Kwantyfikacja ekspresji białek i kolokalizacji za pomocą multipleksowanego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania wielospektralnego

Tyler M. Bauman; Emily A. Ricke; Sally A. Drew; Wei Huang; William A. Ricke

doi:10.3791/53837

Method Article

Kwantyfikacja ekspresji białek i kolokalizacji za pomocą multipleksowanego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania wielospektralnego

DOI:

10.3791/53837

⸱

April 8th, 2016

Tyler M. Bauman¹^,² , Emily A. Ricke² , Sally A. Drew³ , Wei Huang³^,⁴ , William A. Ricke²^,⁴

¹Division of Urologic Surgery, Washington University in St. Louis School of Medicine, ²Department of Urology, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, ³Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, ⁴O’Brien Urology Research Center, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunohistochemia to potężna technika laboratoryjna do oceny lokalizacji i ekspresji białek w tkankach. Obecne półautomatyczne metody oznaczania ilościowego wprowadzają subiektywizm i często dają niepowtarzalne wyniki. W niniejszym artykule opisano metody multipleksowanej immunohistochemii i obiektywnej oceny ilościowej ekspresji i kolokalizacji białek za pomocą obrazowania wielospektralnego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunohistochemia jest powszechnie stosowaną techniką wykrywania klinicznego i badawczego do badania ekspresji i lokalizacji białek w tkankach. Opracowano wiele półilościowych systemów oceny ekspresji za pomocą immunohistochemii, ale nieodłączna subiektywność ogranicza odtwarzalność i dokładność wyników. Co więcej, badanie przestrzennie nakładających się biomarkerów, takich jak jądrowe czynniki transkrypcyjne, jest trudne przy użyciu obecnych technik immunohistochemicznych. Opracowaliśmy i zoptymalizowaliśmy system do jednoczesnego badania wielu białek przy użyciu wysokoprzepustowych metod immunohistochemii multipleksowanej i obrazowania wielospektralnego. Immunohistochemia multipleksowa jest przeprowadzana przez sekwencyjne stosowanie przeciwciał pierwszorzędowych z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową lub fosfatazą alkaliczną. Do wykrywania każdego interesującego białka stosuje się różne chromogeny. Wybarwione preparaty są ładowane do automatycznego skanera slajdów i tworzony jest protokół do automatycznego pozyskiwania obrazów. Biblioteka spektralna jest tworzona przez barwienie zestawu szkiełek pojedynczym chromogenem na każdym z nich. Podzbiór reprezentatywnych barwionych obrazów jest importowany do oprogramowania do obrazowania wielospektralnego, a algorytm rozróżniania typu tkanki jest tworzony poprzez zdefiniowanie przedziałów tkankowych na obrazach. Przedziały subkomórkowe są segmentowane za pomocą barwienia przeciwstawnego hematoksyliny i dostosowania wewnętrznego algorytmu. Progowanie stosuje się w celu określenia dodatniości i kolokalizacji białek. Ostateczny algorytm jest następnie stosowany do całego zestawu tkanek. Uzyskane dane pozwalają użytkownikowi ocenić ekspresję białka w oparciu o typ tkanki (np. nabłonek vs. zrąb) i przedział subkomórkowy (jądro vs. cytoplazma vs. błona plazmatyczna). Analiza kolokalizacji pozwala na badanie podwójnie dodatnich, podwójnie ujemnych i jedno-dodatnich typów komórek. Połączenie obrazowania wielospektralnego z immunohistochemią multipleksową i zautomatyzowaną akwizycją obrazu jest obiektywną, wysokoprzepustową metodą badania biomarkerów w tkankach.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunohistochemia (IHC) jest standardową techniką laboratoryjną do wykrywania białek w tkance, a IHC jest nadal szeroko stosowana zarówno w badaniach, jak i diagnostyce patologicznej. Ocena barwienia IHC jest często częściowo ilościowa, co wprowadza potencjalny błąd systematyczny do interpretacji wyników. Opracowano wiele podejść półilościowych, które uwzględniają zarówno intensywność barwienia, jak i zakres barwienia w ostatecznej diagnozie ^1-4. Inne systemy obejmują intensywność punktacji i lokalizację subkomórkową w celu lepszej lokalizacji ekspresji ⁵. Uwzględnienie średnich wyników od wielu widzów jest często wykorzystywane w celu zminimaliz....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Niniejszy protokół opisuje barwienie i analizę mikromacierzy tkankowej (TMA), opisaną wcześniej ^12,17,18. Przekrój TMA o grubości 4 μm uzyskano z bloku parafinowego przy użyciu standardowego mikrotomu.

UWAGA: W celu ilościowego określenia obrazu należy utworzyć bibliotekę spektralną dla 4 chromogenów i przeciwbarwienia. Aby to zrobić, zoptymalizowany protokół dla każdego pojedynczego przeciwciała powinien być uruchomiony z jednym przeciwciałem na szkiełko, pomniejszonym o końcowe przeciwbarwienie. Piąty szkiełko należy wybarwić hematoksyliną, aby wygenerować 5 obrazów potrzebnych do stworzenia biblioteki spektralnej.

1. Immunohistochem....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na rysunku 1 przeprowadza się trening na tkankach prostaty w celu segmentacji obrazów na części nabłonkowe i zrębowe, wraz z przedziałem nietkankowym. Używając markera błony nabłonkowej E-kadheryny, przeprowadzono segmentację komórek w celu oddzielenia jądra, cytoplazmy i części błony, jak pokazano na rycinie 2.

W jednym eksperymencie użyliśmy multipleksowanego IHC do zbadania ekspresji i lokali.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zastosowanie tradycyjnej immunohistochemii do oceny ekspresji białek jest ograniczone przez subiektywne, półilościowe metody analizy ^22,23. Stworzono zaawansowane platformy do wysokoprzepustowej analizy ekspresji i lokalizacji biomarkerów. Szczegółowa segmentacja zarówno przedziałów tkankowych, jak i subkomórkowych pozwala użytkownikom badać ekspresję, lokalizację i kolokalizację biomarkerów z innymi markerami będącymi przedmiotem zainteresowania. W poprzednich badaniach wykazaliśmy użyteczność IHC i obrazowan.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują laboratorium University of Wisconsin Translational Research Initiatives in Pathology, częściowo wspieranemu przez Wydział Patologii i Medycyny Laboratoryjnej UW oraz grant UWCCC P30 CA014520, za korzystanie z jego obiektów i usług.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylene	Fisher Chemical	X3F1GAL	Ocena NFPA: Zdrowie – 2, Ogień – 3 , Reaktywność – 0
Alkohol etylowy-200 proof	Fisher Scientific 4355223		Ocena NFPA: Zdrowie – 0, Ogień – 3 , Reaktywność – 0
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500	Ocena NFPA: Zdrowie – 2, Ogień – 0 , Reaktywność – 0
Tris Hydroxymethyl aminomethane HCl	Fisher Scientific	BP153-1	NFPA ocena: Zdrowie – 2, Ogień – 0 , Reaktywność – 0
Tween 20	Chem-Impex	1512	Ocena NFPA: Zdrowie – 0, Ogień – 1 , Reaktywność – 0
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Fisher Scientific	BP2944-100	Ocena NFPA: Zdrowie – 1, Ogień – 0 , Reaktywność – 0
Peroxidazed	Biocare Medical	PX968	Unikać kontaktu ze skórą i oczami. Może powodować podrażnienie skóry i uszkodzenie oczu.
Receptor estrogenowy alfa	Thermo Fisher Scientific-Labvision	RM9101	Nie sklasyfikowany jako niebezpieczny
Receptor androgenowy	SCBT	sc-816	Nie sklasyfikowany jako niebezpieczny
CD147	Biodesign	P87535M	Nie sklasyfikowany jako niebezpieczny
E-kadheryna	Dako	M3612	Nie sklasyfikowany jako niebezpieczny
Renoir Red Andibody Diluent	Biocare Medyczny	PD904	Jest specjalnie zaprojektowany do pracy z przeciwciałami na bazie Tris
Komora DeCloakingowa	Biocare	Medical Model DC2002	Podejmij normalne środki ostrożności podczas korzystania z szybkowaru
Długopis barierowy-Immuno Edge	Vector Labs	H-4000
Zestaw do denaturacji-etap elucji	Biocare Medical	DNS001H	Nie sklasyfikowany jako niebezpieczny
Mach 2 Goat anti-Rabbit HRP Polymer	Biocare Medical	RHRP520	Nie sklasyfikowany jako niebezpieczny
Mach 2 Goat anti-Rabbit AP Polymer	Biocare Medical	RALP525	Nie sklasyfikowany jako niebezpieczny
Mach 2 Goat anty-mysi polimer	HRPBiocare Medical	M3M530	Nie sklasyfikowany jako niebezpieczny
Betazoid DAB Chromogen Kit	Biocare Medical	BDB2004	1. Wiadomo, że DAB jest podejrzewany jako czynnik rakotwórczy. 2. Nie wystawiaj komponentów DAB na działanie silnego światła lub bezpośredniego światła słonecznego. 3. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i odzież. 4. DAB może powodować uczulenie skóry. Unikać kontaktu ze skórą i oczami. 5. Przestrzegaj wszystkich federalnych, stanowych i lokalnych przepisów środowiskowych dotyczących utylizacji
Warp Red Chromogen Kit	Biocare Medical	WR806	Corrosive. Kwas, który może powodować podrażnienie skóry lub uszkodzenie oczu.
Vina Green Chromogen Kit	Biocare Medical	BRR807	Działa szkodliwie po połknięciu
Bajoran Purple Chromogen Kit	Biocare Medical	BJP807	Łatwopalna ciecz. Przechowywać z dala od źródeł ciepła, płomieni i iskier. Działa szkodliwie po spożyciu lub wchłonięciu. Unikać kontaktu ze skórą lub oczami i unikać wdychania.
Kot Hematoxylin	Biocare Medyczny	CATHE Fioletowy	Rozwiązanie z a łagodny octowy Kwas (ocet winny) zapach. Maj be irytujące do Skóra lub oczy. Unikaj Kontakt z Skóra oraz oczy. Unikaj Spożyciu.
XYL Nośnik montażowy	Richard Allen	8312-4	Ocena NFPA: Zdrowie – 2, Ogień – 3 , Reaktywność – 0
1.5 Szkiełka nakrywkowe	Marka Fisher 22266858		Ostre krawędzie
Inkubacja (wilgotność)Komora	przestarzała przestarzała	Dostępnych	jest wielu dostawców
Piec konwekcyjny	Stabil- Therm	C-4008-Q
Tło Odczynnik blokujący Punisher	Biocare Medical	BP974	Ten produkt nie jest klasyfikowany jako niebezpieczny.
Oprogramowanie inForm	PerkinElmer	CLS135781	Podstawowe oprogramowanie do obrazowania wielospektralnego używane w manuskryptach
Oprogramowanie Nuance	PerkinElmer	Nuance EX	Oprogramowanie służące do tworzenia bibliotek spektralnych w rękopisie
Mikroskop Vectra i skaner preparatów	PerkinElmer	VECTRA	Automatyczny skaner preparatów i mikroskop do uzyskiwania kostek obrazu IM3

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Valdman, A., et al. Expression of redox pathway enzymes in human prostatic tissue. Anal Quant Cytol Histol. 31 (6), 367-374 (2009).
Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A., Olsen, D. A., Provost, E. Amplification of tissue by construction of tissue microarrays. E....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Kwantyfikacja ekspresji białek i kolokalizacji za pomocą multipleksowanego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania wielospektralnego

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles