Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja ekspresji białek i kolokalizacji za pomocą multipleksowanego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania wielospektralnego

12.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53837

⸱

8 kwietnia 2016

 ,  ,  ,  , 
1Division of Urologic Surgery, Washington University in St. Louis School of Medicine, 2Department of Urology, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 4O’Brien Urology Research Center, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

W tym artykule

Podsumowanie

Immunohistochemia to potężna technika laboratoryjna do oceny lokalizacji i ekspresji białek w tkankach. Obecne półautomatyczne metody oznaczania ilościowego wprowadzają subiektywizm i często dają niepowtarzalne wyniki. W niniejszym artykule opisano metody multipleksowanej immunohistochemii i obiektywnej oceny ilościowej ekspresji i kolokalizacji białek za pomocą obrazowania wielospektralnego.

Streszczenie

Immunohistochemia jest powszechnie stosowaną techniką wykrywania klinicznego i badawczego do badania ekspresji i lokalizacji białek w tkankach. Opracowano wiele półilościowych systemów oceny ekspresji za pomocą immunohistochemii, ale nieodłączna subiektywność ogranicza odtwarzalność i dokładność wyników. Co więcej, badanie przestrzennie nakładających się biomarkerów, takich jak jądrowe czynniki transkrypcyjne, jest trudne przy użyciu obecnych technik immunohistochemicznych. Opracowaliśmy i zoptymalizowaliśmy system do jednoczesnego badania wielu białek przy użyciu wysokoprzepustowych metod immunohistochemii multipleksowanej i obrazowania wielospektralnego. Immunohistochemia multipleksowa jest przeprowadzana przez sekwencyjne stosowanie przeciwciał pierwszorzędowych z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową lub fosfatazą alkaliczną. Do wykrywania każdego interesującego białka stosuje się różne chromogeny. Wybarwione preparaty są ładowane do automatycznego skanera slajdów i tworzony jest protokół do automatycznego pozyskiwania obrazów. Biblioteka spektralna jest tworzona przez barwienie zestawu szkiełek pojedynczym chromogenem na każdym z nich. Podzbiór reprezentatywnych barwionych obrazów jest importowany do oprogramowania do obrazowania wielospektralnego, a algorytm rozróżniania typu tkanki jest tworzony poprzez zdefiniowanie przedziałów tkankowych na obrazach. Przedziały subkomórkowe są segmentowane za pomocą barwienia przeciwstawnego hematoksyliny i dostosowania wewnętrznego algorytmu. Progowanie stosuje się w celu określenia dodatniości i kolokalizacji białek. Ostateczny algorytm jest następnie stosowany do całego zestawu tkanek. Uzyskane dane pozwalają użytkownikowi ocenić ekspresję białka w oparciu o typ tkanki (np. nabłonek vs. zrąb) i przedział subkomórkowy (jądro vs. cytoplazma vs. błona plazmatyczna). Analiza kolokalizacji pozwala na badanie podwójnie dodatnich, podwójnie ujemnych i jedno-dodatnich typów komórek. Połączenie obrazowania wielospektralnego z immunohistochemią multipleksową i zautomatyzowaną akwizycją obrazu jest obiektywną, wysokoprzepustową metodą badania biomarkerów w tkankach.

Wprowadzenie

Immunohistochemia (IHC) jest standardową techniką laboratoryjną do wykrywania białek w tkance, a IHC jest nadal szeroko stosowana zarówno w badaniach, jak i diagnostyce patologicznej. Ocena barwienia IHC jest często częściowo ilościowa, co wprowadza potencjalny błąd systematyczny do interpretacji wyników. Opracowano wiele podejść półilościowych, które uwzględniają zarówno intensywność barwienia, jak i zakres barwienia w ostatecznej diagnozie 1-4. Inne systemy obejmują intensywność punktacji i lokalizację subkomórkową w celu lepszej lokalizacji ekspresji 5. Uwzględnienie średnich wyników od wielu widzów jest często wykorzystywane w celu zminimalizowania skutków stronniczości jednego widza 6. Pomimo tych wysiłków, subiektywizm w analizie nadal pozostaje, szczególnie przy ocenie zakresu barwienia 7. Standaryzacja protokołów i minimalizacja subiektywności wynikającej z wkładu człowieka ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dokładnych, powtarzalnych wyników IHC.

Istnieją inne opcje oprócz IHC do określania ekspresji białek w tkankach. W środowisku badawczym immunohistochemia jest tradycyjnie postrzegana jako sposób na badanie lokalizacji białek 8, podczas gdy inne techniki, takie jak immunoblotting, są postrzegane jako złoty standard w badaniu ekspresji białek. Określenie ekspresji specyficznej dla tkanki lub przedziału komórkowego jest trudne bez zastosowania zaawansowanych technik, takich jak frakcjonowanie komórek lub mikrodysekcja laserowa 9,10. Zastosowanie przeciwciał fluorescencyjnych na szkiełkach tkankowych stanowi rozsądny kompromis, ale autofluorescencja tła spowodowana NADPH, lipofuscynami, włóknami siatkowatymi, kolagenem i elastyną może utrudnić dokładne określenie ilościowe 11.

Zautomatyzowane platformy patologii obliczeniowej są obiecującym kierunkiem dla bardziej obiektywnej oceny ilościowej barwienia patologii 12-15. Połączenie obrazowania wielospektralnego z mikromacierzami tkankowymi ułatwia wysokoprzepustową analizę ekspresji białek w dużych próbkach. Dzięki tym technikom możliwa jest analiza kolokalizacji białek, niejednorodności barwienia oraz lokalizacji tkankowej i subkomórkowej, przy jednoczesnym znacznym zmniejszeniu zarówno wrodzonych uprzedzeń, jak i czasu niezbędnego do analizy, przy jednoczesnym zwracaniu danych w formacie ciągłym, a nie kategorycznym 16. Dlatego celem tego badania było wykazanie użyteczności i metodologii wykonywania multipleksowanej immunohistochemii z analizą, przy użyciu oprogramowania do obrazowania wielospektralnego.

Ten protokół jest napisany do ręcznego, multipleksowego barwienia immunohistochemicznego pojedynczego szkiełka tkankowego z czterema zoptymalizowanymi przeciwciałami monoklonalnymi. Jako reprezentatywny eksperyment, jądrowy receptor estrogenowy alfa (ERα) i receptor androgenowy (AR) są multipleksowane z błoną anty-mysią CD147 i związaną błoną anty-myszą E-kadheryną. Dowolne przeciwciało z wyboru może zostać zastąpione przeciwciałami wymienionymi w niniejszym dokumencie, ale każda kombinacja przeciwciał wymaga oddzielnej optymalizacji. Wstępne leczenie wszystkich przeciwciał musi być identyczne. Przeciwciała AR i CD147 powinny być optymalizowane indywidualnie, a następnie jako koktajl. Każde przeciwciało jest wykrywane za pomocą systemu polimerowego wolnego od biotyny i jednego z 4 unikalnych chromogenów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Niniejszy protokół opisuje barwienie i analizę mikromacierzy tkankowej (TMA), opisaną wcześniej 12,17,18. Przekrój TMA o grubości 4 μm uzyskano z bloku parafinowego przy użyciu standardowego mikrotomu.

UWAGA: W celu ilościowego określenia obrazu należy utworzyć bibliotekę spektralną dla 4 chromogenów i przeciwbarwienia. Aby to zrobić, zoptymalizowany protokół dla każdego pojedynczego przeciwciała powinien być uruchomiony z jednym przeciwciałem na szkiełko, pomniejszonym o końcowe przeciwbarwienie. Piąty szkiełko należy wybarwić hematoksyliną, aby wygenerować 5 obrazów potrzebnych do stworzenia biblioteki spektralnej.

1. Immunohistochemia multipleksowa

  1. Piecz szkiełka w piekarniku o temperaturze 60 °C przez 20 minut. Za pomocą dygestorium zanurz szkiełko w 100% ksylenie. Powtórz dla 2 podmian ksylenu. Zanurz zjeżdżalnię w 100% etanolu na 5 minut. Powtórz ze świeżym 100% etanolem.
  2. Zanurz szkiełko w 95% etanolu na 3 minuty. Powtórz ze świeżym 95% etanolem. Zanurz zjeżdżalnię w 70% etanolu na 3 min. Zanurz szkiełko w wodzie destylowanej na 3 minuty. Powtórz ze świeżą wodą destylowaną. Stuknij w zjeżdżalnię pionowo, aby spuścić wodę ze zjeżdżalni. Stosować 200 μl gotowego do użycia endogennego blokera peroksydazy przez 5 min.
  3. Odcedź bloker peroksydazy ze szkiełka i zanurz w 45 ml gotowego do użycia buforu do pobierania (pH poniżej 7,0). Umieść pojemnik szkiełkowy w szybkowarze i uruchom program ustawiony na 124 °C na 4 minuty. Pozostaw szybkowar do ostygnięcia przez 20 minut przed otwarciem.
  4. Wyjąć pojemnik z buforem do pobierania i pozostawić do ostygnięcia przez dodatkowe 10 minut. Płukać szkiełko w wodzie destylowanej przez 10 minut. Spuść wodę ze szkiełka i ostrożnie obrysuj tkankę na szkiełku za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego.
  5. Dodać 200 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Przenieść szkiełko do płaskiego pojemnika z pokrywką (komora inkubacyjna) zawierającego wilgotną gazę.
  6. Przygotuj 1 litr 1x soli fizjologicznej buforowanej Tris z Tween-20 (TBST), rozcieńczając 50 ml 20x buforowanej soli fizjologicznej Tris zawierającej 1% Tween-20 i 950 ml wody destylowanej.
  7. Odcedzić PBS ze szkiełka i nałożyć 200 μl 1x TBST. Inkubować 2 min. Opróżnić TBST ze szkiełka i szkiełka powrotnego do komory inkubacyjnej. Nałożyć 200 μl gotowego do użycia uniwersalnego bloku białkowego, zamknąć komorę i inkubować przez 7 min.
  8. Odcedzić blok białkowy i powrócić do komory inkubacyjnej. Rozcieńczyć przeciwciało anty-ERα w stosunku 1:400, dodając 0,6 μl przeciwciała do 239,4 μl rozcieńczalnika przeciwciała. Nanieść 200 μl rozcieńczonego przeciwciała na szkiełko i zamknąć komorę.
  9. Inkubować szkiełko w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Odcedź przeciwciało ze szkiełka i spłucz TBST, a następnie zanurz na 5 minut w TBST.
  10. Opróżnić TBST ze szkiełka i szkiełka powrotnego do komory inkubacyjnej. Nałożyć 200 μl gotowego do użycia polimeru koziej peroksydazy chrzanowej przeciw królikowi chrzanowi i zamknąć komorę. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przepłukać szkiełko TBST i umieścić szkiełko w pojemniku TBST na 5 minut.
  11. Przygotować chromogen peroksydazy-3,3'-diaminobenzydyny (HRP-DAB) z peroksydazy chrzanu brunatnego, dodając 8 μl chromogenu DAB do 250 μl buforu substratowego DAB i dobrze mieszając.
  12. Odcedzić TBST ze szkiełka, wrzucić szkiełko z powrotem do komory inkubacyjnej i nanieść 200 μl brązowego chromogenu HRP-DAB na 6 minut. Dokładnie spłukać szkiełko wodą destylowaną i umieścić szkiełko w pojemniku z wodą destylowaną.
  13. Wymieszać roztwór denaturujący, łącząc 50 μl pierwszego odczynnika elucyjnego ze 150 μl drugiego odczynnika buforowego. Spuść wodę ze szkiełka i nałóż rozcieńczony roztwór denaturujący na szkiełko przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Zdekantować i przepłukać odczynnik denaturujący za pomocą TBST. Zanurz zjeżdżalnię w TBST na 5 minut.
  14. Przygotować koktajl przeciwciał AR/CD147, rozcieńczając 4,2 μl przeciwciała anty-AR i 2,8 μl przeciwciała anty-CD147 203 μl rozcieńczalnika przeciwciał. Odcedzić TBST ze szkiełka, wpłacić szkiełko z powrotem do komory inkubacyjnej i nałożyć na szkiełko 200 μl koktajlu AR/CD147. Zamknąć komorę i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przepłukać szkiełko TBST i zanurzyć w TBST na 5 minut.
  15. Opróżnić TBST, wjechać z powrotem do komory inkubacyjnej i nałożyć 200 μl gotowego do użycia koziego polimeru fosfatazy alkalicznej przeciw królikowi. Zamknąć komorę i inkubować szkiełko podstawowe przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przepłukać szkiełko TBST i zanurzyć w TBST na 5 minut.
  16. Przygotuj chromogen czerwonej fosfatazy alkalicznej, dodając 3,2 μl czerwonego chromogenu do 250 μl czerwonego buforu chromogenowego i dobrze wymieszaj.
  17. Opróżnić TBST ze szkiełka i szkiełka powrotnego do komory inkubacyjnej. Nanieść 200 μl rozcieńczonego chromogenu czerwonej fosfatazy alkalicznej na szkiełko, zamknąć komorę i inkubować przez 7 minut.
  18. Odcedź chromogen i dokładnie spłucz szkiełko wodą destylowaną. Umieść szkiełko w pojemniku z wodą destylowaną na 5 minut. Spuść wodę ze szkiełka, spłucz TBST i wróć do komory inkubacyjnej. Nałóż 200 μl koziego polimeru anty-mysiego HRP na szkiełko i zamknij komorę. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  19. Odcedź polimer ze szkiełka i spłucz TBST. Umieść szkiełko w TBST na 5 minut. Przygotować 200 μl fioletowego chromogenu połączonego z HRP, dodając 3,2 μl odczynnika stabilizującego do 250 μl buforu i dobrze wymieszać. Dodać 3,2 μl fioletowego chromogenu i dobrze wymieszać, a następnie 3,2 μl odczynnika nadtlenku wodoru i dobrze wymieszać.
  20. Odcedzić TBST z szkiełka i nałożyć 200 μl przygotowanego fioletowego chromogenu na szkiełko i inkubować przez 7 minut w temperaturze pokojowej. Opłucz szkiełko wodą destylowaną i umieść szkiełko w pojemniku z wodą destylowaną na 5 minut.
  21. Wymieszać roztwór denaturujący, mieszając 50 μl pierwszego odczynnika elucyjnego ze 150 μl drugiego odczynnika buforowego. Spuść wodę ze szkiełka i nałóż rozcieńczony roztwór denaturujący na szkiełko przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  22. Wypłukać odczynnik denaturujący za pomocą TBST. Umieść szkiełko w pojemniku TBST na 5 minut. Rozcieńczyć przeciwciało anty-E-kadheryny w stosunku 1:200, dodając 1,1 μl przeciwciała do 218,9 μl rozcieńczalnika przeciwciała. Opróżnić TBST ze szkiełka, wrzucić szkiełko z powrotem do komory inkubacyjnej i nanieść na szkiełko 200 μl E-kadheryny. Zamknąć komorę i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  23. Przepłukać szkiełko TBST i umieścić szkiełko w pojemniku TBST na 5 minut. Opróżnić TBST ze szkiełka, wrzucić szkiełko z powrotem do komory inkubacyjnej i nałożyć 200 μl koziego polimeru przeciw myszom HRP. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Przepłukać szkiełko TBST i umieścić szkiełko w pojemniku TBST na 5 minut.
  24. Przygotować chromogen połączony z HRP, dodając 8 μl chromogenu do buforu 250 μl. Nanieś 200 μl chromogenu na szkiełko i wywołuj przez 2 minuty. Dokładnie spłucz szkiełko wodą destylowaną i zanurz w pojemniku z wodą destylowaną.
  25. Rozcieńczyć hematoksylinę, dodając 40 μl hematoksyliny do 200 μl wody destylowanej. Spuść wodę ze szkiełka i nałóż 200 μl rozcieńczonej hematoksyliny na szkiełko przez 30 sekund. Dokładnie spłucz szkiełko bieżącą wodą z kranu przez 2 minuty, a następnie płucz w wodzie destylowanej przez 30 sekund. Wstaw szkiełko do piekarnika o temperaturze 60 °C na 15-30 minut.
  26. Zanurz szkiełko w świeżo przygotowanym 100% ksylenie na 30 sekund, zetrzyj nadmiar ksylenu i dodaj jedną kroplę trwałego nośnika montażowego. Szkiełko nakrywkowe z szkiełkiem nakrywkowym nr 1,5.

2. Zautomatyzowana akwizycja i analiza obrazów

  1. Załaduj poplamione szkiełka do automatycznego skanera slajdów. Na podstawie średnicy, separacji i liczby rdzeni TMA utwórz protokół automatycznego skanowania zgodnie z instrukcją obsługi producenta.
  2. Otwórz oprogramowanie do obrazowania wielospektralnego, aby zbudować bibliotekę spektralną ze szkiełek kontrolnych barwionych pojedynczymi chromogenami i szkiełka barwionego hematoksyliną. Otwórz kostkę obrazu uzyskaną ze slajdu kontrolnego i wybierz od czterech do pięciu dodatnio zabarwionych obszarów, aby optycznie zdefiniować ten chromogen. Powtórz z kostkami obrazu z innych slajdów kontrolnych, aż zostanie utworzona kompletna biblioteka spektralna reprezentująca wszystkie chromogeny, a następnie zapisz bibliotekę spektralną.
  3. Rozpocznij nowy projekt w oprogramowaniu do obrazowania wielospektralnego. Wybierz "Multispectral (.im3)" dla opcji formatu obrazu i "Brightfield" dla formatu próbki. Najpierw skonfiguruj projekt, wybierając żądane opcje: "Segment tkanki", "Znajdź cechy", "Fenotypowanie", "Wynik" i "Eksport". W tym momencie rozdzielczość obrazu można zmienić, aby w razie potrzeby przyspieszyć czas analizy.

3. Segmentacja tkanek

  1. Zaimportuj wcześniej utworzoną bibliotekę spektralną i wybierz wszystkie chromogeny, które mają zostać uwzględnione w analizie.
  2. Otwórz kostki obrazu, które mają zostać uwzględnione w zestawie danych treningowych, wybierając opcję "Otwórz kostkę obrazu". Aby zapewnić dokładność trenowania, wybierz co najmniej 18% całkowitej liczby obrazów do analizy. Wybierz obrazy reprezentujące wszystkie stany chorobowe, aby zwiększyć dokładność segmentacji. Ta część obrazów jest nazywana zbiorem treningowym obrazów.
  3. Obrazy balansu bieli w zestawie treningowym, wybierając narzędzie Kroplomierz do oczu i wybierając obszar na jednym obrazie, który jest biały.
  4. Wybierz przycisk "Zaawansowane", aby przejść do segmentacji tkanek. Użyj panelu "Kategorie tkanek", aby wybrać typy tkanek do analizy (tj. "tkanka" i "nietkanka"). W celu dokładniejszej lokalizacji tkanki białkowej można użyć wielu kategorii tkanek (tj. "nabłonek", "zrąb" i "nietkankowy").
  5. Rozpocznij tworzenie algorytmu i definiowanie kategorii tkanek, rysując wokół grup komórek na obrazach treningowych. Po zakończeniu z jedną kategorią tkanek powtórz dla innych kategorii tkanek. Pamiętaj, aby wybrać grupy komórek na obrazach, które są charakterystyczne dla danego typu tkanki.
  6. Powtórz ten proces dla wszystkich obrazów w zestawie treningowym obrazów.
  7. Wybierz składniki (chromogeny), które mają być uwzględnione w szkoleniu dla "Segmentera Tkankowego". Podczas wykonywania analizy obrazów immunohistochemicznych w jasnym polu wszystkie komponenty są zwykle uwzględniane w treningu. Dołącz do zestawu treningowego liczne obrazy barwienia negatywowego, aby uniknąć stronniczości na tym etapie.
  8. Wybierz odpowiednią "Skalę Wzorca" do szkolenia segmentera tkanek. Przy 20-krotnym powiększeniu zazwyczaj odpowiednia jest duża skala wzoru. Podczas pracy z tkankami o delikatnej architekturze w większym powiększeniu bardziej odpowiednia jest mniejsza skala wzoru.
  9. Wybierz przycisk "Train Tissue Segmenter", aby rozpocząć szkolenie segmentera tkankowego. Zwróć uwagę na wyskakujące okienko wyświetlające dokładność odzwierciedlającą proporcję pikseli w regionach treningowych, które są prawidłowo sklasyfikowane.
    UWAGA: Oprogramowanie nieustannie próbuje poprawić dokładność algorytmu, dopóki nie zostanie ręcznie zatrzymany. Wcześniej wykazaliśmy, że trenowanie na 18% obrazów skutkuje dokładnością treningu na poziomie 97% 12.
  10. Po wytrenowaniu segmentera tkanek wybierz odpowiednią rozdzielczość segmentu. Rozdzielczość segmentu odpowiada czasowi wymaganemu do segmentacji obrazów, przy czym rozdzielczość zgrubna wymaga mniej czasu, a rozdzielczość dokładna wymaga więcej czasu.
  11. Podziel cały zestaw obrazów treningowych na segmenty, klikając opcję "Segmentuj obrazy". Daj oprogramowaniu odpowiedni czas na zastosowanie algorytmu do wszystkich obrazów treningowych. Po zakończeniu przejrzyj zestaw treningowy, aby znaleźć błędnie sklasyfikowaną tkankę z bieżącym algorytmem uczenia.
  12. Aby dostroić proces segmentacji tkanek, dodaj, edytuj lub usuń regiony treningowe tkanek. Użyj opcji "przytnij krawędzie", jeśli piksele rozciągają się na krawędziach jednej kategorii tkanek do innej. Jeśli małe grupy pikseli zostaną błędnie sklasyfikowane, dostosuj próg minimalnego rozmiaru segmentu.
  13. Po zakończeniu edycji wybierz opcję "Segmentuj obrazy", co spowoduje ponowne przeszkolenie segmentera tkanek w celu utworzenia nowego algorytmu segmentacji tkanek. Poprzedni algorytm jest automatycznie zapisywany i w razie potrzeby można do niego wrócić.
  14. Gdy masz pewność co do wyników algorytmu segmentacji tkanek, przejdź do segmentacji komórek, wybierając przycisk "Zaawansowane".

4. Segmentacja komórek

  1. Wybierz przedziały subkomórkowe, które mają zostać uwzględnione w segmentacji komórek. Upewnij się, że "Jądra" są już wybrane, aby wybrać "Cytoplazma" lub "Błona".
    UWAGA: Segmentacja "błonowa" powinna być wybierana tylko wtedy, gdy marker białkowy specyficzny dla błony został włączony do IHC, taki jak E-kadheryna.
  2. W zakładce "Jądra" dostępnych jest kilka opcji. Zacznij od wybrania odpowiednich ustawień segmentacji jądra (patrz krok 4.3). Wybierz, czy segmentacja ma obejmować poszczególne kategorie tkanek, czy wszystkie.
  3. Wybór podejścia do segmentacji jądrowej
    1. Wybierz metodę przeciwstawną "Pixel-Based (Threshold)" (próg) w celu uzyskania uproszczonej metody uzyskiwania dobrych wyników bez konieczności posiadania dużej wiedzy na temat ustawień przetwarzania obrazu.
      UWAGA: To często dobry pierwszy wybór. Przy wyborze podejścia, "Pixel-Based (Próg)" jest bardziej odpowiednie, gdy istnieje niezawodne przeciwbarwienie jądrowe, podczas gdy "Object-Based" powinno być używane, jeśli brakuje spójnego przeciwbarwienia jądrowego.
    2. Wybierz metodę "Pixel-Based (próg)", gdy istnieje niezawodna przeciwplama jądrowa.
      UWAGA: To podejście jest oparte wyłącznie na pikselach. Podejście to można również wykorzystać do innych potrzeb związanych z analizą obrazu, które można zaspokoić za pomocą prostego progu, takiego jak wykrywanie wszystkich pikseli w kategorii tkanki, które mają dodatni kolor dla barwienia IHC.
    3. Wybierz podejście obiektowe, jeśli przeciwbarwienie jądrowe nie zapewnia spójnego i specyficznego barwienia obiektów jądrowych, a do wykrycia jąder potrzebne są bardziej zaawansowane podejścia oparte na morfometrii.
    4. Wybierz "Komponenty do segmentacji jądrowej", "Rozmiar jądra" i "Oczyszczanie", jeśli użytkownik chce dalej definiować ustawienia segmentacji jąder.
  4. Wybierz parametry kształtu cytoplazmy
    1. Wybierz przycisk "Zaawansowane", aby przejść do segmentacji cytoplazmy.
      UWAGA: Istnieje kilka opcji segmentacji cytoplazmy do wyboru. Opcja określana jako "wewnętrzna odległość do jądra" jest oparta na pikselach. Odzwierciedla odległość między zewnętrzną częścią jądra a wnętrzem cytoplazmy. Zwiększenie tej wartości zmniejsza prawdopodobieństwo, że sygnał jądrowy przejdzie do przedziału cytoplazmy.
    2. Następnie wybierz "zewnętrzna odległość do jądra".
      UWAGA: Jest to również oparte na pikselach. Zewnętrzna odległość od jądra odzwierciedla odległość między zewnętrzną częścią jądra a zewnętrzną częścią komórki. Wartość tę można ustawić na tyle dużą lub małą, aby w razie potrzeby uwzględnić lub wykluczyć sygnały membranowe.
    3. Następnie wybierz "minimalny rozmiar".
      UWAGA: Minimalny rozmiar, oparty na pikselach, odzwierciedla minimalny rozmiar próbki cytoplazmy, która ma być uwzględniona w analizie. Jeśli rozmiar cytoplazmy jest mniejszy w danej komórce, na przykład gdy komórki są ciasno upakowane razem, ta segmentacja cytoplazmy jest wykluczona z analizy.
    4. Wybierz następną opcję, "Komponent" z "Podstawowy", "Drugorzędny" i wybierz "Trzeciorzędny" jako opcje drugorzędne.
      UWAGA: Tutaj można wybrać konkretny marker cytoplazmy. Podobnie jak w przypadku segmentacji jądrowej, jeśli zastosowano specyficzny cytoplazmatyczny marker IHC, składnik ten można wykorzystać do zdefiniowania cytoplazmy poprzez znalezienie minimalnej wartości progowej. Pomaga to w zdefiniowaniu cytoplazmy, ale nie jest konieczne dla akceptowalnej dokładności.
    5. Przejście do ostatniej z trzech opcji z zakładkami to "Membrana". W tym miejscu użytkownik definiuje przedział błony za pomocą markera białkowego. Wybierz "Pierwszorzędny", "Drugorzędny" i/lub "Trzeciorzędowy" dla każdego użytego markera specyficznego dla błony. Dostosuj "Full Scale OD", aby znaleźć minimalny próg lub dodatni dla każdego markera na błonach komórkowych.
    6. Kontynuując pod zakładką "Membrana" i wybierz opcję "Maksymalny rozmiar komórki".
      UWAGA: Jest to wartość odległości do membrany w pikselach, która określa maksymalny rozmiar komórek. Wartość 12 jest zwykle odpowiednia dla zdjęć robionych w powiększeniu 20x.
    7. Po wybraniu wszystkich opcji wybierz "Podziel obraz na segment" lub "Podziel na segmenty wszystko". Zastosuj ustawienia do obrazów i obserwuj je "pojedynczo" lub w trybie "Galeria".
      UWAGA: W razie potrzeby dostosuj ustawienia i progi, a następnie ponownie segmentuj, aż wyniki segmentacji komórek będą zadowalające w zestawie obrazów do trenowania.

5. Fenotypowanie komórek

UWAGA: Dokładna segmentacja komórek jest wymagana w celu uzyskania dokładnego fenotypowania komórek, a funkcję fenotypowania można trenować.

  1. Użyj przycisku "Dodaj", aby dodać fenotypy do listy "Fenotypy". Użytkownicy mogą wybrać kolor dla fenotypu.
  2. Kliknij "Edytuj fenotypy", aby przypisać fenotyp do komórki. Kliknij konkretną komórkę, aby wyświetlić menu rozwijane, pozwalające użytkownikowi wybrać fenotyp, a następnie przejść dalej. Zidentyfikuj co najmniej pięć (5) komórek w każdym fenotypie, aby kontynuować. Aby osiągnąć optymalne wyniki, konieczne jest wybranie 25 lub więcej komórek każdego fenotypu.

6. Punktacja IHC i kolokacja

  1. Wybierz "Awans", aby przejść do kroku "Wynik IHC lub IF". Wybierz "Kategoria tkanki", aby uzyskać wynik.
    UWAGA: Podczas danej analizy można ocenić tylko jedną kategorię tkanki, ale jeśli pożądane są wyniki punktacji w innej kategorii tkanek, analizę można powtórzyć później z innymi ustawieniami.
  2. Wybierz żądany typ "Punktacji".
    UWAGA: Dodatniość tworzy dwa przedziały (dodatni i ujemny) dla składnika będącego przedmiotem zainteresowania, podczas gdy podwójna dodatniość jest używana do analizy kolokalizacji. Inne opcje obejmują analizy 4-binowe, 10-binowe i 50-binowe dla wybranego markera.
  3. Wybierz komórkę "Przedział", która ma być używana w analizie punktacji.
  4. Podobnie jak w przypadku znajdowania minimalnego progu dla głównego składnika jądrowego, wybierz "Wyświetl dane komponentu" i przesuń kursor nad obrazy treningowe, aby znaleźć odpowiednie minimalne progi barwienia gęstości optycznej dla dodatnich komórek dla interesującego składnika (składników).
  5. Jeśli chcesz wykluczyć intensywnie zabarwione komórki, obniż próg max do odpowiedniego poziomu. W przeciwnym razie użyj przycisku auto, aby wybrać maksymalny próg do analizy.
  6. Wybierz obrazy treningowe do oceny, aby zweryfikować wartości progowe.
    UWAGA: Procent komórek w danym pojemniku zostanie zwrócony i można go porównać za pomocą oględzin lub ręcznego liczenia. Po zakończeniu wybierz "Zaawansowane", aby przejść do kroku "Eksportuj".

7. Stosowanie algorytmu i analiza wsadowa

  1. Przetestuj algorytm utworzony za pomocą segmentacji tkanek, segmentacji komórek i wartości oceniania, eksportując dane dla zestawu treningowego. Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby utworzyć nowy folder dla katalogu eksportu. Wybierz obrazy i tabele, które mają zostać utworzone i uwzględnione w analizie. Przeprowadź analizę, wybierając opcję "Eksportuj dla wszystkich".
  2. Tabele są eksportowane w plikach tekstowych rozdzielanych tabulatorami i można je otwierać w większości programów do analizy danych.
  3. Po zakończeniu analizy wyświetl dane segmentacji komórek i punktacji dla obrazów o wysokim i niskim zabarwieniu, aby ocenić dokładność ustawień.
  4. Jeśli ustawienia są zadowalające, zastosuj algorytm utworzony na podstawie zestawu obrazów treningowych do całego zestawu obrazów za pomocą analizy wsadowej. Kliknij w zakładkę "Analiza wsadowa", a otwarty algorytm zostanie skopiowany z aktywnego projektu.
  5. Wybierz nowy katalog eksportu i wybierz, które obrazy i tabele mają zostać uwzględnione w analizie. W opcji plików wejściowych wybierz "Dodaj obrazy" i wybierz wszystkie obrazy, które mają zostać uwzględnione w analizie wsadowej.
  6. Wykonaj analizę, wybierając opcję "Uruchom". Podobnie jak w przypadku analizy zbioru treningowego, ten krok będzie wymagał różnej ilości czasu, w zależności od konkretnych ustawień i liczby obrazów zawartych w analizie.
  7. Po zakończeniu przejdź do zakładki "Recenzja/Scalanie". Katalog wsadowy jest domyślnie katalogiem eksportu z analizy wsadowej i w razie potrzeby można go zmienić. Wybierz "Uwzględnij wszystko" i wybierz "Scal", aby utworzyć arkusze danych z danymi podsumowującymi do analizy.

8. Analiza eksportowanych danych

  1. Otwórz wyeksportowane tabele w oprogramowaniu do analizy danych i usuń lub ukryj kolumny danych, które są nieistotne dla analizy, takie jak wartości minimalne i maksymalne dla każdego składnika. Podstawowe dane wykorzystywane w analizie znajdują się w kolumnie średniej gęstości optycznej dla każdego składnika.
  2. Przejrzyj wyeksportowane mapy segmentacji i nieprzetworzone obrazy, aby określić, które próbki lub rdzenie TMA mają zostać wykluczone z analizy. Procentowe wartości tkankowe pomagają w ustaleniu, czy próbka powinna zostać uwzględniona, czy nie, przy czym arbitralna wartość graniczna wynosząca <5% jest najczęściej stosowana jako kryteria wykluczenia.
  3. Usuń nieistotne dane lub wiersze zawierające próbki, które mają zostać wykluczone z analizy danych.
  4. Wykorzystaj dane ilościowe dotyczące białka do zbadania zmian w stanie choroby lub związku z kliniczno-patologicznymi cechami choroby 12,18-21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Na Rysunku 1 przeprowadzono trening na tkankach prostaty w celu segmentacji obrazów na części nabłonkowe i zrębowe, wraz z przedziałem nietkankowym. Przy użyciu markera błony nabłonkowej E-cadherin przeprowadzono segmentację komórek w celu oddzielenia części jądra, cytoplazmy i błony, co przedstawiono na Rysunku 2.

W jednym z eksperymentów zastosowaliśmy multipleksową IHC, aby zbadać ekspresję i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zastosowanie tradycyjnej immunohistochemii do oceny ekspresji białek jest ograniczone przez subiektywne, półilościowe metody analizy 22,23. Stworzono zaawansowane platformy do wysokoprzepustowej analizy ekspresji i lokalizacji biomarkerów. Szczegółowa segmentacja zarówno przedziałów tkankowych, jak i subkomórkowych pozwala użytkownikom badać ekspresję, lokalizację i kolokalizację biomarkerów z innymi markerami będącymi przedmiotem zainteresowania. W poprzednich badaniach wykazaliśmy użyteczność IHC i obrazowan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy dziękują laboratorium University of Wisconsin Translational Research Initiatives in Pathology, częściowo wspieranemu przez Wydział Patologii i Medycyny Laboratoryjnej UW oraz grant UWCCC P30 CA014520, za korzystanie z jego obiektów i usług.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
XyleneFisher ChemicalX3F1GALOcena NFPA: Zdrowie – 2, Ogień – 3 , Reaktywność – 0
Alkohol etylowy-200 proofFisher Scientific 4355223Ocena NFPA: Zdrowie – 0, Ogień – 3 , Reaktywność – 0
Tris BaseFisher ScientificBP152-500Ocena NFPA: Zdrowie – 2, Ogień – 0 , Reaktywność – 0
Tris Hydroxymethyl aminomethane HClFisher ScientificBP153-1NFPA ocena: Zdrowie – 2, Ogień – 0 , Reaktywność – 0
Tween 20Chem-Impex1512Ocena NFPA: Zdrowie – 0, Ogień – 1 , Reaktywność – 0
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiFisher ScientificBP2944-100Ocena NFPA: Zdrowie – 1, Ogień – 0 , Reaktywność – 0
PeroxidazedBiocare MedicalPX968Unikać kontaktu ze skórą i oczami. Może powodować podrażnienie skóry i uszkodzenie oczu.
Receptor estrogenowy alfaThermo Fisher Scientific-LabvisionRM9101Nie sklasyfikowany jako niebezpieczny
Receptor androgenowySCBTsc-816Nie sklasyfikowany jako niebezpieczny
CD147BiodesignP87535MNie sklasyfikowany jako niebezpieczny
E-kadherynaDakoM3612Nie sklasyfikowany jako niebezpieczny
Renoir Red Andibody DiluentBiocare MedycznyPD904Jest specjalnie zaprojektowany do pracy z przeciwciałami na bazie Tris
Komora DeCloakingowa BiocareMedical Model DC2002Podejmij normalne środki ostrożności podczas korzystania z szybkowaru
Długopis barierowy-Immuno Edge Vector LabsH-4000
Zestaw do denaturacji-etap elucjiBiocare MedicalDNS001HNie sklasyfikowany jako niebezpieczny
Mach 2 Goat anti-Rabbit HRP PolymerBiocare MedicalRHRP520Nie sklasyfikowany jako niebezpieczny
Mach 2 Goat anti-Rabbit AP PolymerBiocare MedicalRALP525Nie sklasyfikowany jako niebezpieczny
Mach 2 Goat anty-mysi polimerHRPBiocare MedicalM3M530Nie sklasyfikowany jako niebezpieczny
Betazoid DAB Chromogen KitBiocare MedicalBDB20041. Wiadomo, że DAB jest podejrzewany jako czynnik rakotwórczy.
2. Nie wystawiaj komponentów DAB na działanie silnego światła lub bezpośredniego światła słonecznego.
3. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i odzież.
4. DAB może powodować uczulenie skóry. Unikać kontaktu ze skórą i oczami.
5. Przestrzegaj wszystkich federalnych, stanowych i lokalnych przepisów środowiskowych dotyczących utylizacji
Warp Red Chromogen KitBiocare MedicalWR806Corrosive. Kwas, który może powodować podrażnienie skóry lub uszkodzenie oczu.
Vina Green Chromogen KitBiocare MedicalBRR807Działa szkodliwie po połknięciu
Bajoran Purple Chromogen KitBiocare MedicalBJP807Łatwopalna ciecz. Przechowywać z dala od źródeł ciepła, płomieni i iskier. Działa szkodliwie po spożyciu lub wchłonięciu. Unikać kontaktu ze skórą lub oczami i unikać wdychania.
Kot HematoxylinBiocare MedycznyCATHE Fioletowy  Rozwiązanie   z   a   łagodny   octowy   Kwas   (ocet winny)   zapach.   Maj   be
  irytujące   do   Skóra   lub   oczy.   Unikaj   Kontakt   z   Skóra   oraz   oczy.   Unikaj   Spożyciu.
XYL Nośnik montażowyRichard Allen8312-4Ocena NFPA: Zdrowie – 2, Ogień – 3 , Reaktywność – 0
1.5 Szkiełka nakrywkoweMarka Fisher 22266858Ostre krawędzie
Inkubacja (wilgotność)Komoraprzestarzała przestarzałaDostępnychjest wielu dostawców
Piec konwekcyjnyStabil- ThermC-4008-Q
Tło Odczynnik blokujący PunisherBiocare MedicalBP974Ten produkt nie jest klasyfikowany jako niebezpieczny. 
Oprogramowanie inFormPerkinElmerCLS135781Podstawowe oprogramowanie do obrazowania wielospektralnego używane w manuskryptach
Oprogramowanie NuancePerkinElmerNuance EXOprogramowanie służące do tworzenia bibliotek spektralnych w rękopisie
Mikroskop Vectra i skaner preparatówPerkinElmerVECTRAAutomatyczny skaner preparatów i mikroskop do uzyskiwania kostek obrazu IM3

Bibliografia

  1. Valdman, A., et al. Expression of redox pathway enzymes in human prostatic tissue. Anal Quant Cytol Histol. 31 (6), 367-374 (2009).
  2. Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A., Olsen, D. A., Provost, E. Amplification of tissue by construction of tissue microarrays. Exp Mol Pathol. 70 (3), 255-264 (2001).
  3. Jonmarker, S., et al. Expression of PDX-1 in prostate cancer, prostatic intraepithelial neoplasia and benign prostatic tissue. APMIS. 116 (6), 491-498 (2008).
  4. McCarty, K. S., Miller, L. S., Cox, E. B., Konrath, J., McCarty, K. S. Sr Estrogen receptor analyses. Correlation of biochemical and immunohistochemical methods using monoclonal antireceptor antibodies. Arch Pathol Lab Med. 109 (8), 716-721 (1985).
  5. Volante, M., et al. Somatostatin receptor type 2A immunohistochemistry in neuroendocrine tumors: a proposal of scoring system correlated with somatostatin receptor scintigraphy. Mod Pathol. 20 (11), 1172-1182 (2007).
  6. Muris, J. J., et al. Immunohistochemical profiling of caspase signaling pathways predicts clinical response to chemotherapy in primary nodal diffuse large B-cell lymphomas. Blood. 105 (7), 2916-2923 (2005).
  7. Jaraj, S. J., et al. Intra- and interobserver reproducibility of interpretation of immunohistochemical stains of prostate cancer. Virchows Arch. 455 (4), 375-381 (2009).
  8. Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. J Histochem Cytochem. 14 (12), 929-931 (1966).
  9. Peters, T. J. Investigation of tissue organelles by a combination of analytical subcellular fractionation and enzymic microanalysis: a new approach to pathology. J Clin Pathol. 34 (1), 1-12 (1981).
  10. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser Capture Microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
  11. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).
  12. Huang, W., Hennrick, K., Drew, S. A colorful future of quantitative pathology: validation of Vectra technology using chromogenic multiplexed immunohistochemistry and prostate tissue microarrays. Hum Pathol. 44 (1), 29-38 (2013).
  13. Rimm, D. L. C-Path: A Watson-Like Visit to the Pathology Lab. Science Translational Medicine. 3 (108), (2011).
  14. Fiore, C., et al. Utility of multispectral imaging in automated quantitative scoring of immunohistochemistry. J Clin Pathol. 65 (6), 496-502 (2012).
  15. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  16. Rizzardi, A. E., et al. Quantitative comparison of immunohistochemical staining measured by digital image analysis versus pathologist visual scoring. Diagn Pathol. 7, 42(2012).
  17. Bauman, T. M., et al. Characterization of fibrillar collagens and extracellular matrix of glandular benign prostatic hyperplasia nodules. PLoS One. 9 (10), e109102(2014).
  18. Bauman, T. M., et al. Beta-catenin is elevated in human benign prostatic hyperplasia specimens compared to histologically normal prostate tissue. Am J Clin Exp Urol. 2 (4), 313-322 (2014).
  19. Bauman, T. M., Ewald, J. A., Huang, W., Ricke, W. A. CD147 expression predicts biochemical recurrence after prostatectomy independent of histologic and pathologic features. BMC Cancer. 15 (1), 549(2015).
  20. Bauman, T. M., et al. Finasteride treatment alters tissue specific androgen receptor expression in prostate tissues. Prostate. 74 (9), 923-932 (2014).
  21. Nicholson, T. M., Sehgal, P. D., Drew, S. A., Huang, W., Ricke, W. A. Sex steroid receptor expression and localization in benign prostatic hyperplasia varies with tissue compartment. Differentiation. 85 (4-5), 140-149 (2013).
  22. Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49 (4), 411-424 (2006).
  23. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
  24. Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).
  25. Ong, C. W., et al. Computer-assisted pathological immunohistochemistry scoring is more time-effective than conventional scoring, but provides no analytical advantage. Histopathology. 56 (4), 523-529 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Multipleksowa immunohistochemiailościowe oznaczanie ekspresji białekanaliza kolokalizacji białekalgorytm segmentacji tkanektworzenie biblioteki spektralnejmetody detekcji chromogenówzautomatyzowana akwizycja obrazówanaliza przedziałów subkomórkowychbadanie tkanek pod kątem biomarkerów
Kwantyfikacja ekspresji białek i kolokalizacji za pomocą multipleksowanego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania wielospektralnego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.