Opisaliśmy tutaj prostą metodę amplifikacji izotermicznej (LAMP) za pośrednictwem pętli, wykorzystującą liofilizowane odczynniki do wykrywania C. burnetii w próbkach pobranych od pacjentów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Opracowanie liofilizowanych odczynników do amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli do wykrywania Coxiella burnetii
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Coxiella burnetii, czynnik wywołujący gorączkę Q, jest obligatoryjną bakterią wewnątrzkomórkową. Testy diagnostyczne oparte na PCR zostały opracowane do wykrywania DNA C. burnetii w kulturach komórkowych i próbkach klinicznych. PCR wymaga specjalistycznego sprzętu i intensywnego szkolenia użytkowników końcowych, dlatego nie nadaje się do rutynowych prac, zwłaszcza w obszarze o ograniczonych zasobach. Opracowaliśmy test amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP) w celu wykrycia obecności C. burnetii w próbkach pobranych od pacjentów. Metodę tę wykonuje się w pojedynczej temperaturze około 60 °C w łaźni wodnej lub bloku grzewczym. Czułość tego testu LAMP jest bardzo podobna do PCR z granicą wykrywalności około 25 kopii na reakcję. W niniejszym raporcie opisano przygotowanie reakcji przy użyciu liofilizowanych odczynników oraz wizualizację wyników przy użyciu błękitu hydroksynaftolowego (HNB) lub lampy UV z fluorescencyjnym barwnikiem interkalacyjnym w reakcji. Odczynniki LAMP poddano liofilizacji i przechowywano w temperaturze pokojowej (RT) przez jeden miesiąc bez utraty czułości wykrywania. Ten test LAMP jest szczególnie skuteczny, ponieważ przygotowanie mieszaniny reakcyjnej nie obejmuje skomplikowanych etapów. Ta metoda jest idealna do stosowania w warunkach o ograniczonych zasobach, w których gorączka Q jest endemiczna.
Wprowadzenie
Mała bakteria Gram-ujemna Coxiella burnetii jest czynnikiem wywołującym gorączkę Q, która jest ogólnoświatową chorobą odzwierzęcą. Ze względu na ogólnoświatowe rozprzestrzenianie się gorączki Q i wysoką zakaźność C. burnetii, amerykański personel wojskowy i cywilny rozmieszczony za granicą jest narażony na ryzyko zakażenia na obszarach endemicznych.
Q gorączka objawia się w dwóch formach: ostrej i przewlekłej infekcji. Ostra gorączka Q objawia się objawami grypopodobnymi, zapaleniem wątroby lub zapaleniem płuc i jest zwykle chorobą samoograniczającą się o niskiej śmiertelności. Przewlekła gorączka Q, choć mniej powszechna, często prowadzi do zapalenia wsierdzia, które ma znacznie wyższą śmiertelność, jeśli nie jest leczone1,2. Dlatego wczesna diagnoza w celu ukierunkowania odpowiedniego leczenia ma kluczowe znaczenie dla opieki nad pacjentem. Opracowano testy reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) do wykrywania DNA C. burnetii w hodowlach komórkowych i próbkach klinicznych3-5. Zarówno PCR, jak i qPCR są kosztowne i często nie są łatwo dostępne w obszarach o ograniczonych zasobach do rutynowych prac.
Pierwotnie opisana przez Notomi6, amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli (LAMP) oferuje alternatywną metodę amplifikacji DNA. LAMP wykorzystuje polimerazę DNA Bst do syntezy DNA z przemieszczeniem nici wraz ze specjalnie zaprojektowanymi zestawami starterów, które rozpoznają co najmniej sześć niezależnych regionów docelowego genu. Najważniejszą zaletą LAMP jest to, że amplifikacja zachodzi w warunkach izotermicznych. Dlatego wymagana jest tylko łaźnia wodna, blok grzewczy lub inkubator. Metoda ta została wykorzystana do wykrycia kilku patogenów riketsjowych7-9. Wizualizacja amplifikowanych produktów DNA za pomocą elektroforezy żelowej jest najdokładniejszą metodą, która pozwala odróżnić wyniki prawdziwie dodatnie od fałszywie dodatnich z powodu niespecyficznej amplifikacji. Jednak procedury związane z elektroforezą żelową nie są praktyczne w przypadku obszarów o ograniczonych zasobach. Opracowano kilka alternatywnych metod wykrywania produktów reakcji. Te alternatywy, takie jak zmętnienie wynikające z tworzenia pirofosforanu magnezu10 lub użycie fluorescencyjnego barwnika interkalacyjnego do wizualizacji w świetle UV11,12 są korzystniejsze niż stosowanie żelu. Odczynniki LAMP były stabilne przez jeden miesiąc, gdy były przechowywane w temperaturze 25 °C i 37 °C, które są temperaturami otoczenia w krajach tropikalnych i subtropikalnych, w których gorączka Q jest endemiczna13.
Test LAMP został opracowany w naszym laboratorium do wykrywania obecności C. burnetii w próbkach osocza14. Tutaj opisujemy prosty protokół przygotowania mieszaniny reakcyjnej LAMP z liofilizowanych odczynników. Liofilizowane odczynniki są stabilne przez jeden miesiąc, gdy są przechowywane w temperaturze pokojowej. W połączeniu z łatwą metodą wizualizacji jest to idealna metoda do wykrywania C. burnetii w warunkach ograniczonych zasobów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotuj rozcieńczenia plazmidowego DNA jako standard do reakcji LAMP
- Za pomocą spektrofotometru zmierz gęstość optyczną (O.D.) przy 260 nm w celu określenia stężenia DNA plazmidu (zawierającego gen docelowy IS1111a C. burnetii RSA 493). Średnica zewnętrzna 260 równa się 50 μg/μl DNA.
- Przelicz ilość plazmidowego DNA na liczbę kopii. Ponieważ rozmiar plazmidu wynosi 6,330 pz, masa cząsteczkowa tego plazmidu wynosi 4,1 x 106 g (6,330 pz x 649 g/bp). Stężenie DNA w plazmidzie wynosi 34,2 ng/μl (zgodnie z krokiem 1.1). 1 μl tej próbki DNA zawiera 34,2 ng plazmidowego DNA, co odpowiada 5 x 109 kopii (34,2 x 10-9 g / 4,1 x 106 g x 6,02 x 1023) DNA.
- Dodać 10 μl plazmidowego DNA (5 x 109 kopii/μl) do 90 μl wody w celu 10-krotnego rozcieńczenia, aby uzyskać próbkę DNA o wymiarach 5 x 108 kopii/μl.
- Powtórzyć krok 1.3 w celu przygotowania próbek DNA o wymiarach 5 x 107, 5 x 106, 5 x 105, 5 x 104, 5 x 103, 5 x 102, 5 x 101 i 5 x 100 kopii/μl.
2. Przygotuj matrycę DNA z próbek do reakcji LAMP
- Wykonaj ekstrakcję DNA z próbek ludzkiego osocza za pomocą komercyjnego mini zestawu DNA zgodnie z protokołem producenta. Do ekstrakcji należy użyć łącznie 200 μl próbki i wymyć wyekstrahowane DNA w objętości 20 μl.
3. Przygotuj 2x Bufor Reakcyjny LAMP
- Wymieszaj 200 μl 10x Pol Buffer, 320 μl 5 M trimetyloglicyny, 12 μl 1 M MgSO4, 280 μl mieszaniny dNTP (po 10 mM) i 188 μl wody, aby uzyskać 1 ml buforu 2x LAMP. Mieszać przez wirowanie impulsowe przez 10 sekund.
4. Wykonaj standardową reakcję LAMP
- Wymieszać 12,5 μl 2x buforu LAMP (przygotowanego w kroku 3; 40 mM Tris-HCl (pH 8,8), 20 mM KCl, 16 mM MgSO4, 20 mM (NH4)2SO4, 0,2% Triton X-100, 1,6 M trimetyloglicyny, 1,4 mM mieszaniny dNTP), 1,2 μl mieszaniny starterów, 1 μl polimerazy DNA Bst (8 U/μl), i 5,3 μl wody do przygotowania mieszaniny reakcyjnej (20 μl) w probówce PCR o pojemności 0,2 ml.
- Dodać 5 μl DNA (z etapu 1 lub 2) do mieszaniny reakcyjnej o objętości 20 μl i dobrze wymieszać.
- Zamknąć probówkę i inkubować w temperaturze 60 °C przez 60 minut w łaźni wodnej lub bloku grzewczym. Jest to optymalna temperatura reakcji określona wcześniej.
- Dodać 5 μl 10x buforu ładującego żel, aby zakończyć reakcję.
- Załadować 5 μl produktów reakcji do 2% żelu agarozowego wybarwionego interkalacyjnym barwnikiem kwasu nukleinowego.
- Uruchom żel pod napięciem 100 V przez 35 minut w 1x buforze TBE.
- Wizualizacja wyników za pomocą światła UV.
5. Wykonaj reakcję LAMP z odczynnikami odtworzonymi
- Zmieszać 125 μl 10x Pol Buffer, 200 μl 5 M trimetyloglicyny, 7,5 μl 1 MMgSO4, 667,5 μl wody, aby uzyskać 1 ml buforu do rozpuszczenia. Mieszać przez wirowanie impulsowe przez 10 sekund.
- Wyjmij probówki zawierające liofilizowane odczynniki z zamkniętej torebki z folii aluminiowej. Nie używaj tubek, jeśli torba z folii aluminiowej nie jest szczelnie zamknięta lub jest uszkodzona.
- Dodać 20 μl buforu do rozpuszczenia do każdej probówki, aby ponownie zawiesić liofilizowane odczynniki.
- Wymieszać pipetując bufor w górę i w dół 5 razy. Przyjrzyj się, aby upewnić się, że liofilizowane odczynniki są całkowicie ponownie zawieszone. Biały proszek powinien zniknąć w tubce.
- Dodać 5 μl matrycy DNA (z kroku 1 lub 2) do odtworzonych odczynników i dobrze wymieszać.
- Zamknąć probówkę i inkubować w temperaturze 60 °C przez 60 minut w łaźni wodnej lub bloku grzewczym.
- Dodać 5 μl 10x buforu ładującego żel, aby zakończyć reakcję.
- Załadować 5 μl produktów reakcji do 2% żelu agarozowego wybarwionego interkalacyjnym barwnikiem kwasu nukleinowego.
- Uruchom żel pod napięciem 100 V przez 35 minut w 1x buforze TBE.
- Wizualizacja wyników za pomocą światła UV.
6. Przeprowadź reakcję LAMP z buforem do rekonstytucji zawierającym HNB lub fluorescencyjny barwnik interkalacyjny
- Zmieszać 125 μl 10x Pol Buffer, 200 μl 5 M trimetyloglicyny, 7,5 μl 1 M MgSO4, 7,5 μl 20 mM HNB (lub 12,5 μl 100x fluorescencyjnego barwnika interkalacyjnego) i 660 μl (lub 655 μl) wody, aby uzyskać 1 ml buforu do rozpuszczenia. Mieszać przez wirowanie impulsowe przez 10 sekund.
- Użyć przygotowanego buforu przygotowanego w sekcji 6, aby powtórzyć kroki opisane w punktach 5.2 - 5.6.
- Wizualizacja wyników gołym okiem (reakcja zawierająca HNB) lub światłem UV (reakcja zawierająca fluorescencyjny barwnik interkalacyjny).
7. Przeprowadzanie reakcji LAMP w czasie rzeczywistym za pomocą skanera probówkowego
- Dodać 5 μl DNA do odtworzonych odczynników zawierających fluorescencyjny barwnik interkalacyjny, zamknąć probówkę i włożyć ją do skanera probówkowego.
- Ustawić temperaturę inkubacji na 60 °C. Mierzyć fluorescencję przy 520 nm przez 60 minut.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Liofilizowane odczynniki LAMP w probówce 0,2 ml zawierają polimerazę DNA Bst, startery oraz dNTP. Do resuspensji liofilizowanych odczynników stosuje się 20 µl buforu do rekonstytucji. Rysunek 1 przedstawia wyniki reakcji LAMP na żelach agarozowych z zastosowaniem świeżo przygotowanych odczynników oraz odczynników liofilizowanych. Odczynnik liofilizowany nie wykazuje spadku aktywności. Reakcje LAMP przygotowane za pomocą obu rodzajów odczynników pozwalają na detek...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wcześniej opracowaliśmy czuły i specyficzny test LAMP ukierunkowany na element insercyjny IS1111a14. Pierwiastek IS1111 został wybrany, ponieważ jest wysoce konserwatywny wśród różnych szczepów C. burnetii i ma dużą liczbę kopii (od 7 do 110) w bakteriach (Klee 2006). Nasze wyniki wykazały, że LAMP może wykryć około 25 kopii elementu IS1111, który może korelować z zaledwie jedną chromosomalną kopią DNA Coxiella . W tym badaniu polimeraza DNA Bst , startery ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez Centrum Badań Medycznych Marynarki Wojennej, jednostka badawcza 6000.RAD1. J.A0310. Poglądy wyrażone w tym artykule są poglądami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają oficjalną politykę lub stanowisko Departamentu Marynarki Wojennej, Departamentu Obrony lub rządu Stanów Zjednoczonych. Wei-Mei Ching jest pracownikiem rządu Stanów Zjednoczonych. Praca ta została przygotowana w ramach jej obowiązków służbowych. Tytuł 17 § 105 U.S.C. stanowi, że "Ochrona praw autorskich na mocy niniejszego tytułu nie jest dostępna dla żadnego dzieła rządu Stanów Zjednoczonych". Tytuł 17 § 101 U.S.C. definiuje pracę rządu Stanów Zjednoczonych jako pracę przygotowaną przez członka służby wojskowej lub pracownika rządu Stanów Zjednoczonych w ramach obowiązków służbowych tej osoby.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Podkłady LAMP | Eurofins MWG operon | 10 nmol, bez soli | Sekwencja zaprojektowana przez klienta |
| Polimeraza DNA | Bst New England Biolabs | M0275L | 8 jednostek/ml |
| 10x Bufor Thermo pol | New England Biolabs | B9004S | |
| mieszanina dNTP | New England Biolabs | N0447L | 10 mM każdy |
| Betaina | Sigma-Aldrich | B0300 | 5 M, trimetyloglicyna |
| Siarczan magnezu | Sigma-Aldrich | M3409-1ML | 1 M |
| 10x Bluejuice | Invitrogen | 10816-015 | żel bufor ładujący |
| SYBR zielony | Invitrogen | S7585 | 10 000x, wizualizacja produktów w tubkach |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | 10 000x, wizualizacja produktów w żelach |
| Odczynniki liofilizowane | Zasięg | ||
| Hydrooxynaphthol blue | Fluka | 33936-10G | |
| ESEQuant skaner probówek | Qiagen | wykrywanie w czasie rzeczywistym |
Bibliografia
- Anderson, A., et al. Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group. MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).
- Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis. Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).
- Fournier, P. E., Raoult, D. Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever. J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).
- Schneeberger, P. M., et al. Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever. Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).
- Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia. Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).
- Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).
- Huber, E., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR. J. Med. Microb. Diagn. 1 (112), (2012).
- Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification. BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
- Qiao, Y. M., et al. Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores. Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
- Thekisoe, O. M., et al. Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates. J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).
- Chen, H. W., Ching, W. M. Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii. J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).
- Wang, D., et al. A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria. Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
