Pomiar pętli głośności ciśnienia w myszy

Podsumowanie

Ten rękopis opisuje szczegółowy protokół zbierania danych o ciśnieniu i objętości z myszy.

Streszczenie

Zrozumienie przyczyn i postępu chorób serca stanowi poważne wyzwanie dla społeczności biomedycznej. Elastyczność genetyczna myszy zapewnia ogromny potencjał do badania funkcji serca na poziomie molekularnym. Niewielki rozmiar myszy stwarza pewne wyzwania w odniesieniu do wykonywania szczegółowego fenotypowania serca. Miniaturyzacja i inne postępy technologiczne umożliwiły wiele metod oceny serca u myszy. Spośród nich jednoczesne gromadzenie danych dotyczących ciśnienia i objętości zapewnia szczegółowy obraz funkcji serca, który nie jest dostępny za pomocą żadnej innej metody. W tym miejscu opisano szczegółową procedurę zbierania danych pętli ciśnienie-objętość. Uwzględniono w nim omówienie zasad leżących u podstaw pomiarów oraz potencjalnych źródeł błędów. Postępowanie anestezjologiczne i podejścia chirurgiczne są omawiane bardzo szczegółowo, ponieważ mają one kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości pomiarów hemodynamicznych. Omówiono również zasady opracowywania protokołów hemodynamicznych i istotne aspekty analizy danych.

Wprowadzenie

Choroby układu krążenia nadal są istotną przyczyną śmiertelności i zachorowalności na całym świecie ¹. Choroby serca stanowią szczególnie trudne wyzwanie w opracowywaniu nowych terapii. Postępy w genetyce dają możliwość zidentyfikowania wielu potencjalnych czynników genetycznych przyczyniających się do rozwoju chorób serca. Integracyjna natura układu sercowo-naczyniowego wymaga, aby te cele genetyczne zostały zweryfikowane w nienaruszonych modelach zwierzęcych. Elastyczność genetyczna i niskie koszty utrzymania myszy sprawiły, że znalazła się ona w czołówce oceny fizjologicznej roli danego genu. Niewielki rozmiar myszy stanowi wyjątkowe wyzwanie dla oceny czynności serca. Istnieje kilka modalności, które mogą dostarczyć informacji na temat funkcji serca, ale tylko jednoczesny pomiar ciśnienia i objętości komory umożliwia analizę pętli ciśnienie-objętość (PV) funkcji komór. Pętle PV umożliwiają analizę funkcji serca niezależnie od jego połączenia z układem naczyniowym; ważny czynnik decydujący o funkcjonalnej roli danego elementu genetycznego.

Ocena pętli ciśnienie-objętość jest stosowana zarówno eksperymentalnie, jak i klinicznie od wielu lat i istnieje obszerna literatura dotycząca analizy tych zestawów danych ^2,3. Adaptacja technologii pętli fotowoltaicznej do myszy była ważnym postępem w zrozumieniu fizjologii serca myszy ^4-6. Technologie pętli fotowoltaicznej oparte na cewniku łączą przetwornik ciśnienia i wykorzystanie przewodnictwa do oszacowania objętości komory. Objętość komory określa się poprzez badanie zmian w polu elektrycznym generowanym przez cewnik. Metoda ta modeluje komorę jako cylinder, którego wysokość jest określana przez odległość między elektrodami na cewniku, a promień jest obliczany na podstawie przewodzenia pola elektrycznego przez krew w komorze ^7-9. Sygnał przewodzenia mierzony przez cewnik składa się z dwóch składowych. Pierwszym z nich jest przewodzenie przez krew; Zmienia się to w zależności od objętości komory i stanowi podstawowy sygnał używany do określenia objętości komory. Drugi składnik wynika z przewodzenia przez i wzdłuż ściany komory. Nazywa się to przewodnictwem równoległym i musi zostać usunięte w celu określenia bezwzględnej objętości komory. Istnieją dwa komercyjnie dostępne systemy do zbierania danych dotyczących ciśnienia i objętości w laboratorium badawczym, a metoda stosowana do obliczania i usuwania przewodności równoległej jest podstawową różnicą między nimi ^6,10,11. Cewniki konduktancyjne wymagają wstrzyknięcia hipertonicznego roztworu soli fizjologicznej w celu obliczenia przewodnictwa równoległego. To wstrzyknięcie przejściowo zmienia przewodnictwo krwi w komorze, podczas gdy przewodnictwo ściany pozostaje stałe. Na podstawie tych danych można określić składową sygnału przewodnictwa, która pochodzi z krwi, a co pochodzi ze ściany komory. Podejście to zakłada, że przewodnictwo równoległe nie zmienia się podczas cyklu pracy serca. Metoda admitancji opiera się na zmianach fazowych w polu elektrycznym w celu oceny udziału ściany komory w ogólnym sygnale objętościowym. Metoda ta opiera się na różnych z góry określonych stałych przewodności krwi i mięśnia sercowego w celu określenia końcowej objętości, ale wykonuje ciągłe pomiary równoległego przewodnictwa podczas cyklu pracy serca. Oba te systemy zapewniają dobre oszacowanie objętości lewej komory, a różnice między nimi prawdopodobnie nie będą fizjologicznie istotne. Cylindryczny model komory i inne założenia sprawiają, że te podejścia oparte na cewnikach nie są tak dokładne, jak inne metody, ale dane te są dostarczane na zasadzie uderzenie po uderzeniu, co jest niezbędne do oceny niezależnych od obciążenia pomiarów czynności serca.

Opisana tutaj procedura jest stosowana w moim laboratorium i dostarczyła danych do dużej liczby badań badających podstawowe patofizjologiczne mechanizmy kardiomiopatii dystroficznej ^12-18. Poniższa procedura jest jedną z dwóch, które można wykorzystać do uzyskania danych pętli fotowoltaicznej. Chociaż wiele zasad ma zastosowanie do każdego z tych podejść, niniejszy protokół skupi się na podejściu wierzchołkowym z otwartą klatką piersiową; Protokół zamkniętej klatki piersiowej został szczegółowo opisany w innym miejscu ^19,20. Chociaż procedura zostanie szczegółowo opisana, ważnymi nadrzędnymi zasadami jest odsłonięcie serca przy minimalnym uszkodzeniu serca lub płuc. W całym protokole należy pamiętać, że jest to procedura niepozwalająca na przeżycie i że dobra ekspozycja serca jest niezwykle ważna dla prawidłowego umieszczenia cewnika.

Protokół

Przed wykonaniem jakiejkolwiek procedury opisanej w tym protokole, uzyskaj zgodę lokalnej komisji ds. opieki i użytkowania zwierząt.

1. Ustawianie stanowiska eksperymentalnego

Uwaga: Ta procedura jest wykonywana na znieczulonych zwierzętach, a jakość danych jest proporcjonalna do jakości wsparcia anestezjologicznego oferowanego zwierzęciu. W pierwszej sekcji szczegółowo omówiono sprzęt i procedury niezbędne do znieczulenia myszy podczas wykonywania tego protokołu.

1. Wybierz protokół znieczulający. Wziewne środki znieczulające mają wiele korzystnych właściwości do przeprowadzania analizy pętli PV, chociaż stosowano również niektóre protokoły iniekcyjne. Zapoznaj się z dyskusją, aby uzyskać więcej informacji na temat wyboru reżimu znieczulającego.
2. Przymocuj butle ze sprężonym tlenem do stołu operacyjnego lub ściany w pobliżu pola operacyjnego.
3. Jeśli używasz wziewnych środków znieczulających, użyj waporyzatora, aby zapewnić prawidłowe dawkowanie. Kalibruj waporyzatory co roku, aby upewnić się, że dostarczają odpowiednią dawkę gazu znieczulającego. Podłącz parowniki do przepływomierza, który umożliwia kontrolę szybkości, z jaką gaz dostaje się do obwodu znieczulającego. Ustawić na 0,5 - 1,0 l/min.
4. Użyj kolektora, aby umożliwić skierowany przepływ gazu znieczulającego do 1) komory indukcyjnej, 2) maski i 3) respiratora. Oczyszczanie gazu znieczulającego jest niezwykle ważne i powinno być wykonywane przez aktywny system, który albo odprowadza powietrze do dygestorium (lub innej podobnej infrastruktury budowlanej), albo przez kanister przeznaczony do usuwania gazów znieczulających.
   nuta: Skontaktuj się z lokalnymi urzędnikami ds. medycyny pracy, aby upewnić się, że przestrzegasz wszystkich lokalnych przepisów.
5. Utrzymuj temperaturę ciała za pomocą poduszek grzewczych i/lub lamp grzewczych. Stale monitoruj temperaturę ciała za pomocą termometru doodbytniczego. Pozwoli to na proaktywne zwiększanie lub zmniejszanie ogrzewania w celu zapewnienia fizjologicznej temperatury ciała (≈ 37 °C) podczas zbierania danych hemodynamicznych.
6. Zapewnij wsparcie płynami, aby przeciwdziałać utracie krwi i niewyczuwalnej utracie objętości.
   1. Przygotuj 10% roztwór albuminy w 0,9% NaCl, biorąc 1 ml 25% albuminy i dodając 1,5 ml 0,9% NaCl do strzykawki.
   2. Przygotować cewnik wewnątrznaczyniowy o małej objętości resztkowej.
      1. Użyj szczypiec, aby zmiażdżyć plastikową piastę igły o rozmiarze 0.5 cala i rozmiarze 30. Za pomocą uchwytów na igły chwyć igłę i wyjmij piastę. Zeskrobać pozostały klej z igły za pomocą hemostatu. Włóż koniec igły do rurki z mikrootworem. Użyj mniej niż 20 cali długości na rurkę.
   3. Użyj pompy strzykawkowej, aby umożliwić dostarczenie dokładnych objętości.
7. Zapewnij odpowiednią wentylację w celu gromadzenia wysokiej jakości danych fotowoltaicznych. W sprzedaży dostępnych jest wiele wentylatorów dla myszy. Wentylatory sterowane ciśnieniem zapewniają zamknięte środowisko wymagane dla wziewnych gazów znieczulających i zapewniają lepszą kontrolę wentylacji podczas zabiegu.
   1. Upewnij się, że ciśnienie wdechowe jest ograniczone do <15 cm H₂O, aby zapobiec barotraumie. Ustaw respirator tak, aby dostarczał impuls wdechowy przez 35% cyklu oddechowego. Zastosowanie dodatniego ciśnienia końcowo-wydechowego (PEEP) na poziomie 4 - 5 cm_H2Oznacznie poprawi wentylację myszy, zapobiegając niedodmie płuc i wspomagając wymianę gazową.
   2. Ogranicz martwą przestrzeń dystalnie do przegubu Y w obwodzie wentylacyjnym. Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ objętość oddechowa myszy jest bardzo mała, a każda martwa przestrzeń zmniejsza dopływ świeżego wdechu
   .
   3. Utwórz rurkę dotchawiczą (ET) wielkości myszy, odcinając końcówkę cewnika wewnątrznaczyniowego o rozmiarze 20. Zapewnia to zwężający się punkt ułatwiający wkładanie. Umieść odcięty koniec w złączu Y obwodu znieczulającego.
   4. Używaj elastycznych przewodów w obwodzie oddechowym. Każda pamięć strukturalna w rurce wytworzy siły zewnętrzne, które mogą wyciągnąć rurkę dotchawiczą z dróg oddechowych myszy.
   5. Pozwól myszy określić częstość oddechów, używając najniższej szybkości, która tłumi endogenny napęd oddechowy. Zacznij od stosunkowo powolnej częstości oddechów wynoszącej około 60 oddechów na minutę.
      nuta: Przy odpowiedniej wentylacji mysz powinna bardzo mało wysiłku wkładać w oddychanie. Jeśli jednak wentylacja jest niewystarczająca, nagromadzenie CO₂ we krwi zainicjuje wysiłek oddechowy myszy. Jeśli zostanie to zaobserwowane, zwiększenie częstości oddechów jest prostym sposobem na zwiększenie wentylacji pęcherzyków płucnych. Często konieczne jest zwiększenie częstości oddechów w odpowiedzi na zwiększenie obciążenia serca związane ze stymulacją receptorów beta-adrenergicznych.
   6. Po przygotowaniu obwodu oddechowego należy przeprowadzić próbę ciśnieniową systemu, zatykając palcem końcówkę rurki dotchawiczej (ET). Zapewnić ciśnienie w drogach oddechowych ≈10 cmH₂O. Badanie to należy wykonać przed każdym zabiegiem.

2. Podejście chirurgiczne

1. Używaj małych kleszczy i nożyczek oraz innego sprzętu z Tabeli 1. Wszystkie instrumenty są dość małe, aby umożliwić łatwe użycie w powiększonym polu operacyjnym. Użyj stereoskopu chirurgicznego, aby zapewnić odpowiednie powiększenie dla kilku aspektów zabiegu chirurgicznego.
2. Użyj kauteryzacji, aby zmaksymalizować hemostazę podczas zabiegu.
   Uwaga: Istnieje kilka szerokich klas kauteryzacji. Termokaagulacja podgrzewa cienki metalowy element, który przetnie tkankę mięśniową i zatrzyma krwawienie. Systemy te są początkowo stosunkowo niedrogie; Należy jednak pamiętać, że końcówki drutu są zarówno delikatne, jak i stosunkowo kosztowne. Systemy elektrokoagulacji są początkowo droższe w zakupie, ale końcówki są bardzo wytrzymałe i nie trzeba ich wymieniać.
3. Indukcja i przygotowanie chirurgiczne
   1. Uzyskaj masę ciała myszy.
   2. Umieść mysz w komorze indukcyjnej wypełnionej 5% izofluranem.
      nuta: Mysz nie jest w stanie przetrwać w tym środowisku dłużej niż kilka minut. Tylko 45 - 60 sekund potrzeba, aby mysz straciła odruch prostowania (wysiłki, aby się przewrócić, gdy jest umieszczona na plecach lub na boku).
   3. Po utracie odruchu prostowania należy zmniejszyć stężenie izofluranu do 2% i otworzyć gaz znieczulający do maski.
   4. Szybko przenieś mysz na stół operacyjny i umieść ją w pozycji leżącej grzbietowej z nosem w masce.
   5. Jeśli używasz elektrokoagulacji, użyj gazy nasączonej solą fizjologiczną, aby elektrycznie połączyć mysz z podkładką uziemiającą systemu elektrokoagulacji.
   6. Zabezpiecz kończyny taśmą chirurgiczną. Taśma ta zapewnia właściwości adhezyjne nawet po zamoczeniu.
   7. Włóż doodbytniczą termosondę do monitorowania temperatury głębokiej ciała. Zabezpiecz taśmą.
   8. Nałóż depilator na szyję i klatkę piersiową myszy. Odczekaj 2 - 3 minuty, aż depilator zacznie działać, a następnie usuń sierść z tych obszarów za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką i/lub chusteczek laboratoryjnych.
      nuta: Układanie pola operacyjnego nie jest wymagane, ponieważ jest to procedura niezapewniająca przeżycia, ale może być pożądana w celu ograniczenia ekspozycji chirurga na podkładkę uziemiającą kauteryzację, jeśli jest używana.
   9. Gdy mysz jest przygotowana do operacji, oceń płaszczyznę chirurgiczną myszy, wykonując uszczypnięcie palca u nogi. Po upewnieniu się, że głębokość znieczulenia jest odpowiednia, mysz jest gotowa do pierwszego nacięcia.
4. Uzyskaj kontrolę nad drogami oddechowymi poprzez intubację doustną lub tracheotomię. Tracheotomia jest wygodnym podejściem, które jest stosunkowo proste do wykonania.
   nuta: W całym tym opisie procedury wszystkie kierunki i orientacje będą zależne od chirurga.
   1. Wykonaj nacięcie na poziomie wcięcia mostka rozciągającego się od ≈ 5 mm na prawo od linii środkowej do ≈ 5 mm na lewo od linii środkowej.
   2. Wykonaj drugie nacięcie rozciągające się wzdłuż prawej krawędzi pierwszego nacięcia, rozciągając się rostralnie do poziomu ≈ 2 mm ogonowo do końca żuchwy.
   3. Wykonaj trzecie nacięcie rozciągające się od rostralnego końca drugiego nacięcia do ≈ 5 mm na lewo od linii środkowej. Cofnij powstały płat skóry w lewo, aby odsłonić leżące pod nim tkanki.
   4. Oddziel śliniankę przyuszną i podżuchwową na linii środkowej przez rozwarstwienie. Spowoduje to odsłonięcie leżącej pod spodem mięśni leżących nad tchawicą.
   5. Tępo oddziel prawy i lewy mięsień mostkowy, aby odsłonić tchawicę.
   6. Przełóż ≈10 cm kawałek jedwabnego szwu 3-0 pod tchawicą, uważając, aby nie objąć przełyku.
   7. Określ lokalizację tracheotomii: tylko ogonowo do krtani jest przerwa przed pierwszym pierścieniem tchawicy, jest to idealne miejsce do wykonania tracheotomii.
   8. Wyreguluj kolektor, aby dostarczyć gaz znieczulający do wentylatora i włącz wentylator.
   9. Sprawdź, czy nie ma wycieków, zatykając palcem końcówkę rurki dotchawiczej (ET). Zapewnić ciśnienie w drogach oddechowych ≈10 cmH2O.
   10. Używając igły o rozmiarze 20 jako skalpela, naciąć tchawicę. Wykonaj nacięcie stosunkowo szerokie, ponieważ rurka ET wypełni znaczną część światła tchawicy.
   11. Poruszając się szybko, zdejmij maskę i ostrożnie włóż rurkę ET do tchawicy. Nie należy tego robić na siłę, ponieważ tkanki są bardzo delikatne, a przebicie się przez ścianę tchawicy może spowodować odmę opłucnową.
       nuta: Natychmiast po włożeniu powinny stać się widoczne ruchy klatki piersiowej.
   12. Zabezpiecz obwód wentylacyjny taśmą, aby zapobiec wysunięciu rurki ET.
   13. Zawiąż pojedynczy węzeł od góry w szwie 3-0, aby utworzyć uszczelkę wokół rurki ET.
       nuta: W tym momencie wycieczki po klatce piersiowej powinny być wyraźnie widoczne. Jeśli nie, zwykle problemem jest umiejscowienie rurki ET w tchawicy. Pociągnij rurkę ET do tyłu i spróbuj zmienić jej położenie, skupiając się na orientacji tchawicy jako wskazówce.
5. Przygotowanie miejsca żyły szyjnej
   1. Cofnij lewe gruczoły ślinowe rostralno-boczne, odsłaniając żyłę szyjną zewnętrzną.
   2. Przeciąć na pół cienki mięsień (mostkowo-sutkowy) pokrywający żyłę rozwarstwieniem. Spowoduje to odsłonięcie zewnętrznej powierzchni żyły szyjnej.
   3. Ostrożnie usuń wszelkie większe kawałki tkanki, chociaż należy zachować ostrożność, ponieważ ściany żyły są bardzo cienkie. Po wykonaniu tego zadania zakryj żyłę szyjną gruczołami ślinowymi, aby zachować ją do późniejszej kaniulacji.
6. Torakotomia; wejście do jamy opłucnej bez uszkodzenia serca lub płuc
   1. Usuń znaczną część skóry pokrywającej klatkę piersiową, przedłużając prawą krawędź pierwotnego nacięcia skóry w dół do poziomu wyrostka mieczykowatego, a następnie w poprzek linii środkowej, aby ≈ 1,5 cm na lewo od linii środkowej.
      nuta: Należy zachować ostrożność podczas przecinania zewnętrznych naczyń sutkowych, które mogą być znaczącym źródłem krwawienia. Kauteryzacja tych naczyń przed ich przecięciem w dużej mierze zapobiegnie temu krwawieniu.
   2. Używając rozwarstwienia, cofnij płat skóry na boki, aby odsłonić mięśnie znajdujące się pod spodem.
   3. Odizoluj przyczep mięśnia piersiowego większego po prawej stronie w pobliżu ogonowej części mostka za pomocą kleszczy rozszerzających naczynia. Kauteryzuj i przetnij mięsień.
   4. Przeciąć mięsień piersiowy większy wzdłuż jego przyczepu do mostka. Kauteryzuj przycięte krawędzie, aby zapewnić hemostazę.
   5. Następnie podważ najszerszy grzbietu po tej samej stronie, który jest dużym arkuszem mięśnia pokrywającym boczną część myszy. Kauteryzuj i przetnij ten mięsień, a następnie cofnij odcięty koniec czaszki. Może to wymagać dokładnego rozbioru na palcach.
      nuta: Żebra są teraz wyraźnie widoczne, a serce może być również widoczne u niektórych szczepów myszy. U większości myszy wejście do klatki piersiowej w ogonowej połowie czwartej przestrzeni międzyżebrowej zapewni dobry dostęp do serca. Czwarta przestrzeń międzyżebrowa jest drugą co do wielkości przestrzenią ogonową.
   6. Aby dostać się do klatki piersiowej, użyj pary ostrych kleszczy, aby ostrożnie przeciąć warstwy mięśni międzyżebrowych.
   7. Po otwarciu jamy opłucnej ostrożnie włóż rozszerzacze naczyń z końcówkami. Używając rozszerzaczy naczyń, aby zapewnić delikatną siłę skierowaną w górę na ścianę klatki piersiowej, użyj nożyczek sprężynowych, aby ostrożnie naciąć pozostałą część mięśni międzyżebrowych.
   8. Najpierw przeciąć na boki, uważając, aby nie przeciąć płata płuca pod spodem. Następnie przedłuż nacięcie przyśrodkowo, ale pozostań 3 - 4 mm z boku linii środkowej, aby uniknąć tętnicy sutkowej wewnętrznej.
      nuta: Wewnętrzne naczynia sutkowe biegną równolegle do mostka i mogą spowodować znaczną utratę krwi, jeśli zostaną przypadkowo przecięte.
   9. Ostrożnie kauteryzuj przeciętą krawędź mięśni międzyżebrowych, używając małego aplikatora z bawełnianą końcówką, aby zwinąć tkankę do góry, aby umożliwić kauteryzacyjny kontakt z przeciętą tkanką bez kontaktu z płucami lub sercem.
   10. Umieść nasączony solą fizjologiczną mały aplikator z bawełnianą końcówką przez nacięcie, kierując się w stronę linii środkowej. Zapewnij delikatną przyczepność w górę, aby odciągnąć ścianę klatki piersiowej od leżących pod spodem struktur. Rozpocznij kauteryzację ściany klatki piersiowej na przyśrodkowej krawędzi nacięcia i zakończ ≈ 1 cm w bok linii środkowej po lewej stronie.
   11. Przesuń aplikator w lewo, tak aby stale znajdował się pod końcówką kauteryzacyjną.
   12. Po dokładnym kauteryzacji tkanki użyj nożyczek, aby ostrożnie przeciąć mostek. Wierzchołek serca powinien być w tym miejscu wyraźnie widoczny.
   13. Za pomocą rozwarstwienia przerwij osierdzie i zidentyfikuj żyłę główną ogona.
   14. Sprawdź, czy nie ma śladów krwawienia i kauteryzuj go teraz. Gdy wszystkie krwawienia zostaną usunięte, ostrożnie usuń wszelkie zasłony, podkładkę uziemiającą do kauteryzacji i gazę nasączoną solą fizjologiczną.
7. Zakładanie cewnika do żyły szyjnej
   1. Podłącz cewnik wykonany w kroku 1.6.2 do strzykawki zawierającej 10% albuminy, ostrożnie wsuwając rurkę na igłę o rozmiarze 30.
   2. Rozpocznij infuzję albuminy przez cewnik.
   3. Ustawić cewnik w taki sposób, aby igła sama leżała na żyle szyjnej, z igłą skierowaną do góry. W razie potrzeby użyj uchwytu na igłę, aby obrócić igłę w rurce, aby przesunąć skos do właściwej orientacji.
   4. Gdy cewnik zostanie całkowicie przepłukany, należy przerwać infuzję.
   5. Chwyć igłę cewnika kleszczami. Drugą ręką użyj kleszczyków tkankowych, aby cofnąć gruczoł ślinowy, aby umożliwić wizualizację żyły szyjnej. Zastosuj delikatną trakcję do tkanek otaczających dystalną żyłę szyjną, tworząc napięcie na ścianie naczynia. Używając płytkiego kąta natarcia, ostrożnie włóż igłę do żyły. Wsuń końcówkę igły na 3 - 4 mm do naczynia.
   6. Przed zwolnieniem igły cewnika zabezpiecz rurkę cewnika kawałkiem taśmy, co ograniczy ruch igły po zwolnieniu.
   7. Zwolnić igłę i delikatnie pociągnąć do tyłu tłok strzykawki, aby potwierdzić, że cewnik znajduje się w świetle naczynia, poprzez wizualizację krwi w linii.
   8. Po prawidłowym ustawieniu zabezpiecz cewnik klejem chirurgicznym, aby przymocować igłę do leżących pod spodem gruczołów ślinowych.
   9. Oblicz całkowitą objętość do zaparzenia. Jeśli nie nastąpiła znacząca utrata krwi, objętość ciała wynosi 5 μl/g masy ciała. Jeśli nastąpiła znaczna utrata krwi, może być wymagane podanie 6 - 6,5 μl/g. Ustaw natężenie przepływu tak, aby cały napar był kompletny w ciągu 10 - 15 minut.
8. Umieszczenie cewnika PV w lewej komorze
   1. Podczas opisanego powyżej zabiegu chirurgicznego należy umieścić cewnik PV w strzykawce zawierającej roztwór soli fizjologicznej, aby umożliwić jego wyrównanie.
   2. Tuż przed umieszczeniem strzykawki i cewnika należy przesunąć obok myszy. Gdy końcówka cewnika znajduje się mniej więcej na tej samej wysokości co serce, wyzeruj odczyt ciśnienia.
   3. Używając małego aplikatora z bawełnianą końcówką nasączonego solą fizjologiczną, manewruj sercem, aby umożliwić wizualizację wierzchołka.
   4. Za pomocą igły o rozmiarze 25 wykonaj nacięcie jak najbliżej środka wierzchołka.
   5. Po wyjęciu igły należy szybko wprowadzić cewnik przez nacięcie. Wprowadzenie cewnika nie wymaga dużej siły, dlatego należy zachować powściągliwość podczas wprowadzania cewnika do komory. Czasami konieczne jest wykonanie dodatkowego nacięcia kłującego. Jeśli jest to konieczne, spróbuj wykonać kolejne nacięcie w pobliżu początkowej lokalizacji, aby zminimalizować uszkodzenie serca.
      nuta: Gdy cewnik zostanie wprowadzony do komory, ostateczne umieszczenie jest niezwykle ważne. Śledzenie ciśnienia w komorze będzie widoczne przez niskie ciśnienie rozkurczowe (<10 mmHg) i wysokie ciśnienie skurczowe (>80 mmHg w tym momencie). Idealnie, cewnik będzie wyśrodkowany w komorze, a elektrody zewnętrzne będą znajdować się tuż w komorze. Precyzyjną regulację położenia cewnika można wykonać, obserwując dane pętli PV, szukając śladu w kształcie pudełka z kątami ≈ 90° między bokami.

3. Szczegóły proceduralne

Uwaga: Gdy cewnik jest już na miejscu, konieczny jest krótki okres stabilizacji (10 - 15 minut), aby zwierzę mogło dojść do siebie po ostrym stresie chirurgicznym i dać czas na infuzję płynów. Po tym okresie stabilizacji można rozpocząć właściwy protokół.

1. Po umieszczeniu cewnika PV i zaprzestaniu manipulacji chirurgicznej należy zmniejszyć poziom izofluranu do ≈ 1%, ponieważ zmniejsza się potrzeba głębokiego znieczulenia chirurgicznego.
   1. W tym okresie należy uważnie monitorować mysz, aby upewnić się, że utrzymany jest odpowiedni poziom znieczulenia. Dokładnie oceń każdy ruch; Ruch mięśni oddechowych sugeruje poziom hipowentylacji i można mu zaradzić poprzez zwiększenie częstości oddechów respiratora. Ruchy kończyn lub drganie wąsów to oznaki, że mysz staje się zbyt lekka i wymaga większego znieczulenia.
      nuta: Istnieje wiele różnych wariantów zabiegów, które można stosować w połączeniu z tym protokołem. Wiele z tych metod leczenia będzie wymagało infuzji leków. Niezbędne jest efektywne zarządzanie objętością martwej przestrzeni. Zmiana roztworu może być dokonana poprzez przesunięcie rurki cewnika z igły jednej pompy strzykawkowej na drugą. Wykonanie tej czynności na krótko przed zakończeniem wcześniejszej infuzji pozwala na napełnienie rurki cewnika kolejnym lekiem. Konieczna jest znajomość objętości w rurce cewnika, aby określić czas zmiany roztworu. Wprowadzenie małego pęcherzyka powietrza do linii pozwala na określenie dokładnego czasu przełącznika infuzji; Ten pęcherzyk wprowadzony do krążenia żylnego jest dobrze tolerowany.
2. Zmień warunki obciążenia serca poprzez obniżenie napięcia wstępnego i zwiększenie obciążenia następczego.
   1. Zmniejsz obciążenie wstępne, blokując powrót żylny do serca. W tym preparacie wizualizuj i zamykaj żyłę główną ogonową, gdy przechodzi ona z przepony do serca. Wykonaj tę okluzję płynnie i stosunkowo szybko, trwającą nie dłużej niż 2 - 3 sek. Zwiększ przejściowo obciążenie następcze lewej komory, wykonując delikatny ucisk brzucha trwający 1 - 2 sekundy.
   2. Podczas tych zmian w obciążeniu serca należy wstrzymać oddychanie, aby wyeliminować wszelkie artefakty wprowadzane przez respirator.
3. Skalibruj sygnał głośności za pomocą cewników konduktancyjnych. Zabiegi te nie są konieczne w przypadku cewników wykorzystujących technologię adentryjną.
   1. Po protokole eksperymentalnym wstrzyknąć 5 - 10 μl hipertonicznego roztworu soli fizjologicznej (20% NaCl), aby obliczyć przewodność równoległą.
   2. Pobrać krew, usuwając cewnik i pobierając krew z lewej komory do strzykawki z heparyną. Umieść tę krew w kuwetach o znanej objętości i użyj cewnika do pomiaru przewodności.
   3. Użyj miar przewodności kuwety, aby przekonwertować sygnał przewodności na objętość, a przewodność równoległa jest niezbędna do zdefiniowania objętości bezwzględnej mierzonej przez cewnik.
4. Po zakończeniu protokołu poddaj mysz eutanazji poprzez usunięcie serca po przecięciu żyły głównej i przyczepów aorty.

Wyniki

Zgodnie z konwencją, objętość jest wykreślana na osi X, a nacisk na osi Y, jak na rysunku 1. Pętle ciśnienie-objętość wynikające z wykreślenia ciśnienia w funkcji objętości powinny przypominać prostokąt, przy czym pionowe krawędzie reprezentują izowolumiczne zmiany ciśnienia (tj. gdy zarówno zastawka mitralna, jak i aortalna są zamknięte). Dolna pozioma reprezentuje wypełnienie komory przez zastawkę mitralną, a górna pozioma część reprezentuje opróżnianie komory ...

Dyskusja

W tej procedurze występują trzy kluczowe etapy: 1) umieszczenie rurki dotchawiczej i odpowiednia wentylacja, 2) umieszczenie cewnika dożylnego szyjnego oraz 3) prawidłowe umieszczenie cewnika PV w lewej komorze. Określenie odpowiedniej częstości oddechów jest ważną częścią zapewnienia wsparcia wentylacji. Świadome myszy na ogół utrzymują wentylację pęcherzyków płucnych z szybkimi, płytkimi oddechami. Ogólnie rzecz biorąc, wentylowane myszy będą miały znacznie większe objętości oddechowe. W związku z tym wymagana jest wol...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dumont 5/45 (2)	Narzędzia do nauki pięknej	11251-33
Kleszcze do rozszerzania naczyń	Narzędzia do nauki pięknej	18153-11
Castroviejo Micro Nożyczki sprężynowe do preparowania	Roboz Instruments	RS-5668
Kleszcze ośmiokątne - ząbkowane / zakrzywione	narzędzia naukowe	11041-08
Kleszcze oktogońskie - ząbkowane / proste	drobne Science Tools	11040-08
Nożyczki dyssektorowe - ciężkie ostrze	Fine Science Tools	14082-09
Taśma chirurgiczna Transpore	3M	1527-1
3-0 Jedwabny szew	Fine Science Tools	18020-30
Respirator TOPO	Kent Scientific	TOPO
Martin ME 102 Jednostka elektrochirurgiczna	Aparat	HarvardaPY2 72-2484
Pompa strzykawkowa	Lucca Technologies	GenieTouch
Mikroskop stereoskopowy ze stojakiem na wysięgnik	Nikon	SMZ-800N
Termometr termoparowy	Cole Parmer	EW-91100-40
T/pompa Recyrkulator ciepłej wody	Kent Scientific	TP-700
ADVantage System ciśnieniowo-objętościowy	Transonic	ADV500
Pozyskiwanie i analiza danych	DSI	Ponemah ACQ-16