Wydajna i wysokowydajna metoda izolacji podzbiorów komórek dendrytycznych myszy

Komórki dendrytyczne (DC) zostały odkryte prawie czterdzieści lat temu jako "duża komórka gwiaździsta (grecki dendron)" znajdująca się w narządach limfoidalnych¹. Wiele badań wykazało, że DC są jedynymi komórkami prezentującymi antygen, które mogą skutecznie stymulować naiwne limfocyty T². Główną funkcją tych komórek jest wychwyt i prezentacja antygenów oraz ich efektywne przetwarzanie i ładowanie ich na cząsteczki prezentujące antygen. W śledzionie myszy DC można podzielić na podzbiory plazmocytoidalne i konwencjonalne. Plazmocytoidy DC charakteryzują się niską ekspresją CD11c i wysokimi poziomami B220 i Gr-1. Są one również dodatnie dla markera powierzchniowego mPDCA1 i wydzielają interferon typu I w odpowiedzi na ligandy receptora toll like 9 (TLR9). Konwencjonalne prądy stałe są wysokie dla ekspresji CD11c i MHC klasy II. Można je podzielić na trzy odrębne podzbiory w oparciu o powierzchniową ekspresję markerów fenotypowych, takich jak CD4, CD8α, DEC205, CD11b i białka receptora hamującego komórki dendrytyczne 2 (DCIR2, rozpoznawane przez przeciwciało 33D1) ^3,4. CD8α^Pos DC są również znane jako cDC1, są dodatnie dla DEC205, ale ujemne dla markerów szpikowych, takich jak CD11b i 33D1. CD8α^Neg DC, zwane również cDC2, są dodatnie dla 33D1, CD11b i CD4, ale nie mają DEC205. Podzbiór podwójnie ujemny (tj. ujemny zarówno dla CD4, jak i CD8α) jest stosunkowo rzadki i jest ujemny dla DEC205 i 33D1. Jest to najmniej scharakteryzowany podzbiór i może być mniej zróżnicowaną formą CD8α^Neg DC.

Różnice fenotypowe w różnych podzbiorach DC rozciągają się również na ich funkcje in vivo. CD8α^Neg DC są silnie fagocytarne i uważa się, że prezentują antygen egzogenny głównie za pośrednictwem komórek T MHC klasy II do CD4 ³. W przeciwieństwie do tego, CD8α^Pos DC są wyspecjalizowane w prezentacji rozpuszczalnego antygenu białkowego na MHC klasy I w mechanizmie zwanym prezentacją krzyżową. Wynik prezentacji krzyżowej zależy od statusu aktywacji tych DC⁵ i może prowadzić do ekspansji cytotoksycznych limfocytów T (CTL) lub rozwoju limfocytów T regulatorowych ^62,7. Kierowanie antygenu do CD8α^Pos DC za pomocą dostarczania za pośrednictwem przeciwciał anty-DEC205 powoduje w dużej mierze delecję limfocytów T⁸, podczas gdy prezentacja antygenów pochodzących z zakażonych komórek apoptotycznych indukuje silną odpowiedź CTL ⁹.

Oprócz rozpoznawania antygenów peptydowych, układ odpornościowy ssaków ewoluował w kierunku rozpoznawania antygenów lipidowych i glikolipidowych. Antygeny te są prezentowane przez cząsteczki CD1, które są białkami powierzchniowymi komórek podobnymi do MHC klasy I, które występują w wielu pokrewnych formach u różnych ssaków. U myszy pojedynczy typ wysoce konserwatywnej cząsteczki CD1 o nazwie CD1d jest odpowiedzialny za prezentację antygenów glikolipidowych ¹⁰. Główna populacja limfocytów T, które rozpoznają kompleksy CD1d / glikolipidowe, nazywana jest niezmiennymi komórkami NKT (komórki iNKT). Komórki te wyrażają półniezmienny receptor limfocytów T (TCR) składający się z niezmiennego łańcucha TCRα, który jest sparowany z łańcuchami TCRβ, które mają ograniczoną różnorodność ¹¹. W przeciwieństwie do konwencjonalnych limfocytów T, które muszą się namnażać i różnicować, aby stać się aktywowanymi efektorowymi limfocytami T, komórki iNKT istnieją jako populacja efektorowa i zaczynają szybko reagować po podaniu glikolipidów ¹². Identyfikacja fizjologicznie istotnych komórek prezentujących antygen lipidowy jest aktywnym obszarem badań i zasugerowano, że kilka różnych typów komórek, takich jak limfocyty B, makrofagi i DC, pełni tę funkcję. Wykazano jednak, że podzbiór CD8α^Pos DC jest główną komórką pośredniczącą w wychwytywaniu i prezentacji antygenów lipidowych mysim komórkom iNKT ¹³ oraz mieszanemu primingowi glikolipidów limfocytów T CD8 ¹⁴.

Aby porównać skuteczność prezentacji antygenu przez różne komórki prezentujące antygen, prostym podejściem jest przeniesienie różnych typów oczyszczonych APC pulsujących równoważnymi ilościami antygenu do naiwnych gospodarzy. Eksperymenty z transferem komórek tego typu są często wykonywane w badaniach immunologicznych. Jednak przeprowadzenie badań transferu z DC traktowanymi antygenem ex vivo jest trudne, ponieważ komórki te występują jako rzadkie populacje w narządach limfatycznych, gdzie stanowią mniej niż 2% wszystkich komórek¹⁵. W związku z tym konieczne jest przyspieszenie rozwoju tych komórek u zwierząt dawców w celu zwiększenia skuteczności protokołów izolacji.

Wiadomo, że wspólne komórki progenitorowe limfoidalne i szpikowe, które są niezbędne do generowania podzbiorów pDC, CD8^Pos i CD8^Neg DC, wykazują ekspresję receptorowej kinazy tyrozynowej 3 (Flt-3) związanej z fms. Po podaniu in vivo ligandu Flt-3 (Flt-3L) emigracja komórek progenitorowych wykazujących ekspresję Flt-3 ze szpiku kostnego jest zwiększona, co skutkuje zwiększonym wysiewem obwodowych narządów limfatycznych i ekspansją ich dojrzałego potomstwa DC¹⁶. Ekspresja Flt-3 jest tracona podczas angażowania się w szlaki różnicowania komórek B, T lub NK. Dlatego po podaniu Flt-3L obserwuje się tylko minimalne zmiany w tych komórkach. Podobną ekspansję w populacjach DC obserwuje się u myszy z guzami powstałymi w wyniku implantacji linii komórkowej B16-czerniaka wydzielającej mysi Flt-3L, co zapewnia prostą i ekonomiczną metodę zapewnienia trwałego ogólnoustrojowego poziomu Flt-3L^17,18. Stosując to podejście, opracowaliśmy protokół oparty na implantacji komórek czerniaka B16 wydzielających Flt-3L w celu stymulowania ekspansji wszystkich normalnych podzbiorów DC w śledzionie myszy, zwiększając w ten sposób wydajność tych komórek, które można wyizolować do kolejnych eksperymentów. Konsekwentnie stwierdzamy, że w ciągu 10 - 14 dni po podskórnym wszczepieniu guza wydzielającego Flt-3 u myszy rozwija się splenomegalia z wyraźnym wzbogaceniem DC do 40-60% wszystkich komórek śledziony. Z tych śledzion, różne podzbiory DC można wyizolować z wysoką czystością przy użyciu standardowych dostępnych na rynku zestawów do oczyszczania komórek, które wykorzystują markery fenotypowe specyficzne dla podzbioru.

Eksperymenty na zwierzętach są przeprowadzane zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi instytucjonalnego komitetu ds. opieki nad zwierzętami i użytkowania (IACUC). Wszystkie zabiegi wymagające sterylności wykonywane są w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

1. Implantacja czerniaka B16.Flt3L u myszy

1. Hodowla linii komórkowej czerniaka B16 z ekspresją Flt-3 w kolbach hodowli tkankowej T25 o gęstości 0,5 x 10⁶ komórek/ml w kompletnym pożywce DMEM z 10% CO₂ w temperaturze 37 °C. Rosnąć, aż komórki osiągną ~90% konfluencji (~20 godzin).
2. Zbierz komórki przez trawienie trypsyny. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych i przemyć przylegające komórki PBS. Dodać 5 ml 0,05% trypsyny i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Dodać zimne 20 ml kompletnej pożywki DMEM (4 °C) zawierającej płodową surowicę cielęcą (FCS) w celu wygaszenia trawienia proteazy. Wyjmij komórki, lekko stukając, a następnie delikatnie pipetując w górę i w dół.
3. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika żywotności komórek. Zawiesić do gęstości 10-8 komórek/ml w PBS.
4. Implanty myszy (C57BL / 6 lub inny szczep zgodny tkankowo) z komórkami nowotworowymi przez wstrzyknięcie podskórne, jak opisano przez Machholza i wsp.¹⁹ u podstawy szyjki ze 100 μl zawiesiny komórek (10,⁷ komórek).
5. Pozwól guzowi rosnąć, aż stanie się wyczuwalny lub widoczny (średnica 2 - 10 mm, zwykle 7 - 12 dni) przed złożeniem zwierząt w ofierze do pobrania narządów.

2. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej śledziony od myszy z nowotworem

1. Znieczulij myszy przedawkowaniem izofluranu (dostosuj szybkość przepływu izofluranu do >5% i kontynuuj ekspozycję co najmniej 2 minuty po ustaniu oddychania). Złożyć w ofierze mysz z guzem czerniaka Flt-3 przez zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi eutanazji.
2. Zdezynfekuj skórę 70% etanolem i zbierz śledzionę w sposób aseptyczny za pomocą sterylnych nożyczek ²⁰.
3. Umieścić śledzionę na sterylnej szalce Petriego w celu przetransportowania do komory bezpieczeństwa biologicznego. Od tego momentu wykonuj wszystkie kroki w sterylnych warunkach.
4. Przenieś śledzionę na świeżą szalkę Petriego i umyj pożywką RPMI. Śledzionę pokroić na małe (~0,2^cm2) kawałki za pomocą skalpela. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C z 10 ml roztworu kolagenazy/DNazy.
5. Wlać częściowo strawioną zawiesinę tkanki śledziony na sitko do komórek o wielkości 70 μm. Pozostałe fragmenty tkanek należy wycisnąć przez siatkę sitka za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 5 ml.
6. Umyj filtr siatkowy 10 ml świeżego podłoża i wyrzuć filtr. Odwirować zawiesinę o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek.
7. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml buforu do lizy RBC. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Ugasić bufor do lizy RBC, dodając 10 ml kompletnej pożywki RPMI.
8. Osadzać komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić w odpowiedniej objętości do uzyskania gęstości komórek 10-8 komórek/ml w buforze do sortowania komórek (np. MACS) zawierającym 20 μg/ml przeciwciała blokowego Fc (2,4G2).

3. Oczyszczanie plazmocytoidów DC, CD8α^Pos DC i CD8α^Neg DC z zawiesiny pojedynczej komórki śledziony

Uwaga: Izolacja podzbiorów DC śledziony od zawiesiny pojedynczej komórki jest procedurą wieloetapową, jak pokazano na rysunku 1. Wykonać wszystkie czynności, używając wstępnie schłodzonego buforu i lodowatej łaźni wodnej w celu utrzymania temperatury na poziomie 4-8 °C. Wszystkie objętości odczynników w następnej sekcji protokołu oblicza się dla początkowego wprowadzenia 200 μl zawiesiny komórek śledziony przy 10-8 komórkach/ml). Można to skalować w górę lub w dół w zależności od potrzeb, zmieniając objętość zawiesiny komórek (zawsze o gęstości 1 X 10^{8 komórek}/ml) i innych odczynników proporcjonalnie w początkowym etapie (3.1.1 i 3.2.1). Dostosuj odpowiednio objętości odczynnika we wszystkich późniejszych krokach. Na przykład, jeśli zaczynasz od 100 μl zawiesiny komórek śledziony o sile 1 x 10⁸/ml, użyj połowy podanych objętości odczynnika we wszystkich krokach.

1. Izolacja plazmocytoidalnych DC (pDC)
   1. Dodać 300 μl koktajlu przeciwciał znakowanych biotyną dostarczonego w zestawie do izolacji plazmocytoidu DC do 200 μl zawiesiny komórek śledziony.
   2. Dokładnie wymieszaj i inkubuj w lodowatej kąpieli wodnej przez 15 minut. Stukaj w probówkę co 3 minuty, aby utrzymać komórki w zawieszeniu i zmaksymalizować wiązanie przeciwciał.
   3. Dodać 12 ml buforu do sortowania komórek i osadzać komórki przez odwirowanie w stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał biotynylowanych.
   4. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl buforu do sortowania komórek. Dodać 300 μl kulek sprzężonych z przeciwciałami antybiotyny. Powtórz kroki 3.1.2 i 3.1.3.
   5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 2 ml buforu do sortowania komórek. Wykonaj wszystkie czynności od tego momentu w temperaturze pokojowej, korzystając z wstępnie schłodzonych.
   6. Umieść świeżą kolumnę LS do sortowania komórek aktywowanych magnetycznie w stojaku magnetycznym. Przemyć i wyrównać kolumnę 5 ml buforu do sortowania komórek.
   7. Odpipetować zawiesinę komórek na kolumnę, delikatnie nakładając ją na środek powierzchni łoża kolumny. Zbierz przepływ.
   8. Przemyć kolumnę 10 ml buforu do sortowania komórek. Zebrać ten przepływ i połączyć go z przepływem z kroku 3.1.7. PDC są wzbogacone w tym przepływie kolumnowym (FT1).
   9. Osadzać komórki z FT1 przez odwirowywanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, ponownie zawiesić w 2 ml buforu do sortowania komórek i przepuścić komórki przez świeżą kolumnę LS, powtarzając czynności 3.1.6-3.1.8. To zastosowanie dwóch sekwencyjnych kolumn zapewnia zwiększoną czystość izolowanych komórek.
   10. Komórki osadu należy rozdmuchiwać przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić przy użyciu 2 ml pełnej prędkości obrotowej. Ułóż na lodzie, aż będzie potrzebny.
2. Izolacja CD8α^Pos i CD8α^Neg DCs
   Uwaga: Pierwszym krokiem w tej procedurze jest wyczerpanie komórek B, pDC, T i NK.
   1. Zaczynając od całej zawiesiny komórek śledziony (1 ml z 10⁸ komórek/ml uzyskanych w kroku 2.8), dodaj 100 μl koktajlu przeciwciał sprzężonych z biotyną dostarczonego w zestawie do izolacji CD8α^Pos DC.
   2. Dobrze wymieszaj i inkubuj w lodowatej kąpieli wodnej przez 15 minut. Delikatnie postukaj w probówkę co 3 minuty, aby zmaksymalizować wiązanie przeciwciał znakowanych biotyną z ich komórkami docelowymi.
   3. Dodać 12 ml buforu do sortowania komórek i osadzać komórki przez odwirowanie w stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał biotynylowanych.
   4. Dodać 150 μl buforu do sortowania komórek i 100 μl kulek antybiotyny znajdujących się w zestawie izolacyjnym CD8α^Pos DC. Dobrze wymieszaj i inkubuj w lodowatej kąpieli wodnej przez 15 minut.
   5. Dodać 10 ml buforu do sortowania komórek i granulować komórki przez odwirowanie w stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   6. Zawiesić komórki w 1 ml buforze do sortowania komórek i przepuścić przez nową kolumnę LS zgodnie z procedurą opisaną w krokach 3.1.6–3.1.8.
   7. Zbierz nieoznaczony przepływ przez 2 (FT2) i odrzuć retentat kolumny. Ta nieznakowana frakcja jest wzbogacona o CD8α^Pos i CD8α^Neg DCs.
   8. Osadzać komórki w FT2 przez odwirowywanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   9. Ponownie zawieś komórki w 1 ml buforze do sortowania komórek i dodaj 200 μl sprzężonych kulek magnetycznych anty-CD8α dostarczonych w zestawie izolacyjnym CD8α^Pos DC.
   10. Powtórz kroki od 3.2.2 do 3.2.6. Przepływ przez kolumnę jest wzbogacony o CD8α^Neg DC i zubożony o CD8α^Pos DC. Jest to oznaczone jako przepływ przez 3 (FT3).
   11. Aby wymyć CD8α^Pos DC zatrzymane w kolumnie, wyjmij kolumnę z magnesu, dodaj 5 ml buforu do sortowania komórek i przedmuchnij matrycę kolumny za pomocą tłoka dostarczonego z kolumną LS.
   12. Granulować komórki przez odwirowanie w stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml buforu do sortowania komórek. Aby zwiększyć czystość, wymywane komórki należy ponownie przepuścić przez nową kolumnę LS, powtarzając kroki 3.1.6 do 3.1.8, z wyjątkiem odrzucenia przepływu i zebrania zatrzymanych komórek, jak w ppkt 3.2.11.
   13. Aby oczyścić CD8α^Neg DC z zawiesiny FT3, należy zagnieździć FT3 przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić w 300 μl buforu do sortowania komórek.
   14. Dodaj 100 μl kulek magnetycznych anty-CD11c. Dobrze wymieszaj i inkubuj w lodowatej kąpieli wodnej przez 15 minut.
   15. Dodać 10 ml buforu do sortowania komórek i komórek osadu przez odwirowanie w stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   16. Powtórz kroki od 3.1.5 do 3.1.8. Prądy stałe CD8α^Neg są pozytywnie wybierane za pomocą koralików CD11c i są związane z kolumną. Przepływ można odrzucić.
   17. Eluować komórki zatrzymane w kolumnie, jak opisano w kroku 3.2.11, aby zebrać oczyszczone CD8α^Neg DCs.

4. Pulsujące APC z antygenami i transferem komórek

1. Policz żywe komórki po oczyszczeniu, używając wykluczenia błękitu trypanowego ²¹ w celu odróżnienia żywych i martwych komórek.
2. Inkubuj komórki z wybranym antygenem. Stosować analogi antygenu glikolipidowego zwanego ceramidem alfa-galaktozylu (αGalCer) w stężeniu 100 nM¹³. Zazwyczaj płytka 10⁶ żywotnych komórek / studzienki w kompletnym podłożu RPMI przy użyciu 96-dołkowych płytek o bardzo niskim przyleganiu U-bottom, aby zminimalizować przyłączenie komórek. Inkubować komórki w atmosferze 5% CO₂ w temperaturze 37 °C przez 1–4 godziny.
3. Pobrać komórki, kilkakrotnie delikatnie pipetując. Używaj końcówek do pipet o szerokim otworze, aby zminimalizować uszkodzenia komórek spowodowane siłami ścinającymi. Umyj studzienki PBS i połącz te płuczki, aby zmaksymalizować zbieranie komórek.
4. Granulować komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić do żądanej gęstości w PBS. Zazwyczaj wstrzykuje się 1 milion komórek w 200 μl na zwierzę biorcy. Utrzymuj komórki na lodzie, aby zmaksymalizować żywotność przed podaniem zwierzętom gospodarzom.
5. Wstrzyknij komórki dożylnie myszom przez boczny ogon lub splot żylny zadoczodołowy ¹⁹. Użyć igły 27 G na strzykawce o pojemności 1 ml i wstrzyknąć maksymalną objętość 0,1 ml na mysz.

Wynik tej procedury opiera się na ekspansji podzbiorów DC przez mysi Flt-3L wyrażany przez wszczepione komórki czerniaka. Guz B16.Flt3L pochodzi od myszy C57BL/6 i powinien być wszczepiany zwierzętom z tym tłem szczepu, aby uniknąć niepowodzenia rozwoju guza z powodu odrzucenia. W niektórych przypadkach może być pożądane wykorzystanie genetycznie zmodyfikowanych myszy do uzyskania DC ze znanymi defektami w szlakach sygnałowych lub receptorach będących przedmiotem zainteresowania. Ważne jest, aby pamiętać, że guz może rozwijać się z różną kinetyką u takich zwierząt, dlatego ważne jest, aby monitorować wzrost guza na podstawie wyglądu i badania palpacyjnego w miejscu inokulacji. Z naszego doświadczenia wynika, że gdy guz jest wyczuwalny palpacyjnie, myszy z guzem B16.Flt3L konsekwentnie wykazują wyraźny wzrost komórkowości śledziony, który koreluje z ekspansją wszystkich podzbiorów DC (ryc. 2A). Zwykle obserwujemy 2- do 3-krotny wzrost całkowitej liczby splenocytów uzyskanych od myszy z czerniakiem B16.Flt3L w porównaniu ze zwierzętami wcześniejszymi. Wzrost liczby komórek DC częściowo przyczynia się do pozornego zmniejszenia częstości występowania komórek B, podczas gdy zmiana bezwzględnej liczby komórek B jest niewielka lub żadna. Co ciekawe, podczas gdy dużą ekspansję (~15- do 20-krotny wzrost liczb bezwzględnych) obserwuje się dla konwencjonalnych DC u tych myszy, obserwuje się tylko niewielki wzrost (około 4-krotny) w podzbiorze plazmocytoidalnego DC.

Strategia bramkowania do identyfikacji różnych podzbiorów DC jest pokazana na rysunku 2A i opiera się na wyrażeniu B220, CD11b, CD11c i CD8α jako markerów fenotypowych specyficznych dla podzbioru (Rysunek 2B). Zbadaliśmy również ekspresję DEC205, CD11b i mPDCA1 w tych podzbiorach, jak pokazano na rysunku 2B. Pokazuje to oczekiwany wzorzec, z mPDCA tylko na podzbiorze pDC, podczas gdy DEC205 jest wysoce wyrażony na CD8αPos DC, a CD11b jest wykrywany najbardziej widocznie na CD8αNeg DC. Przeanalizowaliśmy również zmiany częstości komórek dla każdego z podzbiorów oczyszczonych na każdym etapie opisanego tutaj protokołu (podsumowane na rysunku 2C, ze szczegółowymi przykładami danych cytometrii przepływowej na rysunku 3). Izolacja podzbiorów DC śledziony opisana w tej metodzie jest procedurą wieloetapową (ryc. 1). Oczyszczanie plazmocytoidów DC opiera się na selekcji negatywnej w celu wzbogacenia tych komórek po wyczerpaniu wszystkich niepożądanych populacji, takich jak komórki B, T, NK i konwencjonalne DC. Oczyszczanie CD8αPos DC i CD8αNeg DC odbywa się przez pozytywną selekcję tych komórek po wyczerpaniu komórek T, B i NK. Wysoka czystość każdego z podzbiorów prądu stałego uzyskana przy użyciu tej procedury (zwykle ~95%) jest również zilustrowana na rysunku 3.

W zależności od eksperymentów, które mają być przeprowadzone, komórki te mogą być pulsowane pożądanym antygenem i przenoszone do histokompatybilnych mysich gospodarzy w celu badań immunologicznych. Ponadto komórki te mogą być również wykorzystywane do badań in vivo stymulujących lub regulacyjnych aktywności fizjologicznych podzbiorów DC. Wydajność komórek dla oczyszczonych podzbiorów DC na 2 x 107 całkowitych splenocytów wynosi około miliona pDC, 2 miliony CD8αPos DC i 4 miliony CD8αNeg DC.

Rysunek 1. Izolacja DC. Schemat ilustrujący różne kroki protokołu izolacji różnych podzbiorów DC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Analiza podzbiorów DC śledziony u myszy z guzami B16.Flt3L. A) Przedstawiono strategię bramkowania w celu identyfikacji populacji komórek odpowiadających pDC (R1), CD8αPos DC (R5) i CD8αNeg DC (R6). B) Ekspresja mPDCA1, 33D1, DEC205 i CD11b na różnych podzbiorach. Komórki zawarte w bramce R4 (podzbiór limfocytów; ujemny dla B220, CD11c, CD11b) są wykorzystywane jako populacja kontrolna pozbawiona ekspresji tych markerów. C) Względne wzbogacenie podzbiorów DC i limfocytów wyizolowanych ze śledziony myszy w dniu 14 po inokulacji komórek czerniaka B16.Flt3L pokazano na lewym wykresie jako czarne paski, podczas gdy częstość występowania tych populacji komórek u myszy wcześniej zaznaczono jako białe paski. Na wykresie po prawej stronie są wyświetlane te same dane, co numery komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Analiza podzbiorów DC śledziony podczas protokołu wzbogacania. A) Wzbogacenie plazmocytoidowych DC (B220High i CD11cLow, R1) od 10% w wyjściowej populacji splenocytów od myszy z guzem B16.Flt3L do ~95% czystości w przepływie kolumnowym przez 1. Należy zauważyć, że komórki retentatu eluowane z tej kolumny są zubożone w tej populacji. B) Wzbogacenie konwencjonalnych DC (w CD11cHigh, mieszanina CD8α dodatniego i ujemnego) z ~ 33% w śledzionie myszy z czerniakiem B16.Flt3L w 10 dniu po implantacji guza do ~ 78% w przepływie przez frakcję 2. Na wykresach retentatu kolumnowego 2 populacje CD11c dodatnie wydają się być częściowo zubożone, co odpowiada usunięciu znacznej liczby DC podczas selekcji negatywnej w celu zubożenia komórek T, B i NK. Dalsze frakcjonowanie przepływu przez zawiesinę 2 przy użyciu pozytywnej selekcji pod kątem wiązania anty-CD8 daje >95% czystość CD8αPos DCs. Przepływ z tego został następnie poddany pozytywnej selekcji pod kątem wiązania anty-CD11c, dając populację >95% czystych CD8αNeg DCs. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.