Opracowanie liofilizowanych odczynników do amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli do wykrywania Coxiella burnetii

Summary

Opisaliśmy tutaj prostą metodę amplifikacji izotermicznej (LAMP) za pośrednictwem pętli, wykorzystującą liofilizowane odczynniki do wykrywania C. burnetii w próbkach pobranych od pacjentów.

Abstract

Coxiella burnetii, czynnik wywołujący gorączkę Q, jest obligatoryjną bakterią wewnątrzkomórkową. Testy diagnostyczne oparte na PCR zostały opracowane do wykrywania DNA C. burnetii w kulturach komórkowych i próbkach klinicznych. PCR wymaga specjalistycznego sprzętu i intensywnego szkolenia użytkowników końcowych, dlatego nie nadaje się do rutynowych prac, zwłaszcza w obszarze o ograniczonych zasobach. Opracowaliśmy test amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP) w celu wykrycia obecności C. burnetii w próbkach pobranych od pacjentów. Metodę tę wykonuje się w pojedynczej temperaturze około 60 °C w łaźni wodnej lub bloku grzewczym. Czułość tego testu LAMP jest bardzo podobna do PCR z granicą wykrywalności około 25 kopii na reakcję. W niniejszym raporcie opisano przygotowanie reakcji przy użyciu liofilizowanych odczynników oraz wizualizację wyników przy użyciu błękitu hydroksynaftolowego (HNB) lub lampy UV z fluorescencyjnym barwnikiem interkalacyjnym w reakcji. Odczynniki LAMP poddano liofilizacji i przechowywano w temperaturze pokojowej (RT) przez jeden miesiąc bez utraty czułości wykrywania. Ten test LAMP jest szczególnie skuteczny, ponieważ przygotowanie mieszaniny reakcyjnej nie obejmuje skomplikowanych etapów. Ta metoda jest idealna do stosowania w warunkach o ograniczonych zasobach, w których gorączka Q jest endemiczna.

Introduction

Mała bakteria Gram-ujemna Coxiella burnetii jest czynnikiem wywołującym gorączkę Q, która jest ogólnoświatową chorobą odzwierzęcą. Ze względu na ogólnoświatowe rozprzestrzenianie się gorączki Q i wysoką zakaźność C. burnetii, amerykański personel wojskowy i cywilny rozmieszczony za granicą jest narażony na ryzyko zakażenia na obszarach endemicznych.

Q gorączka objawia się w dwóch formach: ostrej i przewlekłej infekcji. Ostra gorączka Q objawia się objawami grypopodobnymi, zapaleniem wątroby lub zapaleniem płuc i jest zwykle chorobą samoograniczającą się o niskiej śmiertelności. Przewlekła gorączka Q, choć mniej powszechna, często prowadzi do zapalenia wsierdzia, które ma znacznie wyższą śmiertelność, jeśli nie jest leczone^1,2. Dlatego wczesna diagnoza w celu ukierunkowania odpowiedniego leczenia ma kluczowe znaczenie dla opieki nad pacjentem. Opracowano testy reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) do wykrywania DNA C. burnetii w hodowlach komórkowych i próbkach klinicznych^3-5. Zarówno PCR, jak i qPCR są kosztowne i często nie są łatwo dostępne w obszarach o ograniczonych zasobach do rutynowych prac.

Pierwotnie opisana przez Notomi⁶, amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli (LAMP) oferuje alternatywną metodę amplifikacji DNA. LAMP wykorzystuje polimerazę DNA Bst do syntezy DNA z przemieszczeniem nici wraz ze specjalnie zaprojektowanymi zestawami starterów, które rozpoznają co najmniej sześć niezależnych regionów docelowego genu. Najważniejszą zaletą LAMP jest to, że amplifikacja zachodzi w warunkach izotermicznych. Dlatego wymagana jest tylko łaźnia wodna, blok grzewczy lub inkubator. Metoda ta została wykorzystana do wykrycia kilku patogenów riketsjowych^7-9. Wizualizacja amplifikowanych produktów DNA za pomocą elektroforezy żelowej jest najdokładniejszą metodą, która pozwala odróżnić wyniki prawdziwie dodatnie od fałszywie dodatnich z powodu niespecyficznej amplifikacji. Jednak procedury związane z elektroforezą żelową nie są praktyczne w przypadku obszarów o ograniczonych zasobach. Opracowano kilka alternatywnych metod wykrywania produktów reakcji. Te alternatywy, takie jak zmętnienie wynikające z tworzenia pirofosforanu magnezu¹⁰ lub użycie fluorescencyjnego barwnika interkalacyjnego do wizualizacji w świetle UV^11,12 są korzystniejsze niż stosowanie żelu. Odczynniki LAMP były stabilne przez jeden miesiąc, gdy były przechowywane w temperaturze 25 °C i 37 °C, które są temperaturami otoczenia w krajach tropikalnych i subtropikalnych, w których gorączka Q jest endemiczna¹³.

Test LAMP został opracowany w naszym laboratorium do wykrywania obecności C. burnetii w próbkach osocza¹⁴. Tutaj opisujemy prosty protokół przygotowania mieszaniny reakcyjnej LAMP z liofilizowanych odczynników. Liofilizowane odczynniki są stabilne przez jeden miesiąc, gdy są przechowywane w temperaturze pokojowej. W połączeniu z łatwą metodą wizualizacji jest to idealna metoda do wykrywania C. burnetii w warunkach ograniczonych zasobów.

Protocol

1. Przygotuj rozcieńczenia plazmidowego DNA jako standard do reakcji LAMP

1. Za pomocą spektrofotometru zmierz gęstość optyczną (O.D.) przy 260 nm w celu określenia stężenia DNA plazmidu (zawierającego gen docelowy IS1111a C. burnetii RSA 493). Średnica zewnętrzna ₂₆₀ równa się 50 μg/μl DNA.
2. Przelicz ilość plazmidowego DNA na liczbę kopii. Ponieważ rozmiar plazmidu wynosi 6,330 pz, masa cząsteczkowa tego plazmidu wynosi 4,1 x 10⁶ g (6,330 pz x 649 g/bp). Stężenie DNA w plazmidzie wynosi 34,2 ng/μl (zgodnie z krokiem 1.1). 1 μl tej próbki DNA zawiera 34,2 ng plazmidowego DNA, co odpowiada 5 x 10⁹ kopii (34,2 x ^10-9 g / 4,1 x 10⁶ g x 6,02 x 10²³) DNA.
3. Dodać 10 μl plazmidowego DNA (5 x 10⁹ kopii/μl) do 90 μl wody w celu 10-krotnego rozcieńczenia, aby uzyskać próbkę DNA o wymiarach 5 x 10⁸ kopii/μl.
4. Powtórzyć krok 1.3 w celu przygotowania próbek DNA o wymiarach 5 x 10⁷, 5 x 10⁶, 5 x 10⁵, 5 x 10⁴, 5 x 10³, 5 x 10², 5 x 10¹ i 5 x 10⁰ kopii/μl.

2. Przygotuj matrycę DNA z próbek do reakcji LAMP

1. Wykonaj ekstrakcję DNA z próbek ludzkiego osocza za pomocą komercyjnego mini zestawu DNA zgodnie z protokołem producenta. Do ekstrakcji należy użyć łącznie 200 μl próbki i wymyć wyekstrahowane DNA w objętości 20 μl.

3. Przygotuj 2x Bufor Reakcyjny LAMP

1. Wymieszaj 200 μl 10x Pol Buffer, 320 μl 5 M trimetyloglicyny, 12 μl 1 M MgSO₄, 280 μl mieszaniny dNTP (po 10 mM) i 188 μl wody, aby uzyskać 1 ml buforu 2x LAMP. Mieszać przez wirowanie impulsowe przez 10 sekund.

4. Wykonaj standardową reakcję LAMP

1. Wymieszać 12,5 μl 2x buforu LAMP (przygotowanego w kroku 3; 40 mM Tris-HCl (pH 8,8), 20 mM KCl, 16 mM MgSO₄, 20 mM (NH₄)₂SO₄, 0,2% Triton X-100, 1,6 M trimetyloglicyny, 1,4 mM mieszaniny dNTP), 1,2 μl mieszaniny starterów, 1 μl polimerazy DNA Bst (8 U/μl), i 5,3 μl wody do przygotowania mieszaniny reakcyjnej (20 μl) w probówce PCR o pojemności 0,2 ml.
2. Dodać 5 μl DNA (z etapu 1 lub 2) do mieszaniny reakcyjnej o objętości 20 μl i dobrze wymieszać.
3. Zamknąć probówkę i inkubować w temperaturze 60 °C przez 60 minut w łaźni wodnej lub bloku grzewczym. Jest to optymalna temperatura reakcji określona wcześniej.
4. Dodać 5 μl 10x buforu ładującego żel, aby zakończyć reakcję.
5. Załadować 5 μl produktów reakcji do 2% żelu agarozowego wybarwionego interkalacyjnym barwnikiem kwasu nukleinowego.
6. Uruchom żel pod napięciem 100 V przez 35 minut w 1x buforze TBE.
7. Wizualizacja wyników za pomocą światła UV.

5. Wykonaj reakcję LAMP z odczynnikami odtworzonymi

1. Zmieszać 125 μl 10x Pol Buffer, 200 μl 5 M trimetyloglicyny, 7,5 μl 1 M_MgSO4, 667,5 μl wody, aby uzyskać 1 ml buforu do rozpuszczenia. Mieszać przez wirowanie impulsowe przez 10 sekund.
2. Wyjmij probówki zawierające liofilizowane odczynniki z zamkniętej torebki z folii aluminiowej. Nie używaj tubek, jeśli torba z folii aluminiowej nie jest szczelnie zamknięta lub jest uszkodzona.
3. Dodać 20 μl buforu do rozpuszczenia do każdej probówki, aby ponownie zawiesić liofilizowane odczynniki.
4. Wymieszać pipetując bufor w górę i w dół 5 razy. Przyjrzyj się, aby upewnić się, że liofilizowane odczynniki są całkowicie ponownie zawieszone. Biały proszek powinien zniknąć w tubce.
5. Dodać 5 μl matrycy DNA (z kroku 1 lub 2) do odtworzonych odczynników i dobrze wymieszać.
6. Zamknąć probówkę i inkubować w temperaturze 60 °C przez 60 minut w łaźni wodnej lub bloku grzewczym.
7. Dodać 5 μl 10x buforu ładującego żel, aby zakończyć reakcję.
8. Załadować 5 μl produktów reakcji do 2% żelu agarozowego wybarwionego interkalacyjnym barwnikiem kwasu nukleinowego.
9. Uruchom żel pod napięciem 100 V przez 35 minut w 1x buforze TBE.
10. Wizualizacja wyników za pomocą światła UV.

6. Przeprowadź reakcję LAMP z buforem do rekonstytucji zawierającym HNB lub fluorescencyjny barwnik interkalacyjny

1. Zmieszać 125 μl 10x Pol Buffer, 200 μl 5 M trimetyloglicyny, 7,5 μl 1 M MgSO₄, 7,5 μl 20 mM HNB (lub 12,5 μl 100x fluorescencyjnego barwnika interkalacyjnego) i 660 μl (lub 655 μl) wody, aby uzyskać 1 ml buforu do rozpuszczenia. Mieszać przez wirowanie impulsowe przez 10 sekund.
2. Użyć przygotowanego buforu przygotowanego w sekcji 6, aby powtórzyć kroki opisane w punktach 5.2 - 5.6.
3. Wizualizacja wyników gołym okiem (reakcja zawierająca HNB) lub światłem UV (reakcja zawierająca fluorescencyjny barwnik interkalacyjny).

7. Przeprowadzanie reakcji LAMP w czasie rzeczywistym za pomocą skanera probówkowego

1. Dodać 5 μl DNA do odtworzonych odczynników zawierających fluorescencyjny barwnik interkalacyjny, zamknąć probówkę i włożyć ją do skanera probówkowego.
2. Ustawić temperaturę inkubacji na 60 °C. Mierzyć fluorescencję przy 520 nm przez 60 minut.

Results

Liofilizowane odczynniki LAMP wewnątrz probówki 0,2 ml zawierają polimerazę DNA Bst, startery i dNTP. 20 μl buforu do rekonstytucji służy do ponownego zawieszenia liofilizowanych odczynników. Rysunek 1 przedstawia wyniki reakcji LAMP na żelach agarozowych ze świeżo przygotowanymi odczynnikami i odczynnikami liofilizowanymi. Liofilizowany odczynnik nie zmniejsza jego aktywności. Reakcje LAMP przygotowane przez oba odczynniki mogą wykryć 25 kopii matrycy DNA.

Discussion

Wcześniej opracowaliśmy czuły i specyficzny test LAMP ukierunkowany na element insercyjny IS1111a¹⁴. Pierwiastek IS1111 został wybrany, ponieważ jest wysoce konserwatywny wśród różnych szczepów C. burnetii i ma dużą liczbę kopii (od 7 do 110) w bakteriach (Klee 2006). Nasze wyniki wykazały, że LAMP może wykryć około 25 kopii elementu IS1111, który może korelować z zaledwie jedną chromosomalną kopią DNA Coxiella . W tym badaniu polimeraza DNA Bst , startery ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Podkłady LAMP	Eurofins MWG operon	10 nmol, bez soli	Sekwencja zaprojektowana przez klienta
Polimeraza DNA	Bst New England Biolabs	M0275L	8 jednostek/ml
10x Bufor Thermo pol	New England Biolabs	B9004S
mieszanina dNTP	New England Biolabs	N0447L	10 mM każdy
Betaina	Sigma-Aldrich	B0300	5 M, trimetyloglicyna
Siarczan magnezu	Sigma-Aldrich	M3409-1ML	1 M
10x Bluejuice	Invitrogen	10816-015	żel bufor ładujący
SYBR zielony	Invitrogen	S7585	10 000x, wizualizacja produktów w tubkach
GelRed	Phenix Research Products	RGB-4103	10 000x, wizualizacja produktów w żelach
Odczynniki liofilizowane	Zasięg
Hydrooxynaphthol blue	Fluka	33936-10G
ESEQuant skaner probówek	Qiagen		wykrywanie w czasie rzeczywistym