Integracja procesów na mokrym i suchym stanowisku laboratoryjnym optymalizuje ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji biopsji nowotworów o niskiej jakości i małej ilości

Summary

Opisany jest zintegrowany system do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji próbek onkologicznych. Ten wieloplatformowy system jest zoptymalizowany pod kątem biopsji guza o niskiej jakości i małej ilości, obsługuje niskie dane wejściowe DNA, zawiera dobrze scharakteryzowane wielowariantowe kontrole i zawiera nowatorski wariant wywołujący, który jest informowany o ilościowych przedanalitycznych środkach kontroli jakości.

Abstract

Wszystkie procedury sekwencjonowania nowej generacji (NGS) obejmują testy wykonywane na stanowisku laboratoryjnym ("mokre stanowisko") oraz analizy danych przeprowadzane przy użyciu rurociągów bioinformatycznych ("suche stanowisko"). Oba te elementy są niezbędne do uzyskania dokładnych i wiarygodnych wyników, które są szczególnie ważne dla laboratoriów klinicznych. Ukierunkowane technologie NGS coraz częściej znajdują uznanie w zastosowaniach onkologicznych, pomagając w realizacji celów medycyny precyzyjnej, jednak metody te często obejmują rozłączne i zmienne przepływy pracy na mokrym i suchym stanowisku laboratoryjnym oraz nieskoordynowane zestawy odczynników. W niniejszym raporcie opisujemy metodę sekwencjonowania trudnych próbek nowotworów za pomocą panelu 21-genowego jako przykład kompleksowego ukierunkowanego systemu NGS. System integruje funkcjonalną kwantyfikację i kwalifikację DNA, wzbogacanie PCR z multipleksem w jednej probówce oraz oczyszczanie i normalizację biblioteki przy użyciu zweryfikowanych analitycznie odczynników z jednego źródła z samodzielnym pakietem bioinformatycznym. W rezultacie, można uzyskać dokładne wywołania wariantów z niskiej jakości i małej ilości biopsji guza utrwalonego w formalinie, zatopionego w parafinie (FFPE) i aspiracji cienkoigłowej (FNA). Metoda może rutynowo oceniać warianty związane z rakiem na podstawie danych wejściowych 400 amplifikowalnych kopii DNA i ma konstrukcję modułową, aby dostosować się do nowej zawartości genów. Dwa różne typy analitycznie zdefiniowanych kontroli zapewniają gwarancję jakości i pomagają zabezpieczyć dokładność połączeń z próbkami istotnymi klinicznie. Elastyczny etap PCR typu "tag" zawiera adaptery specyficzne dla platformy i kody indeksowe, aby umożliwić kodowanie kreskowe próbek i kompatybilność z popularnymi urządzeniami laboratoryjnymi NGS. Co ważne, protokół jest usprawniony i może wytworzyć 24 biblioteki gotowe do sekwencji w ciągu jednego dnia. Wreszcie, podejście to łączy procesy na mokrym i suchym stanowisku badawczym poprzez włączenie wyników kontroli jakości próbek przedanalitycznych bezpośrednio do algorytmów wywoływania wariantów w celu poprawy dokładności wykrywania mutacji i rozróżnienia wywołań fałszywie ujemnych i nieokreślonych. Ta ukierunkowana metoda NGS wykorzystuje postępy zarówno w oprogramowaniu mokrym, jak i oprogramowaniu, aby uzyskać bardzo szczegółowe, multipleksowane sekwencjonowanie i czułą analizę heterogenicznych próbek nowotworów do zastosowań diagnostycznych.

Introduction

Medycyna precyzyjna opiera się na indywidualizacji opcji diagnostycznych i terapeutycznych dla pacjentów. Obietnica leczenia dostosowanego do potrzeb klienta jest bezpośrednią konsekwencją lepszego zrozumienia szlaków chorobowych, które mogą informować o powiązaniu diagnostyki molekularnej z terapiami celowanymi. Na przykład stosowanie terapii ukierunkowanych molekularnie wzrosło z 11% do 46% w latach 2003-2013¹, a leki przeciwnowotworowe, takie jak wemurafenib i kryzotynib, są zatwierdzone przez FDA za pomocą towarzyszących testów diagnostycznych. Dzięki zdolności do dokładnego odzyskiwania docelowych sekwencji o niskiej liczebności w wysoce multipleksowanych zestawach próbek, sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) stało się metodą z wyboru do oceny aberracji genetycznych związanych z rakiem i identyfikacji celów molekularnych dla medycyny precyzyjnej.

Najczęstsze biopsje guzów litych do testów molekularnych obejmują próbki utrwalone w formalinie, zatopione w parafinie (FFPE) i aspirowane cienkoigłowo (FNA). Próbki te są obarczone niską ilością i/lub niskiej jakości kwasami nukleinowymi, które stanowią wyzwanie dla dokładnych ocen NGS^2-5. Obecne komercyjne metody NGS do analizy tych próbek opierają się na mozaice różnych odczynników, protokołów i narzędzi informatycznych, które stanowią ruchome cele ciągłych ulepszeń. Na przykład zmiany w chemii i/lub oprogramowaniu testowym następowały co 1-2 miesiące w przypadku najczęściej stosowanych docelowych zestawów NGS⁶. Ta niestabilność odzwierciedla brak spójności w konstruowaniu i weryfikowaniu ujednoliconego systemu NGS dla trudnych typów próbek, szczególnie do badań na raka, i nakłada nadmierne obciążenie na laboratoria w zakresie opracowywania spójnych protokołów, które są optymalizowane od próbki do wyników. Rzeczywiście, jedno z ostatnich badań przeprowadzonych wśród użytkowników NGS podkreśliło trudności związane z tymi "szybko zmieniającymi się" technologiami, wraz z wymaganiami dotyczącymi ustalonych, praktycznych treści medycznych, ugruntowaną wiedzą bioinformatyczną, ugruntowaną i zintegrowaną procedurą, którą można szybko wdrożyć, oraz usprawnionymi przepływami pracy i uproszczonymi protokołami, które ułatwiają szkolenie w miejscu pracy⁷. W tym artykule opisano kompleksowy system ukierunkowanego NGS, który wypełnia te luki.

Przedstawiona metodologia integruje wszystkie kroki proceduralne od przedanalitycznego do postanalitycznego, zarówno na mokrym, jak i suchym stanowisku, aby poprawić dokładność, czułość i niezawodność docelowej kwantyfikacji i wykrywania dla NGS klinicznie istotnych loci genów raka. Podejście to rozpoczyna się od kwantyfikacji "funkcjonalnego" DNA⁴ w celu oceny jakości DNA, kierowania danymi wejściowymi do etapu wzbogacania PCR i ochrony przed fałszywie dodatnimi połączeniami, które mogą powstać w wyniku przesłuchania bardzo niskich kopii matryc. Pojedynczy probówkowy multipleksowy PCR następnie wzbogaca o 46 loci w 21 genach nowotworowych przy użyciu zaledwie 400 amplifikowalnych kopii DNA, a następnie włącza sekwencje specyficzne dla platformy dla NGS przy użyciu popularnych stacjonarnych instrumentów sekwencjonowania. Biblioteki są oczyszczane za pomocą prostej procedury kulek magnetycznych i oznaczane ilościowo za pomocą nowatorskiego, niewymagającego kalibracji testu qPCR. Autonomiczny pakiet bioinformatyczny, oparty na wynikach kontroli jakości próbek DNA w celu poprawy wydajności połączeń, zapewnia analizę sekwencji po NGS. Przedstawiamy dane wykorzystujące to podejście systemowe dla ukierunkowanego NGS w celu ujawnienia mutacji substytucji zasad, insercji/delecji (indeli) i wariantów liczby kopii (CNV) w biopsjach guza o niskiej jakości i małej ilości, takich jak próbki FFPE i FNA, oraz przeprowadzamy kontrole.

Protocol

Uwaga: Ten protokół opisuje jednoczesne przetwarzanie próbek za pomocą systemu MiSeq NGS, ale może być dostosowany do instrumentu Personal Genome Machine (PGM). W przypadku zalecanego minimalnego wkładu DNA wynoszącego 400 amplifikowalnych kopii matryc, test jest w stanie wytworzyć co najmniej 3,000 razy medianę pokrycia dla każdej z 96 próbek na przebieg NGS i równoważną głębokość pokrycia dla 24 próbek przy użyciu PGM na chipie 318. Metoda wymaga również użycia przyrządu do PCR w czasie rzeczywistym.

1. Kwantyfikacja funkcjonalna DNA i kontrola jakości (QC)

1. Odczynniki do rozmrażania: 2x Master Mix, Primer Probe Mix, Inhibition Primer Probe Mix, 6-karboksy-X-rodamina (ROX), Rozcieńczalnik i cztery wzorce krzywej kalibracyjnej ludzkiego genomowego DNA (Standard DNA (50 ng / μl), Standard DNA (10 ng / μl), Standard DNA (2 ng / μl) i Standard DNA (0,4 ng / μl)) (Tabela 1). Wiruj wszystkie odczynniki przez 10 sekund i wiruj z maksymalną prędkością przez 10 sekund, aby zebrać zawartość. Trzymaj 2x master mix na lodzie.
2. Przygotuj wystarczającą ilość mieszanki wzorcowej dla całkowitej liczby próbek do badania i dodaj o 10% większą objętość, aby uniknąć niedoborów spowodowanych pipetowaniem. Przygotować mieszankę wzorcową w probówce mikrowirówkowej, używając następujących objętości na próbkę: 5 μl 2x Master Mix, 0,5 μl Primer Probe Mix, 0,5 μl Inhibition Primer Probe Mix, 0,05 μl ROX i 2,95 μl Diluent. Wiruj przez 10 sekund i wiruj z maksymalną prędkością przez 10 sekund, aby zebrać zawartość.
3. Dodać 9 μl mieszanki wzorcowej do studzienek na 96-dołkowej płytce.
4. Dodaj 1 μl wzorców DNA w dwóch egzemplarzach, aby wygenerować krzywą kalibracyjną. Wymieszać, pipetując pipetę w górę i w dół 5 razy.
5. Upewnij się, że próbka kwasu nukleinowego jest dobrze wymieszana przed użyciem. Dodać 1 μl próbki do mieszanki wzorcowej i wymieszać, pipetując 5 razy w górę i w dół.
6. Uszczelnij płytkę, wiruj przez 10 sekund i wiruj z maksymalną prędkością przez 10 sekund, aby zebrać zawartość.
7. Umieścić płytkę w systemie PCR. Przypisz zarówno detektory FAM (kwantyfikacja funkcjonalna), jak i VIC (inhibicja funkcjonalna) dla każdej próbki zgodnie z instrukcjami producenta. Wykonaj cykle PCR trwające 10 minut w temperaturze 95 °C i 40 cykli (15 sekund w temperaturze 95 °C, 1 minuta w temperaturze 60 °C).
8. Przeanalizuj dane qPCR, generując wykres regresji liniowej dla każdego ze zduplikowanych wzorców DNA przy użyciu protokołów programowych.
9. Wykreślić log₁₀ liczby kopii dla każdego wzorca DNA na osi x i odpowiadającą jej wartość FAM C_q na osi y.
10. Potwierdzić, że wyniki z próbki kwasu nukleinowego mieszczą się w zakresie dynamicznym krzywej kalibracyjnej wzorców DNA, a następnie obliczyć stężenie nieznanego DNA w "funkcjonalnej" lub możliwej do amplifikacji liczbie kopii na μl od odpowiadającego mu położenia na wzorcowej krzywej odniesienia. Rysunek 1 przedstawia przykłady krzywych kalibracyjnych, które przeszły pomyślnie i nie.
11. Określ, czy amplifikacja wystąpiła w każdej reakcji, sprawdzając obecność amplikonu docelowego innego niż ludzki w kanale VIC.
    Uwaga: Jako kontrola pozytywna, Inhibition Primer Probe Mix zawiera startery specyficzne dla celu egzogennego innego niż ludzki i odpowiadającą im matrycę. Inhibition Primer Probe Mix jest składnikiem mieszanki wzorcowej, która jest dodawana do każdej reakcji, w tym do kontroli bez matrycy (NTC). W przypadku braku inhibitora, produkt PCR dla celu innego niż ludzki powinien być zawsze wykrywany w kanale VIC. "Niewykryte" C_q dla próbki w kanale VIC wskazuje na obecność inhibitorów PCR, które mogą odnieść korzyści z późniejszego oczyszczenia próbki przed dalszym przetwarzaniem.

2. Przygotowanie biblioteki: PCR specyficzny dla genu (GS)

1. Przygotuj wystarczającą ilość mieszanki wzorcowej dla całkowitej liczby próbek do badania i dodaj o 10% większą objętość, aby uniknąć niedoborów spowodowanych pipetowaniem. Przygotować główną mieszankę GS PCR w probówce mikrowirówkowej, używając następujących objętości na próbkę: 5 μl 2x Amplification Master Mix (Tabela 1) i 1 μl Panel Pank Cancer Primer (Tabela 1). Mieszać pipetując w górę i w dół, wirować przez 10 sekund i wirować z maksymalną prędkością przez 10 sekund, aby zebrać zawartość.
2. Podwielokrotnić 6 μl głównej mieszanki GS PCR do dołków na 96-dołkowej płytce. Dodać 4 μl każdej próbki kwasu nukleinowego do indywidualnych studzienek. Do innych studzienek dodać 4 μl kontroli FFPE (tabela 1), 4 μl kontroli wielowariantowej (tabela 1) i 4 μl wody wolnej od nukleaz w celu uzyskania proceduralnego NTC. Z każdym dodatkiem wymieszaj, pipetując pipetowanie w górę i w dół 5 razy.
3. Uszczelnij płytkę, wiruj przez 10 sekund i wiruj z maksymalną prędkością przez 10 sekund, aby zebrać zawartość.
4. Umieścić płytkę w termocyklerze na następujące cykle PCR: 5 min w temperaturze 95 °C, 2 cykle (15 sekund w 95 °C, 4 minuty w 60 °C), 23 cykle (15 sekund w 95 °C, 4 minuty w 72 °C) i końcowe przedłużenie o 10 minut w temperaturze 72 °C. Utrzymać w temperaturze 4 °C.
   Uwaga: Po wykonaniu kroku 2.4 płytka będzie określana jako płytka GS PCR.

3. Przygotowanie biblioteki: Tag PCR

1. Rozmrażanie odczynników: 2x Index Master Mix (Tabela 1) i Kody Indeksów (Tabela 1). Wirować przez 10 sekund i wirować z maksymalną prędkością przez 10 sekund, aby zebrać zawartość.
   Uwaga: Kody indeksowe są wstępnie wymieszane, aby zapewnić unikalny zestaw wskaźników parami (kodów kreskowych) dla każdej próbki.
2. Do płytki 96-dołkowej dodać 7,5 μl 2x Index Master Mix i 5,5 μl Index Code do określonego dołka i wymieszać, pipetując 5 razy w górę iw dół.
3. Ostrożnie otworzyć płytkę GS PCR i dodać 2 μl produktu GS PCR do nowej płytki z mieszanką wzorcową. Wymieszać, pipetując pipetę w górę i w dół 5 razy. Dla każdej próbki zapisz identyfikator próbki i odpowiadające im kody indeksu parami. Uszczelnij płytkę, wiruj przez 10 sekund i wiruj z maksymalną prędkością przez 10 sekund, aby zebrać zawartość.
4. Umieścić płytkę w termocyklerze i PCR przez 5 minut w temperaturze 95 °C, 10 cykli (30 sekund w temperaturze 95 °C, 30 sekund w temperaturze 55 °C, 1 minutę w temperaturze 72 °C) i końcowe przedłużenie o 10 minut w temperaturze 72 °C. Utrzymać w temperaturze 4 °C.
   Uwaga: Po wykonaniu kroku 3.4 płytka będzie nazywana płytką Tag PCR.

4. Oczyszczanie biblioteki i wybór rozmiaru

1. Usunąć kulki magnetyczne Library Pure Prep (Tabela 1) i bufor elucyjny (Tabela 1) z 2-8 °C i pozostawić do zrównoważenia do RT przez 30 minut. Dodać 9,6 ml 100% etanolu do pojemnika buforu płuczącego (Tabela 1), zakręcić i wymieszać, kilkakrotnie odwracając butelkę.
2. Wirować kulki magnetyczne przez 10 sekund i dodać 11 μl do oddzielnych studzienek 96-dołkowej płytki.
3. Otwórz płytkę Tag PCR i dodaj 10 μl produktu Tag PCR do kulek i pipetuj 5 razy. Inkubować mieszaninę przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
4. Umieść 96-dołkową płytkę na stojaku magnetycznym (Tabela 1) na 4 minuty. Trzymając 96-dołkową płytkę nadal na stojaku, usunąć i wyrzucić supernatant za pomocą pipety.
5. Wyjmij 96-dołkową płytkę ze stojaka magnetycznego i dodaj 100 μl buforu płuczącego zawierającego etanol do każdej studzienki i wymieszaj, pipetując 5 razy w górę iw dół. Inkubować przez 2 minuty.
6. Umieścić 96-dołkową płytkę na stojaku magnetycznym na 2 minuty, a następnie wyjąć i wyrzucić supernatant za pomocą pipety.
7. Powtórz krok 4.5, w sumie 2 płukania etanolem, usuwając jak najwięcej roztworu myjącego po drugim praniu.
8. Trzymając 96-dołkową płytkę na stojaku magnetycznym, susz kulki przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie wyjmij płytkę ze stojaka.
9. Ponownie zawiesić kulki, dodając 20 μl buforu elucyjnego do każdej studzienki i pipetować w górę iw dół 5 razy.
10. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
11. Umieść 96-dołkową płytkę z powrotem na stojaku magnetycznym na 4 minuty, a następnie ostrożnie wyjmij i przenieś 18 μl klarownego supernatantu do nowego dołka.
    Uwaga: Na tym etapie procedurę można bezpiecznie zatrzymać, a próbki przechowywać w temperaturze od -15 do -30°C. Aby ponownie uruchomić, przed kontynuowaniem rozmrozić zamrożone próbki na lodzie.

5. Kwantyfikacja biblioteki

1. Odczynniki Thaw Library Quant (LQ): 2x LQ Master Mix, LQ Primer / Probe Mix, LQ Standard, LQ Positive Control, LQ Dilurent i LQ ROX (Tabela 1). Wiruj przez 10 sekund i wiruj z maksymalną prędkością przez 10 sekund, aby zebrać zawartość.
2. Korzystając z oczyszczonych produktów bibliotecznych, należy przeprowadzić seryjne rozcieńczanie każdej pojedynczej próbki w rozcieńczalniku LQ.
   1. Dodaj 2 μl (produkt oczyszczony z biblioteki) do 198 μl rozcieńczalnika LQ i mieszaj w górę iw dół za pomocą pipety 10 razy.
   2. Dodać 2 μl (rozcieńczenie 1:100) do 198 μl rozcieńczalnika LQ i mieszać w górę i w dół za pomocą pipety 10 razy.
3. Przygotować wystarczającą ilość głównej mieszanki LQ dla całkowitej liczby próbek do badania i dodać o 10% większą objętość, aby uniknąć niedoborów spowodowanych pipetowaniem. Przygotować LQ Master Mix w probówce mikrowirówkowej, używając następujących objętości na próbkę: 5 μl 2X LQ Master Mix, 2 μl LQ Primer/Probe Mix, 0,5 μl LQ Standard i 0,5 μl LQ ROX. Mieszać pipetując w górę i w dół, wirować przez 10 sekund i wirować z maksymalną prędkością przez 10 sekund, aby zebrać zawartość.
4. Dodać 8 μl głównej mieszanki LQ do dołka na 96-dołkowej płytki optycznej.
5. W oddzielnych studzienkach dodać 2 μl rozcieńczonej biblioteki, 2 μl LQ kontroli pozytywnej i 2 μl rozcieńczalnika LQ (NTC) i wymieszać pipetując 5 razy w górę iw dół. Uszczelnij płytkę optyczną folią samoprzylepną, wiruj przez 10 sekund i wiruj przy 400 x g przez 10 sekund w celu zebrania zawartości.
6. Przypisz detektory FAM i VIC do każdej próbki. Przeprowadzić amplifikację PCR w warunkach cyklicznych trwających 5 minut w temperaturze 95 °C i 40 cykli (15 sekund w temperaturze 95 °C, 1 minuta w temperaturze 60 °C).
7. Oznaczyć stężenie w każdej próbce (nM) przy użyciu metody porównawczej C_q. Oblicz różnicę między znanym wzorcem LQ (C_q VIC) a nieznaną biblioteką (C_q FAM). Stężenie rozcieńczonej próbki (pM) oblicza się za pomocą następującego równania:
   [Conc_lib]_nM = 12,5 x 2^ΔCq
   W przypadku stosowania współczynnika rozcieńczenia innego niż 10 000, obliczyć stosunek docelowego współczynnika rozcieńczenia do 10 000 i pomnożyć ten współczynnik przez wynik równania w ppkt 5.7.

6. Normalizacja bibliotek i łączenie próbek

1. Określić medianę stężenia (nM) we wszystkich próbkach (z których każda zawiera unikalny indeks parami), które mają zostać połączone.
2. Oznaczyć objętość pojedynczej próbki (μl) do pobrania, mnożąc medianę stężenia we wszystkich próbkach przez 5, a następnie dzieląc przez jej indywidualne stężenie (nM). Zaokrąglij wartość wynikową do najbliższej liczby całkowitej. Objętości okrągłe o wartościach od <2 μl do 2 μl i objętości od >15 μl do 15 μl.
3. Dodaj znormalizowaną objętość (μl) dla każdej próbki do pojedynczej probówki mikrowirówkowej, aby utworzyć pulę próbek.
4. Obliczyć nowe stężenie dla każdej próbki, używając zaokrąglonych wartości całkowitych, i zapisać wyniki.
5. Aby określić stężenie w puli próbek, należy obliczyć sumę wszystkich poszczególnych stężeń i zapisać wynikową wartość (nM).
6. Rozcieńczyć pulę próbek do 1,25 nM za pomocą rozcieńczalnika sekwencjonującego (Tabela 1).
   Uwaga: Na tym etapie procedurę można bezpiecznie zatrzymać, a próbki przechowywać w temperaturze od -15 do -30 °C. Aby ponownie uruchomić, przed kontynuowaniem rozmrozić zamrożone próbki na lodzie.

7. Sekwencjonowanie

1. Denaturować pulę próbek w obecności PhiX Control v3 (tabela 1) poprzez dodanie następujących składników: 15 μl z puli próbek 1,25 nM, 3 μl z 0,5 nM PhiX i 2 μl z 1 N NaOH. Krótko wymieszać, a następnie krótko odwirować i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
2. Umieścić pulę próbek zdenaturowanych na lodzie.
3. Dodać 8 μl zdenaturowanej biblioteki do 992 μl wstępnie schłodzonego buforu HT1-Hyb do probówki mikrowirówkowej. Krótko zmieszać, a następnie krótko odwirować, aby zebrać zawartość. Trzymaj na lodzie.
4. Dodać 600 μl denaturowanej i rozcieńczonej biblioteki do pozycji #17 wkładu z odczynnikiem.
5. Rozmrażanie starterów sekwencjonowania odczytu 1 (tabela 1), starterów sekwencjonowania odczytu indeksu (tabela 1) i odczytu 2 starterów sekwencjonowania (tabela 1). W probówkach do mikrowirówek oddzielnie rozcieńczyć 4 μl starterów sekwencjonowania z 636 μl buforu HT1-Hyb. Uwaga: Bufor HT1-Hyb jest dostarczany z zestawem odczynników do sekwencjonowania (Tabela 1).
6. Mieszaj przez wirowanie przez 10 sekund i wiruj z maksymalną prędkością przez 10 sekund, aby zebrać zawartość. Dodaj 600 μl rozcieńczonych starterów do sekwencjonowania Read 1 do pozycji #18 wkładu z odczynnikiem do sekwencjonowania, 600 μl rozcieńczonych starterów do odczytu indeksu do pozycji #19 i 600 μl rozcieńczonych starterów do sekwencjonowania Read 2 do pozycji #20.
7. Załaduj odczynniki na przyrząd NGS (Tabela 1) i ułóż je zgodnie z instrukcjami producenta. Wykonaj sekwencjonowanie z sparowanym końcem 2 x 150 cykli.

8. Analiza danych

Uwaga: Oprogramowanie instrumentu NGS konwertuje obrazy klastrów na wywołania bazowe i wyniki jakości, a także demultipleksuje wskaźniki parami w celu wygenerowania indywidualnych plików FASTQ (*.fastq.gz) skompresowanych gzip dla każdej próbki. Przed przystąpieniem do analizy zdemultipleksowanych plików czytnik musi pobrać i zainstalować odpowiednie oprogramowanie bioinformatyczne (Tabela 1). Oprogramowanie można zainstalować na komputerze z systemem Windows klasy konsumenckiej i nie wymaga specjalistycznego sprzętu komputerowego ani połączenia z Internetem do przeprowadzenia analizy danych.

1. Kliknij dwukrotnie ikonę oprogramowania na pulpicie.
2. Zaloguj się do systemu za pomocą nazwy użytkownika i hasła podanych w instrukcji oprogramowania.
3. Otwórz pulpit nawigacyjny projektu i kliknij "Nowy projekt".
   1. Nazwij projekt i podaj opcjonalny opis projektu. Wybierz docelowy typ panelu NGS i typ instrumentu NGS. Kliknij "Zapisz i kontynuuj".
   2. Prześlij skompresowane pliki FASTQ dla odczytów do przodu i do tyłu. Nie przesyłaj "nieprzypisanych" FASTQ, które zawierają odczyty, które nie mogły zostać zdemultipleksowane. Kliknij "Zapisz i kontynuuj".
   3. Wprowadź liczbę funkcjonalnych kopii wejściowych używanych do przygotowania każdej biblioteki, zgodnie z ustaleniami testu funkcjonalnej kwantyfikacji DNA (patrz krok 1 powyżej). Ręcznie dodaj wartości lub skopiuj i wklej wartości z arkusza kalkulacyjnego do tabeli adnotacji. Kliknij "Zapisz i kontynuuj".
   4. Przejrzyj biblioteki z adnotacjami przesłane do analizy i kliknij "Prześlij analizę", aby rozpocząć analizę.
4. Monitoruj postęp analizy wyświetlany za pośrednictwem pulpitu nawigacyjnego projektu.
   Uwaga: Wskazanie stanu zakończenia analizy jest wyświetlane, gdy wyniki są gotowe do przeglądu.
5. Przejrzyj przeanalizowane wyniki dla przykładowych wskaźników kontroli jakości, w tym całkowitego pokrycia na bibliotekę, procentu odczytów przechodzących przez filtry, głębokości pokrycia amplikonem i jednolitości. Przejrzyj wywołania wariantów dla każdej sekwencjonowanej biblioteki z dbSNP, COSMIC, 1,000 genomów i innymi źródłami adnotacji na poziomie funkcjonalnym i populacji.
6. Eksportuj surowe wyniki jako tabele podsumowań arkuszy kalkulacyjnych, pliki *.bam i pliki *.vcf do długoterminowego przechowywania lub dalszej analizy za pomocą uzupełniających narzędzi informatycznych.

Results

Łącznie 90 próbek (74 unikalne) reprezentujących pozytywne i negatywne kontrole, wcześniej scharakteryzowane linie komórkowe i resztkowe kliniczne biopsje guza FFPE zostały ocenione pod kątem amplifikacji DNA, wprowadzone do wzbogacenia multipleksowego PCR, oznaczone adapterami sekwencyjnymi, oznaczone kodem kreskowym i przeanalizowane w jednym instrumencie laboratoryjnym NGS (Rysunek 2), który wygenerował 19,1 mln odczytów przechodzących przez filtr. Równomolowe łączenie próbek skutkowało sekwencjonowaniem o dużej głębokości (3 692 odczyty) i jednolitym pokryciem (97,8% amplikonów pokrytych w promieniu 5-krotnym od mediany głębokości odczytu). Wartości odstające obejmowały kontrole bez matrycy, jeden DNA linii komórkowej z dużą amplifikacją liczby kopii i jeden DNA FFPE, który został oznaczony do hamowania PCR przez przedanalityczny test QC (Figura 3). Jednorodność pokrycia w 46 amplikonach została utrzymana przy użyciu trzech różnych operatorów (Figura 4A) i dla różnych próbek DNA FFPE niskiej jakości (Figura 4B). Kontrola DNA guza FFPE, sformułowana z mieszaniny szczątkowych próbek klinicznych w celu uzyskania 5% BRAF V600E (oznaczonego ilościowo za pomocą kropelkowego cyfrowego PCR), została zgłoszona jako docelowa mutacja BRAF w obfitości 3,9, 5,3 i 6,5% przez trzech operatorów przy użyciu danych wejściowych 400 amplifikowalnych kopii (a zatem tylko 20 zmutowanych kopii) (Figura 4B i "FFPE3" w tabeli wstawek). Co więcej, mieszanina 12 syntetycznych matryc DNA, z których każda reprezentuje znaną mutację "napędzającą" substytucję zasad, ujawniła oczekiwane mutacje w zamierzonym zakresie 9 - 17% średniej częstości alleli (Tabela 2). Rozcieńczenie próbek DNA linii komórkowej i FFPE amplifikacją liczby kopii wykazało zależność od dawki dla wariantów odpowiednio w EGFR i KRAS (Figura 5). Co ważne, dane wejściowe DNA FFPE można zredukować do zaledwie 50 amplifikowalnych kopii lub 1,2 ng masowego DNA, zachowując jednocześnie wykrywanie znanych mutacji bez fałszywie dodatnich wywołań (Figura 6). Dane wejściowe DNA zostały uwzględnione w 100-krotnym zakresie, aż do co najmniej 50 000 amplifikowalnych kopii (Tabela 3). W tym i powiązanych eksperymentach zgłoszono wywołania wariantów w 22 próbkach FFPE i 20 FNA zgodnie z niezależnymi metodami o wspólnym pokryciu mutacji (Tabela 4).

Czułość i dodatnia wartość predykcyjna testu została określona na podstawie analizy 97 próbek, w tym FFPE, FNA, świeżo mrożonego i DNA linii komórkowej, oraz łącznie 195 wyników sekwencjonowania. Wyniki ujawniły 365 prawdziwie dodatnich połączeń wariantowych, 4 fałszywie ujemne połączenia i 1 fałszywie dodatnie połączenie dla czułości 98,9% (95% CI: 97,1-99,7%) i dodatniej wartości predykcyjnej (PPV) 99,7% (95% CI: 98,2-99,99%). Analizy indeli przeprowadzono dla dwóch powszechnych wariantów EGFR (p.E746_A750delELREA i p.V769_D770insASV) w 33 seriach próbek, wykazując czułość 93,9% (95% CI: 78,4-98,9%) i PPV 100% (95% CI: 86,3-100%) z wariantami wykrytymi w zakresie 2,4-84,8%.

Rysunek 1: Przykład krzywych kalibracji kwantyfikacji DNA, które spełniają i nie spełniają kryteriów kontroli jakości. (A) Mijająca krzywa wzorcowa. (B) Wadliwa krzywa standardowa. W tym przypadku awaria była spowodowana podwójnym pipetowaniem najniższego wejściowego wzorca DNA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przegląd kompleksowego, ukierunkowanego systemu NGS do zastosowań onkologicznych, który integruje przepływy pracy przed analizą, analizą i po analizie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Odczyt pokrycia i jednorodności dla docelowego NGS genów nowotworowych w niskiej jakości DNA FFPE w porównaniu z nienaruszonym DNA linii komórkowej i kontrolnymi. W sumie 90 próbek, które zawierały szczątkowe kliniczne FFPE (zamknięte kręgi), linię komórkową (otwarte okręgi) i syntetyczne matrycowe DNA (plus symbole) przetworzono przy użyciu jednoprobówkowego, 21-genowego wzbogacania multipleksowego PCR. Każda biblioteka amplikonów została oznaczona sekwencjami adapterów dla instrumentu NGS, oznaczona kodem kreskowym z wyraźnym kodem dwuindeksowym, oczyszczona, określona ilościowo i znormalizowana do stężenia 2,5 nM. Biblioteka DNA została zsekwencjonowana i przeanalizowana przez towarzyszące jej oprogramowanie bioinformatyczne. Odchylenia próbki obejmowały serię rozcieńczeń DNA linii komórkowej MDA-MB-468 z dużą amplifikacją liczby kopii EGFR (górne, otwarte prostokąty w kropkowanym okręgu), która zniekształciła jednorodność pokrycia oraz jedną próbkę czerniaka FFPE, która nie wygenerowała znaczącej liczby odczytów z powodu przeniesienia inhibitorów PCR z ekstrakcji DNA. Niepowodzenie próbki czerniaka (dolne, przerywane kółko) zostało przewidziane za pomocą przedanalitycznego testu qPCR DNA QC. NTC, kontrola bez szablonu (x symboli). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Pokrycie odczytem amplikon po amplikonie, jednorodność i wykrywanie wariantów w resztkowym klinicznym DNA guza FFPE. (A) Odczytać pokrycie wszystkich wzbogaconych loci w reprezentatywnej próbce DNA FFPE mierzonej przez trzy różne operatory. Operator 1, Op1 (niebieskie paski); Operator 2, Op2 (zielone paski); Operator 3, Op3 (czarne paski). (B) Jednorodność pokrycia i wywołania wariantów oceniane przy użyciu trzech próbek guza FFPE, w tym mieszaniny kontrolnej (FFPE3, szare paski i tekst) składającej się ze znanej 5% mutacji BRAF c.1799T>A. FFPE1 (niebieskie paski i tekst), FFPE2 (pomarańczowe paski i tekst). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Zależne od dawki wykrywanie wariantów liczby kopii w DNA linii komórkowej i FFPE. DNA linii komórkowej MDA-MB-468 z dobrze scharakteryzowaną amplifikacją liczby kopii EGFR stopniowo rozcieńczano na tle referencyjnego niezmutowanego DNA linii komórkowej, aby zilustrować spadek zmiany liczby kopii w funkcji rozcieńczenia. Procent każdej próbki DNA linii komórkowej jest pokazany z wyraźną linią (0, 12,5, 25, 50 i 100%). Rozcieńczenie próbki guza FFPE jajnika znaną amplifikacją KRAS ujawniło podobny profil przy użyciu tej samej serii miareczkowania, ale z powtórzeniami 100% DNA FFPE dla dwóch górnych linii. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Dokładne wykrywanie mutacji i kwantyfikacja do 50 amplifikowalnych kopii DNA FFPE lub 1,2 ng masowego DNA. Możliwą do amplifikacji liczbę kopii DNA FFPE raka jelita grubego określono za pomocą testu QC opartego na qPCR i rozcieńczono od 400 do 25 kopii jako dane wejściowe do wzbogacenia multipleksowego PCR przed sekwencjonowaniem. Potok bioinformatyczny poprawnie wywołał oba znane warianty do 50 kopii, czyli odpowiednika ~10 zmutowanych szablonów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Nazwa materiału/materiału firma Numer katalogowy 2x Quantidex Master Mix Asuragen 145345 Mieszanka sondy Quant Primer Asuragen 145336 Inhibicja Starter Probe Probe Mix Asuragen 145344 Rox Asuragen 145346 Rozcieńczalnika Asuragen 145339 Wzorzec DNA (50) Asuragen Numer katalogowy: 145340 Wzorzec DNA (10) Asuragen 145341 Wzorzec DNA (2) Asuragen 145342 Wzorzec DNA (0,4) Asuragen 145343 2x Główny miks wzmocnienia Asuragen 145348 Panel podstawowy Pan Cancer Asuragen 145347 Kontrola FFPE raka patelni Asuragen 145349 Wielowariantowa kontrola raka patelni Asuragen Numer katalogowy: 145350 Biblioteka Koraliki Pure Prep Asuragen 145351 Bufor do płukania Asuragen 145352 Bufor elucyjny Asuragen 145353 2x LQ Master Mix Asuragen 145358 LQ Rozcieńczalnik Asuragen 145354 Kontrola pozytywna LQ Asuragen 145355 LQ Standardowy Asuragen 145356 LQ Primer / Mieszanka sond (ILMN) Asuragen 145357 LQ ROX Asuragen 145359 Kody indeksowe (ILMN) - Zestaw A Asuragen 150004 AIL001 - AIL048 (48) Kody indeksowe (ILMN) - Zestaw B Asuragen 150005 AIL049 - AIL096(48) 2x Index Master Mix Asuragen 145361 Przeczytaj 1 Startery sekwencjonowania Asuragen 150001 Startery sekwencjonowania odczytu indeksu Asuragen 150002 Przeczytaj 2 Elementarz sekwencjonowania Asuragen 150003 Rozcieńczalnik sekwencjonujący Asuragen 145365 Illumina MiSeq Oświetlenie Zestaw odczynników MiSeq v3 (600 cykli) Oświetlenie MS-102-3003 MiSeq Reagent Nano Kit v2 (300 cykli) Oświetlenie MS-103-1001 Kontrolka PhiX v3 Oświetlenie FC-110-3001 Stojak magnetyczny-96 (lub równoważne urządzenie) Ambion AM10027 Oprogramowanie Quantidex Reporter Asuragen

Tabela 1: Odczynniki i zestawy. Po pierwszym użyciu ROX należy przechowywać fiolkę w temperaturze 2-8 °C. Nie zamrażaj ponownie. Oprogramowanie można pobrać pod adresem www.asuragen.com.

gen Wariant KOSMICZNY Aminokwas KOSMICZNY Wariant % Krajowe organy regulacyjne c.182A>G p.Q61R 13,3 Krajowe organy regulacyjne c.35G>A p.G12D Rozdział 15,2 System HRAS (system HRAS) c.182A>G p.Q61R Rozdział 17,8 System HRAS (system HRAS) c.35G>A p.G12D Pytanie 9,2 KRAS (Krajowy Rejestr c.182A>G p.Q61R Rozdział 13,5 KRAS (Krajowy Rejestr c.35G>A p.G12D Rozdział 19,1 PIK3CA powiedział: c.1633G>A p.E545K 9,3 PIK3CA powiedział: c.3140A>G p.H1047R Rozdział 9.1 zestaw c.2447A>T p.D816V Rozdział 14,6 Europejski Instrument Ekonomiczno-Wydmieńczy (U c.2369C>T p.T790M Rozdział 11.3 Europejski Instrument Ekonomiczno-Wydmieńczy (U c.2573T>G p.L858R Norma 14,9 BRAF (Organizacja BRAF) ok. 1799T>A p.V600E Rozdział 17,3

Tabela 2: Zbiorcza kontrola syntetyczna składa się z 12 wariantów genów raka "napędzających", które są określane ilościowo na poziomie 9-17%. Po sekwencjonowaniu oceniono mieszaninę 12 różnych dwuniciowych syntetycznych matryc zawierających 12 różnych mutacji. Wszystkie warianty zostały poprawnie wywołane bez fałszywych alarmów.

Przykładowy identyfikator Funkcjonalny
Cps gen Wariant KOSMICZNY Aminokwas KOSMICZNY Wariant % Mediana głębokości odczytu % w granicach 5x od mediany BCPAP powiedział: 400 szt. BRAF (Organizacja BRAF) ok. 1799T>A p.V600E 99,5 pkt. Numer katalogowy: 3289 96% BCPAP powiedział: 10 000 szt. BRAF (Organizacja BRAF) ok. 1799T>A p.V600E 99,7 pkt. Numer katalogowy: 4040 98% BCPAP powiedział: 25 000 osób BRAF (Organizacja BRAF) ok. 1799T>A p.V600E 99,4 pkt. 3687 TGL 96% BCPAP powiedział: 50 000 osób BRAF (Organizacja BRAF) ok. 1799T>A p.V600E 99,7 pkt. Numer katalogowy: 4611 93%

>Tabela 3: Zasięg i wywołanie wariantu są zachowane w >100-krotnym zakresie danych wejściowych DNA. Amplifikowalne DNA z linii komórkowej BCPAP wprowadzono do wzbogacania multipleksowego PCR w 400 do 50 000 kopii i zsekwencjonowano. Głębokość odczytu, jednorodność pokrycia, wykrywanie mutacji i dokładność mutacji zostały zachowane w całym zakresie wejściowym.

Tabela 4: Wywołania wariantów w 22 biopsjach guza FFPE i 20 FNA zgadzają się z wynikami niezależnych testów mutacji. Zestaw 22 DNA guza FFPE ze statusem mutacji wcześniej określonym za pomocą ortogonalnych ukierunkowanych testów NGS został wprowadzony w 400 do 2,928 amplifikowalnych kopiach do etapu wzbogacania PCR i zsekwencjonowany przy użyciu 21-genowego panelu Pan Cancer. Ponadto kohorta 20 próbek DNA FNA, wcześniej scharakteryzowanych za pomocą testu mutacji w płynnej kulce⁸, została amplifikowana PCR przy użyciu od 156 do 36 080 wejściowych amplifikowalnych kopii i zsekwencjonowana. Wszystkie nakładające się na siebie połączenia między panelem Pan Cancer NGS a metodami referencyjnymi były zgodne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Technologie NGS na nowo zdefiniowały oczekiwania dotyczące badania profili molekularnych biopsji guza w warunkach klinicznych⁹. Szereg ukierunkowanych paneli NGS zostało opracowanych jako technologie badawcze, testy opracowane laboratoryjnie oraz dostępne na rynku produkty i niestandardowe panele do oceny wielu typów próbek klinicznych^3,5,10-15. Doniesienia z wielu badań wykazały wartość NGS jako czułego i specyficznego narzędzia klinicznego do wykrywania zmian genomowych^3,10-12,14. Jednak badania wykazały również ryzyko artefaktów, które mogą powodować fałszywie dodatnie wyniki z trudnych biopsji raka, takich jak próbki FFPE^2-5,12,14. Ponadto ostatnie publikacje podkreśliły wysokie wskaźniki niepowodzeń w przypadku NGS przy użyciu próbek onkologicznych¹⁶ oraz fałszywie dodatnie połączenia z komercyjnymi ukierunkowanymi panelami NGS, które są pogarszane przez stosowanie DNA o niskim poziomie wejściowym¹². W rezultacie, niektóre laboratoria zmodyfikowały lub dodały dodatkowe mechanizmy kontroli i równowagi do dostępnych na rynku technologii NGS w celu poprawy wydajności, często w celu zapewnienia dokładności lub potwierdzenia wyników analiz bioinformatycznych^5,10,11.

Panel składający się z 21 genów (ryc. 2) został opracowany jako ukierunkowana zawartość dla kompleksowego systemu NGS do badania opartych na dowodach, możliwych do zastosowania mutacji w trudnych typach próbek, takich jak biopsje guzów FFPE i FNA. Przepływ pracy ma szereg zalet: 1) spójność dzięki zapewnieniu jednolitego pokrycia amplikonem (rysunki 3 i 4, tabela 3); 2) łatwość użycia dzięki dostarczaniu wstępnie sformułowanych, zoptymalizowanych zestawów odczynników i uproszczeniu wymagań bioinformatycznych; 3) wydajność poprzez usprawnienie przepływu pracy i zmniejszenie liczby etapów pipetowania w porównaniu z innymi komercyjnymi metodami NGS; oraz 4) dokładność poprzez włączenie testu kontroli jakości DNA do oceny liczby amplifikowalnych kopii DNA w celu zapewnienia akceptowalnej różnorodności matryc i uniknięcia stochastycznych wahań w wykrywaniu wariantów⁴. Integracja przedanalitycznych danych kontroli jakości z analizą bioinformatyczną pozwala na niskie wprowadzanie DNA FFPE. Udało się to osiągnąć poprzez wytrenowanie algorytmu drzewa decyzyjnego wykorzystującego różne funkcjonalne kopie danych wejściowych DNA z 400 próbek FFPE z niezależnymi pomiarami prawdy i włączenie tego algorytmu do oprogramowania bioinformatycznego. W rezultacie, zalecane wprowadzenie 400 amplifikowalnych kopii, zwykle równoważnych ~5-20 ng DNA FFPE, wypada korzystnie w porównaniu z innymi metodami^10-12, w tym wzbogacaniem opartym na hybrydyzacji, gdzie zaleca się ~250 ng DNA FFPE^17,18. Chociaż technika ta jest opisana do użytku na platformie MiSeq, można ją modyfikować za pomocą starterów Tag PCR z adapterami specyficznymi dla instrumentu, aby umożliwić analizę sekwencji na innych platformach NGS.

Aby zapewnić powodzenie procedury, należy wykonać kilka kroków. Przedanalityczny test kontroli jakości określa liczbę amplifikowalnych kopii DNA i informuje o funkcjonalnym hamowaniu. Jeśli jednak na etapie wzbogacania PCR zostanie użytych mniej niż 400 amplifikowalnych kopii DNA, istnieje zwiększone ryzyko fałszywie ujemnego wywołania z próbek z mutacjami o niskiej liczebności (Figura 6). Ponadto podczas czyszczenia biblioteki należy zachować ostrożność, aby zapobiec nadmiernemu wysuszeniu kulek magnetycznych podczas etapów mycia lub elucji. Co więcej, udana kwantyfikacja biblioteki jest w dużym stopniu zależna od dokładnego rozcieńczenia DNA biblioteki. Aby uzyskać najlepszy wynik, różnica wyników qPCR dla biblioteki próbek (Cq FAM) w porównaniu ze standardem LQ (Cq VIC) powinna wynosić ≤3,3 Cq. Jeżeli różnica jest większa niż 3,3 Cq, zaleca się ponowne rozcieńczenie i zbadanie próbki. Chociaż zaobserwowano doskonałą korelację między tą konkurencyjną metodą qPCR a komercyjnymi zestawami, które oferują bezwzględną kwantyfikację przy użyciu krzywej standardowej, przesunięcie danych wejściowych biblioteki do etapu amplifikacji klonalnej w stosunku do innych metod może być konieczne do osiągnięcia optymalnej gęstości wysiewu.

Niektóre próbki nowotworów są szczególnie trudne do sekwencjonowania ze względu na inhibitory, które utrzymują się po izolacji DNA. Aby zidentyfikować te próbki przed przygotowaniem biblioteki, test QC qPCR wykrywa również hamowanie amplifikacji poprzez włączenie egzogennej matrycy, która służy zarówno jako kontrola wewnętrzna, jak i strażnik hamowania funkcjonalnego. Przykład przedstawiono na rysunku 3 , w którym próbka DNA czerniaka nie przeszła metryki hamowania QC przed sekwencjonowaniem, a następnie nie wygenerowała biblioteki, którą można by zsekwencjonować. Niepowodzenie było prawdopodobnie konsekwencją zanieczyszczenia melaniną, znanym inhibitorem PCR, przeniesionym z etapu izolacji DNA FFPE. Próbki, które zostały zidentyfikowane za pomocą testu kontroli jakości jako zagrożone niepowodzeniem amplifikacji, mogą zostać odzyskane poprzez dodatkowy etap oczyszczania w celu usunięcia potencjalnych inhibitorów.

Ukierunkowany panel 21-genowy koncentruje się na opartych na dowodach punktach zapalnych genów i zapewnia kompletny system ze zoptymalizowanymi odczynnikami i kontrolami dla DNA, QC, NGS i oprogramowania bioinformatycznego, który jest informowany o wstępnych analitycznych "funkcjonalnych" wynikach kwantyfikacji DNA. Metoda ta dokładnie wykrywa mutacje i indele substytucji zasad z niskowejściowego DNA i stanowi przykład systemu NGS z opcją rozszerzenia zawartości panelu, w celu wykrycia dodatkowych wariantów, takich jak CNV, i dostosowania do celowanego sekwencjonowania RNA.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x Quantidex Master Mix	Asuragen	145345
Quant Primer Probe Mix	Asuragen	145336
Inhibition Primer Probe Mix	Asuragen	145344
ROX	Asuragen	145346
Diluent	Asuragen	145339
DNA Standard (50)	Asuragen	145340
Wzorzec DNA (10)	Asuragen	145341
Wzorzec DNA (2)	Asuragen	145342
Wzorzec DNA (0.4)	Asuragen	145343
2X Amplification Master Mix	Asuragen	145348
Pan Cancer Primer Panel	Asuragen	145347
Pan Cancer FFPE Control	Asuragen
Pan Cancer Multi-Variant Control	Asuragen	145350
Biblioteka Pure Prep Beads	Asuragen	145351
Wash Buffer	Asuragen	145352
2X LQ Master Mix	Asuragen	145358
LQ Diluent	Asuragen
LQ Kontrola pozytywna	Asuragen	145355
LQ Standard	Asuragen	145356
LQ Mieszanka starterów/sond (ILMN)	Asuragen	145357
LQ ROX	indeksu 145359		Asuragen
(ILMN) - Zestaw A, AIL001 - AIL048 (48)	150004		Asuragen
(ILMN) - Zestaw B, AIL049 - AIL096(48)	Asuragen	150005
2x Index Master Mix	Asuragen	145361
Read 1 Startery sekwencjonowania	Asuragen	150001
Index Odczyt Startery sekwencjonowania	Asuragen	150002
Read 2 Startery sekwencjonowania	Asuragen	150003
Sekwencjonowanie Diluent	Asuragen	145365
Illumina MiSeq	Illumina
MiSeq Reagent Kit v3 (600 cykli)	Illumina	MS-102-3003
MiSeq Reagent Nano Kit v2 (300 cykli)	Illumina	MS-103-1001
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001
Podstawka magnetyczna-96 (lub równoważne urządzenie)	Ambion	AM10027
Oprogramowanie Quantidex Reporter	Asuragen