Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In vivo (in vivo) Alkaliczny test kometologiczny i test alkaliczny komety modyfikowany enzymami do pomiaru pęknięć nici DNA i oksydacyjnych uszkodzeń DNA w wątrobie szczura

15.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53833

⸱

4 maja 2016

 ,  ,  ,  , 
1Division of Genetic and Molecular Toxicology, US FDA/National Center for Toxicological Research, 2Toxicologic Pathology Associates, US FDA/National Center for Toxicological Research

W tym artykule

Podsumowanie

Alkaliczny test komet mierzy pęknięcia nici DNA w komórkach eukariotycznych. Dodając etap trawienia endonukleazy III lub ludzkiej 8-oksoguaniny-DNA-N-glikozylazy, test może skutecznie wykryć oksydacyjne uszkodzenie DNA. Opisujemy metody stosowania tych testów do wykrywania uszkodzeń DNA w wątrobie szczura.

Streszczenie

Nienaprawione uszkodzenia DNA mogą prowadzić do niestabilności genetycznej, co z kolei może przyspieszyć rozwój raka. Dlatego identyfikacja potencjalnych czynników uszkadzających DNA jest ważna dla ochrony zdrowia publicznego. Test alkalicznych komet in vivo, który wykrywa uszkodzenia DNA w wyniku pęknięcia nici, jest szczególnie istotny dla oceny zagrożeń genotoksycznych ksenobiotyków, ponieważ jego reakcje odzwierciedlają wchłanianie in vivo, dystrybucję w tkankach, metabolizm i wydalanie (ADME) substancji chemicznych, a także proces naprawy DNA. W porównaniu z innymi testami uszkodzeń DNA in vivo, test jest szybki, czuły, wizualny i niedrogi, a dzięki przekształcaniu oksydacyjnych uszkodzeń DNA w pęknięcia nici przy użyciu określonych enzymów naprawczych, test może mierzyć oksydacyjne uszkodzenia DNA w sposób wydajny i stosunkowo wolny od artefaktów. Pomiar uszkodzeń DNA za pomocą testu komety może być przeprowadzony zarówno przy użyciu projektów badań toksykologii ostrej, jak i podprzewlekłej, a dzięki integracji testu komety z innymi ocenami toksykologicznymi, test spełnia wymagania dotyczące dobrostanu zwierząt poprzez maksymalne wykorzystanie zasobów zwierzęcych. Kolejną ważną zaletą testów jest to, że wymagają one tylko niewielkiej ilości komórek, a komórki nie muszą pochodzić z proliferujących populacji komórek. Testy można również wykonywać na różnych próbkach ludzkich uzyskanych od osób narażonych klinicznie lub zawodowo.

Wprowadzenie

Alkaliczny test komet mierzy pęknięcia nici DNA na poziomie pojedynczej komórki. Zawiesiny pojedynczych komórek są zatapiane w agarozie na szkiełku mikroskopowym, a komórki poddawane lizie w celu utworzenia nukleoidów, które zawierają superskręcone pętle DNA. Elektroforeza przy pH >13 powoduje utratę superzwijania w pętlach DNA zawierających pęknięcia nici, przy czym uwolnione nici DNA migrują w kierunku anody, tworząc struktury podobne do komet, które można zaobserwować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Fragmentaryczne DNA migruje z "głowy" komety do "warkocza" w zależności od wielkości fragmentu, a względna fluorescencja warkocza komety w porównaniu z całkowitą intensywnością (głowa i warkocz) może być wykorzystana do ilościowego określenia pęknięcia DNA1,2. Test jest prosty, czuły, wszechstronny, szybki i stosunkowo niedrogi1. Wykrywanie fragmentarycznego DNA spowodowanego przez czynniki uszkadzające DNA stosuje się jako test do ilościowego określania uszkodzeń DNA w komórkach lub izolowanych jądrach z pojedynczych tkanek zwierząt poddanych działaniu potencjalnie genotoksycznego materiału (materiałów) genotoksycznego. Ze względu na swoje zalety, test komet in vivo jest zalecany jako drugi test genotoksyczności in vivo (w połączeniu z testem mikrojądrowym in vivo) do przeprowadzania ocen bezpieczeństwa produktu zgodnie z aktualnymi wytycznymi regulacyjnymi Międzynarodowej Konferencji Harmonizacji (ICH)3 i Europejskiego Urzędu ds. Bezpieczeństwa Żywności (EFSA)4. W naszym laboratorium zastosowaliśmy test do oceny uszkodzeń DNA in vivo wywołanych przez składniki żywności, farmaceutyki i nanomateriały5-10. Wątroba szczura zostanie użyta jako przykład w tym protokole, ale test komety można przeprowadzić na innych tkankach/narządach zwierząt doświadczalnych, o ile nienaruszone pojedyncze komórki mogą zostać wyizolowane z tkanki.

Niektóre rodzaje uszkodzeń DNA są trudne do wykrycia, gdy nić DNA pęka bez modyfikacji podstawowego alkalicznego testu komety. W przypadku oksydacyjnego uszkodzenia DNA, pęknięcia nici mogą powstawać w zmianach oksydacyjnych w DNA poprzez trawienie enzymami naprawczymi, takimi jak ludzka 8-oksoguanina-DNA-N-glikozylaza 1 (hOGG1, która tworzy pęknięcia przy 8-oksaguaninie (8-oxoGua) i metylofapy-guaninie11. Również endonukleaza III (Endo III) tworzy przerwy głównie w utlenionych pirymidynach1. W związku z tym dodanie etapu trawienia enzymatycznego sprawia, że test jest specyficzną i czułą metodą pomiaru oksydacyjnych uszkodzeń DNA in vivo12. Korzystając z tych testów, wykazaliśmy indukowane przez toksyny oksydacyjne uszkodzenie DNA w wątrobie szczurów i myszy6-8 oraz w sercu szczurów10.

Alkaliczny test komet ma wiele zastosowań w toksykologii genetycznej i biomonitoringu ludzi: 1) jako kontynuacja testu in vivo dla genotoksyn zidentyfikowanych przez czułe testy in vitro 3,13, 2) do oceny mechanizmów indukowanego przez ksenobiotyki uszkodzenia DNA w wielu tkankach14, 3) do zbadania, czy czynnik rakotwórczy działa przy użyciu genotoksycznego czy niegenotoksycznego sposobu działania (MOA)7, 4) ocena naprawy uszkodzeń DNA15, 5) badanie chorób człowieka i narażenia zawodowego 16 oraz 6) jako potencjalny wysokoprzepustowy test przesiewowy pod kątem genotoksyczności specyficznej dla narządów17.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) przy amerykańskim FDA/Narodowym Centrum Badań Toksykologicznych.

UWAGA: Opisany tutaj projekt badania opiera się na protokole opracowanym przez Japońskie Centrum Walidacji Metod Alternatywnych (JaCVAM) dla walidacji testu in vivo na alkalicznych kometach gryzoni18 i dalej modyfikowanym w oparciu o zalecenia zawarte w wytycznych OECD TG48919.

1. Przygotowanie

  1. Przygotowanie preparatów
    1. Rozpuścić zwykłą topniejącą agarozę w stężeniu 1% (m/v) w buforze fosforanowym (wolnym od Ca2+, Mg2+ i bez czerwieni fenolowej) przez podgrzanie w kuchence mikrofalowej.
    2. Umieścić stopiony 1% roztwór wzorcowy agarozy w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C i wyrównać temperaturę z temperaturą kąpieli. Zanurz szklane szkiełka mikroskopowe w roztworze agarozy, odcedź nadmiar agarozy i wytrzyj tylną część szkiełek do czysta. Umieść szkiełka pionowo na płaskiej powierzchni i pozwól im wyschnąć w temperaturze pokojowej; Przechowuj szkiełka w suchym miejscu.
  2. Przygotowanie roztworów do oznaczania komet
    1. Przygotować 0,5% niskotopliwy roztwór agarozy. Niskotopliwą agarozę rozpuścić w buforze fosforanowym (bez Ca2+, Mg2+ i czerwieni fenolowej) przez ogrzewanie w kuchence mikrofalowej. Utrzymywać roztwór w temperaturze 37-45 °C podczas przygotowywania szkiełka komety; Następnie należy wyrzucić pozostały roztwór agarozy.
    2. Przygotować bufor do lizy. Przygotować 100 mM roztwór disodowego kwasu etylenodiaminotetraoctowego (disodowy EDTA, Mr 372,24 g/mol), 2,5 M chlorku sodu (NaCl, Mr 58,44 g/mol) i 10 mM tris-hydroksymetyloaminometanu (zasada tris, Mr 121,14 g/mol) w oczyszczonej wodzie i dostosować do pH 10 za pomocą 10 N roztworu wodorotlenku sodu (NaOH, Mr 40 g/mol). W dniu stosowania dodać Triton X100 i dimetylosulfotlenek (DMSO, Mr 78,13 g/mol) do roztworu, aby osiągnąć końcowe stężenia odpowiednio 1% i 10%, a następnie mieszać w temperaturze 4-10 °C przez co najmniej 30 minut przed użyciem.
    3. Przygotuj świeży bufor enzymatyczny w dniu użycia. Przygotować roztwór zawierający 40 mM kwasu 2-[4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-ylo]etanosulfonowego (HEPES, Mr 238,3 g/mol), 100 mM chlorku potasu (KCl, Mr 74,55 g/mol), 0,5 mM disodowego EDTA i 0,2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA, Mr 66,463 g/mol) w wodzie oczyszczonej. Doprowadzić pH do 8,0 za pomocą 10 N roztworu wodorotlenku potasu (KOH, 56,1 g/mol). Wymieszać w RT i sprawdzić całkowite rozpuszczenie przed użyciem.
    4. Przygotować alkaliczny roztwór buforowy zawierający 300 mM NaOH i 1 mM EDTA disodowy w oczyszczonej wodzie. Mieszać w temperaturze 4-10 °C przez co najmniej 30 minut przed użyciem. Przed użyciem zmierz pH roztworu i upewnij się, że pH wynosi >13.
    5. Przygotować roztwór 0,4 M Tris Base w oczyszczonej wodzie i dostosować do pH 7,5 kwasem solnym (HCl, Mr 36,46). Przechowywać roztwór w temperaturze 4-10 °C. Jest to bufor neutralizujący.
    6. Przygotuj świeży bufor do mielenia w dniu użycia. Przygotuj roztwór zawierający 20 mM disodowego EDTA i 10% DMSO w zrównoważonym roztworze soli Hanka (bez HBSS, Ca2+, Mg2+ i czerwieni fenolowej). Przechowywać na lodzie do czasu użycia.
    7. Aby przygotować roztwór barwiący, rozcieńczyć fluorescencyjny roztwór podstawowy barwienia kwasu nukleinowego z tris-boranem-EDTA (bufor TBE) w stosunku 1:10 000 (v/v). Chroń roztwór przed światłem za pomocą folii aluminiowej. Przechowywać w temperaturze 2-8 °C i używać przez 24 godziny.

2. Przygotowanie zawiesin jednokomórkowych z wątroby szczura

  1. Eutanazja szczurów za pomocą gazu CO2 zgodnie z metodami zalecanymi w Amerykańskich Wytycznych Medycyny Weterynaryjnej dotyczących Eutanazji Zwierząt: 2013 Wydanie20.
    1. Ustaw natężenie przepływu CO2 na 2.75. Umieść szczura w komorze eutanazyjnej (np. słoiku eksykatora, klatce dla szczurów z wentylowaną pokrywą) i włącz CO2, otwierając zawór zbiornika. Odczekaj od 1,5 do 2,5 minuty, aż szczur straci przytomność. Zwiększ przepływ CO2 do maksymalnego ustawienia. Po ustaniu oddychania pozostaw szczura w komorze na około 1 minutę, aby zapewnić eutanazję. Zweryfikuj eutanazję, badając palpacyjnie, aby potwierdzić, że szczur nie ma bicia serca, i szczypiąc palce u stóp, aby ustalić, czy szczur nie wycofuje kończyny.
  2. Zdezynfekuj skórę włosów 70% etanolem. Otwórz jamę brzuszną i usuń nienaruszoną wątrobę nożyczkami chirurgicznymi. Po usunięciu wątroby usuń lewy płat boczny z pozostałej wątroby za pomocą nożyczek chirurgicznych. Umieść lewy płat boczny na desce do krojenia i odetnij dwie sąsiednie poprzeczne sekcje o grubości 3-4 mm za pomocą jednorazowej jednosiecznej żyletki.
  3. Umieść jeden poprzeczny odcinek na bibule filtracyjnej (aby zapobiec zwijaniu się sekcji) i umieść odcinek w 10% neutralnej buforowanej formalinie (NBF). Upewnij się, że stosunek 10% NBF do tkanki wynosi 10:1 lub więcej. Po czasie utrwalenia wynoszącym co najmniej 72 godziny należy przetworzyć wątrobę pod kątem histopatologii (patrz punkt 7 poniżej).
  4. Umieścić drugi poprzeczny odcinek wątroby w 5 ml lodowatego buforu do mielenia mięsa (sekcja 1.2.6) na 6 cm szalce Petriego i spłukać 3 razy w celu usunięcia resztek krwi.
  5. Przenieść część wątroby do nowej probówki wirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml lodowatego buforu do mielenia mięsa. Zmiel dobrze wypłukaną część wątroby cienkimi nożyczkami, aby uwolnić komórki. Przecedź zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 40 μm, aby usunąć wszelkie grudki tkanki.
  6. Zawiesinę jednokomórkową umieścić na lodzie i użyć do przygotowania szkiełek w ciągu 1 godziny. Sprawdzić stężenie komórek przez liczenie (np. za pomocą hemocytometru lub elektronicznego licznika komórek), aby upewnić się, że jego stężenie wynosi około 2 x 106 komórek/ml.

3. Przygotowanie preparatów kometarnych

  1. Zmieszać jedną objętość zawiesiny jednokomórkowej z 10 objętościami stopionego, 0,5% niskotopliwego roztworu agarozy o temperaturze 37 °C (sekcja 1.2.1). Natychmiast odpipetować 100 μl na szkiełko pokryte agarozą o regularnej temperaturze topnienia (sekcja 1.1). Natychmiast umieść szkiełko nakrywkowe na mieszaninie komórek i agarozy. Wykonaj co najmniej 8 preparatów dla każdej próbki.
    UWAGA: Wszystkie slajdy powinny być oznaczone numerem lub podobnym kodem, a ich tożsamość powinna być zapisana, tak aby slajdy mogły być oceniane w sposób zaślepiony (patrz 6.2.2 poniżej).
  2. Szkiełka ułożyć płasko i schłodzić do temperatury 4 °C przez 30 minut.
  3. Po zestaleniu się żelu delikatnie usunąć szkiełka nakrywkowe i zanurzyć je we wstępnie schłodzonym buforze do lizy (sekcja 1.2.2). Chronić szkiełka przed światłem i utrzymywać je w buforze do lizy w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę (minimum) do O/N (maksimum).

4. Enzymatyczna obróbka szkiełków kometowych

  1. Wyjąć 6 z 8 szkiełek przygotowanych z każdej próbki tkanki z buforu do lizy i płukać je 3x przez 5 minut za pomocą buforu enzymatycznego (sekcja 1.2.3) w temperaturze pokojowej. Użyć pozostałych dwóch szkiełek do alkalicznego testu kometarnego bez leczenia enzymatycznego (patrz 5.1 poniżej). Po spłukaniu usuń nadmiar płynu, odsączając i osuszając szkiełka chusteczkami.
  2. Rozcieńczyć zapasy enzymów hOGG1 i Endo III buforem enzymatycznym w stosunku 1:1 000 (v/v). Ułóż na lodzie do czasu użycia.
  3. Na szkiełka przygotowane z każdej grupy poddanej działaniu substancji nanieść 200 μl następujących roztworów: 200 μl samego buforu enzymatycznego (2 szkiełka używane jako szkiełka referencyjne), 200 μl roztworu hOGG1 (2 szkiełka) lub 200 μl roztworu Endo III (2 szkiełka).
  4. Umieścić szkiełka na płytkach Petriego wyłożonych zwilżonymi ręcznikami papierowymi, przykryć szkiełka Parafilmem i inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut w przypadku szkiełek poddanych działaniu Endo III i szkiełek referencyjnych oraz 30 minut w przypadku szkiełek poddanych działaniu hOGG1.
  5. Po inkubacji przepłukać szkiełka wodą destylowaną i kontynuować przetwarzanie zgodnie z opisem w ppkt 5.2 poniżej.

5. Odwijanie i elektroforeza

  1. W przypadku szkiełek niepoddanych działaniu enzymów, należy wyjąć szkiełka z buforu do lizy, opróżnić szkiełka i przepłukać je zimnym buforem neutralizującym (sekcja 1.2.5) przez 5 minut w celu usunięcia pozostałości detergentu i soli.
  2. Umieść szkiełka z kroków 4.5 i 5.1 losowo w poziomym zbiorniku do elektroforezy żelowej, unikając wszelkich odstępów. Napełnij zbiornik świeżo przygotowanym buforem do elektroforezy o pH > 13 (sekcja 1.2.4), aż poziom cieczy zakryje szkiełka (unikaj pęcherzyków na agarozie i upewnij się, że zbiornik jest wypoziomowany). Zapisać pH i temperaturę buforu na początku rozwijania DNA.
  3. Pozostaw szkiełka w buforze alkalicznym przez 20 minut, aby umożliwić rozwinięcie DNA i wyrażenie uszkodzeń odpornych na alkalia.
  4. Podczas odwijania zaprogramuj zasilacz tak, aby wytwarzał 0,7 V/cm w zbiorniku do elektroforezy (V/cm = wolty podzielone przez odległość w cm między elektrodami dodatnim i ujemnym).
  5. Po odwinięciu naciśnij przycisk pracy na zasilaczu. W razie potrzeby dostosuj prąd do 300 mA, podnosząc lub obniżając poziom bufora. Utrzymuj poziom bufora tuż nad powierzchnią szkiełek. Przeprowadzić elektroforezę w temperaturze 4 °C przez 20 min. Zapisz położenie szkiełka, temperaturę bufora i prąd (amps) na początku i na końcu elektroforezy.
    UWAGA: Zbyt duży bufor spowoduje niższe napięcia, które mogą zakłócać migrację DNA.
  6. Po elektroforezie zneutralizować nadmiar zasady, delikatnie podnosząc szkiełka ze zbiornika i zanurzając je w buforze neutralizacyjnym (sekcja 1.2.5) na 5 minut. Opróżnij szkiełka i powtórz jeszcze dwa razy.
  7. Zamocuj szkiełka, zanurzając je w zimnym 100% etanolu na 5 minut. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu i umieść w suchym miejscu do przechowywania.

6. Barwienie DNA, wizualizacja i analiza komety

  1. Barwienie DNA
    1. Umieścić szkiełka na tekturowej lub metalowej tacce i dodać 200 μl roztworu roboczego barwienia fluorescencyjnego kwasu nukleinowego (sekcja 1.2.7) do każdego szkiełka i przykryć szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Chroń szkiełka przed światłem, pozwól im pozostać w kontakcie z roztworem barwiącym przez co najmniej 30 minut przed nacięciem. Szkiełka należy barwić partiami po 20 sztuk na raz.
    2. Przed przeczytaniem każdego slajdu delikatnie zetrzyj nadmiar roztworu barwiącego, uważając, aby nie naruszyć szkła nakrywkowego.
  2. Wizualizacja i punktacja komety
    1. Użyj kamery wideo podłączonej do mikroskopu fluorescencyjnego, aby wyświetlić obrazy na żywo slajdu komety na monitorze komputera.
    2. Losowo wybierz pole mikroskopu zawierające komórki. Za pomocą myszy zaznacz komórkę. Kliknij środek "głowy komety" lewym przyciskiem myszy.
      UWAGA: Oprogramowanie komputerowe oblicza wszystkie parametry pomiarowe dla komórki i dodaje dane do pliku danych.
    3. Oceń wszystkie komórki w bieżącym polu (patrz krok 6.2.4), a następnie użyj elementów sterujących stolika mikroskopu i wideo na ekranie, aby znaleźć inny zestaw komórek. Oceń te komórki zgodnie z opisem w pkt 6.2.2.
    4. Naciąć zjeżdżalnię od prawej do lewej i w dół do góry. Wybierz losowo około 10 pól. Podczas tego procesu każda odpowiednia komórka komety, która pojawi się w polu obserwacji, powinna zostać oceniona bez uprzedzeń.
      UWAGA: Nie należy oceniać komety, jeśli spełniony jest którykolwiek z poniższych warunków: 1) znajduje się ona na którejkolwiek z krawędzi zjeżdżalni; 2) dwie lub więcej komet nakłada się na siebie; 3) w ogonie znajdują się szczątki; 4) oprogramowanie nie jest w stanie odróżnić głowy od ogona; lub 5) zabarwienie jądra i/lub warkocza różni się znacznie od innych komet na szkiełku.
      UWAGA: Komety, których prawie cała fluorescencja DNA znajduje się w warkoczu, są często określane jako komety "jeża". Komety jeża nie powinny być oceniane, ale liczba jeży wykrytych podczas punktacji slajdów powinna być rejestrowana i podawana jako procent wszystkich komet.
    5. Przeanalizuj co najmniej 75 komet na szkiełku, odczytując po dwie matryce z każdego narządu/tkanki, aby uzyskać w sumie co najmniej 150 komórek/próbkę komety. Po ocenieniu wymaganej liczby komórek ze slajdu wynik jest zapisywany jako plik arkusza kalkulacyjnego do późniejszej analizy danych.

7. Analiza histopatologiczna

  1. Po co najmniej 72-godzinnym utrwaleniu w 10% NBF, a następnie wycięciu tkanek21, rutynowo przetworzyć i osadzić lewy boczny płat wątroby próbek w podłożu na bazie parafiny22. Próbki należy podzielić na części o wielkości około 5 mikronów i zebrać na szkiełkach podstawowych.
  2. Wybarwić skrawki hematoksyliną i eozyną (H&E):
    1. Podgrzewać szkiełka z sekcjami tkanki parafinowej w piecu o temperaturze 60 °C przez 2 godziny przed zabiegiem barwienia.
    2. Użyj ksylenu do odparafiniowania boków. Ponownie nawodnić szkiełka stopniowanym etanolem (EtOH) do płynnego płukania wodą z kranu.
    3. Umieścić szkiełka w 450 ml hematoksyliny na 2 minuty i 40 sekund. Płukać szkiełka kwasem (2 ml lodowatego kwasu octowego na 450 ml wody dejonizowanej) przez 4 sekundy, a następnie płukać wodą z kranu przez 5 minut.
    4. Umieścić szkiełka w 450 ml 70% EtOH zawierającym 1 ml wodorotlenku amonu na 2 minuty, a następnie płukać bieżącą wodą z kranu przez 2 minuty i 30 sekund, a 70% płukać EtOH przez 1 minutę.
    5. Inkubować szkiełka z 450 ml roztworu eozyny Y zawierającego 4 ml lodowatego kwasu octowego przez 3 minuty.
    6. Odwodnić szkiełka za pomocą stopniowanego EtOH. Wyczyść szkiełka ksylenem (trzy razy po 1 minutę) i przytrzymaj szkiełka w ksylenie, aż szkiełka nakrywkowe zostaną umieszczone na szkiełkach.
  3. Zbadaj szkiełka za pomocą mikroskopii świetlnej, zapisz wyniki i nasilenie zmian nienowotworowych jako 1 (minimalne), 2 (łagodne), 3 (umiarkowane) lub 4 (zaznaczone).
    UWAGA: Stopień nasilenia zastosowany dla określonej zmiany opiera się na względnej proporcji wątroby z uszkodzeniem (minimalna = <1-15%; łagodna = 16-35%; umiarkowana = 36-60%; i oznaczona = 61-100%).

8. Analiza danych

  1. Zwierzę jest uważane za jednostkę doświadczalną do ocen statystycznych. Uszkodzenie DNA jest wyrażone jako % DNA w ogonie.
  2. Oksydacyjne uszkodzenia DNA oblicza się w następujący sposób: szkiełka referencyjne (bez obróbki enzymatycznej) dostarczają oszacowania pęknięć nici DNA tła (SB).
    UWAGA: Szkiełka poddane działaniu enzymów zapewniają miarę pęknięć nici i utlenionych zasad (SB + OX). Zakładając liniową odpowiedź na dawkę dla % DNA w ogonie w funkcji uszkodzenia DNA, odjęcie SB od SB + OX daje oszacowanie pęknięć nici DNA od utlenionych pirymidyn/zmienionych puryn23.
  3. Analizować % DNA w ogonie w funkcji dawki za pomocą jednoczynnikowej ANOVA, a następnie test Dunnetta w celu porównania parami reakcji u leczonych zwierząt na kontrolę nośnika.
    UWAGA: Wszystkie testy są jednostronne, a wartość p mniejsza niż 0,05 jest ustawiana jako kryterium istotności statystycznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Test kometowy w warunkach in vivo w wersji alkalicznej przeprowadzono wraz z testem kometowym modyfikowanym enzymatycznie w celu pomiaru zarówno bezpośrednich, jak i oksydacyjnych uszkodzeń DNA w wątrobie szczurów traktowanych octanem cyproteronu (CPA)5. CPA jest syntetycznym lekiem hormonalnym, który indukuje guzy wątroby u szczurów w sposób zależny od płci, przy czym do wywołania guzów wątroby u samców szczurów wymagane są dawki pięciokrotnie wyższe niż u samic2...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje jednoczesny pomiar zarówno bezpośredniego, jak i oksydacyjnego uszkodzenia DNA w wątrobie szczura na poziomie pojedynczej komórki. Protokół ogólny ma zastosowanie do każdej tkanki, z której można wyizolować pojedyncze komórki lub jądra przy minimalnym uszkodzeniu DNA wywołanym przetwarzaniem (tj. uszkodzeniu DNA wywołanym nie przez czynnik badany, ale przez obchodzenie się z tkankami zwierzęcymi i ich przetwarzanie). W naszych badaniach przeprowadziliśmy alkaliczne testy komet na komórkach z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Żaden z autorów nie ma sprzecznych interesów ani sprzecznych interesów. Informacje zawarte w tych materiałach nie stanowią formalnego rozpowszechniania informacji przez FDA i nie reprezentują stanowiska ani polityki agencji.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków. Przyjmujemy do wiadomości oryginalną publikację badania CPA przeprowadzonego przez Elsevier B.V.: Ding W, Bishop ME, Peace MG, Davis KJ, White GA, Lyn-Cook LE, Manjanatha MG. Specyficzna dla płci analiza dawka-odpowiedź genotoksyczności u szczurów F344 leczonych octanem cyproteronu. Badania nad mutacjami 774: 1-7, 2014 (PMID: 25440904)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szkiełka nakrywkowe (nr 1, 24 x 50 mm) Fisher12-544-14
Szkiełka mikroskopoweFisher12-550-123
Dimetylosulfotlenek (DMSO) Fisher67-68-5
EDTA, disodowyFisherBP120-1
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiFisherICN1860454
1x Hanks Zrównoważony roztwór soli (HBSS) (Ca2+, Mg2+ free)HyCloneSH30588.02
HEPESFisherBP310-1
Agaroza o niskiej temperaturze topnienia ( LMP)Lonza50081NuSieve GTG Agaroza
Normalnie topliwa agaroza (NMA) PaskiBP1356-100
(pH 7,5-14)FisherM95873
Kloródek potasuFisher7447-40-7
Wodorotlenek potasuFisher1310-58-3
Etykiety ślizgowe (0,94 x 0,5 cala)FisherNC9822036
Chlorek sodu (NaCl) Fisher7647-14-5
Wodorotlenek sodu (NaOH) Fisher1310-73-2
SYBR&handel; Złoto InvitrogenS11494
Triton X-100 Fisher9002-93-1
Baza Trizma Fisher77-86-1
Probówki do mikrowirówek 2,0 mlFisher05-402-6
Sitko do komórek (40 &mikro; m)Fisher22363547
Endonukleaza III (Nth) New England BiolabsM0268SRozcieńczenie 1:1,000
hOGG1 New England BiolabsM0241SRozcieńczenie 1:1,000
papieru do testowania pH Fisher

Bibliografia

  1. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
  2. Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the 'comet' assay. Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).
  3. Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use S2(R1). ICH. , Available from: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Safety/S2_R1/Step4/S2R1_Step4.pdf (2011).
  4. Committee, E. S. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379(2011).
  5. Ding, W., et al. Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 774, 1-7 (2014).
  6. Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of estragole in male F344 rats. Environ Mol Mutagen. 56 (4), 356-365 (2015).
  7. Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of furan in F344 rats at cancer bioassay doses. Toxicol Appl Pharmacol. 261 (2), 164-171 (2012).
  8. Li, Y., et al. Cytotoxicity and genotoxicity assessment of silver nanoparticles in mouse. Nanotoxicology. 8 (suppl 1), 36-45 (2014).
  9. Ding, W., et al. Methyleugenol genotoxicity in the Fischer 344 rat using the comet assay and pathway-focused gene expression profiling. Toxicol Sci. 123 (1), 103-112 (2011).
  10. Manjanatha, M. G., et al. Genotoxicity of doxorubicin in F344 rats by combining the comet assay, flow-cytometric peripheral blood micronucleus test, and pathway-focused gene expression profiling. Environ Mol Mutagen. 55 (1), 24-34 (2014).
  11. Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21 (3), 185-190 (2006).
  12. Collins, A. R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 794-800 (2014).
  13. Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).
  14. Hartmann, A., et al. Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay. 4th International Comet Assay Workshop. Mutagenesis. 18, 45-51 (2003).
  15. Collins, A. R. Investigating oxidative DNA damage and its repair using the comet assay. Mutat Res. 681, 24-32 (2009).
  16. Collins, A. R., et al. Comet assay in human biomonitoring studies: reliability, validation, and applications. Environ Mol Mutagen. 30 (2), 139-146 (1997).
  17. Gutzkow, K. B., et al. High-throughput comet assay using 96 minigels. Mutagenesis. 28 (3), 333-340 (2013).
  18. International Validation of The in vivo Rodent Alkaline Comet Assay For the Detection of Genotoxic Carcinogens. JaCVAM. , Available from: http://cometassay.com/JaCVAM.pdf (2009).
  19. Test Guideline (TG) No. 489 In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. , Available from: http://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-489-in-vivo-mammalian-alkaline-comet-assay_9789264224179-en;jsessionid=m5560j16hf1r.x-oecd-live-02 (2014).
  20. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. AVMA Panel on Euthanasia. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013).
  21. Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
  22. Carson, F. A Self-Instrumental Text. Histotechnology. , 25-37 (1996).
  23. Dusinska, M. THE COMET ASSAY, modified for detection of oxidised bases with the use of bacterial repair endonucleases. Dusinska Protocol [Internet]. , Available from: http://www.cometassayindia.org/Dusinska-protocol.PDF (2000).
  24. Schuppler, J., Gunzel, P. Liver tumors and steroid hormones in rats and mice. Arch Toxicol Suppl. 2, 181-195 (1979).
  25. Hobkirk, R. Steroid sulfotransferases and steroid sulfate sulfatases: characteristics and biological roles. Can J Biochem Cell Biol. 63 (11), 1127-1144 (1985).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tkanka wątroby szczurazawiesina pojedynczych komórekelektroforeza w żelumikroskopia fluorescencyjnaenzymy hOGG1 i Endo IIIuszkodzenia DNA indukowane CPA
In vivo (in vivo) Alkaliczny test kometologiczny i test alkaliczny komety modyfikowany enzymami do pomiaru pęknięć nici DNA i oksydacyjnych uszkodzeń DNA w wątrobie szczura
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.