2 aerogele. Aerogele zawierające 15 μM cyt. c w buforze fosforanowym potasu o stężeniach 4,4 mM, 40 mM i 70 mM przedstawiono kolejno od lewej do prawej w porównaniu z monetą dziesięciocentową. Wysokość tych aerogeli wynosi około 0,2–0,5 cm. Za ponowne wykorzystanie udzielono zezwolenia9.

Analiza spektralna, absorbancja cyt. c w aerogelach SiO2, wykres; Długość fali vs. Względna absorbancja.
Rycina 5: Spektroskopia cyt. c-SiO2 aerogelowa. Widma widzialne 15 μM cytochromu c w: (a) roztworze buforowym fosforanowym o stężeniu 50 mM; (b) aerogelu Au(5-nm)~cyt. c-SiO2; (c) aerogelu cyt. c–SiO2 (narażonym na powietrze); (d) aerogelu cyt. c-SiO2 (narażonym na tlenek azotu przez 3,5 min). Przedstawione charakterystyczne widma dla każdego typu żelu zostały przesunięte w celu poprawienia czytelności, a linia przerywana wskazuje położenie pasma Soret cyt. c w buforze. Mimo że każde widmo dotyczy 15 μM cyt. c, grubości (lub wysokości) żelu wynoszą jedynie 0,2–0,5 cm w porównaniu do 1 cm kuwety z roztworem, co skutkuje niższą absorbancją roztworu. Ponadrukowane za zgodą9.

Spektra absorbancji optycznej buforów; wykres; długość fali a absorbancja; analiza spektralna
Rycina 6: Spektroskopia aerogelu przy zmiennej stężeniu buforu w postaci zamkniętej. Uśredniona absorbancja spektralna w zakresie UV-widzialnym aerogeli podzielona przez długość ścieżki żelu dla żeli zawierających 15 μM cyt. c w buforze fosforanowym potasu o stężeniu 70 mM (czarny kolor) (średnia z 4 spektrów), 40 mM (czerwony, przerywana linia) (średnia z 8 spektrów) oraz 4,4 mM (zielony, kreskowana linia) (średnia z 9 spektrów). Odtworzono za zgodą9.

Wykres dikroizmu kołowego przedstawiający widma absorpcyjne do analizy struktury drugorzędowej białka.
Rycina 7: Spektroskopia dikroizmu kołowego aerogelu. Widma dikroizmu kołowego cyt. c w roztworze buforowanym fosforanem sodu (linia ciągła), dwa reprezentatywne widma aerogeli cyt. c-SiO2 (linia przerywana) oraz dwa reprezentatywne widma aerogeli Au(5-nm)~cyt. cSiO-2 (linia kreskowana). Za ponownym drukiem z pozwoleniem9.

Wykres analizy absorpcji dla aerogeli z cyklemi NO i N₂; pokazuje oddziaływanie Au i cyt c w czasie.
Rycina 8: Wykrywanie tlenku azotu za pomocą cyt. c-SiO2 aerogeli. Obserwacja przesunięcia (ΔA = A414 nm - A408 nm) intensywności pasma Soret cyt. c (czerwona linia ciągła) oraz Au~cyt. c (niebieska linia przerywana) uwięzionych w nanokompozytowych aerogelach SiO2 podczas przełączania przepływu gazu między azotem (maksimum pasma Soret przy ~408 nm) a tlenkiem azotu (maksimum pasma Soret przy ~414 nm). Każda krzywa jest średnią z 3–4 prób, z czego dwie próby z cyt. c-SiO2 były monitorowane przy ΔA = A414 nm - A407 nm, ponieważ początkowe maksimum pasma Soret wynosiło 407 nm w tych próbach. Ponownie wydrukowano za zgodą9.

Wykres widma absorpcji; uwalnianie CO2 po 7 min a po 45 min; porównanie długości fali 375–600 nm
Rycina 9: Wpływ czasu uwalniania cieczy nadkrytycznej. Uśrednione widmowe absorbancje w zakresie UV-widzialnym podzielone przez długość drogi optycznej żelu dla aerożeli cyt. c-SiO2 zawierających 10 μM cyt. c w buforze fosforanowym o stężeniu 50 mM, przy czym aerożele osuszono nadkrytycznie poprzez uwalnianie dwutlenku węgla nadkrytycznego w ciągu 45 min (linia ciągła, czarna (uśrednienie 9 widm)) lub 7 min (linia przerywana, czerwona (uśrednienie 4 widm)). Wznowione za zgodą9.

Dyskusja

Zgodnie z opisem, procedura ta konsekwentnie prowadzi do powstania żywotnego cyt. c zamknięte w aerożelach. Stężenie cyt. c w aerożelach może wynosić od 5 do 15 μM, a stężenie buforowe początkowego cyt. Roztwór c zamknięty w aerożelach może mieć różną zawartość fosforanu od 4,4 do 70 mM bez poważnego szkodliwego wpływu na żywotność białka. Jednak środek piku i szerokość piku charakterystycznego cyt. c Pik Soreta w aerożelach są najbliższe temu, czym są dla cyt. c w roztworze, gdy cyt. c jest zamknięty w aerożelach z roztworów 40 mM buforu9.

Synteza cyt. Na aerożele c-SiO2 ma wpływ wiek niektórych odczynników wyjściowych. Metanol, tetrametoksysilan i roztwór wodorotlenku amonu są higroskopijne i należy je wymieniać co jeden do dwóch miesięcy. Zwiększona ilość wody, która gromadzi się w tych odczynnikach z czasem, wpływa na charakterystykę strukturalną żelu i czas przejścia zol do żelu.

Podczas suszenia nadkrytycznego łódź transferowa aparatu do suszenia w punkcie krytycznym może pomieścić do osiemnastu żeli o grubości 0,5 cm i średnicy 1 cm. Jak opisano w sekcji protokołu, należy postępować zgodnie z określoną procedurą napełniania i opróżniania w celu przeniesienia dwutlenku węgla do zol-żeli. Należy zauważyć, że na początku protokołu opróżniania mieszanina drenażowa dwutlenku węgla i acetonu przepływa z taką prędkością, że rura odpływowa zamarza na sztywno, a wilgoć skrapla się na zewnątrz w lód. Odpływająca mieszanina zawiera trochę wody, ponieważ aceton nie jest bezwodny i woda ta może czasami zamarzać do tego stopnia, że rurka odpływowa faktycznie się zatka. Konieczne jest obserwowanie takich zatorów i nasłuchiwanie zatrzymania przepływu. Zawór spustowy powinien być zamknięty na kilka minut, aby zator stopił się w przypadku wykrycia zatkania. W najgorszym przypadku, jeśli zawór spustowy nie jest zamknięty, zatkanie może spowodować wzrost tak dużego ciśnienia, że rurka odpływowa z impetem wyskoczy z urządzenia. Po kilku pierwszych okresach opróżniania większość acetonu zostanie wypłukana z aparatu, a występowanie mokrych kawałków lodu znacznie się zmniejszy. Wyładowanie będzie stopniowo przypominać suchy lód w miarę kontynuowania protokołu opróżniania, a wszelkie szczątkowe dowody obecności acetonu (takie jak zapach) staną się niewykrywalne pod koniec procesu opróżniania.

Po przejściu dwutlenku węgla w aparacie z cieczy w ciecz w płyn nadkrytyczny i rozpoczęciu procesu odpowietrzania, konieczne jest uwalnianie płynu w powolnej szybkości przez co najmniej 45 minut, jak wskazano w procedurze9. Wyższa szybkość uwalniania może zmniejszyć żywotność cyt. c (jak pokazano na rysunku 9) w aerożelach, a same aerożele mogą w rzeczywistości rozpadać się, gdy płyn spieszy się, aby uciec z żeli. Ogólnie rzecz biorąc, nawet jeśli aerożele pozostają nienaruszone po otwarciu drzwiczek aparatu, ważne jest, aby obchodzić się z nimi ostrożnie i delikatnie, ponieważ są kruche i mogą łatwo pękać.

Kontrolne żele krzemionkowe, które są wlewane wzdłuż cyt. Żele c-SiO 2 stosuje się po wysuszeniu nadkrytycznym w celu określenia, czy transfer dwutlenku węgla do żeli zakończył się sukcesem. Czasami cyt. Żele c-SiO 2 mogą wydawać się mętne i ważne jest, aby ustalić, czy jest to spowodowane niepełnym przenoszeniem rozpuszczalnika, czy też może to mieć związek ze stężeniem cyt. c lub bufor zamknięty w żelach. Jeśli żele krzemionkowe bez cyt. c wydają się mieć jednorodny, półprzezroczysty wygląd przez cały czas, co można uznać za dowód, że transfer rozpuszczalnika nastąpił całkowicie, nawet jeśli cyt. Żele c-SiO 2 mają w sobie pewne zmętnienie. Zmętnienie w żelach krzemionkowych bez cyt. c po wyschnięciu wskazuje, że podczas odpowietrzania w żelach pozostała trochę acetonu.

Jak wskazano w sekcji protokołu, podczas pracy z tlenkiem azotu (NO) należy podjąć ważne środki ostrożności. Aby wykryć NO za pomocą aerożeli, konieczne jest bardzo dobre uszczelnienie kuwety i odprowadzenie gazu przepływającego przez aerożele do dygestorium. Alternatywnie, cały spektrofotometr można przenieść do dygestorium wraz z butlą z gazem NO jako dodatkowy środek ostrożności w celu ograniczenia narażenia na gaz NO. W kontakcie z powietrzem NO natychmiast wytworzy silnie trujący dwutlenek azotu, tetratlenek azotu lub jedno i drugie. NO może również reagować z wodą, wytwarzając ciepło i opary. Dlatego długotrwałe narażenie na NO może powodować bezpośrednią toksyczność tkankową.

Podczas korzystania z cyt. c-SiO 2 aerożele do wykrywania obecności tlenku azotu, pasmo Soreta będzie początkowo miało długość ~ 408 nm i zmieni się na ~ 414 nm w obecności tlenku azotu. Po przełączeniu z powrotem na azot pasmo Soreta powinno powrócić do środka na ~408 nm. Możliwe jest również użycie cyt. c-SiO 2 aerożele do wykrywania obecności innych ligandów, takich jak tlenek węgla27.

Różne opublikowane procedury obejmują dodatkowy etap łączenia nanocząstek złota lub srebra z cyt. C w roztworze przed zmieszaniem z zolem i nadkrytycznym suszeniem do postaci aerożeli4-8. Porównanie spektroskopii cyt. w zakresie widzialnym UV. C zamknięty w aerożelach z nanocząstkami metalu do CYT. C zamknięte w aerożelach bez nanocząstek metalu pokazuje, że te dwa rodzaje technik enkapsulacji wytwarzają cyt. c o podobnej żywotności w obrębie aerożeli (rysunek 5). Jednak cyt. C zamknięty w nanocząstkach metalu jest nieco bardziej stabilny niż CYT. C zamknięte w kapsułkach bez nanocząstek metalu w aerożelach9. Widma CD obu typów cyt. Aerożele C są również podobne, chociaż oba różnią się od widma CYT. c w buforze wskazującym na pewne rozwinięcie CYT. c w obrębie aerożeli (rysunek 7). Poprzednie doniesienia na temat cyt. C zamknięte w aerożelach sugerują, że spektroskopia dichroizmu kołowego najprawdopodobniej ocenia najbardziej zewnętrzną warstwę białka, rozwiniętą w kontakcie z żelem krzemionkowym, w wielowarstwowym CYN z jądrami nanocząstek metalu. Struktury C lub luźno zorganizowane struktury, które powstają, gdy w aerożelach nie ma nanocząstek metalu4,9. Większość cyt. c w każdym z typów samoorganizujących się struktur wewnątrz aerożeli pozostaje jednak pofałdowanych, jak zmierzono za pomocą spektroskopii UV-widzialnej. Zaletą opisanego tu protokołu bez nanocząstek jest to, że nie jest konieczny kosztowny zakup lub czasochłonna synteza nanocząstek metali. Białka często nie były skutecznie kapsułkowane w aerożelach, dlatego ta procedura jest ważna, ponieważ może prowadzić do opracowania bardziej ogólnej metody kapsułkowania innych białek w aerożelach, która może mieć potencjalne znaczenie dla przyszłych urządzeń bioanalitycznych.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Wsparcie dla tej pracy i/lub publikacji zostało zapewnione przez Instytut Naukowy Kolegium Sztuki i Nauki Uniwersytetu Fairfield, Grant Badawczy Uniwersytetu Fairfield, Nagrodę Naukową Cottrell College od Korporacji Badawczej ds. Rozwoju Nauki, College of Arts & Sciences Uniwersytetu Fairfield oraz Wydział Chemii i Biochemii Uniwersytetu Fairfield. Wyrażamy wdzięczność Jean Marie Wallace za wiele pomocnych spostrzeżeń i porad dotyczących tego ogólnego obszaru badań. Ponadto składamy specjalne podziękowania wszystkim byłym, obecnym i przyszłym badaczom z Laboratorium Badawczego Harper-Leatherman.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fosforan potasu, monobasicFisher ScientificP285-500Certified ACS (możliwe również użycie fosforanu sodu jednozasadowego)
Fosforan potasu dwuzasadowy bezwodnyFisher ScientificP288-500Certified ACS (można również użyć fosforanu sodu dwuzasadowego)
WaterMillipore Direct-Q18 MΩ cm
pH-metr i elektrodaDenver InstrumentUB-10
Cytochrom c z serca koniaSigma AldrichC7752-100MG ≥ 95% w oparciu o Mol. Wt. 12,384, używane w stanie otrzymanym i przechowywanym w temperaturze -20  ° C
Fiolki scyntylacyjne szklaneWheaton03-341-25J20 ml, średnica zewnętrzna x wysokość (z nakrętką): 28  mm x 61  mm
Kuweta jednorazowaFisher Scientific14-955-126metakrylan, 10 mm x 10 mm x 45 
mm Spektrofotometr ultrafioletowy w świetle widzialnymShimadzuUV-1800Wykorzystuje oprogramowanie UVProbe v 2.33
Spektrometr dichroizmu kołowego (lub spektropolarymetr)Lodówka laboratoryjna JASCOJ-810
IsotempFisher Scientific
Jednorazowe zlewki polipropylenoweFisher Scientific01-291-1050 ml
Tetramethylorthosilicane (znany również jako tetrametoksysilian, TMOS)Sigma Aldrich218472-500G98% czystości
MetanolFisher ScientificA457-4GC Resolv grade
Roztwór wodorotlenku amonuSigma Aldrich221228-25ML-AOdczynnik ACS, 28,0%-30,0%
Fiolki scyntylacyjne z polipropylenu ogólnego przeznaczeniaSigma AldrichZ376825-1PAK16 mm x 57 mm, wielkość objętości 6,5  ml, odetnij spód ostrym nożem lub brzytwą
ogólna folia plastikowaróżne
folia laboratoryjna do pakowania Parafilm MFisher ScientificS37440
Plastikowy tłok strzykawkido różnychzastosowań tłok strzykawki ze strzykawki 3 ml
Alkohol etylowyAcros61509-0040Absolutny, 200 proof, 99,5% odczynnik ACS
AcetonFisher ScientificA949-4Klasa HPLC
Aparat do suszenia punktu krytycznegoQuorum TechnologiesSeria E3000
CyrkulatorFisher ScientificIsotemp 3016
Butla z dwutlenkiem węglaTech Airsyfona Mikrometr
Centralna firma narzędziowa
Oprogramowanie GRAMS / AI 8.0Thermo Electron Corporation
Butla z azotemTech AirInny gaz obojętny można zastąpić
10% tlenku azotu / 90% butli z azotemAirgas
Tygon rurkiróżne
zawory T-switchróżne
igły strzykawkoweróżne

Bibliografia

  1. Pettigrew, G. W., Moore, G. R. Cytochromes c. Biological Aspects. , SpringerVerlag. Berlin. (1987).
  2. Moore, G. R., Pettigrew, G. W. Cytochromes c. Evolutionary, Structural, and Physicochemical Aspects. , SpringerVerlag. Berlin. (1990).
  3. Scott, R. A., Mauk, A. G. Cytochrome c: A Multidisciplinary Approach. , University Science Books. Sausalito, CA. (1996).
  4. Wallace, J. M., Rice, J. K., Pietron, J. J., Stroud, R. M., Long, J. W., Rolison, D. R. Silica nanoarchitectures incorporating self-organized protein superstructures with gas-phase bioactivity. Nano Lett. 3 (10), 1463-1467 (2003).
  5. Wallace, J. M., Dening, B. M., Eden, K. B., Stroud, R. M., Long, J. W., Rolison, D. R. Silver-colloid-nucleated cytochrome c. superstructures encapsulated in silica nanoarchitectures. Langmuir. 20 (21), 9276-9281 (2004).
  6. Wallace, J. M., Stroud, R. M., Pietron, J. J., Long, J. W., Rolison, D. R. The effect of particle size and protein content on nanoparticle-gold-nucleated cytochrome c. superstructures encapsulated in silica nanoarchitectures. J.Non-Cryst. Solids. 350, 31-38 (2004).
  7. US Patent. , 7,238,729 U.S. Patent 6,824,776 (2004) (2007).
  8. Harper-Leatherman, A. S., Wallace, J. M., Rolison, D. R. Cytochrome c. stabilization and immobilization in aerogels. Enzyme Stabilization and Immobilization: Methods and Protocols. Minteer, S. D. 679, Springer. New York, NY. 193-205 (2011).
  9. Harper-Leatherman, A. S., et al. Simplified procedure for encapsulating cytochrome c. in silica aerogel nanoarchitectures while retaining gas-phase bioactivity. Langmuir. 28 (41), 14756-14765 (2012).
  10. Hitihami-Mudiyanselage, A., Senevirathne, K., Brock, S. L. Assembly of phosphide nanocrystals into porous networks: Formation of InP gels and aerogels. ACS Nano. 7 (2), 1163-1170 (2013).
  11. Fricke, J. Aerogels. , Springer-Verlag. Berlin. (1986).
  12. Hüsing, N., Schubert, U. Aerogels-airy materials: chemistry, structure, and properties. Angew. Chem. Int. Edit. 37 (1-2), 22-45 (1998).
  13. Aerogels Handbook. Aegerter, A. M., Leventis, N., Koebel, M. M. , Springer. New York, NY. (2011).
  14. Kazuyoshi, K. Recent progress in aerogel science and technology. Adv. Porous Mater. 1 (2), 147-163 (2013).
  15. Leventis, N., Elder, I. A., Anderson, M. L., Rolison, D. R., Merzbacher, C. I. Durable modification of silica aerogel monoliths with fluorescent 2,7-diazapyrenium moieties. Sensing oxygen near the speed of open-air diffusion. Chem. Mater. 11 (10), 2837-2845 (1999).
  16. Plata, D. L., et al. Aerogel-platform optical sensors for oxygen gas. J. Non-Cryst. Solids. 350, 326-335 (2004).
  17. Rolison, D. R., Pietron, J. J., Long, J. W. Controlling the sensitivity, specificity, and time signature of sensors through architectural design on the nanoscale. ECS Trans. 19 (6), 171-179 (2009).
  18. Carroll, M. K., Anderson, A. M. Aerogels as platforms for chemical sensors. Aerogels Handbook. Aegerter, A. M., Leventis, N., Koebel, M. M. , Springer. New York, NY. 637-650 (2011).
  19. Rolison, D. R. Catalytic nanoarchitectures-The importance of nothing and the unimportance of periodicity. Science. 299 (5613), 1698-1701 (2003).
  20. Pietron, J. J., Stroud, R. M., Rolison, D. R. Using three dimensions in catalytic mesoporous nanoarchitectures. Nano Lett. 2 (5), 545-549 (2002).
  21. Anderson, M. L., Morris, C. A., Stroud, R. M., Merzbacher, C. I., Rolison, D. R. Colloidal gold aerogels: Preparation, properties, and characterization. Langmuir. 15 (3), 674-681 (1999).
  22. Anderson, M. L., Stroud, R. M., Rolison, D. R. Enhancing the activity of fuel-cell reactions by designing three-dimensional nanostructured architectures: Catalyst-modified carbon-silica composite aerogels. Nano Lett. 3 (9), 1321(2003).
  23. Chervin, C. N., et al. Defective by design: vanadium-substituted iron oxide nanoarchitectures as cation-insertion hosts for electrochemical charge storage. J. Mater. Chem. A. 3 (22), 12059-12068 (2015).
  24. Ellerby, L. M., et al. Encapsulation of proteins in transparent porous silicate-glasses prepared by the sol-gel method. Science. 255 (5048), 1113-1115 (1992).
  25. Massari, A. M., Finkelstein, I. J., Fayer, M. D. Dynamics of proteins encapsulated in silica sol-gel glasses studied with IR vibrational echo spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 128 (12), 3990-3997 (2006).
  26. Ray, A., Feng, M., Tachikawa, H. Direct electrochemistry and Raman spectroscopy of sol-gel-encapsulated myoglobin. Langmuir. 21 (16), 7456-7460 (2005).
  27. Blyth, D. J., Aylott, J. W., Richardson, D. J., Russell, D. A. Sol-gel encapsulation of metalloproteins for the development of optical biosensors for nitrogen-monoxide and carbon-monoxide. Analyst. 120 (11), 2725-2730 (1995).
  28. Lan, E. H., Dave, B. C., Fukuto, J. M., Dunn, B., Zink, J. I., Valentine, J. S. Synthesis of sol-gel encapsulated heme proteins with chemical sensing properties. J. Mater. Chem. 9 (1), 45-53 (1999).
  29. Miller, J. M., Dunn, B., Valentine, J. S., Zink, J. I. Synthesis conditions for encapsulating cytochrome c. and catalase in SiO2 sol-gel materials. J. Non-Cryst. Solids. 202 (3), 279-289 (1996).
  30. Ronda, L., Bruno, S., Faggiano, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. Oxygen binding to heme proteins in solution, encapsulated in silica gels, and in the crystalline state. Methods in Enzymology. Poole, R. K. 437, Elsevier Academic Press. San Diego, CA. 311-328 (2008).
  31. Margoliash, E., Frohwirt, N. Spectrum of Horse-Heart Cytochrome c. Biochem. J. 71 (3), 570-572 (1959).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Enkapsulacja cytochromu Caerogele krzemionkoweenkapsulacja bia eksynteza sol gelsuszenie nadkrytycznedetekcja tlenku azotucharakterystyka bioaerogelispektroskopia UV Visdichroizm ko owy

Powiązane artykuły