Method Article

Opracowanie liofilizowanych odczynników do amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli do wykrywania Coxiella burnetii

DOI:

10.3791/53839

⸱

April 18th, 2016

 , 
1Viral and Rickettsial Diseases Department, Naval Medical Research Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisaliśmy tutaj prostą metodę amplifikacji izotermicznej (LAMP) za pośrednictwem pętli, wykorzystującą liofilizowane odczynniki do wykrywania C. burnetii w próbkach pobranych od pacjentów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Coxiella burnetii, czynnik wywołujący gorączkę Q, jest obligatoryjną bakterią wewnątrzkomórkową. Testy diagnostyczne oparte na PCR zostały opracowane do wykrywania DNA C. burnetii w kulturach komórkowych i próbkach klinicznych. PCR wymaga specjalistycznego sprzętu i intensywnego szkolenia użytkowników końcowych, dlatego nie nadaje się do rutynowych prac, zwłaszcza w obszarze o ograniczonych zasobach. Opracowaliśmy test amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP) w celu wykrycia obecności C. burnetii w próbkach pobranych od pacjentów. Metodę tę wykonuje się w pojedynczej temperaturze około 60 °C w łaźni wodnej lub bloku grzewczym. Czułość tego testu LAMP jest bardzo podobna do PCR z granicą wykrywalności około 25 kopii na reakcję. W niniejszym raporcie opisano przygotowanie reakcji przy użyciu liofilizowanych odczynników oraz wizualizację wyników przy użyciu błękitu hydroksynaftolowego (HNB) lub lampy UV z fluorescencyjnym barwnikiem interkalacyjnym w reakcji. Odczynniki LAMP poddano liofilizacji i przechowywano w temperaturze pokojowej (RT) przez jeden miesiąc bez utraty czułości wykrywania. Ten test LAMP jest szczególnie skuteczny, ponieważ przygotowanie mieszaniny reakcyjnej nie obejmuje skomplikowanych etapów. Ta metoda jest idealna do stosowania w warunkach o ograniczonych zasobach, w których gorączka Q jest endemiczna.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mała bakteria Gram-ujemna Coxiella burnetii jest czynnikiem wywołującym gorączkę Q, która jest ogólnoświatową chorobą odzwierzęcą. Ze względu na ogólnoświatowe rozprzestrzenianie się gorączki Q i wysoką zakaźność C. burnetii, amerykański personel wojskowy i cywilny rozmieszczony za granicą jest narażony na ryzyko zakażenia na obszarach endemicznych.

Q gorączka objawia się w dwóch formach: ostrej i przewlekłej infekcji. Ostra gorączka Q objawia się objawami grypopodobnymi, zapaleniem wątroby lub zapaleniem płuc i jest zwykle chorobą samoograniczającą się o niskiej śmiertelności. Przewlekła gorączka Q, choć mniej powszechna,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotuj rozcieńczenia plazmidowego DNA jako standard do reakcji LAMP

  1. Za pomocą spektrofotometru zmierz gęstość optyczną (O.D.) przy 260 nm w celu określenia stężenia DNA plazmidu (zawierającego gen docelowy IS1111a C. burnetii RSA 493). Średnica zewnętrzna 260 równa się 50 μg/μl DNA.
  2. Przelicz ilość plazmidowego DNA na liczbę kopii. Ponieważ rozmiar plazmidu wynosi 6,330 pz, masa cząsteczkowa tego plazmidu wynosi 4,1 x 106 g (6,330 pz x 649 g/bp). Stężenie DNA w plazmidzie wynosi 34,2 ng/μl (zgodnie z krokiem 1.1). 1 μl tej próbki DNA zawiera 34,2 ng plazmidowego DNA, co odpowiada 5 x 109 kop....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Liofilizowane odczynniki LAMP wewnątrz probówki 0,2 ml zawierają polimerazę DNA Bst, startery i dNTP. 20 μl buforu do rekonstytucji służy do ponownego zawieszenia liofilizowanych odczynników. Rysunek 1 przedstawia wyniki reakcji LAMP na żelach agarozowych ze świeżo przygotowanymi odczynnikami i odczynnikami liofilizowanymi. Liofilizowany odczynnik nie zmniejsza jego aktywności. Reakcje LAMP przygotowane przez oba odczynniki mogą wykryć 25 kopii matrycy DNA.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wcześniej opracowaliśmy czuły i specyficzny test LAMP ukierunkowany na element insercyjny IS1111a14. Pierwiastek IS1111 został wybrany, ponieważ jest wysoce konserwatywny wśród różnych szczepów C. burnetii i ma dużą liczbę kopii (od 7 do 110) w bakteriach (Klee 2006). Nasze wyniki wykazały, że LAMP może wykryć około 25 kopii elementu IS1111, który może korelować z zaledwie jedną chromosomalną kopią DNA Coxiella . W tym badaniu polimeraza DNA Bst , startery .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Centrum Badań Medycznych Marynarki Wojennej, jednostka badawcza 6000.RAD1. J.A0310. Poglądy wyrażone w tym artykule są poglądami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają oficjalną politykę lub stanowisko Departamentu Marynarki Wojennej, Departamentu Obrony lub rządu Stanów Zjednoczonych. Wei-Mei Ching jest pracownikiem rządu Stanów Zjednoczonych. Praca ta została przygotowana w ramach jej obowiązków służbowych. Tytuł 17 § 105 U.S.C. stanowi, że "Ochrona praw autorskich na mocy niniejszego tytułu nie jest dostępna dla żadnego dzieła rządu Stanów Zjednoczonych". Tytuł 17 § 101 U.S.C. definiuje pracę rządu Stanów Zjednoczonych jako pracę pr....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Podkłady LAMPEurofins MWG operon10 nmol, bez soliSekwencja zaprojektowana przez klienta
Polimeraza DNABst New England BiolabsM0275L8 jednostek/ml
10x Bufor Thermo polNew England BiolabsB9004S
mieszanina dNTPNew England BiolabsN0447L10 mM każdy
BetainaSigma-AldrichB03005 M, trimetyloglicyna
Siarczan magnezuSigma-AldrichM3409-1ML1 M
10x BluejuiceInvitrogen10816-015żel bufor ładujący
SYBR zielonyInvitrogenS758510 000x, wizualizacja produktów w tubkach
GelRedPhenix Research ProductsRGB-410310 000x, wizualizacja produktów w żelach
Odczynniki liofilizowaneZasięg
Hydrooxynaphthol blueFluka33936-10G
ESEQuant skaner probówekQiagenwykrywanie w czasie rzeczywistym
genu

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Anderson, A., et al. Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group. MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).
  2. Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

LAMP AssayLyophilized ReagentsCoxiella BurnetiiQ Fever DetectionIsothermal AmplificationHydroxynaphthol BlueFluorescent Intercalating DyeTube ScannerResource Limited SettingsDNA Template

Related Articles