Testy jakościowe i ilościowe do wykrywania i charakterystyki białkowych środków przeciwdrobnoustrojowych

Summary

Tutaj prezentujemy protokoły do szybkiego badania i charakteryzowania enzymów pod kątem aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Test dyfuzji mikroszkiełkowej i test uwalniania barwnika wykorzystują docelowe substraty bakteryjne do jakościowej i ilościowej oceny aktywności enzymatycznej.

Abstract

Wstępne oceny dużych bibliotek mikrobiologicznych dla potencjalnych producentów nowych białek przeciwdrobnoustrojowych wymagają zarówno jakościowych, jak i ilościowych metod przesiewowych pod kątem docelowych enzymów przed zainwestowaniem większego wysiłku badawczego i zasobów. Celem tego protokołu jest zademonstrowanie dwóch uzupełniających się testów do przeprowadzenia tych wstępnych ocen. Test dyfuzji mikroszkiełkowej zapewnia wstępne lub proste badanie przesiewowe, które umożliwia jakościową i szybką ocenę aktywności proteolitycznej w odniesieniu do szeregu zarówno żywotnych, jak i zabitych termicznie docelowych substratów bakteryjnych. Z drugiej strony, zwiększona czułość i odtwarzalność testu uwalniania barwnika stanowi ilościową platformę do oceny i porównywania wpływów środowiskowych wpływających na aktywność hydrolityczną białkowych środków przeciwdrobnoustrojowych. Możliwość znakowania specyficznych substratów do hodowli komórkowych zabitych termicznie barwnikiem R Remazol rozszerza tę zdolność do dostosowywania testu uwalniania barwnika w celu scharakteryzowania aktywności enzymatycznej będącej przedmiotem zainteresowania.

Introduction

Środki przeciwdrobnoustrojowe odgrywają kluczową rolę w zwalczaniu szerokiej gamy mikroorganizmów, takich jak wirusy, grzyby i bakterie. Aktywność przeciwdrobnoustrojowa wytwarzana przez różne bakterie ma różną swoistość docelową, od szerokiego spektrum do specyficznej dla gatunku, w tym klinicznie istotnych patogenów bakteryjnych ¹. W naturze białkowe związki przeciwdrobnoustrojowe, takie jak bakteriocyny i lizyny, stanowią mikrobiologiczny arsenał narzędzi do samoobrony, replikacji i pozyskiwania składników odżywczych ^2,3. Pełniąc rolę mediatorów dynamiki populacji w społecznościach drobnoustrojów, białkowe środki przeciwdrobnoustrojowe zapewniają organizmowi produkującemu przewagę konkurencyjną nad nieprodukującymi, wrażliwymi gatunkami ⁴. Jako rekombinowane enzymy i probiotyki, białka te mają również znaczenie gospodarcze i społeczne, ponieważ zapotrzebowanie na nowe źródła kontroli patogenów wzrasta z każdym nowym wzrostem oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe w populacji bakterii ⁵.

Pierwsze oceny nowo odkrytych białkowych środków przeciwdrobnoustrojowych obejmują określenie podstawowych cech fizycznych, które są nieodłączne dla enzymu. Metody szybkich badań przesiewowych potencjalnych środków przeciwdrobnoustrojowych pozwalają na selekcję kandydatów o aktywności hydrolitycznej w stosunku do pożądanych substratów docelowych. Test dyfuzji mikroszkiełkowej i ilościowy test uwalniania barwnika pozwalają na zastosowanie różnych substratów w wykrywaniu hydrolizy enzymatycznej. W przypadku białkowych enzymów przeciwdrobnoustrojowych o działaniu przeciwko ścianie komórkowej bakteryjnej wszechstronność tych testów umożliwia szybkie i skuteczne, jakościowe i ilościowe badania przesiewowe przeciwko żywotnym komórkom bakteryjnym (tylko test mikroszkiełkowy), zabitym termicznie substratom całych komórek bakteryjnych lub oczyszczonemu peptydoglikanowi z bakterii docelowej. Testy te są przydatne w odkrywaniu enzymów przeciwdrobnoustrojowych do stosowania w takich dziedzinach, jak alternatywne terapie, suplementy diety i inhibitory produkcji biofilmu.

Test dyfuzji mikroszkiełkowej i test uwalniania barwnika są demonstrowanymi metodami wykrywania i charakteryzowania nowych białkowych środków przeciwdrobnoustrojowych. Test dyfuzji mikroszkiełkowej zapewnia względne (jakościowe) oszacowanie aktywności przeciwdrobnoustrojowej i pozwala na minimalne wnioskowanie o stężeniu i aktywności enzymu. Korzystając z tej metody, aktywność można łatwo zobrazować jako rozwój strefy lizy z brakiem aktywności skutkującym brakiem tworzenia się strefy. Szybkość rozwoju strefy i średnica strefy wskazują na ilość i czystość enzymu obecnego w próbce; Jednak na tę szybkość i jakość usuwania substratu w strefie może mieć również wpływ obecność zanieczyszczeń, kompletność reakcji hydrolizy i rodzaj podłoża. Zanieczyszczenia zakłócające mogą wpływać na szybkość dyfuzji enzymów ze studni, podczas gdy niepełna hydroliza lub zmiana rodzaju podłoża może spowodować zmętnienie strefy lizy ⁶.

Test uwalniania barwnika ilościowo ocenia ilość kowalencyjnie połączonych produktów barwnika Remazol brilliant blue R uwalnianych do supernatantu reakcyjnego z enzymatycznie zhydrolizowanego substratu. Metoda charakteryzuje się jedynie niewielką zmiennością związaną z różnicą w substracie, co pozwala na większą czułość wykrywania hydrolizy w porównaniu z testem dyfuzji mikroszkiełkowej. Właściwości te pozwalają na użyteczność metody w charakterystyce właściwości biochemicznych enzymu oraz w standaryzacji testu do porównania różnych enzymów przeciwdrobnoustrojowych.

W tym protokole udostępniamy metody do przeprowadzenia podstawowego testu dyfuzji mikroszkiełka i testu uwalniania barwnika, demonstrując jednocześnie skalę granic wykrywalności i zmienności dla każdej z nich. Testy służą do przeprowadzenia podstawowych ocen nieznanego białka przeciwdrobnoustrojowego oczyszczonego z supernatantu kultury niescharakteryzowanego izolatu bakterii glebowych. Zaobserwowana aktywność wobec substratów komórek bakteryjnych w testach pozwala na porównanie aktywności reakcji między wcześniej niescharakteryzowanym białkiem przeciwdrobnoustrojowym a α-chymotrypsyną, kontrolnym enzymem proteolitycznym. Protokoły te stanowią podstawę do stosowania tych dwóch technik, które można rozszerzać i modyfikować w celu dostosowania do różnych zastosowań.

Protocol

1. Przygotowanie substratów bakteryjnych i peptydoglikanu

Uwaga: Substraty bakteryjne całych komórek i oczyszczone peptydoglikany są używane jako substraty enzymatyczne zarówno w teście dyfuzji mikroszkiełkowej, jak i w teście uwalniania barwnika. Substraty te wymagają przygotowania przed przeprowadzeniem reakcji enzymatycznych. Poniższy protokół opisuje ich przygotowanie.

1. Cały substrat komórek bakteryjnych
   1. Wytworzyć substrat komórek bakteryjnych, zaszczepiając 500 ml bulionu odżywczego 2 ml nocnej kultury Bacillus subtilis 168 (American Type Culture Collection; ATCC 23857). Inkubować w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem (125 obr./min) aż kultura osiągnie fazę wykładniczego wzrostu, zdefiniowaną jako faza szybkiego wzrostu prowadząca do podwojenia liczby bakterii. Do uprawy Salmonella enterica subsp. enterica (ATCC 10708) należy użyć bulionu odżywczego jako pożywki w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (125 obr./min).
   2. Uśmiercać termicznie każdą kulturę przez autoklawowanie przez 10 minut w temperaturze 121 °C pod ciśnieniem 3 atm.
   3. Zbierz zabity termicznie substrat bakteryjny przez wirowanie przez 20 minut przy 5,000 x g. Umyj granulat trzykrotnie wodą typu 1 i ponownie zawiesić w minimalnej ilości wody. W tym badaniu zawiesić podłoża w 1,200 μl.
   4. Porcję 300 μl substratów komórek bakteryjnych rozprowadzić do 1,5 ml probówek do mikrofuge i przechowywać w temperaturze 20 °C.
2. Oczyszczony substrat peptydoglikanu
   1. Oczyść peptydoglikan z docelowego substratu bakterii ^7-10 lub nabądź od dostawcy (patrz Tabela materiałów i sprzętu). Oczyść surowe preparaty peptydoglikanu z dodatkowych polimerów ściany komórkowej.

2. Jakościowy test dyfuzji mikroszkiełkowej [Zmodyfikowany z Lachica, et al. ¹¹ ]

Uwaga: Test dyfuzji mikroszkiełkowej jest jakościową metodą wykrywania obecności enzymu przeciwdrobnoustrojowego w próbce. Gdy enzym dyfunduje przez macierz agarozy zawierającą substrat, w miarę hydrolizy substratu przez enzym rozwija się strefa oczyszczania. Poniższy protokół opisuje przygotowanie i wykonanie testu dyfuzji mikroszkiełkowej w celu jakościowego wykrywania obecności białkowych środków przeciwdrobnoustrojowych.

1. Określ stężenie enzymu przeciwdrobnoustrojowego, który ma być oceniany, za pomocą zestawu do oznaczania białek z kwasem bicynchoninowym (BCA) zgodnie z protokołem producenta.
2. Wykorzystać sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) jako bufor enzymu, jednak empirycznie określ bufor odpowiedni dla danego enzymu.
3. Przeprowadzić seryjne rozcieńczanie enzymu przeciwdrobnoustrojowego przy użyciu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) jako buforu reakcyjnego. Seryjne rozcieńczenie stosowane w tych testach dyfuzji mikroszkiełkowej dawało końcowe masy białek w teście 0 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 μg i 10 μg na objętość reakcji.
4. Dozować masy białkowe do pojedynczych probówek do mikrofuge i dostosować objętość białka do 20 μl za pomocą PBS w ramach przygotowań do uzupełnienia dołków reakcyjnych mikroszkiełkowych.
5. Przygotować 0,5% roztwór agarozy, rozpuszczając 0,25 g agarozy w 50 ml PBS. Podgrzej roztwór do wrzenia, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Oznaczyć wagowo wodę utraconą podczas procesu topienia i dodać z powrotem do roztworu.
6. Dodać 50 μl 10% azydku sodu w wodzie do roztworu agarozy i dostosować temperaturę roztworu do 50 °C w łaźni wodnej. Azydek sodu dodaje się w celu zahamowania rozwoju bakterii zanieczyszczających podczas inkubacji testu dyfuzji mikroszkiełkowej. Jeśli jako substrat używane są żywe komórki, należy pominąć azydek sodu w roztworze agarozy.
7. Rozmrozić zabity termicznie substrat bakteryjny na lodzie.
8. Ponownie zawiesić substrat bakteryjny w 12 ml roztworu agarozy, aby w przybliżeniu dopasować zmętnienie do wzorca równoważności 2,0 McFarlanda (patrz tabela materiałów). Porównaj zmętnienia roztworów, wizualizując czarną linię na białym tle przez roztwory, dodając substrat bakteryjny do agarozy, aż do osiągnięcia przybliżonego zmętnienia.
9. Natychmiast odpipetować 3 ml roztworu substratu agarozy do każdego mikroszkiełka (25 x 75 x 1 mm³).
10. Po zestaleniu się szkiełek należy przebić trzy dołki w warstwie substratu agarozowego każdego mikroszkiełka za pomocą świdra korkowego (średnica 4,8 mm). Dodać 20 μl każdego skorygowanego seryjnego rozcieńczenia białka do odpowiednich studzienek.
11. Użyć PBS (20 μl) lub albuminy surowicy bydlęcej (5 μg w 20 μl PBS) w basenie kontroli ujemnej. Jako kontrolę pozytywną należy stosować znane enzymy bakteriolityczne odpowiednie dla substratu, takie jak lizozym.
12. Inkubować szkiełko w komorze wilgotnościowej w temperaturze 37 °C lub przy optymalnej temperaturze aktywności enzymu. Czas trwania inkubacji zależy od stężenia i aktywności specyficznej enzymu przeciwdrobnoustrojowego. Typowy czas reakcji to noc (około 16 godzin).
13. Po inkubacji obserwować szkiełka w świetle pośrednim i uchwycić obrazy rozwijającego się testu za pomocą cyfrowej lustrzanki jednoobiektywowej z obiektywem 60 mm przy ogniskowej około 30 cm.
    Uwaga: Aktywność enzymatyczna białka przeciwdrobnoustrojowego dla danego substratu jest skorelowana z rozwojem wyraźnej strefy hydrolizy, która tworzy się wokół studni, gdy enzym dyfunduje do agarozy.
14. Aby zakwalifikować aktywność enzymatyczną, obserwuj rozmiary stref, które tworzą się wokół każdej studzienki. Wysoka aktywność enzymatyczna odnosi się jakościowo do większej strefy, podczas gdy niska aktywność enzymatyczna jakościowo odnosi się do mniejszej strefy.

3. Etykietowanie podłoża - Remazol Brilliant Blue R Dye Labeling [Zmodyfikowane z Zhou ¹² ]

Uwaga: W teście uwalniania barwnika, substrat jest kowalencyjnie połączony z barwnikiem R brylantowym Remazol. Poniższy protokół opisuje przygotowanie barwionych substratów enzymatycznych.

1. Przygotować 250 mM roztwór wodorotlenku sodu (NaOH), rozpuszczając 1 g NaOH w 99 ml wody typu I, która ma być użyta do przygotowania 200 mM roztworu barwnika R (RBB) Remazol w kolorze błękitu brylantowego.
2. Przygotować 200 mM roztwór RBB, rozpuszczając 1,25 g RBB w 98,75 ml ± 1 ml świeżego 250 mM roztworu NaOH (krok 3.1).
3. Ponownie zawiesić zabite termicznie komórki bakteryjne w stężeniu 0,5 g mokrej masy w 30 ml roztworu RBB. W przypadku oczyszczonego peptydoglikanu ponownie zawiesić peptydoglikan w stężeniu 0,3 g mokrej masy w 30 ml roztworu RBB.
4. Mieszaninę reakcyjną inkubować w kolbie Erlenmeyera na platformie obrotowej przez 6 godzin w temperaturze 37 °C, delikatnie mieszając.
5. Przenieść mieszaninę reakcyjną do inkubatora o temperaturze 4 °C i inkubować przez dodatkowe 12 godzin, delikatnie mieszając.
6. Po inkubacji zebrać barwione podłoże przez odwirowanie przy 3 000 x g przez 30 minut. Zdekantować roztwór barwnika z granulatu substratu.
7. Usunąć niekowalencyjnie związany rozpuszczalny barwnik z substratów, wielokrotnie przemłukując znakowane barwnikiem komórki lub peptydoglikan (około 3-5 płukań) wodą typu I, a następnie odwirować. Przy każdym dodaniu wody dokładnie zawiesić pellet.
   Uwaga: Po odwirowaniu rozpuszczalny barwnik nie jest już widoczny w płukaniu wodą. Podłoże należy poddać jeszcze jednemu płukaniu. Należy pamiętać, że podłoże pozostanie niebieskie, podczas gdy supernatant z ostatniego prania będzie przezroczysty.
8. Barwione podłoża należy przechowywać zawieszone w minimalnej ilości wody w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.

4. Ilościowy test uwalniania barwnika

Uwaga: Podczas testu uwalniania barwnika, hydroliza substratu barwionego RBB w reakcji enzymatycznej uwalnia barwione produkty do supernatantu reakcji. Kolorymetryczny pomiar ilości uwalnianego barwnika wskazuje na stopień aktywności enzymatycznej obecnej w próbce dla danego enzymu. Metoda ilościowa pozwala na porównanie różnych enzymów na różnych substratach i pozwala na zmianę warunków środowiskowych wpływających na reakcję enzymatyczną (np. temperatury, zasolenia i pH). Poniższy protokół opisuje przygotowanie i wykonanie testu uwalniania barwnika w celu ilościowego wykrywania aktywności enzymatycznej białkowych środków przeciwdrobnoustrojowych.

1. Przygotowanie do testu uwalniania barwnika
   1. Pozostawić zamrożony barwiony substrat do powrotu do temperatury pokojowej i dwukrotnie przemyć buforem testowym (PBS), który jest empirycznie określony dla danego enzymu.
   2. Obliczyć objętość zawiesiny substratu, która jest potrzebna, mnożąc objętość reakcji wynoszącą 200 μl przez liczbę testów uwalniania barwnika, które należy przeprowadzić.
   3. Przygotować zawiesinę substratu, dodając barwiony substrat do objętości buforu do oznaczania, oznaczonej w ppkt 4.1.2, aż do uzyskania gęstości optycznej (OD) 2,0 przy długości fali 595 nm przy użyciu spektrofotometru. Aby pozostać w granicach funkcjonalnych spektrofotometru, zmierz 2,0 OD₅₉₅ jako 1,0 dla rozcieńczenia stężonego roztworu w stosunku 1:1. Użyj buforu testowego jako pustego numeru.
      Uwaga: Zmętnienie substratu w reakcji można podnieść powyżej 2,0, aby dopasować poziomy aktywności wysoce wydajnych enzymów.
   4. Zawiesić białkowy środek przeciwdrobnoustrojowy do oceny w buforze testowym o szacowanym stężeniu 1 mg/ml.
   5. Korzystając z testu mikropłytki zestawu do oznaczania białek BCA zgodnie z protokołem producenta, określ rzeczywiste stężenie próbki białka, która ma być oznaczona. Dostosować stężenie zawiesiny podstawowej do 1 mg/ml przy użyciu buforu do oznaczania.
2. Wykorzystanie testu uwalniania barwnika w celu określenia optymalnych warunków inkubacji białkowego środka przeciwdrobnoustrojowego
   1. Rozcieńczyć podstawową zawiesinę białkową przeciwdrobnoustrojową do 100 ng/μl. Stężenie to daje końcową masę reakcyjną wynoszącą 1 μg białka na objętość (10 μl) dodanego do reakcji testu.
   2. Określ zakres termiczny, który ma być oceniany dla białka bakteriolitycznego. Zakres termiczny w tych testach obejmował 5 °C, 15 °C, 25 °C, 35 °C, 45 °C, 55 °C i 65 °C.
   3. Przeprowadzić testy reakcji w probówkach do mikrofug o pojemności 0,5 ml. Dla każdego warunku termicznego dodać 10 μl białka podstawowego do 200 μl przygotowanej zawiesiny substratu.
   4. Inkubować w termocyklerze przez 8 godzin z mieszaniem przez inwersję raz na godzinę.
   5. Po inkubacji zatrzymać reakcje, dodając 25 μl etanolu.
   6. Usunąć niestrawiony, nierozpuszczalny substrat przez odwirowanie przy 3 000 x g przez 2 minuty i przenieść 150 μl supernatantu reakcyjnego dla każdej mieszaniny reakcyjnej na 96-dołkową mikropłytkę płaskodenną, uważając, aby nie naruszyć osadu niestrawionego substratu.
   7. Zmierz aktywność enzymatyczną białka przeciwdrobnoustrojowego dla danego substratu, określając ilość rozpuszczalnego barwnika RBB zdysocjowanego z substratu po hydrolizie enzymatycznej. Aby określić ilościowo aktywność enzymatyczną, należy zmierzyć absorbancję supernatantu przy długości fali 595 nm za pomocą spektrofotometru z mikropłytkami. Zwiększona absorbancja przez rozpuszczalny barwnik uwalniany do supernatantu ze znakowanego substratu jest ilościowym pomiarem aktywności enzymatycznej.
      Uwaga: Zmiana absorbancji jest reprezentowana przez jednostki aktywności (AU), gdzie 1 AU powoduje wzrost gęstości optycznej supernatantu reakcji uwalniania barwnika o 0,01 przy długości fali 595 nm. Ślepa próba, inkubowana ze wszystkimi składnikami reakcji z wyjątkiem enzymu, służy do odejmowania dowolnego barwnika, który uwalnia się z substratu znakowanego RBB w wyniku inkubacji. Optymalna temperatura enzymatyczna zapewnia pomiar jednostki szczytowej aktywności.
   8. Powtórzyć kroki od 4.2.1 do 4.2.7, używając różnych inkubacyjnych, aby określić optymalne warunki buforowe dla enzymu przeciwdrobnoustrojowego. W tych testach należy użyć PBS.
3. Wykorzystanie testu uwalniania barwnika w celu określenia minimalnego stężenia substancji czynnej w optymalnej temperaturze inkubacji dla białkowego środka przeciwdrobnoustrojowego
   1. Przeprowadzić seryjne rozcieńczanie podstawowej zawiesiny białek przeciwdrobnoustrojowych przy użyciu buforu do oznaczania. Zakres serii rozcieńczeń będzie się różnił w zależności od aktywności enzymu przeciwdrobnoustrojowego. Seryjne rozcieńczenie zastosowane w tych testach dało końcowe ilości białka w teście 0 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 μg i 10 μg.
   2. Wykonać każdy test reakcyjny na 48-dołkowej mikropłytce z płaskim dnem. Dla każdego warunku oznaczania dodać 10 μl odpowiedniej zawiesiny białkowej do 200 μl przygotowanej zawiesiny substratu. Dostosuj wszelkie zmiany objętości roztworu białkowego dodanego do reakcji do 10 μl za pomocą buforu reakcyjnego.
   3. Uszczelnij mikropłytkę folią uszczelniającą płytkę, aby uniknąć zmian objętości spowodowanych parowaniem. Inkubować w inkubatorze z wytrząsarką w określonej optymalnej temperaturze inkubacji dla danego białkowego środka przeciwdrobnoustrojowego przez 16 godzin z wytrząsaniem.
   4. Po inkubacji zatrzymać reakcję, dodając 25 μl etanolu do każdego dołka i usunąć niestrawiony substrat przez odwirowanie przy 3 000 x g przez 2 min.
   5. Przenieść 150 μl supernatantu reakcyjnego dla każdej mieszaniny reakcyjnej na 96-dołkową mikropłytkę płaskodenną, uważając, aby nie rozbić osadu niestrawionego substratu.
   6. Aby określić ilościowo aktywność enzymatyczną, należy zmierzyć absorbancję supernatantu przy długości fali 595 nm za pomocą spektrofotometru z mikropłytkami. Ślepa próba, inkubowana ze wszystkimi składnikami reakcji z wyjątkiem enzymu, służy do odejmowania dowolnego barwnika, który uwalnia się z substratu znakowanego RBB w wyniku inkubacji. Zwiększona absorbancja rozpuszczalnego barwnika uwalnianego do supernatantu z znakowanego substratu stanowi ilościową miarę aktywności enzymatycznej.
      Uwaga: Zmiana absorbancji jest reprezentowana przez jednostki aktywności (AU), gdzie 1 AU powoduje wzrost gęstości optycznej supernatantu reakcji uwalniania barwnika o 0,01 przy długości fali 595 nm.

Results

Test dyfuzji mikroszkiełkowej i ilościowy test uwalniania barwnika są skutecznymi metodami do badań przesiewowych i pomiarów wstępnych badań nowych białkowych środków przeciwdrobnoustrojowych. Każdy test ma zalety i ograniczenia; Jednak gdy są wykonywane w połączeniu, umożliwiają szybkie wstępne badanie przesiewowe i podstawową charakterystykę środka przeciwdrobnoustrojowego.

Test dyfuzji mikroszkiełkowej skutecznie pozwala na szybkie badanie przesiewowe bibliotek mikroorganizmów, produkując białkowe środki przeciwdrobnoustrojowe. W przypadku gdy poziomy stężenia enzymu budzą obawy, ograniczenia czułości wykrywania mogą ograniczać test, wymagając dokładnego dodania większej ilości enzymu do reakcji niż w przypadku testu uwalniania barwnika. Jak pokazano na rysunku 1, właściwości jakościowe testu pozwalają obserwatorowi na porównanie względnych ilości enzymów obecnych w każdym dołku.

W rozwijającej się strefie lizy, zilustrowanej na rysunku 1A (25 μg enzymu), krawędź czołowa strefy wykazuje mętną lub niepełną lizę substratu, podczas gdy strefa najbliżej studni wykazuje bardziej kompletną lizę substratu. Zjawisko to, będące wynikiem zmniejszającego się stężenia enzymu dyfundującego na krawędzi natarcia, komplikuje dokładny pomiar średnicy strefy. Ponieważ studzienki B (15 μg), C (10 μg), D (5 μg), E (1,0 μg) i F (0,1 μg) są obserwowane na rysunku 1, średnica strefy całkowitej lizy rozprasza się do ekstynkcji korelując ze zmniejszoną ilością enzymu. W przypadku warunku F (0,1 μg) stężenie enzymu w agarozie jest poniżej limitu, który pozwoli na wizualizację enzymu dyfuzyjnego, gdy przemieszcza się on przez agarozę, hydrolizując substrat. Test dyfuzji mikroszkiełkowej przeprowadzono również przy użyciu oczyszczonego peptydoglikanu Bacillus subtilis jako substratu (ryc. 2). Chociaż strefa jest mniej zdefiniowana niż te obserwowane w przypadku Salmonelli enterica z całych komórek ze względu na niechęć peptydoglikanu do równomiernego zawieszania się w agarozie, widoczna jest hydroliza peptydoglikanu przez nieznany enzym przeciwdrobnoustrojowy.

Test uwalniania barwnika jest bardziej czuły i wszechstronny niż test dyfuzji mikroślizgowej, co pozwala na obniżenie granicy wykrywalności i zmienność czynników środowiskowych wpływających na reakcję enzymatyczną. W reprezentatywnych testach temperatura była zmieniana w celu określenia optymalnej temperatury dla enzymu przeciwdrobnoustrojowego, określonej na 35 °C w PBS (ryc. 3). To optimum jest wyraźnie widoczne w supernatantach reakcyjnych jako zwiększone ilości niebieskiego koloru (Rysunek 3B), a także reprezentowane w jednostkach aktywności pochodzących z pomiarów absorbancji przy 595 nm (Rysunek 3A). Wszechstronność testu uwalniania barwnika pozwala badaczowi zmieniać nie tylko temperatury, ale także bufor reakcyjny i składniki buforu w celu szybkiego określenia optymalnych warunków inkubacji dla danego enzymu.

Poziom aktywności nieznanego enzymu przeciwdrobnoustrojowego (Rysunek 4) oraz enzymu kontrolującego α-chymotrypsynę (Rysunek 5) zostały zmierzone przy określonej optymalnej temperaturze inkubacji 35 °C w PBS przeciwko substratowi Bacillus subtilis znakowanemu przez RBB. Porównanie wyników z ryciny 4 i ryciny 5 wskazuje, że nieznany enzym przeciwdrobnoustrojowy ma prawie dwukrotnie większe powinowactwo do substratu B. subtilis. Ponadto kontrola α-chymotrypsyny nie trawiła całkowicie zabitego termicznie substratu B. subtilis w studni (dane nie pokazane). Aktywność kontroli α-chymotrypsyny zaczyna utrzymywać się na poziomie około 0,3 μg w porównaniu z ciągłym wzrostem jednostek aktywności we wszystkich ilościach enzymu dla nieznanego enzymu przeciwdrobnoustrojowego (Figura 4 i Figura 5). Może to wskazywać, że nieznany enzym ma większą trwałą aktywność lub że w substracie B. subtilis dostępna jest większa liczba miejsc rozszczepienia dla enzymu.

Rycina 1: Aktywność enzymu wobec substratu całych komórek Salmonella enterica.Test dyfuzji mikroszkiełkowej wykorzystano do jakościowej oceny aktywności nieznanego białka przeciwdrobnoustrojowego przeciwko zabitej termicznie Salmonella enterica subsp. enterica (ATCC 10708). Masy białkowe nieznanego środka przeciwdrobnoustrojowego zawieszonego w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), które dodano do odpowiednich dołków szkiełków, obejmowały 25 μg (studzienka A), 15 μg (studnia B), 10 μg (studnia C), 5 μg (studnia D), 1 μg (studnia E) i 0,1 μg (studnia F). Sam PBS użyto do kontroli ujemnej testów. Strefy lizy obrazowano po 6-godzinnej inkubacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Aktywność enzymu przeciwko ścianie komórkowej peptydoglikanu Bacillus subtilis.Test dyfuzji mikroszkiełkowej wykorzystano do jakościowej oceny aktywności nieznanego białka przeciwdrobnoustrojowego przeciwko peptydoglikanowi Bacillus subtilis 168. Zawieszone w 20 μl PBS, 10 μg nieznanego środka przeciwdrobnoustrojowego dodano do studzienki A mikroszkiełka. Sam PBS zastosowano jako kontrolę ujemną w teście (studnia B). Strefa lizy została zobrazowana po 6-godzinnej inkubacji w temperaturze 37 °C. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Optymalna temperatura reakcji dla białkowego środka przeciwdrobnoustrojowego. Wszechstronność testu uwalniania barwnika pozwala na zmianę parametrów fizycznych i chemicznych, takich jak temperatury inkubacji i, w celu określenia ich wpływu na aktywność enzymu będącego przedmiotem zainteresowania ⁶. Jak pokazano na tym rysunku, aktywność nieznanego białka przeciwdrobnoustrojowego (1 μg) oceniano w PBS przeciwko Bacillus subtilis znakowanym RBB w różnych temperaturach inkubacji. Wyrażona jako jednostki aktywności (AU) w (A), absorbancja produktów związanych z RBB uwolnionych do supernatantu po hydrolizie została zmierzona przy długości fali 595 nm za pomocą spektrofotometru mikropłytkowego. W każdych warunkach temperaturowych reakcje bez dodatku enzymu stosowano w celu odjęcia wpływu uwolnionego barwnika, który powstał w wyniku inkubacji w różnych temperaturach. Supernatanty reakcyjne odpowiadające każdej temperaturze inkubacji zobrazowano przed pomiarem absorbancji (B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Zakres aktywności białkowego środka przeciwdrobnoustrojowego. Zakres aktywności nieznanego białkowego środka przeciwdrobnoustrojowego mierzono jako jednostki aktywności po całonocnych inkubacjach dla 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 i 1000 ng, mierzonych za pomocą testu białka BCA (A). W przypadku tych reakcji poziom substratu B. subtilis znakowany RBB został zwiększony, aby uzyskać gęstość optyczną 5,0 przy 595 nm, aby zapewnić, że reakcja z największą ilością enzymu (1000 ng) nie zhydrolizowała całkowicie całego dostępnego substratu w okresie inkubacji reakcji. Reakcje kontrolne bez dodatku enzymu stosowano w celu odjęcia skutków uwolnienia barwnika spowodowanego samą inkubacją. Supernatanty reakcyjne odpowiadające każdej ilości enzymu zobrazowano przed pomiarami absorbancji (B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Zakres aktywności α-chymotrypsyny. Zakres aktywności α-chymotrypsyny mierzono jako jednostki aktywności po całonocnych inkubacjach dla 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 i 1000 ng enzymu (A). W przypadku tych reakcji poziom substratu B. subtilis znakowany RBB został zwiększony, aby uzyskać gęstość optyczną 5,0 przy 595 nm, aby zapewnić, że reakcja z największą ilością enzymu (1000 ng) nie zhydrolizowała całkowicie całego dostępnego substratu w okresie inkubacji reakcji. Reakcje kontrolne bez dodatku enzymu stosowano w celu odjęcia skutków uwolnienia barwnika spowodowanego samą inkubacją. Supernatanty reakcyjne odpowiadające każdej ilości enzymu zobrazowano przed pomiarami absorbancji (B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Test dyfuzji mikroszkiełkowej i test uwalniania barwnika zapewniają korzyści w wykrywaniu i charakteryzowaniu wcześniej niezidentyfikowanych białkowych środków przeciwdrobnoustrojowych. Te szybkie i czułe metody umożliwiają wysokoprzepustowe badania przesiewowe bibliotek źródłowych organizmów w celu identyfikacji enzymów będących przedmiotem zainteresowania przed zainwestowaniem większych zasobów badawczych. W miarę identyfikowania wysokoprofilowych enzymów docelowych, różne wersje testów wykrywania mogą być wykorzystywane do szybkiego wykrywania enzymu lub do określenia charakterystyki biochemicznej enzymu. Na przykład, podczas wieloetapowego schematu oczyszczania białek, test dyfuzji mikroszkiełkowej może szybko wykryć frakcje zawierające enzym będący przedmiotem zainteresowania. Ponadto optyma reakcji dla enzymu można wyznaczyć, zmieniając reakcyjne i temperatury inkubacji w teście uwalniania barwnika.

Zakres masy enzymu wymagany do wykrycia w teście dyfuzji mikroszkiełkowej jest funkcją charakterystyki enzymu. Ograniczenia wykrywalności testu na ogół wymagają użycia większych ilości enzymu niż w teście uwalniania barwnika. W tym badaniu porównanie granic wykrywalności testu dyfuzji mikroszkiełkowej (rysunek 1) z testem uwalniania barwnika (rysunek 4) wykazało, że test dyfuzji mikrosuwakowej jest mniej czułą techniką niż test uwalniania barwnika. Gdy stężenie enzymu nie stanowi problemu, test mikroszkiełkowy pozwala na szybkie wstępne badanie przesiewowe bibliotek do produkcji białkowych środków przeciwdrobnoustrojowych pod kątem docelowych substratów przy niskim nakładzie pracy i sprzętu. Chociaż wymaga to więcej wysiłku i sprzętu, test uwalniania barwnika jest bardziej czuły i powtarzalny, dając wyniki ilościowe, które umożliwiają porównanie między testami uwalniania barwnika tych samych lub różnych enzymów dla danego substratu. Obie metody można łatwo wykonać w większości laboratoriów mikrobiologicznych bez potrzeby stosowania wysoce specjalistycznego oprzyrządowania. W reprezentatywnych testach enzym kontrolny, α-chymotrypsyna, został wykryty w ilościach tak niskich, jak 100 ng (ryc. 5) przy użyciu testu uwalniania barwnika, podczas gdy minimalna ilość wykryta w teście dyfuzji mikroszkiełkowej wynosiła 1 μg (dane nie pokazane).

Zapewniając użyteczność jako jakościowy test wykrywania enzymów przeciwdrobnoustrojowych, zgłoszono szereg wariantów testu dyfuzyjnego ^11,13. Dokonując przeglądu tych testów, test dyfuzji mikroszkiełkowej został opracowany ze względu na jego stosunkowo wysoką czułość jako początkowego badania przesiewowego oraz łatwość obserwacji reakcji. Zmodyfikowano na podstawie pracy Lachica et al. ¹¹, w którym zastosowano nakładki agarozowe do wykrywania wytwarzania nukleaz przez szczepy Staphylococcus aureus, test dyfuzji mikroszkiełkowej działa podobnie do metody immunodyfuzji promieniowej ¹⁴ , ponieważ białko dyfunduje ze studzienki do agarozy zawierającej substrat. Metoda immunodyfuzji radialnej hamuje rozszerzanie się strefy immunoprecypitacji, gdy układ osiąga równowagę tworzenia kompleksu między dyfundującym antygenem a przeciwciałem w agarozie. W przeciwieństwie do tego, substrat testu dyfuzji mikroszkiełkowej jest początkowo trawiony przez dyfundujący białko przeciwdrobnoustrojowe w stale rozszerzającej się strefie lizy otaczającej studzienkę. Zwiększanie średnicy strefy trwa do momentu, gdy enzym straci aktywność lub substrat zostanie wyczerpany. Szybkość produkcji strefy lizy zwiększa się wraz ze wzrostem czystości, a tym samym aktywności właściwej enzymu lub stężenia enzymu dodanego do studzienki.

Do ilościowej oceny aktywności enzymatycznej białkowych środków przeciwdrobnoustrojowych w stosunku do zabitego termicznie B. subtilis wybrano test uwalniania barwnika. Testy kolorymetryczne z wykorzystaniem substratów znakowanych barwnikiem R (RBB) Remazol umożliwiają wszechstronną i czułą ocenę aktywności przeciwdrobnoustrojowej białek. Hydroliza enzymatyczna substratu znakowanego RBB powoduje uwolnienie rozpuszczalnych niebieskich produktów, które można łatwo zmierzyć za pomocą spektrofotometru przy długości fali 595 nm. Kilka wariantów testu uwalniania barwnika RBB, opracowanego w celu scharakteryzowania innych białkowych enzymów przeciwdrobnoustrojowych, pokazuje elastyczność tego testu w zastosowaniu z innymi substratami. Na przykład, określając wpływ aktywności bakteriolitycznej lizostafiny, Zhou i wsp. opisali test uwalniania barwnika przy użyciu komórek gronkowcowych barwionych RBB i gronkowcowego peptydoglikanu jako substratów ¹². W modyfikacji zastosowania tego testu uwalniania barwnika RBB, zaproponowano znakowany RBB substrat Micrococcus luteus do stosowania jako szybki i czuły środek do diagnozowania i badań przesiewowych w kierunku chorób, takich jak infekcja bakteryjna i obecność raka złośliwego, które można skorelować z poziomami ekspresji ludzkiego lizozymu w surowicy krwi ¹⁵. Ponadto substraty komórek bakteryjnych znakowane RBB zostały również wykorzystane w metodzie zymogramu do wykrywania lizozymu ¹⁶.

Demonstrujemy obniżoną granicę wykrywalności, wygodę i odtwarzalność testu uwalniania barwnika, co pozwala na szybkie badania przesiewowe w bibliotece pod kątem produkcji enzymów. Modyfikacje testu pozwalają na dalsze ilościowe testy charakterystyki biochemicznej, w tym wpływ temperatury, pH i zasolenia, a także wpływ innych enzymów proteolitycznych na aktywność białek przeciwdrobnoustrojowych ⁶. Ponadto ilościowy test uwalniania barwnika może być wykorzystany do porównania aktywności wielu enzymów dla danego substratu. Test uwalniania barwnika RBB wykazał przydatność enzymów o aktywności przeciwko polisacharydom, a także charakterystyki i wykrywania białkowych środków przeciwdrobnoustrojowych. Pettersson i Eriksson opisali test do wykrywania aktywności endoglikanazy przy użyciu amorficznych, barwionych RBB kulek polisacharydowych celulozy, ksylanu, mannanu, chityny ¹⁷. Rozszerzając te odkrycia, opracowano czułą metodę wykrywania enzymów chitynazy wytwarzanych przez Bacillus thuringiensis Bt-107 przy użyciu koloidalnej chityny znakowanej RBB ¹⁸. Z tych i innych badań wyłoniły się komercyjnie dostępne źródła substratów barwionych RBB do stosowania w wykrywaniu aktywności glikolitycznej, w tym przeciwko keratynie, amylopektynie, amylozie, glikogenowi, laminarynie, d-ksylanowi, glukanowi azowo-jęczmiennemu i skrobi.

W tym badaniu wykazujemy użyteczność testu uwalniania barwnika w formacie mikropłytki, zmniejszając objętość substratu i enzymu znakowanego RBB wymaganego do uzyskania wyniku kolorymetrycznego. Jak pokazano na rysunku 4 i rysunku 5, test uwalniania barwnika na mikropłytkach zapewnia niższą granicę wykrywalności niż test dyfuzji mikroszkiełkowej do wykrywania aktywności enzymatycznej. Biorąc pod uwagę szybkie użycie, oszczędność pracy i łatwość interpretacji, test dyfuzji mikroszkiełkowej zapewnia użyteczność w początkowych wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych na obecność aktywności przeciwdrobnoustrojowej, a także wskazanie obecności białka przeciwdrobnoustrojowego na dalszych etapach izolacji i oczyszczania białek. Połączenie tych dwóch testów uzupełnia się nawzajem we wstępnych badaniach przesiewowych i ostatecznej charakterystyce nowych białkowych środków przeciwdrobnoustrojowych

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
48-dołkowa mikropłytka z płaskim dnem i pokrywką o niskim parowaniu	Becton Dickinson	3078
96-dołkowa mikropłytka z płaskim dnem (Costar 3595)	Corning, Inc.	3595
agaroza	Fisher Scientific	BP162-100
&alfa;-chymotrypsyna	MP Biomedicals	215227205
Bacillus subtilis 168	Kolekcja kultur typu amerykańskiego	23857
C1000 Dotykowy termocykler	Bio-Rad
świdr korkowy	Humboldt	H-9661
lizozym	Sigma-Aldrich	L6876-1G
Wzorzec równoważności McFarlanda (2.0)	Mikroszkiełka Fisher Scientific	R20412
	Fisher Scientific	22-38-103
bulion odżywczy	Fisher Scientific	S25959B
peptydoglikan z Bacillus subtilis 168	Sigma-Aldrich	69554-10MG-F
sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1x)	Teknova	P0200
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA	Life Technologies	23227
Spektrofotometr mikropłytkowy Synergy HT	BioTek Instruments, Inc.
Remazol brylantowy niebieski barwnik R (RBB)	Sigma-Aldrich	R8001
Salmonella enterica subsp. enterica	American Type Culture Collection	10708
azydek sodu	Fisher Scientific	S227-100
wodorotlenek sodu (NaOH)	Fisher Scientific	S318-500
Titer Tops wstępnie przycięta samoprzylepna folia polietylenowa	Diversified Biotechnology	T-TOPS-50
UltraPure woda destylowana	Invitrogen	10977-015
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Solution
roztwór agarozy 50 ml PBS 0,25 g agarozy			Do stopionego roztworu PBS/agarozy dodać 10% azydku sodu
pożywka bulion 4 g bulion odżywczy 500 ml Woda
250 mM roztwór wodorotlenku sodu (NaOH) 1 g NaOH 99 ml Woda
typu I200 mM Remazol błękit brylantowy R barwnik (RBB) 1,25 g RBB 98,75 ml 250 mM roztwór