Dlaczego kwantyfikacja ma znaczenie: charakterystyka fenotypów w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila

Summary

Morfologia, rozmiar i lokalizacja organelli wewnątrzkomórkowych są ewolucyjnie zachowane i wydają się bezpośrednio wpływać na ich funkcję. Zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw tych procesów stało się ważnym celem współczesnej biologii. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób badania te można ułatwić dzięki zastosowaniu technik ilościowych.

Abstract

Większość badań nad morfogenezą opiera się na jakościowych opisach tego, jak na cechy anatomiczne wpływa zakłócenie określonych genów i ścieżek genetycznych. Opisy ilościowe są rzadko wykonywane, chociaż manipulacje genetyczne wywołują szereg efektów fenotypowych, a różnice obserwuje się nawet wśród osób w grupach kontrolnych. Pojawiające się dowody wskazują, że morfologia, rozmiar i lokalizacja organelli odgrywają wcześniej niedocenianą, ale fundamentalną rolę w funkcjonowaniu i przetrwaniu komórek. Tutaj przedstawiamy instrukcje krok po kroku dotyczące przeprowadzania analiz ilościowych fenotypów w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila (NMJ). Wykorzystujemy kilka wiarygodnych markerów immunohistochemicznych w połączeniu z technikami bioobrazowania i analizami morfometrycznymi, aby zbadać wpływ mutacji genetycznych na określone procesy komórkowe. W szczególności skupiamy się na ilościowej analizie fenotypów wpływających na morfologię, wielkość i położenie jąder w mięśniach prążkowanych larw Drosophila. Larwa Drosophila NMJ jest cennym modelem eksperymentalnym do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw struktury i funkcji układu nerwowo-mięśniowego, zarówno w zdrowiu, jak i chorobie. Jednak opisywane przez nas metodologie można rozszerzyć również na inne systemy.

Introduction

Analiza jakościowa ogranicza większość badań eksperymentalnych do badania manipulacji genetycznych prowadzących do dużych efektów fenotypowych lub do fenotypów, które nie są podatne na kwantyfikację, np. brak/obecność. Kwantyfikacja fenotypów zwykle nie jest przeprowadzana, a zmiany obecne w obrębie członków grupy fenotypowej nie są brane pod uwagę. Dodatkowo, bez matematycznych opisów morfologii, może być trudno określić, czy drobne zmiany fenotypowe są wynikiem zmian indukowanych genetycznie, czy też obserwowane zmiany są po prostu spowodowane przypadkowymi fluktuacjami.

Proponujemy, aby dla dokładnej i bezstronnej analizy defektów fenotypowych spowodowanych zaburzeniami genów, metodologie ilościowe towarzyszyły bardziej tradycyjnym podejściom jakościowym. Ilościowa ocena fenotypów jest szczególnie korzystna w przypadku struktur takich jak synapsy, które wykazują wysoki stopień zmienności ze względu na ich wewnętrzną plastyczność morfologiczną i funkcjonalną. Wybraliśmy przykłady analiz ilościowych zastosowanych w obszarach badań, które są nam najbardziej znane, a mianowicie w połączeniach nerwowo-mięśniowych larw Drosophila (NMJ). Jednak koncepcje i zasady odnoszą się równie dobrze do innych systemów eksperymentalnych.

Larwalny NMJ jest doskonałym modelowym systemem do badania rozwoju i funkcji synaptycznych ze względu na wysoce stereotypową naturę jego struktury. Każdy półsegment larwalnego układu nerwowo-mięśniowego zawiera 32 możliwe do zidentyfikowania neurony ruchowe tworzące kontakty synaptyczne z postsynaptycznym mięśniem docelowym. Każdy segment półkulowy zawiera również ustaloną liczbę mięśni widocznych jako wielojądrowe włókna przyczepione do wewnętrznej powierzchni naskórka¹. Kolejną zaletą stosowania układu nerwowo-mięśniowego larw jest moc i wszechstronność genetyki Drosophila, która z łatwością pozwala na generowanie wielu zmutowanych alleli oraz możliwość modyfikacji ekspresji genów w sposób ograniczony czasowo i tkankowo. Wreszcie, 75% ludzkich genów powodujących chorobę ma ewolucyjnie zachowany ortolog u Drosophila². Rzeczywiście, całe szlaki genetyczne są zachowane między muchami a ludźmi. Z tego powodu układ nerwowo-mięśniowy larw Drosophila jest bardzo popularnym modelem eksperymentalnym do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw wielu chorób człowieka, w tym stwardnienia zanikowego bocznego (ALS)¹.

Tutaj pokazujemy, że dostępność kilku wiarygodnych markerów immunohistochemicznych, w połączeniu z technikami bioobrazowania i dokładnymi analizami morfometrycznymi, może opisać cechy anatomiczne, które mogą odgrywać ważną rolę funkcjonalną^3,4,5. Wśród procesów komórkowych, które podlegają analizom ilościowym, koncentrujemy się na zmianach kształtu, wielkości i położenia struktur wewnątrzkomórkowych, takich jak jądra. Wszystko to są procesy, o których wiemy bardzo niewiele.

Wyzwaniem dla genetyków molekularnych w nadchodzących dekadach będzie poszerzenie naszej obecnej wiedzy poprzez analizę wpływu mutacji genetycznych, które wytwarzają bardzo subtelne defekty fenotypowe. Metodologie ilościowe, które pozwalają naukowcom na skrupulatne badanie skutków mutacji genetycznych, mogą zapewnić bardziej kompleksowe zrozumienie, w jaki sposób genotypy odnoszą się do fenotypów, zwłaszcza w przypadku słabo poznanych procesów komórkowych.

Protocol

1. Przygotowanie do eksperymentu

Uwaga: Sekcje i procedury immunohistochemiczne w sekcjach 2 i 3 są wykonywane zgodnie z odniesieniami^3-6, ale z modyfikacjami.

1. Przygotować 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i PBS zawierającą 0,1% Triton-X 100 (PBT). Trzymaj je na lodzie.
2. Przygotuj utrwalacz Bouina (15 Kwas pikrynowy: 10 Formaldehyd: 1 Lodowaty kwas octowy). Spraw, aby ten odczynnik był świeży.
3. Wybierz czyste szpilki do drobiazgów ze stali nierdzewnej i drobne kleszcze.
4. Przygotować płytki rozwarstwiające zawierające krążek Sylgarda na 5 cm szalce Petriego.

2. Sekcja larw NMJ w trzecim stadium rozwojowym

1. Za pomocą cienkiej szczoteczki wybrać wędrujące larwy trzeciego stadium z fiolki lub butelki i umieścić je na 2-centymetrowej szalce Petriego zawierającej 4 °C PBS, aby zmyć resztki pokarmu.
2. Umieść jedną larwę na wierzchu powierzchni sylgardowej płytki rozwarstwiającej i upewnij się, że jest ona ustawiona grzbietową stroną do góry, tak aby dwie podłużne rurki tchawicy były widoczne na górze.
3. Używając kleszczy do przytrzymania szpilki, przygwoźdź larwę do jej przedniego końca, tuż pod haczykiem do ust. Rozciągnij larwę tak bardzo, jak to możliwe i przypnij jej tylny koniec w dół.
4. Dodaj tyle soli fizjologicznej PBS, aby dotrzeć do ścianek płytki i całkowicie zanurz larwę.
5. Powtórzyć procedurę od kroków 2.1 do 2.3 dla innych larw o tym samym genotypie. Pojedyncza płytka preparująca na szalkę Petriego o średnicy 5 cm może z łatwością pomieścić do 8 larw.
6. Za pomocą nożyczek do mikropreparacji lekko unieś naskórek grzbietowy i wykonaj małe poziome nacięcie na tylnym końcu w pobliżu szpilki.
7. Włóż nożyczki do nacięcia, przetnij larwę aż do przedniego końca wzdłuż linii środkowej między dwoma podłużnymi odcinkami tchawicy. Upewnij się, że nacięcia w linii środkowej są wystarczająco powierzchowne, aby przejść tylko przez naskórek i uniknąć przecinania mięśni po stronie brzusznej.
8. Na każdym końcu wytnij dwa nacięcia po lewej i prawej stronie.
9. Otwórz filet, umieszczając dwa kołki po obu stronach przedniego nacięcia. Powtórz to samo z tylnym końcem. Podczas umieszczania kołków upewnij się, że ściana korpusu jest rozsunięta.
10. Oczyść narządy wewnętrzne za pomocą kleszczy i soli fizjologicznej PBS. Pozostaw ośrodkowy układ nerwowy nienaruszony. Delikatnie rozciągnij larwę za pomocą szpilek narożnych, aż zostanie całkowicie rozciągnięta, ale upewnij się, że mięśnie nie są rozdarte podczas tego procesu.
11. Powtórz tę samą procedurę preparacji dla innych larw na tej samej płytce preparucyjnej.
12. Umyj trzykrotnie solą fizjologiczną PBS, aby usunąć wszystkie narządy wewnętrzne.
13. Zastąp PBS utrwalaczem Bouina i pozostaw w temperaturze pokojowej na 10 minut.
14. Umyj kilka razy PBT.
15. Ostrożnie usuń szpilki i przenieś wszystkie preparaty, które są teraz dość sztywne, do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml w celu barwienia immunologicznego.

3. Barwienie immunohistochemiczne Drosophila NMJ przeciwciałami specyficznymi dla mięśni i mięśni

1. Szybko opłucz filety larwalne w PBT.
2. Zablokuj preparaty przez inkubację z 10% normalną surowicą kozią (NGS) w PBT przez 2 godziny pod ciągłym mieszaniem.
3. Inkubować zestaw wypreparowanych NMJ w PBT zawierających 5% NGS i królicze przeciwciało anty-laminowe (w stężeniu 1:500) oraz z przeciwciałem anty-DVAP świnki morskiej (w stężeniu 1:500) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 ºC przez noc. Przeciwciało anty-DVAP barwi mięśnie prążkowane, podczas gdy barwienie anty-laminowe wykrywa kontur mięśniówek.
4. Przemyć raz szybko w PBT, aby usunąć nadmiar przeciwciał. Myć w PBT przez 2 godziny, zmieniając bufor PBT co 15 minut.
5. Próbki inkubować w PBT zawierającym 5% NGS i przeciwciała drugorzędowe znakowane fluorescencyjnie w rozcieńczeniu 1:500 przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Te same próbki można poddać barwieniu wieloma przeciwciałami w tym samym czasie, jeśli stosuje się przeciwciała drugorzędowe sprzężone z różnymi chromoforami.
6. Usuń przeciwciała drugorzędowe i przemyj PBT przez 2 godziny, zmieniając bufor PBT co 15 minut.
7. Aby zabarwić wnętrze mięśni płuczek, należy trzykrotnie przemyć próbki PBS i postępować w następujący sposób:
   1. Dodać marker jądrowy TO-PRO-3 w rozcieńczeniu 1:1,000 w PBS i inkubować przez 20 minut pod ciągłym mieszaniem. Ten marker jest używany w tym badaniu, ale każdy inny dostępny na rynku marker jądrowy może być również użyty.
   2. Umyj szybko trzy razy w PBS przed montażem.

4. Montaż próbek na slajdach

1. Pobrać próbki za pomocą kleszczyków z probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i położyć je na szkiełku podstawowym.
2. Za pomocą nożyczek do mikropreparowania odetnij głowę i ogon filetów i utrzymuj ich wewnętrzną powierzchnię do góry.
3. Przygotuj szkiełko montażowe, owijając się wokół trzech pasków taśmy celulozowej z każdej strony czystego szkiełka w odległości około 1 cm od siebie. Po umieszczeniu szkiełka nakrywkowego na dwóch paskach zostanie utworzona szczelina, która pozwoli uniknąć spłaszczenia próbek. Ma to kluczowe znaczenie, jeśli mają być wykonywane trójwymiarowe renderingi objętościowe konstrukcji.
4. Umieść małą kroplę około 20 μl medium montażowego na środku szkiełka montażowego między trzema paskami taśmy celulozowej.
5. Po rozprowadzeniu podłoża montażowego za pomocą czystych kleszczyków, przeciągnij wypreparowane larwy do szkiełka montażowego do podłoża montażowego, trzymając wewnętrzną powierzchnię do góry. Spróbuj zamontować je w rzędach po cztery lub pięć.
6. Delikatnie upuść szkiełko nakrywkowe na szkiełko montażowe i upewnij się, że nie powstają pęcherzyki powietrza. Uszczelnij szkiełko przezroczystym lakierem do paznokci. Pozostawić próbki do wyschnięcia przez co najmniej 10 minut przed obrazowaniem.

5. Ustawienia konfokalne dla obrazowania

Uwaga: Obrazy przedstawione w tym badaniu zostały wykonane przy użyciu konfokalnego zestawu Nikon A1R zintegrowanego z odwróconym mikroskopem Ti:E. Jednak do tego celu nadaje się każdy mikroskop konfokalny z co najmniej 3 jednostkami laserowymi dostępnymi w zakresach długości fal 488 nm, 561 nm i 642 nm oraz 3-kanałowym systemem detekcji.

1. Włącz lasery, detektor, żarówkę rtęciową, kontroler stopnia, mikroskop i komputer. Uruchom oprogramowanie sterujące i zabezpiecz suwak na uchwycie stolika.
2. Aby przyspieszyć obrazowanie, wybierz i zaznacz wszystkie obszary zainteresowania (ROI) na próbce za pomocą obiektywu 20X.
3. Ostrożnie przesuń końcówkę do soczewki obiektywu o 60-krotnym powiększeniu (60X Plan Apo VC/ NA 1.4 OIL).
4. Umieść kroplę olejku immersyjnego na soczewce obiektywu i wybierz jeden z zaznaczonych ROI z XYZ view okienko na komputerze.
5. Rozpocznij obrazowanie, korzystając z następujących ustawień optycznych: Wybierz pierwsze zwierciadło dichroiczne: 405/488/561/640. Wybierz laser 488 nm z filtrem emisyjnym 525/50 nm w kanale 1, laser 561 nm z filtrem emisji 595/50 w kanale 2 i laser 642 nm z filtrem długoprzepustowym 650 nm w kanale 3.
6. Przed rozpoczęciem akwizycji obrazu należy użyć następujących ustawień skanowania: Wybierz skaner Galvano; Kierunek skanowania: w jedną stronę; Prędkość skanowania: 0,5 klatki na sekundę.
7. Wybierz opcję Seria kanałów, aby uniknąć przebijania kanałów.
8. Dostosuj rozmiar otworu na 1 przewiewną jednostkę. Skanuj i dostosuj moc lasera, wzmocnienie wykrywania i przesunięcie odpowiednio dla każdego kanału, aby uniknąć nasycenia pikseli i poziomu tła.
9. Uzyskaj stosy z, używając rozmiaru woksela 0,2 x 0,2 x 0,5 μm³ dla wszystkich zwrotów z inwestycji i przygotowań szkiełek. Jeśli obrazy zostaną poddane dekonwolucji, ustaw rozmiar woksela na 0,06 x 0,06 x 0,15 μm³.
10. Zapisuj obrazy w formacie pliku .nd2 lub w formacie .ics.

6. Obliczanie odległości między jądrami w obrębie mięśni prążkowanych metodą analizy najbliższego sąsiada

1. Do tej analizy należy użyć obrazów konfokalnych przedstawiających mięśnie ciała larw barwione przeciwciałami DVAP w celu wizualizacji mięśni oraz przeciwciał laminowych i markera jądrowego w celu podkreślenia jąder.
2. Aby oszacować najbliższą odległość między jądrami, należy użyć punktów pomiarowych w module MeasurementPro oprogramowania do analizy obrazu (np. Imaris). Inne podobne aplikacje do analizy obrazu mogą być używane do tych samych celów.
3. Otwórz obrazy konfokalne. Aby rozpocząć, kliknij dwukrotnie ikonę oprogramowania. Przeciągnij i upuść obrazy konfokalnego stosu z konfokalnym stosem na Arenę.
4. Kliknij dwukrotnie obrazy, aby automatycznie otworzyć je w widoku Surpass, pod ikoną paska narzędzi menu . Widok Surpass ma trzy główne panele przestrzeni roboczej: Obszar widoku, Lista obiektów i Obszar właściwości obiektu.
5. Utwórz obraz z trzema kanałami renderowany woluminem, klikając ikonę menu Widok 3D .
6. Kliknij ikonę Dodaj nowe punkty pomiarowe na pasku narzędzi Obiekty i postępuj zgodnie z instrukcjami kreatora tworzenia, który pojawi się w obszarze właściwości obiektu.
7. W kreatorze tworzenia wybierz najpierw kartę Edycja, a następnie Określony kanał. Wybierz znacznik jądrowy lub kanał laminowy, aby podświetlić jądra.
8. Ustaw wskaźnik w trybie wyboru, naciskając Esc na klawiaturze.
9. Dostosuj rozmiar pola kursora 3D za pomocą kółka myszy, aby zawierał dane jądro na obrazie. Dodaj punkt pomiaru, przytrzymując Shift i klikając lewym przyciskiem myszy na to samo jądro.
10. Dodaj drugi punkt na pobliskim jądrze na tym samym mięśniu, powtarzając poprzednie kroki. Między dwoma punktami automatycznie rysowana jest linia i wyświetlana jest zmierzona odległość między dwoma jądrami. Odległość między dwoma jądrami jest teraz rejestrowana jako zmienna statystyczna w obszarze Właściwości obiektu w zakładce Statystyka >Szczegółowe>Dane odległości.
11. Powtórzyć procedurę od kroków 6.6 do 6.10 dla wszystkich jąder otaczających dane jądro.
12. W obszarze Statistics > Detailed> Distance data (Statystyki szczegółowe Dane odległości wyświetlające wszystkie zebrane punkty pomiarowe wybierz najkrótszą odległość.
13. Klikając na Eksportuj statystyki na karcie Wyświetlanie do pliku dostępnej w obszarze właściwości obiektu, dane zostaną zapisane w arkuszu kalkulacyjnym.
14. Powtórz tę samą procedurę dla innych otaczających jąder i dla wybranej liczby włókien mięśniowych na genotyp.
15. Korzystając z danych wyeksportowanych do pliku arkusza kalkulacyjnego, oblicz średnią najkrótszą odległość (D_ave) dla całej liczby mięśni M, korzystając z następującego równania:
    
    Di to najkrótsza odległość do sąsiedniego jądra dla danego jądra i, gdzie i waha się od 0 do N, a N to liczba analizowanych jąder na mięsień. Suma wartości od j = 0 do j = m wskazuje na liczbę M analizowanych mięśni.
16. Alternatywnie, użyj kreatora tworzenia punktów i Odległości od punktów do punktów, aby oszacować średnią odległość do najbliższego sąsiedniego jądra. Do tego potrzebny jest moduł rozszerzeń Matlab.
    1. Kliknij dwukrotnie na jeden konkretny obraz na Arenie, a obraz objętości 3D zostanie wyświetlony w obszarze widzenia. Kliknij ikonę Tworzenie obiektu i dodaj nowe miejsca z paska narzędzi Obiekty.
    2. W kreatorze tworzenia w obszarze Właściwości obiektu kliknij opcję Pomiń automatyczne tworzenie, edytuj ręcznie.
    3. Wybierz kanał znacznika laminy lub jądra, aby wyświetlić jądra.
    4. Przesuń Shift i kliknij lewym przyciskiem myszy na wszystkich jądrach określonego mięśnia na obrazie. Pojawi się plamka na każdym jądrze.
    5. Wybierz opcję Punkty do punktów w najbliższej odległości na karcie Narzędzia w obszarze Właściwości obiektu. Wybierz Statystyki spotów w trybie Wynik, a pojawi się okno Matlaba.
    6. Na karcie Statystyki wybierz opcję Szczegółowe, a następnie Określone wartości. Kliknij na Distmin, a pojawią się wartości minimalnych odległości dla każdego jądra.
    7. Wyeksportuj dane do pliku arkusza kalkulacyjnego i oblicz średnią tych odległości na mięsień. Powtórz procedurę dla wszystkich mięśni o danym genotypie.

7. Określanie kształtu jąder w obrębie mięśni ścian ciała larw Drosophila

1. Do tej analizy użyj konfokalnych obrazów mięśni ściany ciała zabarwionych laminą i markerem jądrowym, aby uwidocznić jądra.
2. Aby ocenić kształt mionucleus, zmierz sferyczność (zdefiniowaną jako stosunek powierzchni kuli o tej samej objętości co dane jądro, do powierzchni jądra) lub eliptyczności (rozróżnia elipsoidy spłaszczone/prolate i sferoidy).
3. Otwórz obraz zgodnie z wcześniejszym opisem. Kliknij ikonę Obiekty na pasku narzędzi Dodaj nowe powierzchnie .
4. W kreatorze tworzenia, który pojawi się w obszarze Właściwości obiektu, wybierz barwienie znacznika jądrowego jako kanał źródłowy, aby wyświetlić jądra.
5. Ustaw opcję Intensywność bezwzględna jako próg. Upewnij się, że większość jąder wykazuje płynne i nieprzeciążone renderowanie, zmieniając wartość na krzywej progowej. Jednocześnie unikaj obecności lub niepełnej maski do jakiegokolwiek jądra przy użyciu tej samej krzywej.
6. Użyj narzędzia Filtr, aby wykluczyć wszelkie szumy w renderowaniu powierzchni. Na karcie Edycja nowo utworzonej warstwy powierzchniowej podziel lub scal powierzchnie jąder, które są nieprawidłowo renderowane.
7. Eksportuj do pliku arkusza kalkulacyjnego wartości eliptyczności i sferyczności jądr renderowanych powierzchni, które są dostępne na karcie Statystyka.
8. Alternatywnie, użyj oprogramowania ImageJ lub Fiji do pomiaru kołowości jąder, gdzie kołowość (C) jest zdefiniowana jako C . Wartość jeden oznacza idealne koło, podczas gdy wartość zbliżająca się do zera wskazuje na coraz bardziej wydłużony kształt.
9. Utwórz projekcje maksymalnej intensywności stosów z z menu Images>Stacks>Z Project. Ustaw typ projekcji na Maksymalna intensywność.
10. Podziel kanały i wybierz kanał znacznika jądrowego.
11. Z menu głównego wybierz opcję Image>Adjust>Threshold (ObrazDostosujpróg.
12. Podzielić jądra na segmenty, dostosowując próg intensywności. Jeśli pobliskie jądra są podzielone na segmenty jako pojedyncza jednostka, kliknij narzędzie Process>Binary>Watershed, aby rozłączyć jądra.
13. Z menu głównego wybierz Edycja>Zaznaczenie>Utwórz zaznaczenie.
14. Dodaj wszystkie wybrane ROI do Menedżera ROI, klikając menu Analizuj>Narzędzia>Menedżer ROI. W oknie Menedżer zwrotu z inwestycji kliknij Dodaj. W tym samym oknie wybierz Więcej >Podziel.
15. Wybierz opcję Deskryptory kształtów w oknie Analizuj>ustaw pomiary. W oknie Menedżer ROI kliknij na zakładkę Pomiar. Spowoduje to wyświetlenie listy wartości kołowości wszystkich wybranych jąder.
16. Ponadto, aby zmierzyć objętość jądra, postępuj zgodnie z kreatorem tworzenia powierzchni za pomocą kanału barwienia znacznika jądrowego, jak opisano w podrozdziałach 7.3-7.7.

8. 3D Renderowanie objętości wybranych jąder w obrębie mięśni ciała larw Drosophila w celu oceny wewnątrzjądrowej lokalizacji określonego białka

1. Użyj obrazów konfokalnych przedstawiających mięśnie ścian ciała zabarwione markerem jądrowym i przeciwciałami specyficznymi dla laminy i DVAP.
2. Otwórz obrazy, uruchamiając oprogramowanie i wybierz konkretne jądro do analizy. Można to zrobić, wybierając pozycję menu głównego Edit>Crop 3D.
3. Postępuj zgodnie z kreatorem tworzenia powierzchni za pomocą kanału laminy, jak opisano w podrozdziale 7.3-7.7.
4. Po utworzeniu powierzchni kliknij Edytuj w obszarze właściwości obiektów, a następnie wybierz opcję Maskuj wszystko, aby wyizolować sygnał wewnątrz jądra. Spowoduje to utworzenie nowego okna.
5. Wybierz opcję Sygnał DVAP z menu rozwijanego Select Channel (Wybierz kanał). Wybierz sygnał immunoreaktywności DVAP wewnątrz jądra, klikając opcję Ustaw woksele poza powierzchnią na zero. Tworzony jest nowy zamaskowany kanał, który jest dostępny do wyboru w oknie regulacji wyświetlania.
6. Aby zobrazować obecność sygnału wewnątrz jądra, utwórz płaszczyznę konturu, klikając ikonę Dodaj nową płaszczyznę przycinania na pasku narzędzi Obiekty.
7. Interaktywnie dostosuj kąt płaszczyzny przycinania i jej położenie, aby zobrazować rozkład sygnału wewnątrz jądra.

Results

ALS jest chorobą zwyrodnieniową dotykającą neurony ruchowe, prowadzącą do postępującego i śmiertelnego paraliżu mięśni poprzecznie prążkowanych⁷. Mutacje typu missense w ludzkim białku B związanym z VAMP (hVAPB) powodują szereg chorób neuronu ruchowego, w tym ALS typu 8^8-12. Mutacja typu missense (V234I) w genie hVAPB została niedawno zidentyfikowana w jednym przypadku typowego ALS u ludzi¹³. Aby ocenić jego potencjał patogenny, wygenerowaliśmy transgeniczne muchy wykazujące ekspresję ortologa hVAPB Drosophila orthologue DVAP przenoszącego mutację powodującą chorobę (DVAP-V260I). Ekspresja tego transgenu była ukierunkowana na mięśnie za pomocą systemu UAS/GAL4 i specyficznego dla mięśni sterownika BG57-Gal4^14,15. Efekt transgenicznej ekspresji DVAP-V260I porównano i skontrastowano z dwoma innymi transgenami (DVAP-WT1 i DVAP-WT2), które wyrażają różne poziomy białka DVAP^{typu dzikiego 16}. Mówiąc dokładniej, wzrost immunoreaktywności DVAP jest 2,2-krotnie wyższy niż w kontrolach dla linii DVAP-WT2, podczas gdy DVAP-V260I i DVAP-WT1 wykazują porównywalne i niższe poziomy tego samego sygnału¹⁶.

Zmiany jądrowe są związane ze starzeniem się i kilkoma chorobami neurodegeneracyjnymi, w tym chorobą Parkinsona^17,18. Aby ocenić, czy nasz model muchy dla ALS8 wykazuje zmiany w architekturze, położeniu i rozmiarze jądra, wybarwiliśmy jądra w mięśniach prążkowanych o odpowiednich genotypach markerem jądrowym i przeciwciałem anty-laminowym^19-22, które wizualizuje otoczkę jądrową. Aby uwydatnić mięśnie, do tych samych próbek dodano również przeciwciało specyficzne dla DVAP (ryc. 1). Zebrano obrazy konfokalne i przeprowadzono szczegółowe analizy morfometryczne za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. W mięśniach kontrolnych stwierdzono, że jądra są równomiernie rozmieszczone wzdłuż włókien mięśniowych, podczas gdy w mięśniach wyrażających DVAP-V260I i DVAP-WT jądra wykazują tendencję do redystrybucji w ściśle powiązanych klastrach (ryc. 1).

Przeprowadziliśmy analizę najbliższego sąsiada, aby przeprowadzić ilościową ocenę rozmieszczenia jąder wzdłuż włókien mięśniowych każdego genotypu. Analiza najbliższego sąsiada najpierw identyfikuje najbliższego sąsiada dla każdego jądra, mierząc odległość między środkiem danego jądra a środkiem każdego innego otaczającego jądra. Procedura ta jest następnie powtarzana dla każdego innego jądra wzdłuż włókna mięśniowego. Wreszcie, najkrótsza odległość między jądrami w obrębie określonego mięśnia jest obliczana poprzez uśrednienie najkrótszych odległości każdego jądra i jego najbliższych sąsiadów. (Rysunek 2A-C). W porównaniu z grupą kontrolną, mięśnie wykazujące ekspresję transgenu DVAP-V260I lub któregokolwiek z transgenów wykazujących nadekspresję białka typu dzikiego, wykazują dramatyczne zmniejszenie średniej najkrótszej odległości między jądrami, w wyniku czego jądra wydają się być ściśle związane w klastrach. Wpływ ALS powodującego allel DVAP-V260I jest poważniejszy niż ten związany z nadekspresją białka typu dzikiego, nawet jeśli używany jest najsilniejszy transgen DVAP-WT2 (Figura 1 i Figura 2D).

Nadekspresja transgenów DVAP-V260I lub DVAP-WT również wykazuje poważne pogorszenie architektury jądrowej, co skutkuje zdeformowanymi jądrami o wydłużonej strukturze (Rysunek 1). Ta aberracja strukturalna została określona ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ, w którym okrągłość jest zdefiniowana za pomocą wzoru C, które mierzy stosunek szerokości do długości każdego jądra, gdzie C = 1 reprezentuje idealne koło, a C = 0 nieskończenie wydłużony wielokąt. W jądrach kontrolnych wykazujących wyraźny okrągły kształt, C jest równe 1, podczas gdy w mutantach transgenicznych zmiana kształtu, a w konsekwencji utrata kolistości, powoduje znaczne odchylenie od tej wartości (ryc. 1 i ryc. 3).

Odkryliśmy również, że w mięśniach wyrażających te same transgeny, jądra wykazują wyraźnie powiększoną objętość jądra w porównaniu do grupy kontrolnej, chociaż allel powodujący ALS wydaje się być bardziej skuteczny w indukowaniu tego fenotypu w porównaniu do transgenów DVAP-WT (Rysunek 4).

Prawie wszystkie choroby neurodegeneracyjne charakteryzują się wewnątrzkomórkowym nagromadzeniem agregatów zawierających białko chorobotwórcze. Wykonaliśmy rekonstrukcje 3D i renderowanie objętości jąder i stwierdziliśmy, że w mięśniach wyrażających zmutowany transgen lub nadmiernie eksprymujących białko typu dzikiego, immunoreaktywność DVAP tworzyła klastry, a niektóre z nich były również zlokalizowane w jądrach (Figura 5). I odwrotnie, w kontrolnych NMJ, immunoreaktywność DVAP jest słabo rozproszona we włóknie mięśniowym i jest wykluczona z jądra¹⁶.

Rycina 1: Konfokalne obrazy jąder mięśniowych w mięśniach prążkowanych wyrażających transgeny DVAP-WT lub DVAP-260I. (A) sterowanie BG57-Gal4/+, (B) BG57; DVAP-V260I, (C) BG57; DVAP-WT1 oraz (D) BG57; Mięśnie DVAP-WT2 wykazujące ekspresję wskazanych transgenów są barwione przeciwciałami specyficznymi dla DVAP (sygnał czerwony), laminą (sygnał zielony) oraz markerem specyficznym dla jądra w celu wizualizacji jąder (sygnał niebieski). Podziałka = 30 μm Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Analiza najbliższego sąsiada w celu określenia średniej odległości między jądrem a jego najbliższym sąsiadem. (B) Reprezentatywne wyniki pokazujące zmienione ułożenie jąder w mięśniach z nadekspresją transgenu DVAP-WT2 w porównaniu z kontrolami w (A). Średnią odległość jądrową w mięśniach o wskazanych genotypach oszacowano za pomocą wzoru z (C), a dane przedstawiono w (D). Larwy NMJ są barwione przeciwciałami specyficznymi dla DVAP (sygnał czerwony), laminą (zielony) i markerem jądrowym (sygnał niebieski). Gwiazdki oznaczają istotność statystyczną. P <0,001, **P <0,01. Do analizy statystycznej tego eksperymentu i wszystkich eksperymentów opisanych poniżej zastosowano jednoczynnikowy test ANOVA oraz test wielokrotnych porównań Tukeya jako test post hoc, gdy różnice między genotypami okazały się znaczące w teście ANOVA. Słupki błędów reprezentują SEM. Pasek skali = 30 μm Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Obrazy przedstawiające reprezentatywne etapy obliczania objętości jądra atomowego. (A) Reprezentatywny obraz przedstawiający segmentowane jądra przy użyciu kreatora tworzenia powierzchni. Jądra na granicy obrazów zostały zignorowane. (B) Obraz przedstawiający jądrowy sygnał DVAP po zamaskowaniu otaczającego go barwienia DVAP za pomocą powierzchni utworzonej w kanale znacznika jądrowego. (C) Warstwa powierzchniowa dostarcza informacji o dodatkowych parametrach, w tym objętości jądra i kulistości. (D) Dane dotyczące objętości jądrowej różnych genotypów. Gwiazdki oznaczają istotność statystyczną. Wypreparowane NMJ wybarwiono przeciwciałami anty-DVAP (sygnał czerwony), przeciwciałami anty-laminowymi (sygnał zielony) i markerem jądrowym (sygnał niebieski). P <0,001, **P <0,01. Słupki błędów reprezentują SEM. Pasek skali = 30 μm Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Obrazy przedstawiające reprezentatywne etapy szacowania kształtu jądra za pomocą ImageJ.  Projekcje obrazów o maksymalnej intensywności analizowano za pomocą ImageJ w celu oszacowania kolistości jąder w mięśniach. (A) Reprezentatywny przykład projekcji intensywności obrazu z trzech kanałów, jak w kroku 7.9 protokołu. (B) Ilustracja przedstawiająca krok 7.10 protokołu, w którym kanały są dzielone i wybierany jest kanał znacznika jądrowego. (C) Reprezentatywny obraz pokazujący, że po zastosowaniu progu intensywności do segmentacji jąder i wtyczki menedżera ROI w ImageJ, wszystkie jądra zainteresowania mogą być wybrane i ich kształt zmierzony za pomocą deskryptorów kształtu (kroki 7.11-7.15). (D) Kwantyfikacja cyrkularności różnych genotypów. Na larwach NMJ czerwony sygnał wskazuje na barwienie DVAP, podczas gdy zielony konturuje jądra i odpowiada barwieniu laminą. Wnętrze każdego jądra jest oznaczone na niebiesko ze względu na zabarwienie markerem jądrowym. Gwiazdki oznaczają istotność statystyczną. P <0,001, **P <0,01. Słupki błędów reprezentują SEM. Pasek skali = 30 μm Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Obrazy przedstawiające konkretne etapy tworzenia renderingów objętościowych mięśni jądrowych. (A) Obraz przedstawiający mieszany widok intensywności 3D mięśni barwionych białkiem DVAP (czerwony), laminą (zielony) i markerem DNA (niebieski). (B) Obraz przedstawiający warstwę powierzchniową wytworzoną przez użycie kanału laminy do segmentacji jąder. (C) Obraz przedstawiający jądro, w którym warstwa powierzchniowa została wykorzystana do zamaskowania sygnału DVAP na zewnątrz wybranego jądra. Na żółto zaznaczona jest płaszczyzna tnąca, która została dodana do obrazu. Jego kąt widzenia i położenie mogą być interaktywnie dostosowywane w celu wizualizacji rozkładu sygnału wewnątrz jądra. (D) Obraz przedstawiający przekrój poprzeczny warstwy powierzchniowej jądra utworzonej przy użyciu kanału laminy połączonej z niezamaskowanymi sygnałami DVAP i znacznikami jądrowymi. (E i F) Dodatkowe przekroje objętościowe tego samego jądra. Podziałka = 10 μm Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

W przeszłości różnice morfologiczne w obrębie grup eksperymentalnych i między nimi były rzadko brane pod uwagę. Jednak stosowanie metod ilościowych staje się obecnie normą w porównawczych badaniach morfologii i oblicza się matematyczny opis form anatomicznych. Wykorzystanie analiz ilościowych do oceny wpływu manipulacji genetycznych na określone procesy komórkowe daje nadzieję na zwiększenie naszej zdolności do wykrywania zmian morfologicznych i poprawę dokładności, z jaką te zmiany są opisywane. Co więcej, analiza statystyczna danych ilościowych pozwala ocenić, czy obserwowane różnice między fenotypami są znaczące.

W mięśniach prążkowanych jądra wykazują wyraźną zaokrągloną strukturę i są równomiernie rozmieszczone wzdłuż włókna mięśniowego. Chociaż mechanizmy molekularne ustalające i utrzymujące wielkość, kształt i architekturę jąder nie są znane, te cechy jądrowe prawdopodobnie odgrywają fundamentalną rolę w kontrolowaniu funkcji mięśni. Rzeczywiście, kilka miopatii jest spowodowanych mutacjami w genach regulujących morfologię i położenie jąder w mięśniach. Funkcjonalne znaczenie kształtu i rozmieszczenia jąder w komórce nie ogranicza się do mięśni. Coraz więcej dowodów wskazuje, że defekty jądrowe są również związane z chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Parkinsona^18,24. Ponadto zaczynamy zdawać sobie sprawę, że morfologia, rozmiar i dystrybucja wewnątrzkomórkowa innych organelli, w tym retikulum endoplazmatycznego i mitochondriów, może mieć konsekwencje funkcjonalne. Na przykład zmiany w morfologii mitochondriów są związane z zaburzeniami neurologicznymi, takimi jak atrofia nerwu wzrokowego typu 1 (OPA1) i neuropatia Charcota-Marie-Tootha typu^{2A 25}.

Aby pomóc w procesie wyjaśniania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw tych ważnych procesów, proponujemy połączenie danych konfokalnych o wysokiej rozdzielczości z oprogramowaniem do obrazowania i analizami morfometrycznymi w celu ilościowej oceny, w jaki sposób manipulacje genetyczne mogą wpływać na kształt, rozmiar i lokalizację jąder we włóknach mięśniowych. Siła i wszechstronność genetyki Drosophila w połączeniu z wysoce stereotypowym charakterem układu nerwowo-mięśniowego u larw Drosophila sprawiają, że larwa NMJ jest modelem eksperymentalnym szczególnie odpowiednim do tego typu analiz. W przypadku larw NMJ analizę fenotypową można przeprowadzić w rozdzielczości pojedynczej synapsy, co pozwala na dokładną analizę morfometryczną, w której można badać wiele NMJ w obrębie tej samej muchy, a nawet ten sam możliwy do zidentyfikowania NMJ można porównać między muchami o różnych genotypach^3,4.

Charakterystyka fenotypowa położenia, kształtu i wielkości jąder u larw Drosophila NMJ rozpoczyna się od przeprowadzenia barwienia immunologicznego wypreparowanych NMJ przeciwciałami, które uwydatniają mięśnie i jądra w mięśniach. W protokole przedstawionym w tym artykule, jądra mięśniowe wybarwiono poliklonalnymi przeciwciałami przeciwko laminie, markerowi otoczki jądrowej, markerem jądrowym podkreślającym wnętrze jądra oraz przeciwciałami specyficznymi dla DVAP w celu zabarwienia całego mięśnia. Przeciwciała laminowe użyte w tych eksperymentach zostały uprzejmie dostarczone przez Paula Fishera^19-22 , ale można użyć alternatywnych źródeł przeciwciał anty-laminowych. Ponadto na rynku dostępnych jest wiele innych przeciwciał specyficznych dla otoczki jądrowej. Wreszcie, dostępne są również markery jądrowe, takie jak DAPI i jodek propidyny, podczas gdy mięśnie można uwidocznić poprzez barwienie przeciwciałami anty-aktynowymi lub anty-tubulinami. Jeżeli stosowane są przeciwciała inne niż użyte w tej procedurze doświadczalnej, protokół barwienia immunologicznego będzie wymagał dodatkowych kroków, w których warunki wiązania i stężenia robocze dla nowych przeciwciał będą musiały zostać zoptymalizowane. Jednym z kluczowych etapów tego protokołu, zwłaszcza gdy konieczne jest przeanalizowanie renderingu objętościowego, jest zamontowanie próbek na szkiełku. W takim przypadku ważne jest, aby między szkiełkiem a szkiełkiem nakrywkowym umieścić przekładki, aby próbki nie uległy zgnieceniu. Trzy pasma taśmy celulozowej owinięte wokół szkiełka po obu stronach szkiełka nakrywkowego to łatwy sposób na wykonanie przekładek.

Podczas gdy ImageJ był używany do obrazów 2D, większość wielokanałowych analiz obrazów 3D przedstawionych w tym artykule została wykonana przy użyciu Imaris ze względu na jego wewnętrzną dostępność. Jednak każdy inny podobny komercyjny pakiet oprogramowania może być używany do tych aplikacji.

Dostępnych jest kilka platform oprogramowania typu open source (na przykład ImageJ, CellProfiler, Vaa3D, Icy, KNIME i inne) oraz komercyjnych do analizy obrazów konfokalnych. ImageJ²⁶, darmowe oprogramowanie NIH lub jego bardziej ulepszona wersja, znana jako FiJi²⁷, zawiera dużą liczbę filtrów importu, makr i wtyczek dostępnych dla światowej społeczności obrazowania. Większość z tych wtyczek koncentruje się na przetwarzaniu informacji w sposób kawałek po plasterku. Dostępne są również wtyczki do wizualizacji i analizy wielokanałowych obrazów 3D. Jednak często są one przeznaczone do konkretnego zadania, a użytkownicy mogą potrzebować rozszerzyć lub dostosować te wtyczki do własnych potrzeb. Z drugiej strony, platformy komercyjne są skierowane do stosunkowo niedoświadczonych użytkowników i często koncentrują się na łatwym w użyciu, szerokim pokryciu zadań przetwarzania obrazu z niewiarygodną szybkością.

Procedura eksperymentalna wraz z ilościową analizą fenotypową opisaną w niniejszym protokole może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów molekularnych kontrolujących morfologię organelli i ich rozmieszczenie w komórce. Podejście to ma jednak oczywiste ograniczenie polegające na analizowaniu tych procesów w określonym punkcie końcowym. Proces kontrolowania morfologii i rozmieszczenia organelli może być bardzo dynamiczny i różnić się nie tylko między różnymi typami komórek, ale także w obrębie tej samej komórki, w zależności od stanu rozwojowego lub fizjologicznego. Dalsza implementacja tej analizy byłaby reprezentowana przez obrazowanie poklatkowe, które pozwala na monitorowanie zmian w morfologii i położeniu organelli w czasie.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mikrokleszcze 0,3 mm x 0,25 mm	Narzędzia do nauki precyzyjnej	11030-12
Płyty sekcyjne Sylgard	SIGMA-ALDRICH	76103	Wymieszaj wstępnie zważoną bazę elastomerową ze środkiem utwardzającym. Ubij mieszaninę na 5-centymetrową szalkę Petriego. Pozwól mu utwardzić się w temperaturze 60 & stopni; C przez co najmniej 24 godziny
Kołki Minutien ze stali nierdzewnej o średnicy 0,1 mm	Fine Science Tools	26002-10
Nożyczki do mikrodysekcji (bardzo drobne)	Narzędzia naukowe	15200-00
1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami). Skład: 3 mM NaH2PO4, 7 mM Na2HPO4, 130 mM NaCl, pH 7			NaH2PO4 (SIGMA-S8282), Na2HPO4 (SIGMA-S7907), NaCl (SIGMA-S7653)
Roztwór Bouina. Skład: Kwas pikrynowy, Formaldehyd, Kwas octowy (15:10:1)			Kwas pikrynowy (SIGMA 197378), Formaldehyd (F8775), Kwas octowy (SIGMA-1005706)
1x PBT (sól fizjologiczna buforowana fosforanami z trytonem). 1x PBS + 0,1% Tryton			Tryton-X100. SIGMA-T8787
Normalna surowica kozia	SIGMA	G9023
		anty-DVAP świnki morskiej	Dostarczone przez dr Giuseppa Pennetta (Uniwersytet w Edynburgu, Wielka Brytania). Stosować w rozcieńczeniu 1:200 w 5% NGS
Rabbit anty-HRP (peroksydaza chrzanowa)	Jackson ImmunoResearch	123-065-021	Stosować w rozcieńczeniu 1:500 w PBT zawierającym 5% NGS
		Przeciwciało anty-Laminowe królika	Dostarczone przez dr Paula Fishera (Uniwersytet Stanowy Nowego Jorku w Stony Brook). Stosować w rozcieńczeniu 1:500 w PBT zawierającym 5% NGS
Sondy molekularne	TO-PRO-3	T3605
Przeciwciało anty-królicze Kozy, Alexa Fluor488, sprzężone	Jackson ImmunoResearch	bs-295G-A555-BSS	Stosować w rozcieńczeniu 1:500 w PBT zawierającym 5% NGS
Przeciwciało IgG przeciwko śwince morskiej kóz, Cy3, sprzężone	Jackson ImmunoResearch	bs-0358G-Cy3-BSS	Stosować w rozcieńczeniu 1:500 w PBT zawierającym 5% NGS
Pożywkę montażową Vectashield do fluorescencyjne	Laboratoria wektorowe	H-1000