Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Procedura indukująca jaskrę w modelu szczura in vivo i preparat siatkówki z pełnym mocowaniem

12.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53831

⸱

12 marca 2016

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Western Michigan University, 2Department of Biomedical Sciences, Grand Valley State University

W tym artykule

Podsumowanie

Jaskra charakteryzuje się uszkodzeniem komórek zwojowych siatkówki. Indukowanie jaskry w modelach zwierzęcych może zapewnić wgląd w badania nad tą chorobą. W tym miejscu przedstawiamy procedurę, która indukuje utratę RGC w modelu szczura in vivo i demonstrujemy przygotowanie całych siatkówk do analizy.

Streszczenie

Jaskra jest chorobą ośrodkowego układu nerwowego wpływającą na komórki zwojowe siatkówki (RGC). Aksony RGC tworzące nerw wzrokowy przenoszą bodźce wzrokowe do mózgu w celu percepcji wzrokowej. Uszkodzenie RGC i ich aksonów prowadzi do utraty wzroku i/lub ślepoty. Chociaż konkretna przyczyna jaskry nie jest znana, głównym czynnikiem ryzyka choroby jest podwyższone ciśnienie wewnątrzgałkowe. Procedury indukujące jaskrę w modelach zwierzęcych są cennym narzędziem dla naukowców badających mechanizm śmierci RGC. Takie informacje mogą prowadzić do opracowania skutecznych terapii neuroprotekcyjnych, które mogą pomóc w zapobieganiu utracie wzroku. Protokół w tej pracy opisuje metodę wywoływania stanów podobnych do jaskry w modelu szczurzym in vivo, w którym 50 μl 2 M hipertonicznego soli fizjologicznej wstrzykuje się do nadtwardówkowego splotu żylnego. Blanszowanie naczyń wskazuje na udane wstrzyknięcie. Ta procedura powoduje utratę RGC w celu symulacji jaskry. Miesiąc po wstrzyknięciu zwierzęta są uśmiercane i usuwa się oczy. Następnie rogówka, soczewka i ciało szkliste są usuwane, aby utworzyć muszlę oczną. Siatkówka jest następnie odklejana z tylnej części oka i przypinana do szalek sylgarda za pomocą igieł kaktusowych. W tym momencie neurony w siatkówce mogą zostać wybarwione w celu analizy. Wyniki tego laboratorium pokazują, że około 25% RGC zostaje utraconych w ciągu jednego miesiąca od zabiegu w porównaniu z kontrolami wewnętrznymi. Procedura ta pozwala na ilościową analizę śmierci komórek zwojowych siatkówki w modelu jaskry szczura in vivo.

Wprowadzenie

Jaskra to grupa chorób oczu atakujących neurony w siatkówce, a konkretnie komórki zwojowe siatkówki1-2. Aksony tych komórek zbiegają się, stając się nerwem wzrokowym przenoszącym informacje wizualne do mózgu, w którym postrzegany jest wzrok. Uszkodzenia RGC i ich aksonów powodują zatem wady wizualne.

Podstawowe cechy związane z zaburzeniami jaskry to zwyrodnienie i śmierć RGC, podwyższone ciśnienie wewnątrzgałkowe (IOP) oraz bańki i atrofia dysku nerwu wzrokowego. Cechy te prowadzą do utraty pola widzenia lub całkowitej, nieodwracalnej ślepoty. Obecnie jaskra spowodowała ślepotę u 70 milionów ludzi na całym świecie 3. W związku z tym jest to trzecia co do wielkości przyczyna ślepoty na świecie 4.

Dokładny mechanizm śmierci RGC w jaskrze pozostaje nieznany. Przeprowadzono wiele badań, aby rozwikłać tę tajemnicę. Wiadomo jednak, że głównym czynnikiem ryzyka jaskry jest wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego spowodowany nieregularnym krążeniem cieczy wodnistej (AH) w przedniej komorze oka. AH działa jako przezroczysty i bezbarwny zamiennik krwi w jałowej przedniej komorze oka. Odżywia otaczające komórki, usuwa wydzielane produkty przemiany materii z procesów metabolicznych, transportuje neuroprzekaźniki i umożliwia krążenie leków i komórek zapalnych w oku w stanach patologicznych 1.

Utrzymanie krążenia cieczy wodnistej obejmuje ciało rzęskowe i siatkę beleczkową. Ciecz wodnista jest wytwarzana przez ciało rzęskowe. Następnie przepływa do przedniej komory, aby utrzymać ogólny stan zdrowia tkanki oka. 75 - 80% odpływu cieczy wodnistej jest aktywnie wydzielane przez niepigmentowy nabłonek rzęskowy, gdy płyn jest filtrowany przez trzy warstwy gąbczastej tkanki w mięśniu rzęskowym. Płyn wydostaje się przez siatkę beleczkową i przez kanał Schlemma, który opróżnia się do układu krwionośnego 5. Pozostałe 20 - 25% odpływu omija siatkę beleczkową i jest biernie wydzielane przez ultrafiltrację i dyfuzję przez szlak błony naczyniowej oka. Szlak ten wydaje się być względnie niezależny od ciśnienia wewnątrzgałkowego 1.

Gdy produkcja i odpływ cieczy wodnistej nie są zrównoważone, w oku narasta ciśnienie. Jak stwierdzono, ten wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego jest głównym czynnikiem ryzyka rozwoju jaskry. Takie ciśnienie powoduje uszkodzenie skomplikowanych warstw neuronów w siatkówce w tylnej części oka. Uszkodzenie aksonów komórek zwojowych siatkówki nerwu wzrokowego powoduje, że mózg nie otrzymuje już dokładnych informacji wizualnych. W rezultacie percepcja wzroku zostaje utracona i może dojść do całkowitej ślepoty.

Do tej pory nie ma lekarstwa na jaskrę. Istnieją różne metody leczenia, które mają na celu przede wszystkim obniżenie ciśnienia wewnątrzgałkowego. Należą do nich klasy leków miejscowych, takich jak blokery receptora beta1-adrenergicznego lub miejscowe analogi prostaglandyn. Beta-blokery obniżają ciśnienie wewnątrzgałkowe poprzez zmniejszenie wytwarzania cieczy wodnistej 7. Prostaglandyny działają w celu zmniejszenia ciśnienia wewnątrzgałkowego poprzez zwiększenie odpływu cieczy wodnistej 8-14. Agoniści receptorów alfa-adrenergicznych i inhibitory anhydrazy węglanowej są również stosowane jako wtórne metody leczenia. Agoniści receptorów alfa-adrenergicznych zwiększają odpływ przez szlak naczyniowo-twardówkowy 15-17. Inhibitory anhydrazy węglanowej zmniejszają produkcję AH poprzez hamowanie enzymatyczne 18. W leczeniu jaskry stosuje się również znacznie bardziej inwazyjne procedury. Trabekuloplastyka laserowa służy do zwiększenia odpływu cieczy wodnistej 19. Inna terapia chirurgiczna, zwana trabekulektomią, tworzy alternatywne miejsce drenażu do filtrowania AH, gdy tradycyjna ścieżka beleczkowa jest zablokowana 20-21.

Te opcje leczenia są znane z skutecznego zmniejszania IOP. Jednak do 40% pacjentów z jaskrą wykazuje prawidłowy poziom IOP, co wskazuje na potrzebę bardziej kompletnych metod terapeutycznych. 22,23 Ponadto śmierć komórek zwojowych siatkówki obserwowana w jaskrze jest nieodwracalna po jej rozpoczęciu, a obecne leczenie nie zatrzymuje postępu choroby 24-28. Uwypukliło to potrzebę skutecznych terapii neuroprotekcyjnych, które mają na celu przetrwanie samych neuronów. Opracowanie modeli jaskry ma kluczowe znaczenie dla tego rozwoju.

W tym badaniu demonstrujemy metodę wywoływania efektów podobnych do jaskry u dorosłych szczurów rasy Long Evans przy użyciu zmodyfikowanej procedury pierwotnie opisanej przez Morrisona29. W tej procedurze wstrzyknięcie 2 M hipertonicznego soli fizjologicznej do nadtwardówkowego splotu żylnego wywołuje stany podobne do jaskry poprzez bliznowacenie tkanki w celu zmniejszenia odpływu cieczy wodnistej w siatce beleczkowej, co prowadzi do wzrostu ciśnienia wewnątrzgałkowego i znacznej utraty RGC w ciągu jednego miesiąca od zabiegu 30-31. Procedury wywołujące jaskrę, takie jak ta opisana tutaj, mogą być kluczem do odblokowania nowych osiągnięć w leczeniu jaskry.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury z wykorzystaniem zwierząt były zgodne ze standardami Komitetu Instytutu Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) na Uniwersytecie Western Michigan.

1. Zwierzęta

  1. W tym badaniu wykorzystaj samce i samice szczurów w wieku 3 miesięcy.
  2. Trzymaj zwierzęta w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności ze swobodnym dostępem do jedzenia i wody.

2. Przygotowanie koktajlu KAX do znieczulenia zwierząt

  1. Rozpuścić 50 mg ksylazyny (20 mg/ml) w 5 ml ketaminy (100 mg/ml) z 1 ml acepromazyny (10 mg/ml) i 3 ml wody destylowanej. Dokładnie wymieszaj.
  2. Wysterylizować filtrem strzykawkowym i przechowywać ten roztwór w butelce z surowicą o pojemności 10 ml.

3. Wtrysk KAX

  1. Zważyć zwierzę (g) i umieścić je w klatce do momentu, gdy będzie gotowe do wstrzyknięcia.
  2. Wstrzyknąć dootrzewnowo 0,1 ml KAX/100 g masy ciała zwierzęcia za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml z igłą 28 G.
  3. Pozwól, aby zwierzę straciło przytomność. Sprawdź odruchy, szczypiąc stopy i ogon.
  4. Trzymaj wszystkie zwierzęta bezpiecznie w laboratorium na czas operacji.
  5. Po operacji umieść zwierzęta w ich klatkach i utrzymuj je w komfortowym stanie do czasu odzyskania przytomności. Zwierzęta należy zwracać do obiektu tylko wtedy, gdy się obudzą i wznowią normalne zachowanie.

4. Przygotowanie do operacji i montażu mikroigieł

  1. Przygotować sterylny 2 M roztwór NaCl.
  2. Użyj ściągacza do mikroelektrod (Rysunek 1C), aby wyciągnąć jedną grubościenną, polerowaną, standardową i cienkościenną rurkę borokrzemianową o średnicy wewnętrznej 0,86 mm do dwóch drobno zwężających się szklanych mikroigieł (Rysunek 1D, Rysunek 1E).
  3. Napełnić jedną mikroigłę z poprzedniego etapu solą fizjologiczną 2 M za pomocą igły do zasypywania strzykawki i strzykawki o pojemności 1 ml (Rysunek 1B) . Wystuknij pęcherzyki powietrza z końcówki elektrody.
  4. Napełnić drugą strzykawkę o pojemności 1 ml 2 M NaCl. Podłącz igłę 18 G, a następnie przymocuj rurkę polietylenową na długość (około 10 cali) (Rysunek 1A). Za pomocą tłoka strzykawki napełnić rurkę polietylenową solą fizjologiczną przez igłę.
  5. Gdy zarówno mikroigła, jak i rurka zostaną wypełnione solą fizjologiczną, ostrożnie je połącz. Wyeliminuj powietrze z połączenia między nimi (Rysunek 2).
  6. Drobno ukosuj końcówkę mikroigły, zeskrobując ją bardzo delikatnie o słoje ręcznika papierowego.
  7. Sprawdź opór mikroigły, delikatnie naciskając tłok na strzykawce, aż na ręczniku papierowym będzie widoczny drobny strumień płynu. Strumień cieczy nie powinien być szerszy niż 0,5 mm.

5. Przygotowanie zwierzęcia

  1. Nałóż 1-2 krople znieczulenia miejscowego na rogówkę (roztwór okulistyczny chlorowodorku proparakainy, USP, 0,5%). Poczekaj, aż nie wystąpi odruch oczny.
  2. Przytnij wąsy nożyczkami.
  3. Nasącz aplikator z bawełnianą końcówką roztworem betadyny i wymazówką wokół oka eksperymentalnego.
  4. Za pomocą mikroskopu przymocuj hemostat, aby zacisnąć dolną powiekę, aby wybrzuszyć oko, odsłonić żyłę nadtwardówkową i ograniczyć ruchy gałek ocznych. (Rysunek 3, grot strzałki)

6. Wstrzyknięcie soli fizjologicznej wywołującej jaskrę

  1. Po przygotowaniu zespołu mikroigłowego i zwierzęcia należy rozpocząć wstrzykiwania.
  2. Gdy potwierdzi się, że zwierzę nie reaguje na szczypanie stóp/ogona, ostrożnie przebij żyłę nadtwardówkową mikroigłą, zbliżając się pod małym kątem od 10 do 20 stopni do żyły (ryc. 3, biała strzałka). Udane wkłucie do żyły jest widoczne, gdy krew dostanie się do końcówki mikroigły (ryc. 3, strzałka).
  3. Powoli i ręcznie wstrzyknąć do żyły około 50 μl soli fizjologicznej. Powinno to zająć około 10 sekund. Żyły bledną na biało, gdy sól krąży w układzie naczyniowym (ryc. 4, grot strzałki). Niektóre obszary mogą zachować krwistoczerwony wygląd (Ryc. 4, strzałka).
    1. Wykonać drugie wstrzyknięcie do żyły, naprzeciwko miejsca pierwszego, aby zapewnić dokładne uszkodzenie siatkówki w całej warstwie komórek zwojowych siatkówki.
      Uwaga: W ciągu kilku minut powinno pojawić się wyraźne zmętnienie przez tęczówkę oka, gdy sól krąży w układzie naczyniowym.
  4. Przeciwległe oko należy pozostawić nieleczone do stosowania jako kontrola wewnętrzna.

7. Odzyskiwanie zwierząt

  1. Usuń hemostat.
  2. Za pomocą bawełnianego aplikatora nanieść potrójną maść z antybiotykiem (bacytracyna, siarczan neomycyny, siarczan polimyzyny B) na miejsce zaciśnięte przez hemostat i na miejsca wstrzyknięcia. Uszkodzenie tkanek wokół oka nie występuje przy użyciu hemostatu.
  3. >Umieść znieczulone zwierzęta w klatkach na kocu z ciepłą wodą, aby zapobiec hipotermii. Trzymaj zwierzęta pod obserwacją, dopóki nie odzyskasz przytomności i normalnego zachowania. Przewieź obudzone zwierzęta z powrotem do kolonii zwierząt. Zwierzęta pozostają w kolonii do czasu złożenia ofiary.

8. Składanie ofiar ze zwierząt i usuwanie siatkówki

  1. Miesiąc po zabiegu wywołania jaskry zwierzęta są poddawane eutanazji przez uduszenie CO2 i wtórne nakłucie klatki piersiowej.
    1. Umieść zwierzę w komorze i bezpiecznie załóż pokrywę.
    2. Otwórz zawory CO2 i regulatora gazu, aby umożliwić wyparcie tlenu w komorze o 20% objętości / min CO2
      3. .
    3. Odczekaj od czterech do 5 minut, aż zwierzę zginie.
    4. Wyłącz oba zawory.
    5. Wyjąć zwierzę z komory i wykonać wtórne nakłucie klatki piersiowej sterylnym skalpelem.
  2. Po eutanazji za pomocą skalpela przeciąć tkankę łączną w jamie oczodołu otaczającej oko, uważając, aby nie przeciąć samej gałki ocznej.
  3. Ostrożnie użyj nożyczek o zakrzywionych krawędziach, aby przeciąć nerw wzrokowy i pozostałą tkankę, aby wydobyć nienaruszoną gałkę oczną. Umieść wyekstrahowaną gałkę oczną na sterylnej jednorazowej szalce Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm zawierającej świeży PBS.
  4. Zrób muszlę oczną z gałki ocznej. Aby to zrobić, wykonaj małe nacięcie skalpelem tuż za granicą między tęczówką a twardówką. Wykonaj to nacięcie na obwodzie oka małymi sprężynowymi nożyczkami, aby usunąć półkulę rogówki z gałki ocznej. Półkula połączona z nerwem wzrokowym pozostaje.
  5. Znajdź bardzo cienką różowo-beżową siatkówkę wewnątrz muszli ocznej zwierzęcia poddanego eutanazji. Przytrzymaj pigmentowaną warstwę siatkówki za pomocą kleszczyków, aby ustabilizować muszlę oczną. Użyj kolejnej pary zamkniętych kleszczy, aby bardzo delikatnie usunąć całą nienaruszoną siatkówkę z tylnej części oka. Unikaj bezpośredniego szczypania, ciągnięcia lub szarpania siatkówki.
  6. Użyj małych nożyczek sprężynowych, aby przeciąć obszar, w którym nerw wzrokowy jest nadal przyczepiony do siatkówki.
  7. Pamiętaj, aby odciąć wszelkie resztki nabłonka barwnikowego lub tkanki twardówki z siatkówki.
  8. Za pomocą pipety transferowej bardzo delikatnie przenieś izolowaną siatkówkę na czystą, pokrytą Sylgardem szalkę Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm zawierającą świeży PBS.

9. Przygotowanie całej siatkówki

  1. Po umieszczeniu w naczyniu sylgardowym użyj kleszczy i jednej igły do kaktusa, aby przypiąć siatkówkę na miejscu. Utrzymuj warstwę komórek zwojowych siatkówki skierowaną do góry, a nerw wzrokowy do dołu. Półkulisty kształt siatkówki jest zauważalny nawet po fiksacji. Krzywizna siatkówki będzie się zwijać w kierunku sufitu, gdy warstwa komórek zwojowych siatkówki znajdzie się w pożądanej orientacji.
  2. Użyj małych nożyczek, aby przeciąć siatkówkę na cztery ćwiartki, tworząc kształt czterolistnej koniczyny promieniującej z głowy nerwu wzrokowego.
  3. Przypnij ćwiartki siatkówki dodatkowymi igłami kaktusowymi, aby siatkówka była jak najbardziej płaska bez rozciągania (ryc. 5).
  4. Przypięte siatkówki umieścić w naczyniu sylgardowym za pomocą 3 ml 4% paraformaldehydu O/N w temperaturze pokojowej.

10. Barwienie siatkówki przeciwciałami

Uwaga: Wybarwiaj siatkówki przeciwciałami pierwszorzędowymi i wtórnymi do oglądania neuronów w siatkówce (Rysunek 6).

  1. Przepłukać stałe, płasko zamontowane siatkówki trzy razy po 2 minuty w PBS.
  2. Przepuszczalność siatkówki za pomocą 1% Triton X-100 z 1% płodowej surowicy bydlęcej w PBS przez 60 min.
  3. Przepłukać siatkówki trzy razy po 2 minuty każda, w PBS.
  4. Spłukać dwukrotnie 0,1% Triton X-100 w PBS, 5 minut na pranie.
  5. Spłucz dwukrotnie PBS, 5 minut na pranie.
  6. Inkubować z 1% Triton X-100 i 1% płodową surowicą bydlęcą w PBS w temperaturze pokojowej przez 45 min.
  7. Spłukać dwukrotnie 0,1% Triton X-100 w PBS, 5 minut na pranie.
  8. Spłucz dwukrotnie PBS, 5 minut na pranie.
  9. Inkubować każdą siatkówkę w 3 ml 1% płodowej surowicy bydlęcej w PBS z oczyszczonym mysim anty-szczurzym CD90 / mysim CD90.1 (rozcieńczenie 1:300) O/N w RT.
  10. Przepłukać siatkówkę raz 0,1% Triton X-100 w PBS przez 5 minut.
  11. Spłucz dwukrotnie PBS, 5 minut na pranie.
  12. Inkubuj każdą siatkówkę w 3 ml PBS (bez FBS) z wtórnym kozim anty-mysim IgG Alexa Fluor 594 (1:300) O/N w RT.
  13. Obficie umyć siatkówki za pomocą PBS.
  14. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego ostrożnie usuń igły kaktusa z siatkówki.
  15. Delikatnie przenieś siatkówki na szkiełka mikroskopowe za pomocą pipety transferowej. Upewnij się, że utrzymujesz orientację z warstwą komórek zwojowych siatkówki skierowaną do sufitu. Półkulisty kształt siatkówki jest zauważalny nawet po fiksacji. Krzywizna siatkówki będzie się zwijać w kierunku sufitu, gdy warstwa komórek zwojowych siatkówki znajdzie się w pożądanej orientacji.
  16. Nadmiar PBS należy wchłonąć za pomocą KimWipe lub innego podobnego materiału chłonnego. Uważaj, aby nie wchłonąć siatkówki.
  17. Dodać 5 kropli 1/2 glicerolu i 1/2 PBS wagowo jako podłoże montażowe.
  18. Przykryj siatkówkę szkiełkiem nakrywkowym, unikając pęcherzyków powietrza.
  19. Zabezpiecz szkiełko nakrywkowe za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci, kleju lub innego kleju.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tej sekcji przedstawiono komponenty aparatury oraz procedurę stosowaną w celu wywołania stanu podobnego do jaskry w modelu jaskry u szczura in vivo. Prezentujemy poszczególne narzędzia i sprzęt wykorzystywane do wykonania wstrzyknięcia soli hipertonicznej, co powoduje wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego. Pokazujemy wstrzyknięcie do splotu żylnego nadtwardówkowego z charakterystycznym efektem blaknięcia oraz wynikającym z tego zmętnieniem komory przedniej. Opisujemy również proce...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje metodę wywoływania stanów podobnych do jaskry w modelu szczura in vivo . Procedura ta wykorzystuje wstrzyknięcie hipertonicznego roztworu soli fizjologicznej w celu wywołania bliznowacenia w siatce beleczkowej 29, 32. Rozwijająca się tkanka bliznowata blokuje odpływ cieczy wodnistej, która zwiększa ciśnienie w komorze przedniej. Wraz ze zmniejszonym odpływem i wzrostem ciśnienia soczewka zawieszona na elastycznych więzadłach wpycha się z powrotem do komory ciała szklistego. Ciało ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają sprzecznych lub konkurujących ze sobą interesów, które mogliby ujawnić.

Podziękowania

C. Linn jest wspierany przez grant NIH (NIH NEI EY022795).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorowodorek ksylazyny, Minimum 99%Sigma, Life ScienceX1251-1G
Chlorowodorek ketaminy do wstrzykiwań, USP, 100mg/ml Putney, IncNDC 26637-411-01Butelka 10 ml
Maleinian acepromazyny, 10 mg / mlPhoenix Pharmaceutical, IncNDC 57319-447-04, 670008L-03-0408Butelka 50 ml
Butelka surowicy, 10 mlVWR16171319szkła borokrzemianowego
1 ml Igła VWRBD32941028 G 
Chlorek soduSigma Rozwiązanie S76532 M 
Ściągacz mikroelektrod Narishige GroupPP-830
Ciężkie, polerowane, standardowe i cienkościenne rurki borokrzemianowe Sutter InstrumentsB150-86-10HPbez filamentu, igła
strzykawkowa Microfil 0,86 mm do napełniania mikropipetWorld Precision Instruments, IncMF28G
Igła Luer-Lock o rozmiarze 18 FisherScientific1130421Igła strzykawkowa
Elastyczna rurka polietylenowaFisher Scientific22046941Średnica 0,034 cala, około 10 cali 
Chlorowodorek proparakainy roztwór okulistyczny, USP, 0.5%Akorn, IncNDC 17478-263-1215 ml  sterylna butelka 
Zakrzywione nożyczkiNarzędzia do nauki14061-11
MikroskopLeica Zacisk Hemostat StereoZoom 4
 Fine Science Tools1310912zakrzywiona
krawędź Potrójna maść antybiotykowa Fisher ScientificNC0664481
Rękojeść skalpelaFine Science Tools 10004-13
Ostrze skalpela #11Fine Science Tools 10011-00
60 mm x 15 mm Jednorazowa szalka PetriegoVWR351007
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami 10x KoncentratSigma, Nauki przyrodnicze P7059-1L1x rozcieńczenie 
Nożyczki sprężynoweNarzędzia do nauki pięknej 15009-08
Kleszcze (2), Dumont # 5Fine Science Tools11251-30
Pipety transferowe 3 ml, polietylenowe, niesterylneBD Biosciences357524 lub 52947-948Podziałka 1 i 2 ml
35 mm x 10 mm Easy Grip Szalka Petriego BD Biosciences351008
Sylgard 184VWR102092-312
Igły
ParaformaldehydEMD Millipore PX0055-3 lub 818715.0100Przekształcony w 4% roztwór 
Triton X-100Sigma T9284-100 mlWytwarzany zarówno w roztworze 1%, jak i 0,1% 
Surowica bydlęca płodu Atlanta BiologicalS11150500 ml
Oczyszczony mysz Anti-Rat CD90/mysz CD90.1BD PharmingenCat 554892rozcieńczenie 1:300 
Alexa Fluor 594 kozia anty-mysz Technologie życiowe A11005Rozcieńczenie 1:300 
Szkiełka mikroskopoweCorning 2948-75x25
Glicerol Sigma G5516-100 ml 50% glicerolu do 50% PBS, wagowo 
Szkło nakrywkowe Corning 2975-225Grubość 1 22 x 50 mm 
Mikroskop konfokalnyNikon C2 Zaćmienie Ti
Strzykawka insulinowa ze kaktusowe

Bibliografia

  1. Goel, M., Picciani, R. G., Lee, R. K., Bhattacharya, S. K. Aqueous Humor Dynamics: A Review. Open Ophthalmol. J. 4, 52-59 (2010).
  2. Thylefors, B., Negrel, A. D. The global impact of glaucoma. Bull. World Health Organ. 72 (3), 323-326 (1994).
  3. Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie, K. Y. Global data on blindness. Bull. World Health Organ. 73 (1), 115-121 (1995).
  4. Roodhooft, J. M. Leading causes of blindness worldwide. Bull Soc. Belge. Ophtalmol. 283, 19-25 (2002).
  5. Sacca, S., Pulliero, A., Izzotti, A. The Dysfunction of the Trabecular Meshwork During Glaucoma Course. J. Cell. Physiol. 230 (3), 510-525 (2014).
  6. McKinnon, S. J., Goldberg, L. D., Peeple, P., Walt, J. G., Bramley, T. J. Current Management of Glaucoma and the Need for Complete Therapy. Am. J. Manag. Care. 14 (1 Suppl), S20-S27 (2008).
  7. Lee, D. A., Higginbotham, E. J. Glaucoma and its treatment: a review. Am. J. Health Syst. Pharm. 62, 691-699 (2005).
  8. Brandt, J. D., Vandenburgh, A. M., Chen, K., Whitcup, S. M. Bimatoprost Study Group. Comparison of once- or twice-daily bimatoprost with twice-daily timolol in patients with elevated IOP: a 3-month clinical trial. Ophthalmology. 108, 1023-1031 (2001).
  9. Camras, C. B. Comparison of latanoprost and timolol in patients with ocular hypertension and glaucoma: a six-month masked, multicenter trial in the United States. The United States Latanoprost Study Group. Ophthalmology. 103, 138-147 (1996).
  10. Netland, P. A., et al. Travoprost compared with latanoprost and timolol in patients with open-angle glaucoma or ocular hypertension. Am. J. Ophthalmol. 132, 472-484 (2001).
  11. Sherwood, M., Brandt, J. Bimatoprost Study Groups 1 and 2. Six-month comparison of bimatoprost once-daily and twice-daily with timolol twice-daily in patients with elevated intraocular pressure. Surv. Ophthalmol. 45 (Suppl 4), S361-S368 (2001).
  12. Watson, P., Stjernschantz, J. A six-month, randomized, double-masked study comparing latanoprost with timolol in open-angle glaucoma and ocular hypertension. The Latanoprost Study Group. Ophthalmology. 103, 126-137 (1996).
  13. Hedman, K., Alm, A., Gross, R. L. Pooled-data analysis of three randomized double-masked, six-month studies comparing intraocular pressure-reducing effects of latanoprost and timolol in patients with ocular hypertension. J. Glaucoma. 12 (6), 463-465 (2003).
  14. Schumer, R. A., Podos, S. M. The nerve of glaucoma! Arch. Ophthalmol. 112, 37-44 (1994).
  15. Tsai, J. C., Chang, H. W. Comparison of the effects of brimonidine 0.2% and timolol 0.5% on retinal nerve fiber layer thickness in ocular hypertensive patients: a prospective, unmasked study. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 21 (6), 475-482 (2005).
  16. Wilhelm, B., Ludtke, H., Wilhelm, H. The BRAION Study Group. Efficacy and tolerability of 0.2% brimonidine tartrate for the treatment of acute non-arteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION): a 3-month, double-masked, randomised, placebo-controlled trial. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 244, 551-558 (2006).
  17. Fazzone, H. E., Kupersmith, M. J., Leibmann, J. Does topical brimonidine tartrate help NAION? Br. J. Ophthalmol. 87, 1193-1194 (2003).
  18. Harris, A., Arend, O., Kagemann, L., Garrett, M., Chung, H. S., Martin, B. Dorzolamide, visual function and ocular hemodynamics in normal-tension glaucoma. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 15, 189-197 (1999).
  19. Leahy, K. E., White, A. J. Selective laser trabeculoplasty: current perspectives. Clin. Ophthalmol. 11 (9), 833-841 (2015).
  20. Nesaratnam, N., Sarkies, N., Martin, K. R., Shahid, H. Pre-operative intraocular pressure does not influence outcome of trabeculectomy surgery: a retrospective cohort study. BMC Ophthalmol. 15 (1), 17(2015).
  21. Cairns, J. E. Trabeculectomy. Preliminary report of a new method. Am. J. Ophthalmol. 66 (4), 673-679 (1968).
  22. Cheng, J. W., Cai, J. P., Wei, R. L. Meta-analysis of medical intervention for normal tension glaucoma. Ophthalomology. 116 (7), 1243-1249 (2009).
  23. Dielmans, I., Vingerling, J. R., Wolfs, R. C. W., Hofman, A., Grobbee, D. E., deJong, P. T. V. M. The prevalence of primary open-angle glaucoma in a population based study in The Netherlands: the Rotterdam Study. Ophthalmology. 101, 1851-1855 (1994).
  24. Lichter, P. R., et al. Interim clinical outcomes in the Collaborative Initial Glaucoma Treatment Study comparing initial treatment randomized to medications or surgery. Ophthalmology. 108 (11), 1943-1953 (2001).
  25. Heijl, A., et al. Reduction of intraocular pressure and glaucoma progression: results from the Early Manifest Glaucoma Trial. Arch. Ophthalmol. 120 (10), 1268-1279 (2002).
  26. Kass, M. A., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Arch. Ophthalmol. 120 (6), 701-713 (2002).
  27. Beidoe, G., Mousa, S. A. Current primary open-angle glaucoma treatments and future directions. Clin. Ophthalmol. 6, 1699-1707 (2012).
  28. Jeong, J. H., Park, K. H., Jeoung, J. W., Kim, D. M. Preperimetric normal tension glaucoma study: long-term clinical course and effect of therapeutic lowering of intraocular pressure. Acta. Ophthalmol. 92 (3), e185-e193 (2014).
  29. Morrison, J. C., Moore, C. G., Deppmeier, L. M., Gold, B. G., Meshul, C. K., Johnson, E. C. A Rat Model of Chronic Pressure-Induced Optic Nerve Damage. Exp. Eye Res. 64 (1), 85-96 (1997).
  30. Morrison, J. C., Johnson, E., Cepurna, W. O. Rat Models for Glaucoma Research. Prog. Brain Res. 173, 285-301 (2008).
  31. Iwamoto, K., Birkholz, P., Schipper, A., Mata, D., Linn, D. M., Linn, C. L. A Nicotinic Acetylcholine Receptor Agonist Prevents Loss of Retinal Ganglion Cells in a Glaucoma Model. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (2), 1078-1087 (2014).
  32. Morrison, J. C., Fraunfelder, F. W., Milne, S. T., Moore, C. G. Limbal Microvasculature of the Rat Eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 36 (3), 751-756 (1995).
  33. McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse Models of Retinal Ganglion Cell Death and Glaucoma. Exp. Eye Res. 88 (4), 816-824 (2009).
  34. Maass, A., et al. Assessment of Rat and Mouse RGC Apoptosis Imaging in Vivo with Different Scanning Laser Ophthalmoscopes. Curr. Eye Res. 32 (10), 851-861 (2007).
  35. Li, Y., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Experimental induction of retinal ganglion cell death in adult mice. Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 40 (5), 1004-1008 (1999).
  36. Gross, R. L., et al. A mouse model of elevated intraocular pressure: retina and optic nerve findings. Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 101, 163-171 (2003).
  37. Cenni, M. C., Bonfanti, L., Martinou, J. C., Ratto, G. M., Strettoi, E., Maffei, L. Long-term survival of retinal ganglion cells following optic nerve section in adult bcl-2 transgenic mice. Eur. J. Neurosci. 8 (8), 1735-1745 (1996).
  38. Templeton, J. P., Geisert, E. E. A practical approach to optic nerve crush in the mouse. Mol. Vis. 18, 2147-2152 (2012).
  39. Schlamp, C. L., Johnson, E. C., Li, Y., Morrison, J. C., Nickells, R. W. Changes in Thy1 gene expression associated with damaged retinal ganglion cells. Mol. Vis. 7, 192-201 (2001).
  40. Libby, R. T., et al. Susceptibility to neurodegeneration in a glaucoma is modified by Bax gene dosage. PLoS Genet. 1, 17-26 (2005).
  41. Yang, Z., et al. Changes in gene expression in experimental glaucoma and optic nerve transection: the equilibrium between protective and detrimental mechanisms. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (12), 5539-5548 (2007).
  42. Huang, W., Fileta, J., Guo, Y., Grosskreutz, C. L. Downregulation of Thy1 in retinal ganglion cells in experimental glaucoma. Curr. Eye Res. 31 (3), 265-271 (2006).
  43. Smedowski, A., Pietrucha-Dutczak, M., Kaarniranta, K., Lewin-Kowalik, J. A rat experimental model of glaucoma incorporating rapid-onset elevation of intraocular pressure. Sci. Rep. 4, 1-11 (2014).
  44. Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Exp. Eye Res. 91 (3), 415-424 (2010).
  45. Pease, M. E., Cone, F. E., Gelman, S., Son, J. L., Quigley, H. A. Calibration of the TonoLab tonometer in mice with spontaneous or experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (2), 858-864 (2011).
  46. Cone, F. E., et al. The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma. Exp. Eye Res. 99, 27-35 (2012).
  47. Frankfort, B. J., et al. Elevated intraocular pressure causes inner retinal dysfunction before cell loss in a mouse model of experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (1), 762-770 (2013).
  48. Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51 (1), 207-216 (2010).
  49. Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53 (7), 3847-3857 (2012).
  50. Cone-Kimball, E., et al. Scleral structural alterations associated with chronic experimental intraocular pressure elevation in mice. Mol. Vis. 19, 2023-2039 (2013).
  51. Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (3), 1671-1675 (2011).
  52. WoldeMussie, E., Ruiz, G., Wijono, M., Wheeler, L. A. Neuroprotection of retinal ganglion cells by brimonidine in rats with laser-induced chronic ocular hypertension. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42 (12), 2849-2855 (2001).
  53. Garcia-Valenzuela, E., Shareef, S., Walsh, J., Sharma, S. C. Programmed cell death of retinal ganglion cells during experimental glaucoma. Exp. Eye Res. 61 (1), 33-44 (1995).
  54. Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Experimental mouse ocular hypertension: establishment of the model. Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 44 (10), 4314-4320 (2003).
  55. Ji, J., et al. Effects of elevated intraocular pressure on mouse retinal ganglion cells. Vision Res. 45 (2), 169-179 (2005).
  56. Flammer, J., et al. The eye and the heart. Eur. Heart J. 34 (17), 1270-1278 (2013).
  57. Gugleta, K., et al. Association between risk factors and glaucomatous damage in untreated primary open-angle glaucoma. J. Glaucoma. 22 (6), 501-505 (2013).
  58. Mozaffarieh, M., Flammer, J. New insights in the pathogenesis and treatment of normal tension glaucoma. Curr. Opin. Pharmacol. 13 (1), 43-49 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model jaskrykomórki zwojowe siatkówkiwstrzyknięcie do żyły nadtwardówkowejsól hipertonicznaanaliza utraty RGCprzygotowanie mikroiłyizolacja miseczki gałki ocznejprzypinanie siatkówkibarwienie immunocytochemiczne
Procedura indukująca jaskrę w modelu szczura in vivo i preparat siatkówki z pełnym mocowaniem
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.