Artykuł metodologiczny

Dlaczego kwantyfikacja ma znaczenie: charakterystyka fenotypów w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila

11.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53821

⸱

12 maja 2016

 ,  , 
1Euan MacDonald Centre for Motor Neurone Disease Research, University of Edinburgh, 2School of Biomedical Sciences, University of Edinburgh

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Morfologia, rozmiar i lokalizacja organelli wewnątrzkomórkowych są ewolucyjnie zachowane i wydają się bezpośrednio wpływać na ich funkcję. Zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw tych procesów stało się ważnym celem współczesnej biologii. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób badania te można ułatwić dzięki zastosowaniu technik ilościowych.

Streszczenie

Większość badań nad morfogenezą opiera się na jakościowych opisach tego, jak na cechy anatomiczne wpływa zakłócenie określonych genów i ścieżek genetycznych. Opisy ilościowe są rzadko wykonywane, chociaż manipulacje genetyczne wywołują szereg efektów fenotypowych, a różnice obserwuje się nawet wśród osób w grupach kontrolnych. Pojawiające się dowody wskazują, że morfologia, rozmiar i lokalizacja organelli odgrywają wcześniej niedocenianą, ale fundamentalną rolę w funkcjonowaniu i przetrwaniu komórek. Tutaj przedstawiamy instrukcje krok po kroku dotyczące przeprowadzania analiz ilościowych fenotypów w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila (NMJ). Wykorzystujemy kilka wiarygodnych markerów immunohistochemicznych w połączeniu z technikami bioobrazowania i analizami morfometrycznymi, aby zbadać wpływ mutacji genetycznych na określone procesy komórkowe. W szczególności skupiamy się na ilościowej analizie fenotypów wpływających na morfologię, wielkość i położenie jąder w mięśniach prążkowanych larw Drosophila. Larwa Drosophila NMJ jest cennym modelem eksperymentalnym do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw struktury i funkcji układu nerwowo-mięśniowego, zarówno w zdrowiu, jak i chorobie. Jednak opisywane przez nas metodologie można rozszerzyć również na inne systemy.

Wprowadzenie

Analiza jakościowa ogranicza większość badań eksperymentalnych do badania manipulacji genetycznych prowadzących do dużych efektów fenotypowych lub do fenotypów, które nie są podatne na kwantyfikację, np. brak/obecność. Kwantyfikacja fenotypów zwykle nie jest przeprowadzana, a zmiany obecne w obrębie członków grupy fenotypowej nie są brane pod uwagę. Dodatkowo, bez matematycznych opisów morfologii, może być trudno określić, czy drobne zmiany fenotypowe są wynikiem zmian indukowanych genetycznie, czy też obserwowane zmiany są po prostu spowodowane przypadkowymi fluktuacjami.

Proponujemy, aby dla dokładnej i bezstronnej analizy defektów fenotypowych spowodowanych zaburzeniami genów, metodologie ilościowe towarzyszyły bardziej tradycyjnym podejściom jakościowym. Ilościowa ocena fenotypów jest szczególnie korzystna w przypadku struktur takich jak synapsy, które wykazują wysoki stopień zmienności ze względu na ich wewnętrzną plastyczność morfologiczną i funkcjonalną. Wybraliśmy przykłady analiz ilościowych zastosowanych w obszarach badań, które są nam najbardziej znane, a mianowicie w połączeniach nerwowo-mięśniowych larw Drosophila (NMJ). Jednak koncepcje i zasady odnoszą się równie dobrze do innych systemów eksperymentalnych.

Larwalny NMJ jest doskonałym modelowym systemem do badania rozwoju i funkcji synaptycznych ze względu na wysoce stereotypową naturę jego struktury. Każdy półsegment larwalnego układu nerwowo-mięśniowego zawiera 32 możliwe do zidentyfikowania neurony ruchowe tworzące kontakty synaptyczne z postsynaptycznym mięśniem docelowym. Każdy segment półkulowy zawiera również ustaloną liczbę mięśni widocznych jako wielojądrowe włókna przyczepione do wewnętrznej powierzchni naskórka1. Kolejną zaletą stosowania układu nerwowo-mięśniowego larw jest moc i wszechstronność genetyki Drosophila, która z łatwością pozwala na generowanie wielu zmutowanych alleli oraz możliwość modyfikacji ekspresji genów w sposób ograniczony czasowo i tkankowo. Wreszcie, 75% ludzkich genów powodujących chorobę ma ewolucyjnie zachowany ortolog u Drosophila2. Rzeczywiście, całe szlaki genetyczne są zachowane między muchami a ludźmi. Z tego powodu układ nerwowo-mięśniowy larw Drosophila jest bardzo popularnym modelem eksperymentalnym do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw wielu chorób człowieka, w tym stwardnienia zanikowego bocznego (ALS)1.

Tutaj pokazujemy, że dostępność kilku wiarygodnych markerów immunohistochemicznych, w połączeniu z technikami bioobrazowania i dokładnymi analizami morfometrycznymi, może opisać cechy anatomiczne, które mogą odgrywać ważną rolę funkcjonalną3,4,5. Wśród procesów komórkowych, które podlegają analizom ilościowym, koncentrujemy się na zmianach kształtu, wielkości i położenia struktur wewnątrzkomórkowych, takich jak jądra. Wszystko to są procesy, o których wiemy bardzo niewiele.

Wyzwaniem dla genetyków molekularnych w nadchodzących dekadach będzie poszerzenie naszej obecnej wiedzy poprzez analizę wpływu mutacji genetycznych, które wytwarzają bardzo subtelne defekty fenotypowe. Metodologie ilościowe, które pozwalają naukowcom na skrupulatne badanie skutków mutacji genetycznych, mogą zapewnić bardziej kompleksowe zrozumienie, w jaki sposób genotypy odnoszą się do fenotypów, zwłaszcza w przypadku słabo poznanych procesów komórkowych.

Protokół

1. Przygotowanie eksperymentalne

Uwaga: Procedury sekcji i immunohistochemii w rozdziałach 2 i 3 są wykonywane zgodnie z referencjami3-6, lecz z modyfikacjami.

  1. Przygotować 1x roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) oraz PBS zawierający 0,1% Triton-X 100 (PBT). Przechowywać je w lodzie.
  2. Przygotować utrwalacz Bouina (15 kwasu pikrynowego: 10 formaldehydu: 1 lodowatego kwasu octowego). Odczynnik ten należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.
  3. Wybrać czyste stalowe szpilki minutien oraz precyzyjną pęsetę.
  4. Przygotować płytki do sekcji zawierające dysk Sylgard w szalce Petri o średnicy 5 cm.

2. Disekcja NMJ larw w trzecim stadium rozwojowym

  1. Za pomocą cienkiego pędzla przenieś wędrujące larwy trzeciego stadium z fiolki lub butelki do szalki Petriego o średnicy 2 cm zawierającej PBS w temperaturze 4 °C, aby wypłukać resztki pokarmu.
  2. Umieść jedną larwę na powierzchni sylgardu płytki do sekcji, upewniając się, że znajduje się ona stroną grzbietową do góry, tak aby dwie podłużne tchawki były widoczne na powierzchni.
  3. Używając pęsety do trzymania szpilki, przypnij larwę w jej przednim końcu, tuż pod hakiem gębowym. Rozciągnij larwę tak bardzo, jak to możliwe i przypnij jej koniec tylny.
  4. Dodaj wystarczającą ilość soli PBS, aby dotarła ona do ścianek płytki i całkowicie zanurzyła larwę.
  5. Powtórz procedurę z kroków 2.1 do 2.3 dla pozostałych larw tego samego genotypu. Pojedyncza płytka do sekcji w szalce Petriego o średnicy 5 cm może pomieścić do 8 larw.
  6. Używając nożyczek do mikrosekcji, lekko unieś kutykulę grzbietową i wykonaj małe poziome nacięcie w tylnym końcu w pobliżu szpilki.
  7. Wsuń nożyczki w nacięcie i przetnij larwę aż do przedniego końca wzdłuż linii środkowej między dwiema podłużnymi tchawkami. Upewnij się, że nacięcia w linii środkowej są wystarczająco powierzchowne, aby przejść jedynie przez kutykulę i uniknąć przecięcia mięśni po stronie brzusznej.
  8. Na każdym końcu wykonaj dwa wcięcia po lewej i prawej stronie.
  9. Otwórz preparat, umieszczając dwie szpilki po obu stronach przedniego nacięcia. Powtórz to samo z końcem tylnym. Podczas umieszczania szpilek pamiętaj o rozszerzeniu ścian ciała.
  10. Usuń organy wewnętrzne za pomocą pęsety i soli PBS. Pozostaw nienaruszony ośrodkowy układ nerwowy. Delikatnie rozciągnij larwę za pomocą szpilek narożnych, aż będzie całkowicie wyprostowana, dbając o to, aby w trakcie tego procesu nie rozerwać mięśni.
  11. Powtórz tę samą procedurę sekcji dla pozostałych larw na tej samej płytce do sekcji.
  12. Przemyj trzy razy solą PBS, aby usunąć wszystkie organy wewnętrzne.
  13. Zastąp PBS utrwalaczem Bouina i pozostaw w temperaturze pokojowej na 10 min.
  14. Przemyj kilkakrotnie PBT.
  15. Ostrożnie usuń szpilki i przenieś wszystkie preparaty, które są teraz dość sztywne, do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml w celu przeprowadzenia immunobarwienia.

3. Barwienie immunohistochemiczne NMJ Drosophila przeciwciałami specyficznymi dla mięśni i myj jąder

  1. Szybko opłukać filety larwalne w PBT.
  2. Zablokować preparaty poprzez inkubację z 10% normalnym surowicą kozią (NGS) w PBT przez 2 hr przy stałym mieszaniu.
  3. Inkubować zestaw wypreparowanych NMJ w PBT zawierającym 5% NGS oraz przeciwciało królicze anty-laminy (w stężeniu 1:500) i przeciwciało świnki morskiej anty-DVAP (w stężeniu 1:500) przez 2 hr w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 ºC. Przeciwciało anty-DVAP barwi mięśnie poprzecznie prążkowane, natomiast barwienie anty-laminą wykrywa kontur jąder komórkowych mięśni.
  4. Opłukać raz szybko w PBT, aby usunąć nadmiar przeciwciał. Przemywać w PBT przez 2 hr, wymieniając bufor PBT co 15 min.
  5. Inkubować próbki w PBT zawierającym 5% NGS i znakowane fluorescencyjnie przeciwciała wtórne w rozcieńczeniu 1:500 przez 2 hr w temperaturze pokojowej. Te same próbki można poddać jednoczesnemu barwieniu wieloma przeciwciałami, jeśli zastosuje się przeciwciała wtórne sprzężone z różnymi chromoforami.
  6. Usunąć przeciwciała wtórne i przemywać w PBT przez 2 hr, wymieniając bufor PBT co 15 min.
  7. Aby zabarwić wnętrze jąder komórkowych mięśni, przemyć próbki trzykrotnie w PBS i postępować zgodnie z poniższymi krokami:
    1. Dodać marker jądrowy TO-PRO-3 w rozcieńczeniu 1:1,000 w PBS i inkubować przez 20 min przy stałym mieszaniu. W niniejszym badaniu zastosowano ten marker, jednak można użyć każdego innego dostępnego komercyjnie markera jądrowego.
    2. Szybko przemyć trzykrotnie w PBS przed montażem.

4. Montowanie próbek na szkiełkach

  1. Przenieś próbki pęsetą z probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 ml i ułóż je na szkiełku do obróbki.
  2. Za pomocą nożyczek do mikrodysekcji odetnij głowę i ogon filetów, układając je wewnętrzną powierzchnią do góry.
  3. Przygotuj szkiełko przedmiotowe, naklejając po trzech paskach taśmy celulozowej po każdej stronie czystego szkiełka w odstępach około 1 cm od siebie. Po umieszczeniu szkiełka nakrywnego na dwóch paskach powstanie szczelina, która zapobiegnie spłaszczeniu próbek. Jest to kluczowe w przypadku planowania trójwymiarowych rekonstrukcji objętościowych struktur.
  4. Nanieś małą kroplę medium montażowego o objętości około 20 µl na środek szkiełka przedmiotowego, pomiędzy trzy paski taśmy celulozowej.
  5. Po rozprowadzeniu medium montażowego czystą pęsetą, przenieś zdysekowane larwy na szkiełko przedmiotowe do medium montażowego, zachowując orientację wewnętrzną powierzchnią do góry. Staraj się układać je w rzędach po cztery lub pięć sztuk.
  6. Ostrożnie nałóż szkiełko nakrywki na wierzch szkiełka przedmiotowego, upewniając się, że nie powstały pęcherzyki powietrza. Uszczelnij szkiełko przezroczystym lakierem do paznokci. Pozostaw próbki do wyschnięcia na co najmniej 10 min przed obrazowaniem.

5. Ustawienia konfokalne do obrazowania

Uwaga: Obrazy przedstawione w niniejszym badaniu zostały wykonane przy użyciu jednostki konfokalnej Nikon A1R zintegrowanej z odwróconym mikroskopem Ti:E. Niemniej jednak do tego celu odpowiedni będzie każdy mikroskop konfokalny wyposażony w co najmniej 3 jednostki laserowe w zakresach długości fal 488 nm, 561 nm i 642 nm oraz 3-kanałowy system detekcji.

  1. Włącz lasery, jednostkę detektora, lampę rtęciową, sterownik stolika, mikroskop oraz komputer. Uruchom oprogramowanie sterujące i zamocuj preparat w uchwycie stolika.
  2. Aby przyspieszyć obrazowanie, wybierz i zaznacz wszystkie obszary zainteresowania (ROI) na próbce, korzystając z obiektywu 20X.
  3. Ostrożnie obróć rewolwer na obiektyw o wyższym powiększeniu 60X (60X Plan Apo VC/ NA 1.4 OIL).
  4. Nanieś kroplę oleju imersyjnego na soczewkę obiektywu i wybierz jeden z zaznaczonych obszarów ROI z okna podglądu XYZ na komputerze.
  5. Rozpocznij obrazowanie, stosując następujące ustawienia optyczne: wybierz pierwszy lustro dichroiczne: 405/488/561/640. Wybierz laser 488 nm z filtrem emisyjnym 525/50 nm w kanale 1, laser 561 nm z filtrem emisyjnym 595/50 nm w kanale 2 oraz laser 642 nm z filtrem długoprzepustowym 650 nm w kanale 3.
  6. Przed rozpoczęciem akwizycji obrazów ustaw następujące parametry skanowania: wybierz skaner Galvano; kierunek skanowania: jednokierunkowy; prędkość skanowania: 0.5 klatek na sek.
  7. Wybierz tryb sekwencji kanałów (Channel series), aby uniknąć przenikania sygnału między kanałami (bleed-through).
  8. Ustaw rozmiar otworu pin-hole na 1 jednostkę Airy. Wykonaj skan i odpowiednio dostosuj moc lasera, wzmocnienie detekcji (gain) oraz offset dla każdego kanału, aby uniknąć nasycenia pikseli i zminimalizować poziom tła.
  9. Wykonaj stosy Z (z-stacks), stosując rozmiar woksela 0.2 x 0.2 x 0.5 µm3 dla wszystkich obszarów ROI i preparatów na szkiełkach. Jeśli obrazy będą poddane dekonwolucji, ustaw rozmiar woksela na 0.06 x 0.06 x 0.15 µm3.
  10. Zapisz obrazy w formacie pliku .nd2 lub .ics.

6. Obliczanie odległości między jądrami w mięśniach poprzecznie prążkowanych metodą analizy najbliższego sąsiada

  1. Do niniejszej analizy należy wykorzystać obrazy konfokalne przedstawiające mięśnie ściany ciała larw, barwione przeciwciałami przeciwko DVAP w celu wizualizacji mięśni oraz przeciwciałami przeciwko laminie i markerem jądrowym w celu zaznaczenia jąder komórkowych.
  2. Aby oszacować najkrótszą odległość między jądrami, należy użyć funkcji Measurement Points w module MeasurementPro oprogramowania do analizy obrazu (np., Imaris). Do tych samych celów można wykorzystać inne podobne aplikacje programistyczne do analizy obrazu.
  3. Otwórz obrazy konfokalne. Aby rozpocząć, kliknij dwukrotnie ikonę oprogramowania. Przeciągnij i upuść obrazy z serii z-stack uzyskane za pomocą mikroskopu konfokalnego do obszaru Arena.
  4. Kliknij dwukrotnie obrazy, aby automatycznie otworzyć je w widoku Surpass View, pod ikoną paska narzędzi menu  figure-protocol-1Widok Surpass składa się z trzech głównych paneli obszaru roboczego: pola widoku, listy obiektów oraz obszaru właściwości obiektu.
  5. Utwórz obraz trójkanałowy z renderowaniem objętościowym, klikając ikonę menu 3D View figure-protocol-2.
  6. Kliknij ikonę Dodaj nowe punkty pomiarowe figure-protocol-3 z Pasek narzędzi obiektów i postępuj zgodnie z kreatorem tworzenia, który pojawi się w obszarze właściwości obiektu.
  7. W kreatorze tworzenia wybierz najpierw kartę Edycja, a następnie Kanał specyficzny. Wybierz marker jądrowy lub kanał laminy, aby zaznaczyć jądra komórkowe.
  8. Ustaw wskaźnik w trybie zaznaczania (Select), naciskając klawisz Esc na klawiaturze.
  9. Dostosuj rozmiar ramki kursora 3D za pomocą kółka myszy tak, aby objęła ona wybrany jądro komórkowe na obrazie. Dodaj punkt pomiarowy, przytrzymując klawisz Shift i klikając lewym przyciskiem myszy na tym samym jądrze.
  10. Nanieś drugi punkt na sąsiednim jądrze w tym samym mięśniu, powtarzając poprzednie kroki. Pomiędzy dwoma punktami zostanie automatycznie narysowana linia, a zmierzona odległość między dwoma jądrami zostanie wyświetlona. Odległość między dwoma jądrami jest teraz zapisywana jako zmienna statystyczna w polu Właściwości Obiektu (Object Properties Area) w zakładce Statystyki (Statistics). >Szczegółowe>Dane o odległościach.
  11. Powtórz procedurę z kroków 6.6–6.10 dla wszystkich jąder otaczających dane jądro.
  12. Ze statystyki > Szczegółowe> Dane dotyczące odległości wyświetlające wszystkie zebrane punkty pomiarowe; należy wybrać najkrótszą odległość.
  13. Klikając Eksportuj statystyki z karty Wyświetlanie do pliku figure-protocol-4 dane zostaną zapisane w arkuszu kalkulacyjnym, dostępnym w obszarze Właściwości Obiektu (Object Properties Area).
  14. Powtórz tę samą procedurę dla pozostałych sąsiednich jąder oraz dla wybranej liczby włókien mięśniowych dla każdego genotypu.
  15. Korzystając z danych wyeksportowanych do pliku arkusza kalkulacyjnego, oblicz średnią najkrótszą odległość (Dwitaj) dla wszystkich M mięśni, korzystając z następującego równania:
    figure-protocol-5
    Di to najkrótsza odległość do sąsiedniego jądra dla danego jądra i, gdzie i przyjmuje wartości od 0 do N, a N oznacza liczbę jąder przeanalizowanych w jednym mięśniu. Sumowanie wartości od j = 0 do j = m wskazuje na liczbę M przeanalizowanych mięśni.
  16. Ewentualnie można zastosować Kreator tworzenia punktów (Spots Creation wizard) oraz funkcja najbliższej odległości między punktami (Spots to Spots Closest Distance) w celu oszacowania średniej odległości do najbliższego sąsiedniego jądra. Do tego celu wymagany jest moduł rozszerzający Matlab.
    1. Kliknij dwukrotnie konkretny obraz na Arenie, a w obszarze widoku (View Area) zostanie wyświetlony obraz objętościowy 3D. Kliknij ikonę tworzenia obiektów (Object Creation) i wybierz opcję dodawania nowych punktów (Add New Spots). figure-protocol-6 z paska narzędzi Obiekty.
    2. W kreatorze tworzenia w obszarze właściwości obiektu kliknij opcję Pomiń automatyczne tworzenie, edytuj ręcznie.
    3. Wybierz kanał markera lamin lub markera jądrowego, aby wyświetlić jądra komórkowe.
    4. Przytrzymaj klawisz Shift i klikaj lewym przyciskiem myszy na wszystkie jądra konkretnego mięśnia na obrazie. Na każdym jądrze pojawi się punkt.
    5. W obszarze Właściwości Obiektu (Object Properties Area) w karcie Narzędzia (Tools) wybierz opcję Spots to Spots Closest Distance. W trybie Wyniki (Result) wybierz Spots Statistics, co spowoduje otwarcie okna programu Matlab.
    6. W karcie Statystyki wybierz opcję Szczegółowe, a następnie Konkretne wartości. Kliknij Distmin, aby wyświetlić wartości minimalnych odległości dla każdego jądra.
    7. Wyeksportuj dane do pliku arkusza kalkulacyjnego i oblicz średnią tych odległości dla każdego mięśnia. Powtórz procedurę dla wszystkich mięśni danego genotypu.

7. Określanie kształtu jąder komórkowych w mięśniach ściany ciała larw Drosophila

  1. Do tej analizy należy wykorzystać obrazy konfokalne mięśni ściany ciała barwionych laminą oraz markerem jądrowym w celu wizualizacji jąder.
  2. Aby ocenić kształt miojąder, należy zmierzyć sferyczność (zdefiniowaną jako stosunek powierzchni sfery o tej samej objętości co dane jądro do powierzchni jądra) lub eliptyczność (pozwalającą rozróżnić elipsoidy spłaszczone/wydłużone od sferoidów).
  3. Otwórz obraz zgodnie z wcześniejszym opisem. Kliknij ikonę Dodaj Nowe Powierzchnie (Add New Surfaces) figure-protocol-7 na pasku narzędzi Obiekty (Objects).
  4. W kreatorze tworzenia, który pojawi się w obszarze Właściwości Obiektu (Object Properties Area), wybierz barwienie markerem jądrowym jako Kanał Źródłowy (Source Channel), aby wyświetlić jądra.
  5. Ustaw opcję Intensywność Bezwzględna (Absolute Intensity) jako próg. Zmieniając wartość na krzywej progowej, upewnij się, że większość jąder wykazuje gładkie i nieprzeładowane renderowanie. Jednocześnie, korzystając z tej samej krzywej, unikaj występowania dziur lub niepełnych masek w obrębie dowolnego jądra.
  6. Użyj narzędzia Filtr (Filter), aby wykluczyć szumy w renderowaniu powierzchni. W karcie Edytuj (Edit) nowo utworzonej warstwy powierzchni, rozdziel (Split) lub połącz (Merge) powierzchnie jąder, które zostały błędnie wyrenderowane.
  7. Wyeksportuj do pliku arkusza kalkulacyjnego wartości eliptyczności i sferyczności wyrenderowanych powierzchni jąder, które są dostępne w karcie Statystyki (Statistics).
  8. Alternatywnie można użyć oprogramowania ImageJ lub Fiji do pomiaru kolistości jąder, gdzie Kolistość (C) jest definiowana jako Cfigure-protocol-8 . Wartość jeden reprezentuje idealne koło, natomiast wartość zbliżająca się do zera wskazuje na kształt coraz bardziej wydłużony.
  9. Utwórz projekcje maksymalnej intensywności stosów z (z stacks) z menu Images>Stacks>Z Project. Ustaw typ projekcji na Max Intensity.
  10. Rozdziel kanały i wybierz kanał markera jądrowego.
  11. Z menu głównego wybierz Image>Adjust>Threshold.
  12. Przeprowadź segmentację jąder, dostosowując próg intensywności. Jeśli sąsiadujące jądra zostaną zsegmentowane jako jedna jednostka, kliknij narzędzie Process>Binary>Watershed, aby je rozdzielić.
  13. Z menu głównego wybierz Edit>Selection>Create selection.
  14. Dodaj wszystkie zaznaczone obszary zainteresowania (ROI) do Menedżera ROI (ROI Manager), klikając w menu Analyze>Tools>ROI Manager. W oknie ROI Manager kliknij Add. W tym samym oknie wybierz More >Split.
  15. W Analyze>Set Measurements zaznacz Deskryptory Kształtu (Shape Descriptors). W oknie ROI Manager kliknij zakładkę Measure. Wyświetli to listę wartości kolistości wszystkich wybranych jąder.
  16. Dodatkowo, aby zmierzyć objętość jądra, postępuj zgodnie z kreatorem tworzenia powierzchni, używając kanału barwienia markerem jądrowym, jak opisano w podrozdziałach 7.3-7.7.

8. Trójwymiarowe renderingi objętościowe wybranych jąder w mięśniach ściany ciała larwy Drosophila w celu oceny wewnątrzjądrowej lokalizacji specyficznego białka

  1. Należy wykorzystać obrazy konfokalne przedstawiające mięśnie ściany ciała barwione markerem jądrowym oraz przeciwciałami specyficznymi dla laminy i DVAP.
  2. Otwórz obrazy po uruchomieniu oprogramowania i wybierz konkretne jądro do analizy. Można to zrobić, wybierając z menu głównego opcję Edycja>Kadrowanie 3D (Edit>Crop 3D).
  3. Postępuj zgodnie z kreatorem tworzenia powierzchni, korzystając z kanału laminy, jak opisano w podrozdziałach 7.3-7.7.
  4. Po utworzeniu powierzchni kliknij Edytuj (Edit) w obszarze właściwości obiektów (Objects Properties Area), a następnie wybierz Maskuj wszystko (Mask All), aby wyizolować sygnał wewnątrz jądra. Spowoduje to otwarcie nowego okna.
  5. Z rozwijanego menu Wybierz kanał (Select Channel) wybierz sygnał DVAP. Zaznacz sygnał immunoreaktywności DVAP wewnątrz jądra, klikając opcję Ustaw woksle poza powierzchnią na zero (Set Voxels Outside The Surface to zero). Zostanie utworzony nowy zamaskowany kanał, który będzie dostępny do wyboru w oknie regulacji wyświetlania.
  6. Aby zwizualizować obecność sygnału wewnątrz jądra, utwórz płaszczyznę konturową, klikając ikonę Dodaj nową płaszczyznę przycinania (Add New Clipping Plane) figure-protocol-9 na pasku narzędzi obiektów.      
  7. Interaktywnie dostosuj kąt i pozycję płaszczyzny przycinania, aby zwizualizować rozkład sygnału wewnątrz jądra.

Wyniki

ALS jest chorobą zwyrodnieniową, która dotyczy specyficznie neuronów ruchowych, prowadząc do postępującego i śmiertelnego paraliżu mięśni poprzecznie prążkowanych7. Mutacje missense w ludzkim białku VAMP-Associated Protein B (hVAPB) wywołują szereg chorób neuronów ruchowych, w tym ALS typu 88-12. Niedawno w jednym przypadku typowego ALS u ludzi zidentyfikowano mutację missense (V234I) w genie hVAPB13. Aby ocenić jej potencjał patogenny, stworzyliśmy transgeniczne muchy wykazujące ekspresję ortologu hVAPB u Drosophila, białka DVAP, niosącego mutację wywołującą chorobę (DVAP-V260I). Ekspresja tego transgenu została skierowana do mięśni przy użyciu systemu UAS/GAL4 oraz specyficznego dla mięśni drivera BG57-Gal414,15. Efekt transgenicznej ekspresji DVAP-V260I porównano i zestawiono z efektami dwóch innych transgenów (DVAP-WT1 i DVAP-WT2), które wykazują różny poziom ekspresji białka DVAP typu dzikiego16. Dokładniej, wzrost immunoreaktywności DVAP jest 2,2-krotnie wyższy niż w grupach kontrolnych dla linii DVAP-WT2, podczas gdy DVAP-V260I i DVAP-WT1 wykazują porównywalne i niższe poziomy tego samego sygnału16.

Zmiany w jądrach komórkowych wiąże się ze starzeniem oraz kilkoma chorobami neurodegeneracyjnymi, w tym z chorobą Parkinsona17,18. Aby ocenić, czy nasz model muchy dla ALS8 wykazuje zmiany w architekturze, położeniu i wielkości jąder, jądra w mięśniach poprzecznie prążkowanych odpowiednich genotypów barwiono markerem jądrowym oraz przeciwciałem antylaminowym19-22, które wizualizuje otoczkę jądrową. W celu podkreślenia mięśni do tych samych próbek dodano również przeciwciało specyficzne dla DVAP (Rysunek 1). Wykonano obrazy konfokalne, a następnie przeprowadzono szczegółowe analizy morfometryczne przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu. W mięśniach kontrolnych stwierdzono równomierny rozkład jąder wzdłuż włókien mięśniowych, natomiast w mięśniach wykazujących ekspresję DVAP-V260I oraz DVAP-WT jądra wykazują tendencję do redystrybucji w postaci gęsto powiązanych skupisk (Rysunek 1).

Przeprowadziliśmy analizę najbliższego sąsiedztwa, aby dokonać ilościowej oceny rozkładu jąder wzdłuż włókien mięśniowych dla każdego genotypu. Analiza najbliższego sąsiedztwa polega najpierw na zidentyfikowaniu najbliższego sąsiada dla każdego jądra poprzez pomiar odległości między środkiem danego jądra a środkami wszystkich pozostałych jąder w jego otoczeniu. Procedurę tę powtarza się dla wszystkich pozostałych jąder wzdłuż włókna mięśniowego. Na koniec oblicza się najkrótszą odległość między jądrami w konkretnym mięśniu, wyciągając średnią z najkrótszych odległości między każdym jądrem a jego najbliższymi sąsiadami (Ryc. 2A-C). W porównaniu z grupą kontrolną, mięśnie wykazujące ekspresję transgenu DVAP-V260I lub któregokolwiek z transgenów nadekspresujących białko typu dzikiego, wykazują drastyczną redukcję średniej najkrótszej odległości między jądrami, w konsekwencji czego jądra wydają się być ściśle powiązane w skupiska. Efekt allelu DVAP-V260I wywołującego ALS jest bardziej nasilony niż efekt związany z nadekspresją białka typu dzikiego, nawet w przypadku zastosowania najsilniejszego transgenu DVAP-WT2 (Ryc. 1 oraz Ryc. 2D).

Nadekspresja transgenów DVAP-V260I lub DVAP-WT powoduje również poważne pogorszenie architektury jądrowej, skutkujące deformacją jąder i nadaniem im wydłużonej struktury (Rycina 1). Aberrację strukturalną tę ilościowo określono za pomocą oprogramowania ImageJ, w którym kołowość definiuje wzór Cfigure-results-1, mierzący stosunek szerokości do długości każdego jądra, gdzie C = 1 oznacza idealne koło, a C = 0 wielokąt nieskończenie wydłużony. W jądrach kontrolnych o wyraźnym okrągłym kształcie wartość C wynosi 1, natomiast w mutantach transgenicznych zmiana kształtu i wynikająca z niej utrata kołowości powodują znaczące odchylenie od tej wartości (Rycina 1 oraz Rycina 3).

Stwierdziliśmy również, że w mięśniach wykazujących ekspresję tych samych transgenów jądra wykazują wyraźnie zwiększoną objętość jądrową w porównaniu z grupą kontrolną, choć allel powodujący ALS wydaje się być bardziej efektywny w indukowaniu tego fenotypu niż transgeny DVAP-WT (Rysunek 4).

Prawie wszystkie choroby neurodegeneracyjne charakteryzują się wewnątrzkomórkowym gromadzeniem agregatów zawierających patogenne białko. Wykonaliśmy rekonstrukcje 3D oraz renderingi objętościowe jąder i stwierdziliśmy, że w mięśniach wykazujących ekspresję zmutowanego transgenu lub nadekspresję białka typu dzikiego, immunoreaktywność DVAP tworzyła skupiska, z których niektóre były również zlokalizowane w jądrach (Rycyna 5). Odwrotnie, w kontrolnych złączach nerwowo-mięśniowych immunoreaktywność DVAP jest słabo rozproszona w całym włóknie mięśniowym i nie występuje w jądrze16.

figure-results-2
Rysunek 1: Obrazy konfokalne jąder mięśniowych w mięśniach poprzecznie prążkowanych wykazujących ekspresję transgenów DVAP-WT lub DVAP-260I. (A) kontrola BG57-Gal4/+, (B) BG57;DVAP-V260I, (C) BG57;DVAP-WT1 oraz (D) mięśnie BG57;DVAP-WT2 wykazujące ekspresję wskazanych transgenów zostały zabarwione przeciwciałami specyficznymi dla DVAP (sygnał czerwony), laminy (sygnał zielony) oraz markerem specyficznym dla jądra w celu wizualizacji jąder (sygnał niebieski). Pasek skali = 30 µm Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 2: Analiza najbliższego sąsiada w celu określenia średniej odległości między jądrem a jego pojedynczym najbliższym sąsiadem. (B) Reprezentatywne wyniki wykazujące zmienione rozmieszczenie jąder w mięśniach z nadekspresją transgenu DVAP-WT2 w porównaniu z kontrolami w (A). Średnią odległość jąder w mięśniach wskazanych genotypów oszacowano za pomocą wzoru w (C), a dane przedstawiono w (D). Larwalne NMJ są barwione przeciwciałami specyficznymi dla DVAP (sygnał czerwony), laminy (zielony) oraz markerem jądrowym (sygnał niebieski). Gwiazdki oznaczają istotność statystyczną. ***P <0.001, **P <0.01. Do analizy statystycznej tego doświadczenia oraz wszystkich opisanych poniżej eksperymentów zastosowano jednoczynnikowy test ANOVA, a w przypadku stwierdzenia istotnych różnic między genotypami w teście ANOVA, jako test post-hoc zastosowano test wielokrotnych porównań Tukeya. Słupki błędów reprezentują SEM. Pasek skali = 30 µm Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-4
Rysunek 3: Obrazy przedstawiające reprezentatywne etapy obliczania objętości jądra. (A) Reprezentatywny obraz pokazujący segmentację jąder przy użyciu kreatora tworzenia powierzchni. Jądra znajdujące się na krawędziach obrazów zostały pominięte. (B) Obraz przedstawiający sygnał DVAP w jądrze po zamaskowaniu otaczającego barwienia DVAP przy użyciu powierzchni utworzonej w kanale markera jądrowego. (C) Warstwa powierzchni dostarcza informacji o dodatkowych parametrach, w tym o objętości jądra i sferyczności. (D) Dane dotyczące objętości jądra dla różnych genotypów. Gwiazdki oznaczają istotność statystyczną. Wypreparowane połączenia NMJ zostały zabarwione przeciwciałami anty-DVAP (sygnał czerwony), przeciwciałami anty-laminowymi (sygnał zielony) oraz markerem jądrowym (sygnał niebieski). ***P <0.001, **P <0.01. Słupki błędów reprezentują SEM. Pasek skali = 30 µm Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rycina 4: Obrazy przedstawiające reprezentatywne etapy szacowania kształtu jądra za pomocą programu ImageJ.  Do oszacowania kolistości jąder wewnątrz mięśni przeanalizowano obrazy z maksymalną projekcją intensywności przy użyciu programu ImageJ. (A) Reprezentatywny przykład projekcji intensywności obrazu trójkanałowego, zgodnie z krokiem 7.9 protokołu. (B) Obraz przedstawiający krok 7.10 protokołu, w którym kanały zostają rozdzielone i wybrany zostaje kanał markera jądrowego. (C) Reprezentatywny obraz pokazujący, że po zastosowaniu progu intensywności w celu segmentacji jąder oraz wtyczki ROI manager w programie ImageJ, wszystkie interesujące jądra mogą zostać wybrane, a ich kształt zmierzony za pomocą deskryptorów kształtu (Shape descriptors) (kroki 7.11-7.15). (D) Kwantyfikacja kolistości różnych genotypów. W larwalnych NMJ sygnał czerwony wskazuje barwienie DVAP, natomiast zielone obrysowuje jądra i odpowiada barwieniu laminy. Wnętrze każdego jądra jest oznakowane kolorem niebieskim dzięki barwieniu markerem jądrowym. Gwiazdki oznaczają istotność statystyczną. ***P <0.001, **P <0.01. Słupki błędu reprezentują SEM. Pasek skali = 30 µm Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-6
Rysunek 5: Obrazy przedstawiające poszczególne etapy tworzenia renderowania objętościowego jąder mięśniowych. (A) Obraz przedstawiający 3D widok mieszany intensywności mięśni barwionych białkiem DVAP (czerwony), laminą (zielony) i markerem DNA (niebieski). (B) Obraz reprezentujący warstwę powierzchniową wygenerowaną przy użyciu kanału laminy w celu segmentacji jąder. (C) Obraz reprezentujący jądro, w którym warstwa powierzchniowa została użyta do zamaskowania sygnału DVAP poza wybranym jądrem. Na żółto zaznaczono dodaną do obrazu płaszczyznę przycinania. Jej kąt widzenia i pozycję można interaktywnie dostosowywać, aby zwizualizować rozkład sygnału wewnątrz jądra. (D) Obraz przedstawiający widok przekroju poprzecznego powierzchniowej warstwy jądra stworzonej przy użyciu kanału laminy, połączony z niezamaskowanym sygnałem DVAP i sygnałem markera jądrowego. (E) i (F) Dodatkowe renderowania objętościowe przekrojów tego samego jądra. Pasek skali = 10 µm Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

W przeszłości różnice morfologiczne w obrębie grup eksperymentalnych i między nimi były rzadko brane pod uwagę. Jednak stosowanie metod ilościowych staje się obecnie normą w porównawczych badaniach morfologii i oblicza się matematyczny opis form anatomicznych. Wykorzystanie analiz ilościowych do oceny wpływu manipulacji genetycznych na określone procesy komórkowe daje nadzieję na zwiększenie naszej zdolności do wykrywania zmian morfologicznych i poprawę dokładności, z jaką te zmiany są opisywane. Co więcej, analiza statystyczna danych ilościowych pozwala ocenić, czy obserwowane różnice między fenotypami są znaczące.

W mięśniach prążkowanych jądra wykazują wyraźną zaokrągloną strukturę i są równomiernie rozmieszczone wzdłuż włókna mięśniowego. Chociaż mechanizmy molekularne ustalające i utrzymujące wielkość, kształt i architekturę jąder nie są znane, te cechy jądrowe prawdopodobnie odgrywają fundamentalną rolę w kontrolowaniu funkcji mięśni. Rzeczywiście, kilka miopatii jest spowodowanych mutacjami w genach regulujących morfologię i położenie jąder w mięśniach. Funkcjonalne znaczenie kształtu i rozmieszczenia jąder w komórce nie ogranicza się do mięśni. Coraz więcej dowodów wskazuje, że defekty jądrowe są również związane z chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Parkinsona18,24. Ponadto zaczynamy zdawać sobie sprawę, że morfologia, rozmiar i dystrybucja wewnątrzkomórkowa innych organelli, w tym retikulum endoplazmatycznego i mitochondriów, może mieć konsekwencje funkcjonalne. Na przykład zmiany w morfologii mitochondriów są związane z zaburzeniami neurologicznymi, takimi jak atrofia nerwu wzrokowego typu 1 (OPA1) i neuropatia Charcota-Marie-Tootha typu2A 25.

Aby pomóc w procesie wyjaśniania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw tych ważnych procesów, proponujemy połączenie danych konfokalnych o wysokiej rozdzielczości z oprogramowaniem do obrazowania i analizami morfometrycznymi w celu ilościowej oceny, w jaki sposób manipulacje genetyczne mogą wpływać na kształt, rozmiar i lokalizację jąder we włóknach mięśniowych. Siła i wszechstronność genetyki Drosophila w połączeniu z wysoce stereotypowym charakterem układu nerwowo-mięśniowego u larw Drosophila sprawiają, że larwa NMJ jest modelem eksperymentalnym szczególnie odpowiednim do tego typu analiz. W przypadku larw NMJ analizę fenotypową można przeprowadzić w rozdzielczości pojedynczej synapsy, co pozwala na dokładną analizę morfometryczną, w której można badać wiele NMJ w obrębie tej samej muchy, a nawet ten sam możliwy do zidentyfikowania NMJ można porównać między muchami o różnych genotypach3,4.

Charakterystyka fenotypowa położenia, kształtu i wielkości jąder u larw Drosophila NMJ rozpoczyna się od przeprowadzenia barwienia immunologicznego wypreparowanych NMJ przeciwciałami, które uwydatniają mięśnie i jądra w mięśniach. W protokole przedstawionym w tym artykule, jądra mięśniowe wybarwiono poliklonalnymi przeciwciałami przeciwko laminie, markerowi otoczki jądrowej, markerem jądrowym podkreślającym wnętrze jądra oraz przeciwciałami specyficznymi dla DVAP w celu zabarwienia całego mięśnia. Przeciwciała laminowe użyte w tych eksperymentach zostały uprzejmie dostarczone przez Paula Fishera19-22 , ale można użyć alternatywnych źródeł przeciwciał anty-laminowych. Ponadto na rynku dostępnych jest wiele innych przeciwciał specyficznych dla otoczki jądrowej. Wreszcie, dostępne są również markery jądrowe, takie jak DAPI i jodek propidyny, podczas gdy mięśnie można uwidocznić poprzez barwienie przeciwciałami anty-aktynowymi lub anty-tubulinami. Jeżeli stosowane są przeciwciała inne niż użyte w tej procedurze doświadczalnej, protokół barwienia immunologicznego będzie wymagał dodatkowych kroków, w których warunki wiązania i stężenia robocze dla nowych przeciwciał będą musiały zostać zoptymalizowane. Jednym z kluczowych etapów tego protokołu, zwłaszcza gdy konieczne jest przeanalizowanie renderingu objętościowego, jest zamontowanie próbek na szkiełku. W takim przypadku ważne jest, aby między szkiełkiem a szkiełkiem nakrywkowym umieścić przekładki, aby próbki nie uległy zgnieceniu. Trzy pasma taśmy celulozowej owinięte wokół szkiełka po obu stronach szkiełka nakrywkowego to łatwy sposób na wykonanie przekładek.

Podczas gdy ImageJ był używany do obrazów 2D, większość wielokanałowych analiz obrazów 3D przedstawionych w tym artykule została wykonana przy użyciu Imaris ze względu na jego wewnętrzną dostępność. Jednak każdy inny podobny komercyjny pakiet oprogramowania może być używany do tych aplikacji.

Dostępnych jest kilka platform oprogramowania typu open source (na przykład ImageJ, CellProfiler, Vaa3D, Icy, KNIME i inne) oraz komercyjnych do analizy obrazów konfokalnych. ImageJ26, darmowe oprogramowanie NIH lub jego bardziej ulepszona wersja, znana jako FiJi27, zawiera dużą liczbę filtrów importu, makr i wtyczek dostępnych dla światowej społeczności obrazowania. Większość z tych wtyczek koncentruje się na przetwarzaniu informacji w sposób kawałek po plasterku. Dostępne są również wtyczki do wizualizacji i analizy wielokanałowych obrazów 3D. Jednak często są one przeznaczone do konkretnego zadania, a użytkownicy mogą potrzebować rozszerzyć lub dostosować te wtyczki do własnych potrzeb. Z drugiej strony, platformy komercyjne są skierowane do stosunkowo niedoświadczonych użytkowników i często koncentrują się na łatwym w użyciu, szerokim pokryciu zadań przetwarzania obrazu z niewiarygodną szybkością.

Procedura eksperymentalna wraz z ilościową analizą fenotypową opisaną w niniejszym protokole może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów molekularnych kontrolujących morfologię organelli i ich rozmieszczenie w komórce. Podejście to ma jednak oczywiste ograniczenie polegające na analizowaniu tych procesów w określonym punkcie końcowym. Proces kontrolowania morfologii i rozmieszczenia organelli może być bardzo dynamiczny i różnić się nie tylko między różnymi typami komórek, ale także w obrębie tej samej komórki, w zależności od stanu rozwojowego lub fizjologicznego. Dalsza implementacja tej analizy byłaby reprezentowana przez obrazowanie poklatkowe, które pozwala na monitorowanie zmian w morfologii i położeniu organelli w czasie.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni dr Andrei Chai za jej wnikliwe komentarze na temat manuskryptu. Prace te były wspierane przez Wellcome Trust (numer grantu: Pennetta8920) oraz przez Motor Neuron Disease Association (numer grantu: Pennetta6231).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikrokleszcze 0,3 mm x 0,25 mmNarzędzia do nauki precyzyjnej 11030-12
Płyty sekcyjne Sylgard SIGMA-ALDRICH76103Wymieszaj wstępnie zważoną bazę elastomerową ze środkiem utwardzającym. Ubij mieszaninę na 5-centymetrową szalkę Petriego. Pozwól mu utwardzić się w temperaturze 60 & stopni; C przez co najmniej 24 godziny
Kołki Minutien ze stali nierdzewnej o średnicy 0,1 mmFine Science Tools 26002-10
Nożyczki do mikrodysekcji (bardzo drobne) Narzędzia naukowe 15200-00
1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami). Skład: 3 mM NaH2PO4, 7 mM Na2HPO4, 130 mM NaCl, pH 7NaH2PO4 (SIGMA-S8282), Na2HPO4 (SIGMA-S7907), NaCl (SIGMA-S7653)
Roztwór Bouina. Skład: Kwas pikrynowy, Formaldehyd, Kwas octowy (15:10:1)Kwas pikrynowy (SIGMA 197378), Formaldehyd (F8775), Kwas octowy (SIGMA-1005706)
1x PBT (sól fizjologiczna buforowana fosforanami z trytonem). 1x PBS + 0,1% Tryton Tryton-X100. SIGMA-T8787
Normalna surowica kozia SIGMAG9023
anty-DVAP świnki morskiejDostarczone przez dr Giuseppa Pennetta (Uniwersytet w Edynburgu, Wielka Brytania). Stosować w rozcieńczeniu 1:200 w 5% NGS
Rabbit anty-HRP (peroksydaza chrzanowa)Jackson ImmunoResearch123-065-021Stosować w rozcieńczeniu 1:500 w PBT zawierającym 5% NGS
Przeciwciało anty-Laminowe królikaDostarczone przez dr Paula Fishera (Uniwersytet Stanowy Nowego Jorku w Stony Brook). Stosować w rozcieńczeniu 1:500 w PBT zawierającym 5% NGS 
Sondy molekularneTO-PRO-3T3605
Przeciwciało anty-królicze Kozy, Alexa Fluor488, sprzężoneJackson ImmunoResearchbs-295G-A555-BSSStosować w rozcieńczeniu 1:500 w PBT zawierającym 5% NGS
Przeciwciało IgG przeciwko śwince morskiej kóz, Cy3, sprzężoneJackson ImmunoResearchbs-0358G-Cy3-BSSStosować w rozcieńczeniu 1:500 w PBT zawierającym 5% NGS
Pożywkę montażową Vectashield do fluorescencyjneLaboratoria wektoroweH-1000
Przeciwciało

Bibliografia

  1. Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr. Opin. Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).
  2. Fortini, M. E., Skupski, M. P., Boguski, M. S., Hariharan, I. K. A survey of human disease gene counterparts in the Drosophila genome. J. Cell Biol. 150 (2), 23-30 (2000).
  3. Ramachandran, P., Budnik, V. Dissection of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. (8), (2010).
  4. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. JoVE. (24), (2009).
  5. Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. JoVE. (25), (2009).
  6. Ramachandran, P., Budnik, V. Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. (8), (2010).
  7. Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis. Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).
  8. Nishimura, A. L., et al. A mutation in the vesicle-trafficking protein VAPB causes late-onset spinal muscular atrophy and amyotrophic lateral sclerosis. Am J Hum Genet. 75 (5), 822-831 (2004).
  9. Chen, H. J., et al. Characterization of the properties of a novel mutation in VAPB in familial amyotrophic lateral sclerosis. J Biol Chem. 285 (51), 40266-40281 (2010).
  10. Funke, A. D., et al. The P56S mutation in the VAPB gene is not due to a single founder: the first European case. Clin Genet. 77 (3), 302-303 (2010).
  11. SOD1,ANG,VAPB,TARDBP, and FUS mutations in familial amyotrophic lateral sclerosis: genotype-phenotype correlations. J Med. Genet. Millecamps, S., et al. 47 (8), 554-560 (2010).
  12. Landers, J. E., et al. New VAPB deletion variant and exclusion of VAPB mutations in familial ALS. Neurology. 70 (14), 1179-1185 (2008).
  13. Van Blitterswijk, M., et al. VAPB and C9orf72 mutations in 1 familial amyotrophic lateral sclerosis patient. Neurobiol Aging. 33 (12), 2951-2954 (2012).
  14. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  15. Budnik, V., et al. Regulation of synapse structure and function by the Drosophila tumor suppressor gene dlg. Neuron. 17 (4), 627-640 (1996).
  16. Sanhueza, M., Zechini, L., Gillespie, T., Pennetta, G. Gain-of-function mutations in the ALS8 causative gene VAPB have detrimental effects on neurons and muscles. Biol Open. 3 (1), 59-71 (2014).
  17. Worman, H. J., Ostlund, C., Wang, Y. Diseases of the nuclear envelope. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (2), a000760(2010).
  18. Liu, G. H., et al. Progressive degeneration of human neural stem cells caused by pathogenic LRRK2. Nature. 491 (7425), 603-607 (2012).
  19. Pennetta, G., Hiesinger, P. R., Fabian-Fine, R., Meinertzhagen, I. A., Bellen, H. J. Drosophila VAP-33A directs bouton formation at neuromuscular junctions in a dosage-dependent manner. Neuron. 35 (2), 291-306 (2002).
  20. Fisher, P. A., Berrios, M., Blobel, G. Isolation and characterization of a proteinaceous subnuclear fraction composed of nuclear matrix, peripheral lamina, and nuclear pore complexes from embryos of Drosophila melanogaster. J Cell Biol. 92 (3), 674-686 (1982).
  21. Smith, D. E., Fisher, P. A. Identification, developmental regulation, and response to heat shock of two antigenically related forms of a major nuclear envelope protein in Drosophila embryos: application of an improved method for affinity purification of antibodies using polypeptides immobilized on nitrocellulose blots. J Cell Biol. 99 (1), 20-28 (1984).
  22. Smith, D. E., Gruenbaum, Y., Berrios, M., Fisher, P. A. Biosynthesis and interconversion of Drosophila nuclear lamin isoforms during normal growth and in response to heat shock. J Cell Biol. 105 (2), 771-790 (1987).
  23. Puckelwartz, M. J., et al. Disruption of nesprin-1 produces an Emery Dreifuss muscular dystrophy-like phenotype in mice. Hum Mol Genet. 18 (4), 607-620 (2009).
  24. Tsujikawa, M., Omori, Y., Biyanwila, J., Malicki, J. Mechanism of positioning the cell nucleus in vertebrate photoreceptors. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (37), 14819-14824 (2007).
  25. Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 872-884 (2010).
  26. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ilo ciowa analiza fenotypuocena morfologii j dra kom rkowegotechniki obrazowania konfokalnegomarkery immunohistochemicznemetody analizy morfometrycznejpomiar sferyczno ci j draanaliza najbli szego s siadalokalizacja bia ka DeVAPbarwienie przeciwcia ami przeciwko laminie

Powiązane artykuły