Wydajna i wysokowydajna metoda izolacji podzbiorów komórek dendrytycznych myszy

Summary

Odrębne podzbiory komórek dendrytycznych istnieją jako rzadkie populacje w narządach limfoidalnych, dlatego są trudne do wyizolowania w wystarczającej liczbie i czystości do eksperymentów immunologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę o wysokiej skuteczności i wysokiej wydajności do izolacji wszystkich obecnie znanych głównych podzbiorów komórek dendrytycznych śledziony myszy.

Abstract

Komórki dendrytyczne (DC) to profesjonalne komórki prezentujące antygen, głównie odpowiedzialne za pozyskiwanie, przetwarzanie i prezentowanie antygenów na cząsteczkach prezentujących antygen w celu zainicjowania odporności za pośrednictwem limfocytów T. Komórki dendrytyczne można podzielić na kilka fenotypowo i funkcjonalnie heterogenicznych podzbiorów. Trzy ważne podzbiory komórek dendrytycznych śledziony to plazmocytoidy, komórki CD8α^Pos i CD8α^Neg. Plazmocytoidy DC są naturalnymi producentami interferonu typu I i są ważne dla odporności przeciwwirusowych komórek T. Podzbiór CD8α^Neg DC specjalizuje się w prezentacji antygenu MHC klasy II i jest centralnie zaangażowany w pobudzanie limfocytów T CD4. CD8α^Pos DC są przede wszystkim odpowiedzialne za krzyżową prezentację egzogennych antygenów i pobudzanie limfocytów T CD8. Wykazano, że CD8α^Pos DC są najbardziej skuteczne w prezentacji antygenów glikolipidowych przez cząsteczki CD1d wyspecjalizowanej populacji komórek T znanej jako niezmienne komórki T NK (iNKT). Podanie liganda Flt-3 zwiększa częstość migracji komórek progenitorowych komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego, co ostatecznie prowadzi do ekspansji komórek dendrytycznych w obwodowych narządach limfatycznych w modelach mysich. Dostosowaliśmy ten model do oczyszczania dużej liczby funkcjonalnych komórek dendrytycznych do wykorzystania w eksperymentach z transferem komórek w celu porównania biegłości in vivo różnych podzbiorów DC.

Introduction

Komórki dendrytyczne (DC) zostały odkryte prawie czterdzieści lat temu jako "duża komórka gwiaździsta (grecki dendron)" znajdująca się w narządach limfoidalnych¹. Wiele badań wykazało, że DC są jedynymi komórkami prezentującymi antygen, które mogą skutecznie stymulować naiwne limfocyty T². Główną funkcją tych komórek jest wychwyt i prezentacja antygenów oraz ich efektywne przetwarzanie i ładowanie ich na cząsteczki prezentujące antygen. W śledzionie myszy DC można podzielić na podzbiory plazmocytoidalne i konwencjonalne. Plazmocytoidy DC charakteryzują się niską ekspresją CD11c i wysokimi poziomami B220 i Gr-1. Są one również dodatnie dla markera powierzchniowego mPDCA1 i wydzielają interferon typu I w odpowiedzi na ligandy receptora toll like 9 (TLR9). Konwencjonalne prądy stałe są wysokie dla ekspresji CD11c i MHC klasy II. Można je podzielić na trzy odrębne podzbiory w oparciu o powierzchniową ekspresję markerów fenotypowych, takich jak CD4, CD8α, DEC205, CD11b i białka receptora hamującego komórki dendrytyczne 2 (DCIR2, rozpoznawane przez przeciwciało 33D1) ^3,4. CD8α^Pos DC są również znane jako cDC1, są dodatnie dla DEC205, ale ujemne dla markerów szpikowych, takich jak CD11b i 33D1. CD8α^Neg DC, zwane również cDC2, są dodatnie dla 33D1, CD11b i CD4, ale nie mają DEC205. Podzbiór podwójnie ujemny (tj. ujemny zarówno dla CD4, jak i CD8α) jest stosunkowo rzadki i jest ujemny dla DEC205 i 33D1. Jest to najmniej scharakteryzowany podzbiór i może być mniej zróżnicowaną formą CD8α^Neg DC.

Różnice fenotypowe w różnych podzbiorach DC rozciągają się również na ich funkcje in vivo. CD8α^Neg DC są silnie fagocytarne i uważa się, że prezentują antygen egzogenny głównie za pośrednictwem komórek T MHC klasy II do CD4 ³. W przeciwieństwie do tego, CD8α^Pos DC są wyspecjalizowane w prezentacji rozpuszczalnego antygenu białkowego na MHC klasy I w mechanizmie zwanym prezentacją krzyżową. Wynik prezentacji krzyżowej zależy od statusu aktywacji tych DC⁵ i może prowadzić do ekspansji cytotoksycznych limfocytów T (CTL) lub rozwoju limfocytów T regulatorowych ^62,7. Kierowanie antygenu do CD8α^Pos DC za pomocą dostarczania za pośrednictwem przeciwciał anty-DEC205 powoduje w dużej mierze delecję limfocytów T⁸, podczas gdy prezentacja antygenów pochodzących z zakażonych komórek apoptotycznych indukuje silną odpowiedź CTL ⁹.

Oprócz rozpoznawania antygenów peptydowych, układ odpornościowy ssaków ewoluował w kierunku rozpoznawania antygenów lipidowych i glikolipidowych. Antygeny te są prezentowane przez cząsteczki CD1, które są białkami powierzchniowymi komórek podobnymi do MHC klasy I, które występują w wielu pokrewnych formach u różnych ssaków. U myszy pojedynczy typ wysoce konserwatywnej cząsteczki CD1 o nazwie CD1d jest odpowiedzialny za prezentację antygenów glikolipidowych ¹⁰. Główna populacja limfocytów T, które rozpoznają kompleksy CD1d / glikolipidowe, nazywana jest niezmiennymi komórkami NKT (komórki iNKT). Komórki te wyrażają półniezmienny receptor limfocytów T (TCR) składający się z niezmiennego łańcucha TCRα, który jest sparowany z łańcuchami TCRβ, które mają ograniczoną różnorodność ¹¹. W przeciwieństwie do konwencjonalnych limfocytów T, które muszą się namnażać i różnicować, aby stać się aktywowanymi efektorowymi limfocytami T, komórki iNKT istnieją jako populacja efektorowa i zaczynają szybko reagować po podaniu glikolipidów ¹². Identyfikacja fizjologicznie istotnych komórek prezentujących antygen lipidowy jest aktywnym obszarem badań i zasugerowano, że kilka różnych typów komórek, takich jak limfocyty B, makrofagi i DC, pełni tę funkcję. Wykazano jednak, że podzbiór CD8α^Pos DC jest główną komórką pośredniczącą w wychwytywaniu i prezentacji antygenów lipidowych mysim komórkom iNKT ¹³ oraz mieszanemu primingowi glikolipidów limfocytów T CD8 ¹⁴.

Aby porównać skuteczność prezentacji antygenu przez różne komórki prezentujące antygen, prostym podejściem jest przeniesienie różnych typów oczyszczonych APC pulsujących równoważnymi ilościami antygenu do naiwnych gospodarzy. Eksperymenty z transferem komórek tego typu są często wykonywane w badaniach immunologicznych. Jednak przeprowadzenie badań transferu z DC traktowanymi antygenem ex vivo jest trudne, ponieważ komórki te występują jako rzadkie populacje w narządach limfatycznych, gdzie stanowią mniej niż 2% wszystkich komórek¹⁵. W związku z tym konieczne jest przyspieszenie rozwoju tych komórek u zwierząt dawców w celu zwiększenia skuteczności protokołów izolacji.

Wiadomo, że wspólne komórki progenitorowe limfoidalne i szpikowe, które są niezbędne do generowania podzbiorów pDC, CD8^Pos i CD8^Neg DC, wykazują ekspresję receptorowej kinazy tyrozynowej 3 (Flt-3) związanej z fms. Po podaniu in vivo ligandu Flt-3 (Flt-3L) emigracja komórek progenitorowych wykazujących ekspresję Flt-3 ze szpiku kostnego jest zwiększona, co skutkuje zwiększonym wysiewem obwodowych narządów limfatycznych i ekspansją ich dojrzałego potomstwa DC¹⁶. Ekspresja Flt-3 jest tracona podczas angażowania się w szlaki różnicowania komórek B, T lub NK. Dlatego po podaniu Flt-3L obserwuje się tylko minimalne zmiany w tych komórkach. Podobną ekspansję w populacjach DC obserwuje się u myszy z guzami powstałymi w wyniku implantacji linii komórkowej B16-czerniaka wydzielającej mysi Flt-3L, co zapewnia prostą i ekonomiczną metodę zapewnienia trwałego ogólnoustrojowego poziomu Flt-3L^17,18. Stosując to podejście, opracowaliśmy protokół oparty na implantacji komórek czerniaka B16 wydzielających Flt-3L w celu stymulowania ekspansji wszystkich normalnych podzbiorów DC w śledzionie myszy, zwiększając w ten sposób wydajność tych komórek, które można wyizolować do kolejnych eksperymentów. Konsekwentnie stwierdzamy, że w ciągu 10 - 14 dni po podskórnym wszczepieniu guza wydzielającego Flt-3 u myszy rozwija się splenomegalia z wyraźnym wzbogaceniem DC do 40-60% wszystkich komórek śledziony. Z tych śledzion, różne podzbiory DC można wyizolować z wysoką czystością przy użyciu standardowych dostępnych na rynku zestawów do oczyszczania komórek, które wykorzystują markery fenotypowe specyficzne dla podzbioru.

Protocol

Eksperymenty na zwierzętach są przeprowadzane zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi instytucjonalnego komitetu ds. opieki nad zwierzętami i użytkowania (IACUC). Wszystkie zabiegi wymagające sterylności wykonywane są w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

1. Implantacja czerniaka B16.Flt3L u myszy

1. Hodowla linii komórkowej czerniaka B16 z ekspresją Flt-3 w kolbach hodowli tkankowej T25 o gęstości 0,5 x 10⁶ komórek/ml w kompletnym pożywce DMEM z 10% CO₂ w temperaturze 37 °C. Rosnąć, aż komórki osiągną ~90% konfluencji (~20 godzin).
2. Zbierz komórki przez trawienie trypsyny. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych i przemyć przylegające komórki PBS. Dodać 5 ml 0,05% trypsyny i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Dodać zimne 20 ml kompletnej pożywki DMEM (4 °C) zawierającej płodową surowicę cielęcą (FCS) w celu wygaszenia trawienia proteazy. Wyjmij komórki, lekko stukając, a następnie delikatnie pipetując w górę i w dół.
3. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika żywotności komórek. Zawiesić do gęstości 10-8 komórek/ml w PBS.
4. Implanty myszy (C57BL / 6 lub inny szczep zgodny tkankowo) z komórkami nowotworowymi przez wstrzyknięcie podskórne, jak opisano przez Machholza i wsp.¹⁹ u podstawy szyjki ze 100 μl zawiesiny komórek (10,⁷ komórek).
5. Pozwól guzowi rosnąć, aż stanie się wyczuwalny lub widoczny (średnica 2 - 10 mm, zwykle 7 - 12 dni) przed złożeniem zwierząt w ofierze do pobrania narządów.

2. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej śledziony od myszy z nowotworem

1. Znieczulij myszy przedawkowaniem izofluranu (dostosuj szybkość przepływu izofluranu do >5% i kontynuuj ekspozycję co najmniej 2 minuty po ustaniu oddychania). Złożyć w ofierze mysz z guzem czerniaka Flt-3 przez zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi eutanazji.
2. Zdezynfekuj skórę 70% etanolem i zbierz śledzionę w sposób aseptyczny za pomocą sterylnych nożyczek ²⁰.
3. Umieścić śledzionę na sterylnej szalce Petriego w celu przetransportowania do komory bezpieczeństwa biologicznego. Od tego momentu wykonuj wszystkie kroki w sterylnych warunkach.
4. Przenieś śledzionę na świeżą szalkę Petriego i umyj pożywką RPMI. Śledzionę pokroić na małe (~0,2^cm2) kawałki za pomocą skalpela. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C z 10 ml roztworu kolagenazy/DNazy.
5. Wlać częściowo strawioną zawiesinę tkanki śledziony na sitko do komórek o wielkości 70 μm. Pozostałe fragmenty tkanek należy wycisnąć przez siatkę sitka za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 5 ml.
6. Umyj filtr siatkowy 10 ml świeżego podłoża i wyrzuć filtr. Odwirować zawiesinę o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek.
7. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml buforu do lizy RBC. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Ugasić bufor do lizy RBC, dodając 10 ml kompletnej pożywki RPMI.
8. Osadzać komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić w odpowiedniej objętości do uzyskania gęstości komórek 10-8 komórek/ml w buforze do sortowania komórek (np. MACS) zawierającym 20 μg/ml przeciwciała blokowego Fc (2,4G2).

3. Oczyszczanie plazmocytoidów DC, CD8α^Pos DC i CD8α^Neg DC z zawiesiny pojedynczej komórki śledziony

Uwaga: Izolacja podzbiorów DC śledziony od zawiesiny pojedynczej komórki jest procedurą wieloetapową, jak pokazano na rysunku 1. Wykonać wszystkie czynności, używając wstępnie schłodzonego buforu i lodowatej łaźni wodnej w celu utrzymania temperatury na poziomie 4-8 °C. Wszystkie objętości odczynników w następnej sekcji protokołu oblicza się dla początkowego wprowadzenia 200 μl zawiesiny komórek śledziony przy 10-8 komórkach/ml). Można to skalować w górę lub w dół w zależności od potrzeb, zmieniając objętość zawiesiny komórek (zawsze o gęstości 1 X 10^{8 komórek}/ml) i innych odczynników proporcjonalnie w początkowym etapie (3.1.1 i 3.2.1). Dostosuj odpowiednio objętości odczynnika we wszystkich późniejszych krokach. Na przykład, jeśli zaczynasz od 100 μl zawiesiny komórek śledziony o sile 1 x 10⁸/ml, użyj połowy podanych objętości odczynnika we wszystkich krokach.

1. Izolacja plazmocytoidalnych DC (pDC)
   1. Dodać 300 μl koktajlu przeciwciał znakowanych biotyną dostarczonego w zestawie do izolacji plazmocytoidu DC do 200 μl zawiesiny komórek śledziony.
   2. Dokładnie wymieszaj i inkubuj w lodowatej kąpieli wodnej przez 15 minut. Stukaj w probówkę co 3 minuty, aby utrzymać komórki w zawieszeniu i zmaksymalizować wiązanie przeciwciał.
   3. Dodać 12 ml buforu do sortowania komórek i osadzać komórki przez odwirowanie w stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał biotynylowanych.
   4. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl buforu do sortowania komórek. Dodać 300 μl kulek sprzężonych z przeciwciałami antybiotyny. Powtórz kroki 3.1.2 i 3.1.3.
   5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 2 ml buforu do sortowania komórek. Wykonaj wszystkie czynności od tego momentu w temperaturze pokojowej, korzystając z wstępnie schłodzonych.
   6. Umieść świeżą kolumnę LS do sortowania komórek aktywowanych magnetycznie w stojaku magnetycznym. Przemyć i wyrównać kolumnę 5 ml buforu do sortowania komórek.
   7. Odpipetować zawiesinę komórek na kolumnę, delikatnie nakładając ją na środek powierzchni łoża kolumny. Zbierz przepływ.
   8. Przemyć kolumnę 10 ml buforu do sortowania komórek. Zebrać ten przepływ i połączyć go z przepływem z kroku 3.1.7. PDC są wzbogacone w tym przepływie kolumnowym (FT1).
   9. Osadzać komórki z FT1 przez odwirowywanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, ponownie zawiesić w 2 ml buforu do sortowania komórek i przepuścić komórki przez świeżą kolumnę LS, powtarzając czynności 3.1.6-3.1.8. To zastosowanie dwóch sekwencyjnych kolumn zapewnia zwiększoną czystość izolowanych komórek.
   10. Komórki osadu należy rozdmuchiwać przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić przy użyciu 2 ml pełnej prędkości obrotowej. Ułóż na lodzie, aż będzie potrzebny.
2. Izolacja CD8α^Pos i CD8α^Neg DCs
   Uwaga: Pierwszym krokiem w tej procedurze jest wyczerpanie komórek B, pDC, T i NK.
   1. Zaczynając od całej zawiesiny komórek śledziony (1 ml z 10⁸ komórek/ml uzyskanych w kroku 2.8), dodaj 100 μl koktajlu przeciwciał sprzężonych z biotyną dostarczonego w zestawie do izolacji CD8α^Pos DC.
   2. Dobrze wymieszaj i inkubuj w lodowatej kąpieli wodnej przez 15 minut. Delikatnie postukaj w probówkę co 3 minuty, aby zmaksymalizować wiązanie przeciwciał znakowanych biotyną z ich komórkami docelowymi.
   3. Dodać 12 ml buforu do sortowania komórek i osadzać komórki przez odwirowanie w stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał biotynylowanych.
   4. Dodać 150 μl buforu do sortowania komórek i 100 μl kulek antybiotyny znajdujących się w zestawie izolacyjnym CD8α^Pos DC. Dobrze wymieszaj i inkubuj w lodowatej kąpieli wodnej przez 15 minut.
   5. Dodać 10 ml buforu do sortowania komórek i granulować komórki przez odwirowanie w stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   6. Zawiesić komórki w 1 ml buforze do sortowania komórek i przepuścić przez nową kolumnę LS zgodnie z procedurą opisaną w krokach 3.1.6–3.1.8.
   7. Zbierz nieoznaczony przepływ przez 2 (FT2) i odrzuć retentat kolumny. Ta nieznakowana frakcja jest wzbogacona o CD8α^Pos i CD8α^Neg DCs.
   8. Osadzać komórki w FT2 przez odwirowywanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   9. Ponownie zawieś komórki w 1 ml buforze do sortowania komórek i dodaj 200 μl sprzężonych kulek magnetycznych anty-CD8α dostarczonych w zestawie izolacyjnym CD8α^Pos DC.
   10. Powtórz kroki od 3.2.2 do 3.2.6. Przepływ przez kolumnę jest wzbogacony o CD8α^Neg DC i zubożony o CD8α^Pos DC. Jest to oznaczone jako przepływ przez 3 (FT3).
   11. Aby wymyć CD8α^Pos DC zatrzymane w kolumnie, wyjmij kolumnę z magnesu, dodaj 5 ml buforu do sortowania komórek i przedmuchnij matrycę kolumny za pomocą tłoka dostarczonego z kolumną LS.
   12. Granulować komórki przez odwirowanie w stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml buforu do sortowania komórek. Aby zwiększyć czystość, wymywane komórki należy ponownie przepuścić przez nową kolumnę LS, powtarzając kroki 3.1.6 do 3.1.8, z wyjątkiem odrzucenia przepływu i zebrania zatrzymanych komórek, jak w ppkt 3.2.11.
   13. Aby oczyścić CD8α^Neg DC z zawiesiny FT3, należy zagnieździć FT3 przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić w 300 μl buforu do sortowania komórek.
   14. Dodaj 100 μl kulek magnetycznych anty-CD11c. Dobrze wymieszaj i inkubuj w lodowatej kąpieli wodnej przez 15 minut.
   15. Dodać 10 ml buforu do sortowania komórek i komórek osadu przez odwirowanie w stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   16. Powtórz kroki od 3.1.5 do 3.1.8. Prądy stałe CD8α^Neg są pozytywnie wybierane za pomocą koralików CD11c i są związane z kolumną. Przepływ można odrzucić.
   17. Eluować komórki zatrzymane w kolumnie, jak opisano w kroku 3.2.11, aby zebrać oczyszczone CD8α^Neg DCs.

4. Pulsujące APC z antygenami i transferem komórek

1. Policz żywe komórki po oczyszczeniu, używając wykluczenia błękitu trypanowego ²¹ w celu odróżnienia żywych i martwych komórek.
2. Inkubuj komórki z wybranym antygenem. Stosować analogi antygenu glikolipidowego zwanego ceramidem alfa-galaktozylu (αGalCer) w stężeniu 100 nM¹³. Zazwyczaj płytka 10⁶ żywotnych komórek / studzienki w kompletnym podłożu RPMI przy użyciu 96-dołkowych płytek o bardzo niskim przyleganiu U-bottom, aby zminimalizować przyłączenie komórek. Inkubować komórki w atmosferze 5% CO₂ w temperaturze 37 °C przez 1–4 godziny.
3. Pobrać komórki, kilkakrotnie delikatnie pipetując. Używaj końcówek do pipet o szerokim otworze, aby zminimalizować uszkodzenia komórek spowodowane siłami ścinającymi. Umyj studzienki PBS i połącz te płuczki, aby zmaksymalizować zbieranie komórek.
4. Granulować komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić do żądanej gęstości w PBS. Zazwyczaj wstrzykuje się 1 milion komórek w 200 μl na zwierzę biorcy. Utrzymuj komórki na lodzie, aby zmaksymalizować żywotność przed podaniem zwierzętom gospodarzom.
5. Wstrzyknij komórki dożylnie myszom przez boczny ogon lub splot żylny zadoczodołowy ¹⁹. Użyć igły 27 G na strzykawce o pojemności 1 ml i wstrzyknąć maksymalną objętość 0,1 ml na mysz.

Results

Wynik tej procedury opiera się na ekspansji podzbiorów DC przez mysi Flt-3L wyrażany przez wszczepione komórki czerniaka. Guz B16.Flt3L pochodzi od myszy C57BL/6 i powinien być wszczepiany zwierzętom z tym tłem szczepu, aby uniknąć niepowodzenia rozwoju guza z powodu odrzucenia. W niektórych przypadkach może być pożądane wykorzystanie genetycznie zmodyfikowanych myszy do uzyskania DC ze znanymi defektami w szlakach sygnałowych lub receptorach będących przedmiotem zainteresowania. Ważne je...

Discussion

Przyjmuje się, że komórki dendrytyczne są głównymi profesjonalnymi komórkami prezentującymi antygen zaangażowanymi w pobudzanie odpowiedzi limfocytów T. Ich główną funkcją jest badanie mikrośrodowiska tkanek poprzez pobieranie i przetwarzanie antygenów w celu prezentacji limfocytom T. Aby zbadać funkcję określonych podzbiorów DC, należy je wyizolować w wystarczającej liczbie przy użyciu podejścia, które zachowuje ich normalny fenotyp i funkcje. Większość protokołów opiera się na izolacji określonego podzbioru DC od naiwn...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,05% Trypsyna-EDTA	Life Technologies, Gibco	25300-054
Izofluran	Sigma-Aldrich	CDS019936-250MG
Kolagenaza D	Roche Diagnostics	11088858001
DNaza I (suchy proszek)	QIAGEN	79254
200 proof etanol	Thermo Fisher Scientific	9-6705-004-220	Służy do przygotowania 70% etanolowego
buforu do lizy RBC	Pożywka Sigma-Aldrich	R7757
RPMI-1640 z L-glutaminą	Life Technologies, Gibco	11875-119
Pożywka DMEM z L-glutaminą	Life Technologies, Gibco	11995-073
200 mM L-glutamina	Life Technologies	25030081
MEM aminokwasy endogenne	Life Technologies, Gibco	11140-050
Aminokwasy egzogenne MEM	Technologie życiowe	11130-051
β-merkaptoetanol	Life Technologies, Invitrogen	21985-023
Pirogronian sodu	Life Technologies	11360-070
HEPES	Life Technologies, Invitrogen	15630
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS Ca2+ i Mg2+ pH 7.2)	Life Technologies, Invitrogen	20012-050
Dulbecco' s PBS (DPBS z Ca2+ i Mg2+)	Life Technologies, Gibco	14040-182
0,5 M roztwór etylenodiaminotetraoctanu (EDTA)	Life Technologies	15575-020
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Surowica cielęca płodu	Atlanta Biologicals	S11050
Penicylina/streptomycyna	Life Technologies, Invitrogen	15140-163
Błękit trypanowy (suchy proszek)	Sigma-Aldrich	T6146-5G	Przygotuj 0,08% z PBS
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mysz	Miltenyi Biotech	130-092-786
Koraliki magnetyczne sprzężone z anty-mysim CD11c	Miltenyi Biotech	130-152-001
CD8&alfa; Pos zestaw izolacyjny DC myszy	Miltenyi Biotech	130-091-169
Przeciwciało blokujące receptor Fc-gamma (klon 2.4G2)	BD Biosciences	553141
Anty-mysie CD11c-FITC	BD Biosciences	553801
Anty-mysz CD8α-PerCP	BD Biosciences	553036
Anty-mysz B220-PE	BD Biosciences	553090
Strzykawki 1 ml	Igła BD	26048
23 G1	Szalki	305145
100 mm	Thermo Fisher Scientific	875712
Narzędzia chirurgiczne	Kent Scientific	INSMOUSEKIT
Sitko do komórek (70 &mikro; m)	BD	352350
Duże płytki Petriego	Thermo Fisher Scientific	FB0875712
System filtracji próżniowej (500 ml (0,22 &mikro; m))	Kolumny Corning	431097
LS	Miltenyi	130-042-401
Stojak magnetyczny Separator MACS	Miltenyi Biotec	130-042-302
Szeroki otwór 200 μ l Końcówki do pipet	PerkinElmer	111623
Corning 96-dołkowe płytki z ultra niskim nasadką	Corning	CLS3474-24EA
6-8 tygodniowa samica myszy C57BL/6	Jackson Research Laboratories, Jax
		Murine B16.Flt3L linia komórkowa czerniaka	opisana przez Mach et al., 2000
Serum free DMEM i RPMI media 500 ml DMEM z L-glutaminą lub 500 ml RPMI-1640 z L-glutaminą 5 ml MEM aminokwasy endogenne (100x, 10  mM) 5 ml buforu HEPES (1 M) 5 ml L-glutaminy (200  mM) 0,5 ml 2-merkaptoetanolu (5,5 x 10-2 M)			Wymieszaj wszystkie składniki w komorze bezpieczeństwa biologicznego z pożywką DMEM lub RPMI, w zależności od potrzeb. Filtr sterylizuje media, przechodząc przez 0,22 i mikro; m system filtracji próżniowej.
Complete RPMI i DMEM pożywki			50 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy cielęcej do surowicy wolnej od RPMI lub DMEM, aby uzyskać kompletną pożywkę.
MACS buffer			Dodać 2 ml 0,5 M EDTA i 10 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy cielęcej do 500 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, Ca2+ i Mg2+ Free, pH 7,2) i 2  &mikro; g/ml 2,4G2 (przeciwciało Fc-Block).
FACS bufor do barwienia			Rozpuścić azydek sodu do 0,05% (0,25 g na 500 ml) w buforze MACS, aby otrzymać bufor barwiący FACS
10x roztwór podstawowy kolagenazy D i DNazy 1 Rozpuścić 1 g kolagenazy D i 0,2 ml preparatu DNazy 1 (1 mg/ml, 100x) w 20 ml PBS zawierającego Ca2+ i Mg2+ do uzyskania roztworu o stężeniu około 1,000-2,000 jednostek aktywności kolagenazy na ml.			Ten 10-krotny roztwór podstawowy można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze -20 ° C przez kilka tygodni. Rozcieńczyć 1 ml tego roztworu w 9 ml wolnego RPMI w surowicy bezpośrednio przed użyciem.