Artykuł metodologiczny

Obrazowanie wideo i mapy czasoprzestrzenne do analizy motoryki przewodu pokarmowego u myszy

14.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53828

⸱

3 lutego 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, The University of Melbourne, 2Melbourne School of Engineering, The University of Melbourne, 3Department of Electrical and Electronic Engineering, The University of Melbourne

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje technikę obrazowania wideo i mapowanie czasoprzestrzenne o wysokiej rozdzielczości w celu identyfikacji zmian w neuronalnej regulacji ruchliwości okrężnicy u dorosłych myszy. Subtelny wpływ na czynność przewodu pokarmowego (GI) można wykryć przy użyciu tego podejścia w izolowanych preparatach tkankowych, aby pogłębić naszą wiedzę na temat chorób przewodu pokarmowego.

Streszczenie

Jelitowy układ nerwowy (ENS) odgrywa ważną rolę w regulacji motoryki przewodu pokarmowego (GI) i może funkcjonować niezależnie od ośrodkowego układu nerwowego. Zmiany w funkcji ENS są główną przyczyną objawów i chorób przewodu pokarmowego i mogą przyczyniać się do objawów żołądkowo-jelitowych zgłaszanych w zaburzeniach neuropsychiatrycznych, w tym autyzmie. Powszechnie wiadomo, że izolowane segmenty okrężnicy generują spontaniczne, rytmiczne skurcze znane jako migrujące kompleksy motoryczne okrężnicy (CMMC). Opisano procedurę analizy regulacji neuronalnej jelit CMMC w preparatach ex vivo okrężnicy myszy. Okrężnica jest wycinana ze zwierzęcia i przepłukiwana w celu usunięcia zawartości kału przed kaniulacją w kąpieli narządowej. Dane są pozyskiwane za pomocą kamery wideo umieszczonej nad łaźnią organową i przekształcane w mapy czasoprzestrzenne o wysokiej rozdzielczości za pomocą wewnętrznego pakietu oprogramowania. Korzystając z tej techniki, można porównać wyjściowe wzorce skurczu i wpływ farmakologiczny na funkcję ENS w segmentach okrężnicy w ciągu 3-4 godzin. Ponadto można rejestrować długość i prędkość propagacji CMMC, a także zmiany średnicy jelita i częstotliwości skurczu. Technika ta jest przydatna do charakteryzowania wzorców motoryki przewodu pokarmowego w transgenicznych modelach myszy (i u innych gatunków, w tym szczurów i świnek morskich). W ten sposób farmakologicznie indukowane zmiany w CMMC są rejestrowane u myszy typu dzikiego oraz w mysim modelu autyzmu Neuroligin-3R451C. Ponadto technika ta może być stosowana w innych regionach przewodu pokarmowego, w tym w dwunastnicy, jelicie czczym i jelicie krętym oraz w różnym wieku rozwojowym u myszy.

Wprowadzenie

Jelitowy układ nerwowy (ENS) jest wewnętrzną siecią neuronalną przewodu pokarmowego i moduluje różne funkcje, takie jak trawienie treści jelitowej, wchłanianie składników odżywczych oraz wydzielanie i ponowne wchłanianie płynów. Neurony ENS znajdują się w splocie mięśniowym jelitowym i podśluzówkowym. Splot mięśniowo-jelitowy odgrywa główną rolę w regulacji motoryki przewodu pokarmowego1, podczas gdy splot podśluzówkowy jest przede wszystkim zaangażowany w kontrolę wydzielania2,3. Splot mięśniowo-jelitowy znajduje się między podłużnymi i okrężnymi warstwami mięśni ściany przewodu pokarmowego. Aktywność skurczowa warstw mięśni gładkich ściany jelita ułatwia podstawowe funkcje przewodu pokarmowego poprzez mieszanie i rozprowadzanie treści jelitowej na całej długości jelita3. Chociaż zewnętrzne zaopatrzenie nerwowe w przewód pokarmowy z OUN przyczynia się do funkcji przewodu pokarmowego in vivo, ENS jest w stanie samodzielnie regulować pracę przewodu pokarmowego. Ta unikalna cecha umożliwia funkcjonalne badanie obwodów neuronalnych jelit i ich udziału w motoryce przewodu pokarmowego ex vivo.

Migrujące kompleksy motoryczne okrężnicy (CMMC) są spontanicznymi, neurogennymi zdarzeniami, które są dominującym wzorcem motorycznym obserwowanym w izolowanej okrężnicy myszy przy braku granulek kału4-9. CMMC definiuje się jako rytmiczne skurcze, które rozchodzą się wzdłuż odległości poziomej wynoszącej co najmniej połowę całkowitej długości okrężnicy (tj. od jelita ślepego do odbytnicy)10. Związek między CMMC a wzorcami skurczu, które napędzają granulki kału, nie został jeszcze jasno ustalony, jednak zgłoszono pewne różnice farmakologiczne11. Niemniej jednak zdolność ENS do funkcjonowania niezależnie od OUN i istnienie wzorców motorycznych za pośrednictwem neuronów w izolowanej okrężnicy zapewnia idealny system testowy do badania zaburzeń ruchliwości wynikających z podstawowej dysfunkcji ENS. Spontaniczność wzorców motorycznych przewodu pokarmowego pozwala na ocenę zmian funkcjonalnych w odpowiedzi na bodźce farmakologiczne.

Wykorzystanie obrazowania wideo i mapowania czasoprzestrzennego zostało po raz pierwszy opracowane do ilościowego badania perystaltyki jelita cienkiego u świnek morskich12. W tym miejscu opisano technikę ex vivo, która umożliwia badanie wzorców ruchliwości okrężnicy myszy za pomocą obrazowania wideo i analizy tych nagrań w celu skonstruowania map o wysokiej rozdzielczości (~100 μm, 33 ms) średnicy okrężnicy w funkcji położenia wzdłuż okrężnicy i czasu (mapy czasoprzestrzenne). Korzystając z wewnętrznego oprogramowania do wykrywania krawędzi (Analyse2; dostępne na życzenie), dane z segmentów okrężnicy na całej długości kurczących się w czasie rzeczywistym są przetwarzane w celu wygenerowania map czasoprzestrzennych dla każdego eksperymentu. W tym kroku pliki wideo (AVI) są podsumowywane i konwertowane na mapy czasowo-przestrzenne przy użyciu Analyse2. Mapy czasoprzestrzenne (rysunek 2) przedstawiają kurczliwość w czasie i umożliwiają pomiar wielu parametrów, w tym prędkości propagacji, wielkości, długości i czasu trwania. Średnica jelita jest również rejestrowana przez cały czas trwania eksperymentu jako miara ogólnej kurczliwości segmentu tkanki. Metoda ta może być stosowana do identyfikacji różnic w punkcie inicjacji kompleksów kurczliwych, które mogą wskazywać na zmienione połączenia nerwowe jelit.

Podobny protokół obrazowania wideo przeznaczony do oceny napędu granulek u świnek morskich został zgłoszony13, jednak tutaj przedstawiamy zastosowanie podejścia obrazowania wideo do ilościowego oznaczania spontanicznej ruchliwości okrężnicy (tj. przy braku granulek). Zapewniamy również szczegółowe informacje, które pomogą w sekcji i przygotowaniu tkanki przewodu pokarmowego do obrazowania wideo. Protokół ten zapewnia naukowcom dostępne i łatwe do powielenia narzędzie do analizy jelitowej kontroli neuronalnej funkcji przewodu pokarmowego w zwierzęcych modelach chorób, w tym genetycznych modelach myszy.

Technika obrazowania wideo umożliwia analizę motoryki okrężnicy w odpowiedzi na różne czynniki farmakologiczne. Leki mogą być podawane przez światło jelita lub kąpiel narządową na zewnątrz preparatu okrężnicy. Różne obszary przewodu pokarmowego myszy wykazują specyficzne wzorce ruchliwości, takie jak segmentacja jelita cienkiego i CMMC w okrężnicy.

Ta technika została użyta do identyfikacji różnic między szczepami w funkcjonowaniu jelita cienkiego; różnicowa wrażliwość na antagonistów 5-HT3 i 5-HT4 została zaobserwowana w jelicie czczym myszy Balb/c i C57/Bl6 ze względu na polimorficzną naturę genu tph2 wyrażonego w dwóch szczepach6. Wpływ hamowania 5-HT na ruchliwość pozostaje kontrowersyjny, ponieważ zgłoszono sprzeczne dane na temat znaczenia endogennego 5-HT na perystaltykę okrężnicy i CMMC14,15. Zmiany w ruchliwości przed i po urodzeniu podczas rozwoju7 oraz wpływ mutacji genów na motorykę przewodu pokarmowego w zwierzęcych modelach choroby10 można również zbadać za pomocą obrazowania wideo. W tym miejscu ilustrujemy zastosowanie metody do badania motoryki okrężnicy w mysim modelu autyzmu NL3R451C, który wyraża mutację missense w genie Nlgn3 kodującym białko adhezyjne synapsy Neuroligin-316. Mutacja ta została po raz pierwszy zidentyfikowana u pacjentów, u których zdiagnozowano zaburzenie ze spektrum autyzmu (ASD)17, które jest silnie związane z dysfunkcją przewodu pokarmowego18-22. Zbadaliśmy, czy mutacja synaptyczna NL3 R451C wpływa na wyjścia neuronalne w ENS za pomocą techniki obrazowania wideo. Przedstawiono dane charakteryzujące CMMC na początku badania i w odpowiedzi na serotoninergicznego antagonistę receptora5HT 3/4 tropisetron w mysim modelu autyzmu NL3R451C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Obchodzenie się ze zwierzętami i zwichnięcie szyjki macicy zwierząt przed wszystkimi eksperymentami były wykonywane ściśle według protokołów zatwierdzonych przez Komitet ds. Eksperymentów na Zwierzętach dla Uniwersytetu w Melbourne (ID etyki: 1212494.7)

1. Pobieranie i sekcja tkanek

  1. Poddaj eutanazji dorosłe myszy przez zwichnięcie szyjki macicy. Jeśli to możliwe, unikaj znieczulenia, aby zapobiec wpływowi na funkcjonowanie jelit poprzez receptory zlokalizowane w interesujących populacjach neuronów.
  2. Zapisz całkowitą masę ciała zwierzęcia, przypnij ciało (czterema łapami, stroną brzuszną wystawioną na eksperymentatora) mocno przymocuj do deski sekcyjnej za pomocą igieł podskórnych (rozmiar: 20 g).
  3. Za pomocą kleszczy preparacyjnych i nożyczek wykonaj nacięcie przez naskórek, pokrywając dolne warstwy mięśni brzucha. Kontynuuj używanie kleszczy i nożyczek, aby otworzyć jamę brzuszną wzdłuż linii środkowej brzucha do mostka.
  4. Aby zapobiec odwodnieniu tkanki, należy wlać sól fizjologiczną (roztwór Krebsa: 118 NaCl, 4,6 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgSO4, 1 NaH2PO4, 25 NaHCO3, 11 D-glukozy w mM - bąbelkowaną w temperaturze RT z gazem karbogenowym; 95% O2 i 5% CO2 przez minimum 20 min) na treść brzuszną w regularnych odstępach czasu (tj. co 30-60 sekund) podczas procesu preparacji.
  5. Aby wyizolować okrężnicę, gdy jest przyczepiona do jelita ślepego i odbytnicy, delikatnie przytrzymaj jelito ślepe (znajdujące się w sąsiedztwie bliższego końca okrężnicy) za pomocą kleszczy preparacyjnych około 4-5 cm nad ciałem zwierzęcia, jednocześnie przycinając krezkę za pomocą cienkich nożyczek preparacyjnych.
  6. Uważaj, aby nie dotykać, nie rozciągać ani nie przecinać tkanki żołądkowo-jelitowej podczas usuwania przylegającej krezki.
  7. Usuń nadmiar tkanki (tj. pęcherz moczowy i jądra). Za pomocą grubych nożyczek preparacyjnych wykonaj dwa pionowe nacięcia (tj. około 0,5 cm od linii środkowej), aby przeciąć kość miednicy po każdej stronie okrężnicy.
  8. Użyj cienkich nożyczek, aby oddzielić odbytnicę od przylegającej tkanki miednicy i przyciąć otaczające mięśnie od okrężnicy.
  9. Umieścić okrężnicę na całej długości (od jelita ślepego do odbytnicy) w zlewce zawierającej sól fizjologiczną (uprzednio natlenioną karbogenem) i kontynuować natlenianie w temperaturze pokojowej. Usunąć kątnicę i odbytnicę za pomocą cienkich nożyczek preparacyjnych i umieścić w zlewce.
  10. Opróżnij granulki kału/treść jelitową z preparatów okrężnicy, wywierając delikatne nadciśnienie na końcu jamy ustnej za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml dołączonej do końcówki pipety o pojemności 200 μl wypełnionej solą fizjologiczną. Aby w przyszłości zorientować tkankę, użyj szpilki przeciw owadom, aby zaznaczyć najbardziej proksymalny koniec okrężnicy, gdzie widoczne są prążki w błonie śluzowej.
    1. Zmodyfikować plastikową końcówkę pipety tak, aby pasowała do strzykawki o pojemności 5 ml, usuwając około 1 cm najszerszego/bliższego końca za pomocą żyletki. Aby zwiększyć natężenie przepływu, poszerz dystalny/mniejszy koniec, przycinając pod kątem (około 45 °C) za pomocą żyletki.
  11. Chwyć delikatnie tkankę jelita grubego za jej bliższy koniec kleszczami preparacyjnymi, włóż końcówkę pipety do światła okrężnicy i przepłucz fizjologiczną sól fizjologiczną przez światło.

2. Przygotowanie tkanki okrężnicy i zestaw eksperymentalny do obrazowania wideo

  1. Przepłukać sól fizjologiczną przez wszystkie rurki podłączone do dwukomorowej łaźni narządowej (Rysunek 1 i Rysunek 3) za pomocą strzykawki przymocowanej do końcówki pipety o pojemności 200 μl. Ten krok usuwa wszelkie zanieczyszczenia w rurce, które mogłyby blokować przepływ roztworu. Specyfikacje przewodów można znaleźć w tabeli materiałów.
  2. Upewnij się, że komory łaźni narządowej są stale przepełnione solą fizjologiczną z bąbelkami karbogenu (95%O2 i 5% CO2, natężenie przepływu 5 ml min-1). Używając sondy temperatury w regularnych odstępach czasu, upewnij się, że temperatura kąpieli jest utrzymywana w zakresie 33 °C -37 °C.
  3. Napełnić zbiornik dopływowy podłączony 3-kierunkowym zaworem odcinającym do rurki wlotowej około 20-30 ml soli fizjologicznej za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml.
  4. Podczas eksperymentu należy utrzymywać ciśnienie w zbiorniku dopływowym za pomocą gumowego korka z rurką szklaną (o średnicy wewnętrznej 5 mm) wprowadzoną przez jego środek. Upewnij się, że górny otwór zbiornika dopływowego jest dobrze uszczelniony (wewnętrzna szklana rurka pozostaje nieuszczelniona).
  5. Umieść okrężnicę (o długości 5-7 cm) w komorze do kąpieli narządów, upewniając się, że jest całkowicie zanurzona w soli fizjologicznej.
  6. Kanulować każdy koniec segmentu okrężnicy do dwóch zanurzonych rurek wlotowych/wylotowych (rurki wlotowe/wylotowe o różnej średnicy można zmieniać w zależności od wielkości światła tkanki, np. tkanki poporodowej, dorosłych myszy i świnki morskiej) w kąpieli za pomocą standardowej bawełnianej nici do szycia. Przymocuj bliższy koniec okrężnicy do rurki wlotowej, a dystalny koniec okrężnicy do rurki wylotowej (połączonej za pomocą 3-kierunkowego kranu z pionową rurką odpływową; wysokość 6 cm). Upewnij się, że tkanka nie jest nadmiernie rozciągnięta lub zbyt rozluźniona po kaniulacji, aby uniknąć zakłóceń w przyszłych pomiarach i analizach.
  7. Zapisz długość okrężnicy, mierząc odległość między kaniulacją bliższą i dystalną za pomocą linijki o długości 15 cm. Jest to ważne dla interpretacji zmian długości skurczu, prędkości propagacji i punktów inicjacji skurczu.
  8. Upewnij się, że ustabilizowane podstawowe ciśnienie świetlne (cm H2O) zostało ustalone przed rozpoczęciem eksperymentu. Obliczyć ciśnienie świetlne, mierząc pionową odległość od tkanki do menisku soli fizjologicznej w szklanej rurce zbiornika dopływowego (doustnie) i pionowej rurce odpływowej (anal).
  9. Utrzymuj preparaty tkankowe na stałym ciśnieniu śródświetlnym (np. 1-2 cm H2O), upewniając się, że ciśnienie w uszczelnieniu korka dopływu jest utrzymywane na stałym poziomie i że w zestawie nie ma zatorów.
  10. Pozostaw okrężnicę do zrównoważenia w soli fizjologicznej na 30 minut przed zarejestrowaniem ruchów jelit. Sprawdź, czy w rurkach wlotowych lub odpływowych nie ma zatorów i usuń je, wywierając ciśnienie przez zbiornik dopływowy lub ponownie kaniulując ustne i odbytowe końce okrężnicy.

3. Przechwytywanie obrazów i protokół eksperymentalny

  1. Rejestruj ruchy jelit jako pliki wideo za pomocą kamery wideo (30 klatek/s, 640 x 840 pikseli) umieszczonej 10-15 cm nad łaźnią narządową na standardowym stanowisku laboratoryjnym (ryc. 1).
  2. Otwórz Virtual Dub (oprogramowanie do przechwytywania wideo) za pomocą ikony na pulpicie. Na karcie "Plik" wybierz "przechwyć AVI", aby wyświetlić obraz z kamery. Na karcie "Audio" odznacz "włącz przechwytywanie dźwięku", aby wyłączyć dźwięk.
    1. W zakładce wideo wybierz "kompresja" i "DivX6.9.2". Kodek do kompresji plików wideo w celu zminimalizowania zużycia przestrzeni dyskowej. Funkcja ta stanie się dostępna po zainstalowaniu oprogramowania do kompresji "DivX".
  3. Ręcznie dostosuj położenie kamery tak, aby cały kaniulowany segment okrężnicy był widoczny (z obszarami kaniulowanymi bezpośrednio przylegającymi do pionowych krawędzi klatki wideo) za pomocą okna oprogramowania do przechwytywania wideo (patrz Rysunek 1). Aby poprawić jakość obrazu i zminimalizować odbicia, przymocuj papierowo-tekturową osłonę do wspornika kamery, aby zablokować obce światło na kąpieli organowej. Zoptymalizuj jakość wideo, dostosowując ustawienia jasności, kontrastu i ekspozycji za pomocą interfejsu oprogramowania aparatu.
    1. Przed nagraniem ustaw konkretną nazwę pliku; w zakładce "Plik" wybierz "Ustaw plik przechwytywania" i określ unikalną nazwę filmu.
    2. Rozpocznij przechwytywanie wideo, naciskając "Przechwyć plik" na pasku narzędzi "Przechwyć". Aby zatrzymać nagrywanie, wybierz przycisk "Zatrzymaj przechwytywanie" lub "Esc" na klawiaturze.
  4. Sól fizjologiczną znajdującą się w zbiorniku dopływowym należy wymieniać na świeżą sól fizjologiczną co 30 min.
    1. Zanotować ciśnienie świetlne (patrz 2.9) i za pomocą sondy temperatury zwrócić uwagę na temperaturę kąpieli narządowej. Powtarzaj te kroki przez cały czas trwania eksperymentu (tj. co 30 minut), aby upewnić się, że te zmienne są stałe.
  5. Rejestruj aktywność okrężnicy łącznie przez 3 godziny (w tym stosowanie leku i czas wypłukiwania). Na potrzeby przechowywania danych nagrywaj dane w 15-minutowych segmentach wideo. Pełny eksperyment zazwyczaj składa się z nagrań wideo o wymiarach 12 x 15 minut.
    1. Rejestruj aktywność przez 1 godzinę w warunkach kontrolnych (sól fizjologiczna).
    2. Lek (albo przelać do kąpieli, albo podać do światła przez zbiornik dopływowy) na 30 minut do 1 godziny.
      Uwaga: Różne drogi podania mogą dawać różne skutki23.
    3. Nałóż świeżą sól fizjologiczną do kąpieli lub światła podczas 1-godzinnego okresu zmywania.

4. Przetwarzanie danych i generowanie map czasoprzestrzennych

  1. Przetwarzaj każde nagranie wideo w trybie offline za pomocą wewnętrznego oprogramowania napisanego w MATLAB (R2012a, wersja 7.4; dostępne na żądanie) w celu wygenerowania map czasoprzestrzennych ilustrujących ruchliwość okrężnicy.
    1. Otwórz oprogramowanie analityczne za pomocą ikony na pulpicie.
    2. W oknie poleceń wpisz "Analiza2", aby otworzyć panel sterowania analizy.
  2. Wykorzystaj funkcję wykrywania krawędzi do generowania map czasowo-przestrzennych, klikając "Wykrywanie krawędzi dla plików .avi" w oknie panelu sterowania. Ta funkcja umożliwi oprogramowaniu analitycznemu odczytanie przekodowanych filmów w formacie Audio Video Interleaved (AVI).
  3. Wykonaj sekwencyjnie następujące kroki, aby wygenerować mapy czasowo-przestrzenne przy użyciu algorytmu adaptacyjnego wykrywania krawędzi.
    1. Otwórz nagrane pliki wideo, wybierając zakładkę "Dodaj pliki", wybierz "Otwórz wideo" i wybierz lokalizację plików wideo.
    2. Z plików wideo wymienionych w oprogramowaniu do analizy wybierz plik, który Cię interesuje.
    3. Wybierz prostokątny obszar zainteresowania w kadrze filmu, np. na całej długości okrężnicy, od punktu, w którym okrężnica jest kaniulowana doustnie, do kanulacji odbytu. Upewnij się, że proksymalne i dystalne punkty kaniulacji przylegają do pionowych granic obszaru zainteresowania. Linie wykrywania krawędzi (czerwona i zielona) pojawią się automatycznie nałożone na obraz w czasie rzeczywistym.
    4. Upewnij się, że linie progu wykrywania krawędzi przylegają bezpośrednio do okrężnicy zarówno na górnej, jak i dolnej granicy tkanki okrężnicy (można to zoptymalizować dla każdego filmu, zmieniając wartości progu wykrywania na panelu sterowania). Upewnij się, że linie wykrywania krawędzi są ciągłe na całej długości obrazu okrężnicy, dostosowując kontrast i jasność za pomocą panelu sterowania.
    5. Wprowadź pełną długość dwukropka (mm) w oknie dialogowym szerokości (zgodnie z opisem w kroku 2.7). Następnie wybierz "Generuj mapę cieplną".
    6. W wyskakującym okienku wybierz lokalizację, w której ma zostać zapisany plik, i określ nazwę pliku dla mapy czasowo-przestrzennej.
    7. Wybierz format ".su2" i wybierz "Dodaj do kolejki".
      Uwaga: Format .su2 kompresuje dane do mniejszego rozmiaru pliku, a do kolejki można dodać wiele plików wideo.
    8. Wybierz opcję "Rozpocznij wykrywanie", aby wygenerować mapy czasowo-przestrzenne.

5. Analiza map czasoprzestrzennych

  1. Wykorzystaj mapy czasoprzestrzenne do oszacowania parametrów, takich jak częstotliwość, prędkość propagacji, długość i czas trwania CMMC, średnica jelita oraz punkt inicjacji i kierunek skurczów.
    1. Aby rozpocząć analizowanie map czasoprzestrzennych, wpisz "analyse2" w oknie poleceń zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji. Zamiast "Wykrywanie krawędzi" wybierz przycisk "Analiza mapy cieplnej".
    2. Otwórz pliki map czasoprzestrzennych (pliki .su2), wybierając zakładkę 'Dodaj pliki' i określając lokalizację wcześniej uzyskanych plików .su2.
    3. Gdy mapa czasowo-przestrzenna jest widoczna na ekranie, określ zakres kolorów na panelu sterowania, upewniając się, że wartość minimalna jest ustawiona na 1,
      Należy pamiętać, że maksimum może wynosić od 5 do 10 w zależności od kurczliwości tkanki.
    4. Wybierz opcję "Zablokuj zakres kolorów", aby upewnić się, że wszystkie mapy z jednego eksperymentu są analizowane w tych samych warunkach.
    5. Upewnij się, że ustawienia ram czasowych są stałe dla wszystkich map czasoprzestrzennych z danego eksperymentu.
  2. Aby określić częstotliwość CMMC, ręcznie policz skurcze, które przechodzą przez więcej niż 50% długości okrężnicy. Skurcze te można zwizualizować jako czerwone/pomarańczowe smugi (standardowy indeks kolorów HSV) na mapie czasoprzestrzennej (patrz rysunek 2 dla przykładu). Inne skurcze, które są krótsze lub nie rozprzestrzeniają się, można również zidentyfikować i określić ilościowo.
  3. W razie potrzeby przeprowadź dalszą analizę w wyższej rozdzielczości na podstawie tych map. Na przykład można zbadać szczegółowe właściwości, w tym szybkość i czas trwania każdego skurczu.
    1. Aby zmierzyć prędkość i czas trwania, wybierz przycisk "Opisz fale skurczu" w panelu sterowania analizy mapy cieplnej.
    2. Następnie powiększ każdy CMMC, klikając przycisk "Zoom" i wybierając obszar zainteresowania. Następnie wybierz przycisk "Ręcznie adnotuj", aby dodać adnotację do każdego skurczu, używając myszy, aby narysować linię od najbardziej początkowej pozycji do końca każdego skurczu. Metodę tę można zastosować do pomiaru pozornej prędkości propagacji i czasu trwania dylatacji, które wydają się rozchodzić (np. patrz analny koniec map na rysunku 2A, 2B).
      Uwaga: Dane dotyczące szybkości i czasu trwania pojawią się w oknie wyników. Wartości te można przenieść do interesującego Cię arkusza kalkulacyjnego, wybierając zakładkę "Eksportuj dane". Niechciane adnotacje można usunąć, klikając przycisk "Usuń wybrane adnotacje".
  4. W razie potrzeby wykorzystaj współrzędne x i y map czasoprzestrzennych (odpowiednio czas i położenie wzdłuż okrężnicy), aby określić pozycję inicjacji małych skurczów lub CMMC.
  5. Podobnie, aby określić odstępy między skurczami, użyj funkcji "Adnotacja", aby zmierzyć czas trwania między skurczami. Tak jak poprzednio, wyniki te można wyeksportować do arkusza kalkulacyjnego, wybierając zakładkę "Eksportuj dane".
  6. W celu zmierzenia spoczynkowej szerokości jelita należy wybrać przycisk "Weź przekrój poprzeczny" w panelu Analiza mapy cieplnej.
    1. Wybierz opcję "Dodaj" w panelu czasowych przekrojów poprzecznych. Kliknij dwukrotnie w dowolnym miejscu na mapie, aby wygenerować poziomą linię nałożoną na mapę skupień. Dane dotyczące średnicy jelita będą teraz wyświetlane w nowym oknie.
    2. Aby zmierzyć średnicę jelita, umieść kursor na szczycie i sąsiednim korycie, aby uzyskać średnią szerokość jelita dla określonego warunku eksperymentalnego. Zmiany średnicy jelita można porównać między warunkami eksperymentalnymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Nawet 90% pacjentów z ASD doświadcza szeregu zaburzeń żołądkowo-jelitowych, w tym biegunek i zaparć18,24,25. Przyczyny tych problemów żołądkowo-jelitowych pozostają jednak nieznane. Wiele mutacji zidentyfikowanych u pacjentów z ASD wiąże się z białkami synaptycznymi przyczyniającymi się do zmian i zaburzeń w przekazywaniu lub funkcji synaptycznej. Jedna z takich mutacji, w genie kodującym cząsteczkę adhezji komórkowej neuroliginę-3 (NL3 R451C), została zidentyfikowana u dwóch b...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Korzystając z tej techniki obrazowania wideo, zmierzono częstotliwość CMMC jako wskaźnik ruchliwości okrężnicy u myszy typu dzikiego i NL3R451C , mysiego modelu zaburzenia ze spektrum autyzmu17. Nasze wyniki wskazują na zmniejszenie liczby CMMC u zmutowanych myszy NL3R451C w porównaniu z myszami typu dzikiego w obecności antagonisty receptora 5HT3/4 Tropisetron, co sugeruje, że myszy NL3R451C wykazują zwiększoną wrażliwość na Tropisetron. W związku z tym sugerujemy, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

JCB i ELH-Y były wspierane przez Program Badań nad Autyzmem (AR11034) Departamentu Obrony USA. NHMRC (1047674) do ELH-Y. Stypendium May Stewart Bursary-University of Melbourne ufundował stypendium dla SM. Dziękujemy Ali Taherowi, Fátimie Ramalhosie i Gracii Seger za wkład techniczny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki
NaCl (MW: 58.44)Sigma-AldrichS7653-250G
KCl (MW: 74.55)Sigma-AldrichP9333-500G
NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01)Dostawa chemiczna471-500G
MgSO4 .7H20 (MW: 246.48)Chem SupplyMA048
CaCl2.2H2O (MW: 147.02)Chem SupplyCA033
D-glukoza bezwodna (MW: 180.16)Dostawa chemicznaGA018-500G
NaHCO3 (MW: 84.01)Dostawa chemiiGA018-500G
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Materiały
Dwukomorowa łaźnia organowa
Wymiary: 14 cm x 8 cm x 3 cm		WykonaneSkontaktuj się bezpośrednio z laboratorium 
  732 USZCZELNIACZ WIELOFUNKCYJNY BEZBARWNYDow Corning Australia Pty Ltd1890573
SYLGARD 184 ZESTAW ELASTOMERÓW SILIKONOWYCH Dow Corning Australia Pty Ltd1064291
KRAN 3-DROŻNY FEM-ML L/LOCK STerumo Medical Corporation0912-2006
STRZYKAWKI z końcówkami Luer Lock 50 ml, 20 ml, 10 mlTerumo Medical CorporationN/A
1,57 mm (ID) x 3,16 mm (OD) - Rurka silikonowaMasterflex508-008
1,02 mm (ID) x 2,16 mm (OD) - Rurka silikonowaMasterflex508-005
1,50 mm (średnica wewnętrzna) x 2,50 mm (średnica zewnętrzna) - Rurka silikonowaMasterflex508-007
1,60 mm (średnica wewnętrzna) - Rurka silikonowa utwardzana platyną Masterflex96410 - 14
4,40 mm (ID) - Rurki silikonowe utwardzane platyną Masterflex96410 - 15 
3,10 mm (ID) - rurka silikonowa utwardzana platyną Masterflex96410 -16
szklane butelki laboratoryjne z podziałką - 500 ml         Thermofisher Naukowy 100-400
KOREK Z GUMY CHEMICZNEJ 57 x 65 mm 
KOREK CHEMICZNY GUMOWY 29 mm x 32 mm
Podgrzewacz wody  (regulator temperatury) Ratek TH7000 
Logitech WebcamLogitech
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Software
Virtual Dub - 1.9 11virtualdub.org
MATLAB Czynnik chłodniczy R2012a Graph Pad
Logitech Webcam SoftwareLogitech
na zamówienie

Bibliografia

  1. Powell, A. K., O'Brien, S. D., Fida, R., Bywater, R. A. Neural integrity is essential for the propagation of colonic migrating motor complexes in the mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 495-504 (2002).
  2. Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, 286-294 (2012).
  3. Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Mechanisms underlying nutrient-induced segmentation in isolated guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G1162-G1172 (2007).
  4. Bush, T. G., Spencer, N. J., Watters, N., Sanders, K. M., Smith, T. K. Spontaneous migrating motor complexes occur in both the terminal ileum and colon of the C57BL/6 mouse in vitro. Auton Neurosci. 84, 162-168 (2000).
  5. Fida, R., Lyster, D. J., Bywater, R. A., Taylor, G. S. Colonic migrating motor complexes (CMMCs) in the isolated mouse colon. Neurogastroenterol Motil. 9, 99-107 (1997).
  6. Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J Physiol. 587, 567-586 (2009).
  7. Roberts, R. R., Murphy, J. F., Young, H. M., Bornstein, J. C. Development of colonic motility in the neonatal mouse-studies using spatiotemporal maps. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G930-G938 (2007).
  8. Spencer, N. J. Control of migrating motor activity in the colon. Curr Opin Pharmacol. 1, 604-610 (2001).
  9. Spencer, N. J., Bywater, R. A. Enteric nerve stimulation evokes a premature colonic migrating motor complex in mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 657-665 (2002).
  10. Roberts, R. R., Bornstein, J. C., Bergner, A. J., Young, H. M. Disturbances of colonic motility in mouse models of Hirschsprung's disease. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294, G996-G1008 (2008).
  11. Tough, I. R., et al. Endogenous peptide YY and neuropeptide Y inhibit colonic ion transport, contractility and transit differentially via Y(1) and Y(2) receptors. Br J Pharmacol. 164, 471-484 (2011).
  12. Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps. J Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).
  13. Hoffman, J. M., Brooks, E. M., Mawe, G. M. Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM). J Vis Exp. , (2010).
  14. Smith, T. K., Gershon, M. D. Rebuttal from Terence K. Smith and Michael D. Gershon. J Physiol. 593, 3233(2015).
  15. Spencer, N. J., Sia, T. C., Brookes, S. J., Costa, M., Keating, D. J. CrossTalk opposing view: 5-HT is not necessary for peristalsis. J Physiol. 593, 3229-3231 (2015).
  16. Tabuchi, K., et al. A neuroligin-3 mutation implicated in autism increases inhibitory synaptic transmission in mice. Science. 318, 71-76 (2007).
  17. Jamain, S., et al. Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism. Nat Genet. 34, 27-29 (2003).
  18. Chaidez, V., Hansen, R. L., Hertz-Picciotto, I. Gastrointestinal problems in children with autism, developmental delays or typical development. J Autism Dev Disord. 44, 1117-1127 (2014).
  19. Ibrahim, S. H., Voigt, R. G., Katusic, S. K., Weaver, A. L., Barbaresi, W. J. Incidence of gastrointestinal symptoms in children with autism: a population-based study. Pediatrics. 124, 680-686 (2009).
  20. Kohane, I. S., et al. The co-morbidity burden of children and young adults with autism spectrum disorders. PloS One. 7, e33224(2012).
  21. McElhanon, B. O., McCracken, C., Karpen, S., Sharp, W. G. Gastrointestinal symptoms in autism spectrum disorder: a meta-analysis. Pediatrics. 133, 872-883 (2014).
  22. Peters, B., et al. Rigid-compulsive behaviors are associated with mixed bowel symptoms in autism spectrum disorder. J Autism Dev Disord. 44, 1425-1432 (2014).
  23. Ellis, M., Chambers, J. D., Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Serotonin and cholecystokinin mediate nutrient-induced segmentation in guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304, G749-G761 (2013).
  24. Parracho, H. M., Bingham, M. O., Gibson, G. R., McCartney, A. L. Differences between the gut microflora of children with autistic spectrum disorders and that of healthy children. J Med Microbiol. 54, 987-991 (2005).
  25. Buie, T., et al. Evaluation, diagnosis, and treatment of gastrointestinal disorders in individuals with ASDs: a consensus report. Pediatrics. 125, Suppl 1. S1-S18 (2010).
  26. Etherton, M., et al. Autism-linked neuroligin-3 R451C mutation differentially alters hippocampal and cortical synaptic function. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13764-13769 (2011).
  27. Etherton, M. R., Tabuchi, K., Sharma, M., Ko, J., Sudhof, T. C. An autism-associated point mutation in the neuroligin cytoplasmic tail selectively impairs AMPA receptor-mediated synaptic transmission in hippocampus. EMBO J. 30, 2908-2919 (2011).
  28. Zhang, Q., et al. Expression of neurexin and neuroligin in the enteric nervous system and their down-regulated expression levels in Hirschsprung disease. Mol Biol Rep. 40, 2969-2975 (2013).
  29. Wang, J., et al. Expression and significance of neuroligins in myenteric cells of Cajal in Hirschsprung's disease. PloS One. 8, e67205(2013).
  30. Yang, H., et al. The down-regulation of neuroligin-2 and the correlative clinical significance of serum GABA over-expression in Hirschsprung's disease. Neurochem Res. 39, 1451-1457 (2014).
  31. Roberts, R. R., et al. The first intestinal motility patterns in fetal mice are not mediated by neurons or interstitial cells of Cajal. J Physiol. 588, 1153-1169 (2010).
  32. Barnes, K. J., Spencer, N. J. Can colonic migrating motor complexes occur in mice lacking the endothelin-3 gene? Clin Exp Pharmacol Physiol. 42, 485-495 (2015).
  33. Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Multiple neural oscillators and muscle feedback are required for the intestinal fed state motor program. PloS One. 6, e19597(2011).
  34. Heredia, D. J., et al. Important role of mucosal serotonin in colonic propulsion and peristaltic reflexes: in vitro analyses in mice lacking tryptophan hydroxylase 1. J Physiol. 591, 5939-5957 (2013).
  35. Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Insights into mechanisms of intestinal segmentation in guinea pigs: a combined computational modeling and in vitro study. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 295, G534-G541 (2008).
  36. Huizinga, J. D., et al. The origin of segmentation motor activity in the intestine. Nat Commun. 5, 3326(2014).
  37. Neild, T. O., Shen, K. Z., Surprenant, A. Vasodilatation of arterioles by acetylcholine released from single neurones in the guinea-pig submucosal plexus. J Physiol. 420, 247-265 (1990).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

W druj ce kompleksy motoryczne jelita grubegoenteryczny uk ad nerwowyjelito grube myszyk piel organowatechnika kaniulacjileczenie tropisetronemNeuroligin 3 R451C

Powiązane artykuły