Amplifikacja, sekwencjonowanie nowej generacji i mapowanie genomowego DNA miejsc integracji retrowirusowej

Podsumowanie

Opisujemy protokół amplifikacji miejsc integracji retrowirusowej z genomowego DNA zakażonych komórek, sekwencjonowania amplifikowanych połączeń wirus-gospodarz, a następnie mapowania tych sekwencji do genomu referencyjnego. Opisujemy również techniki ilościowego określania rozmieszczenia miejsc integracji w odniesieniu do różnych adnotacji genomowych za pomocą BEDTools.

Streszczenie

Retrowirusy wykazują preferencje integracji sygnatur zarówno w skali lokalnej, jak i globalnej. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół (1) generowania różnorodnych bibliotek miejsc integracji retrowirusowej przy użyciu amplifikacji PCR (LM-PCR) za pośrednictwem ligacji i sekwencjonowania nowej generacji (NGS), (2) mapowania lokalizacji genomowej każdego połączenia wirus-gospodarz za pomocą BEDTools oraz (3) analizy danych pod kątem istotności statystycznej. Genomowe DNA wyekstrahowane z zakażonych komórek jest fragmentowane przez trawienie enzymami restrykcyjnymi lub przez sonikację. Po odpowiedniej naprawie końca DNA, dwuniciowe łączniki są ligowane na końcach DNA, a częściowo zagnieżdżony PCR jest przeprowadzany przy użyciu starterów komplementarnych zarówno do końca długiego końcowego powtórzenia (LTR) wirusa, jak i ligowanego DNA łącznikowego. Startery PCR przenoszą sekwencje wymagane do grupowania DNA podczas NGS, negując wymóg oddzielnej ligacji adaptera. Kontrola jakości (QC) jest przeprowadzana w celu oceny rozkładu wielkości fragmentów DNA i włączenia adaptera DNA przed NGS. Pliki wyjściowe sekwencji są filtrowane pod kątem odczytów zawierających LTR, a sekwencje definiujące LTR i konsolidator są przycinane. Przycięte sekwencje komórek gospodarza są mapowane do genomu referencyjnego za pomocą BLAT i są filtrowane pod kątem minimalnej 97% tożsamości do unikalnego punktu w genomie referencyjnym. Unikalne miejsca integracji są badane pod kątem sekwencji i rozmieszczenia sąsiednich nukleotydów (nt) w odniesieniu do różnych cech genomu. Korzystając z tego protokołu, biblioteki ośrodków integracji o wysokiej złożoności mogą zostać zbudowane z genomowego DNA w ciągu trzech dni. Cały protokół, który obejmuje egzogenne zakażenie wirusowe podatnych komórek hodowli tkankowej do analizy miejsca integracji, można zatem przeprowadzić w ciągu około jednego do dwóch tygodni. Najnowsze zastosowania tej technologii dotyczą podłużnej analizy miejsc integracji pacjentów zakażonych wirusem HIV.

Wprowadzenie

Integracja wirusowego DNA (vDNA) z genomem komórki gospodarza jest niezbędnym krokiem w cyklu życia retrowirusa. Integracja odbywa się za pomocą enzymu wirusowego integrazy (IN), który przeprowadza dwa odrębne procesy katalityczne, które prowadzą do powstania stabilnie wprowadzonego prowirusa ¹. Podjednostki IN angażują się w końce liniowego vDNA, który jest generowany przez odwrotną transkrypcję, tworząc intasomy wyższego rzędu z końcami vDNA utrzymywanymi razem przez multimer IN ^2-4. IN rozszczepia końce 3' vDNA za niezmiennymi sekwencjami 5'-CA-3' w procesie znanym jako przetwarzanie 3', pozostawiając zagłębione końce 3' z reaktywnymi grupami hydroksylowymi na każdym końcu ^{vDNA 5-8}. Intasom jest następnie importowany do jądra jako część dużego zestawu białek gospodarza i wirusa, znanego jako kompleks preintegracji () ^9-11. Po napotkaniu docelowego komórkowego DNA (tDNA), IN wykorzystuje grupy 3'-hydroksylowe vDNA do rozszczepienia górnych i dolnych nici tDNA w sposób rozłożony w czasie i jednocześnie łączy vDNA z grupami fosforanowymi tDNA 5' w procesie przenoszenia nici ^12,13.

Retrowirusy wykazują preferencje dotyczące integracji stron w skali lokalnej i globalnej. Lokalnie, miejsca integracji konsensusu składają się ze słabo konserwatywnych sekwencji tDNA palindromicznych, które rozciągają się od około pięciu do dziesięciu pz w górę i w dół od miejsc insercji vDNA ^14,15. Na całym świecie retrowirusy celują w określone adnotacje chromatyny ¹⁶. Istnieje siedem różnych rodzajów retrowirusowych - alfa przez epsilon, lenti i spuma. Lentiwirusy, do których zalicza się HIV-1, sprzyjają integracji w organizmach aktywnie transkrybowanych genów ¹⁷, podczas gdy gammaretrowirusy preferencyjnie integrują się z miejscami startowymi transkrypcji (TSS) i aktywnymi regionami wzmacniającymi ^18-20. W ostrym kontraście, spumawirus jest silnie ukierunkowany na regiony heterochromatyczne, takie jak ubogie w geny domeny związane z blaszkami ²¹. Lokalne preferencje zasad tDNA są w dużej mierze podyktowane specyficznymi sieciami kontaktów nukleoprotein między IN a tDNA ^13,22,23. W przypadku lentiwirusów i gammaretrowirusów integracja względem adnotacji genomowych jest w dużej mierze regulowana przez interakcje między IN a pokrewnymi czynnikami komórkowymi ^24-27. Zmiana specyfiki sieci interakcji IN-tDNA ^13,22,23,28 oraz zakłócenie lub przeprojektowanie interakcji czynnika IN-gospodarz ^25-27,29-32 są sprawdzonymi strategiami retargetowania integracji odpowiednio na poziomie lokalnym i globalnym.

Moc procedur sekwencjonowania DNA używanych do katalogowania miejsc integracji retrowirusowej ogromnie wzrosła w ciągu ostatnich dziesięcioleci. Miejsca integracji zostały odzyskane w pionierskich pracach przy użyciu pracochłonnych technik oczyszczania i ręcznego klonowania, aby uzyskać zaledwie kilka unikalnych miejsc na badanie ^33,34. Połączenie amplifikacji LM-PCR połączeń DNA LTR-gospodarza z możliwością mapowania poszczególnych miejsc integracji do genomów ludzkich i mysich przekształciło pole, a liczba miejsc odzyskanych z egzogennych zakażeń komórkami hodowli tkankowej wzrosła do kilkuset do ^{tysięcy17,18}. Nowsze połączenie LM-PCR z metodologią NGS spowodowało gwałtowny wzrost głębokości bibliotek. W szczególności pirosekwencjonowanie dało rzędu dziesiątek tysięcy unikalnych miejsc integracji ^30,35-38, podczas gdy biblioteki zsekwencjonowane za pomocą grupowania DNA mogą dać miliony unikalnych sekwencji ^19-21,39. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół LM-PCR do amplifikacji i sekwencjonowania miejsc integracji retrowirusowej przy użyciu grupowania DNA NGS. Metoda ta włącza wymagane sekwencje adapterowe do starterów PCR, a tym samym bezpośrednio do amplifikowanych cząsteczek DNA, wykluczając w ten sposób wymóg dodatkowego etapu ligacji adaptera przed sekwencjonowaniem ⁴⁰. Ogólny opis obejmuje również proces analizy bioinformatycznej, począwszy od analizowania surowych danych sekwencjonowania połączeń DNA między LTR-gospodarzem a połączeniami DNA gospodarza LTR, a skończywszy na mapowaniu unikalnych miejsc integracji i odpowiednich cech genomu. Zgodnie z precedensem ustanowionym na podstawie wcześniejszych protokołów metodologicznych w tej dziedzinie ^36,38,41-43, można opracować niestandardowe skrypty, aby pomóc w ukończeniu określonych etapów w procesie bioinformatycznym. Użyteczność i czułość protokołu zilustrowano reprezentatywnymi danymi poprzez amplifikację, sekwencjonowanie i mapowanie miejsc integracji HIV-1 z komórek hodowli tkankowej zakażonych przy przybliżonej wielokrotności infekcji (MOI) 1,0, a także serii miareczkowania tego DNA rozcieńczonego przez niezakażone DNA komórkowe w 5-krotnych krokach do maksymalnego rozcieńczenia 1:15,625, aby uzyskać przybliżony równoważny MOI 6,4 x ^10-5.

Protokół

1. Generuj zapasy wirusów

Uwaga: Schemat blokowy aspektu mokrego stanowiska w tym protokole jest pokazany na rysunku 1. Szczegóły dotyczące produkcji stada wirusowego i późniejszej infekcji komórek hodowli tkankowej będą na ogół miały zastosowanie do różnych typów retrowirusów. W przypadku niektórych eksperymentów komórka docelowa może nie wyrażać endogennego receptora (receptorów) wirusa, a w takich przypadkach do zakażenia wymagana będzie budowa pseudotypowanych cząstek retrowirusowych zawierających heterologiczną glikoproteinę otoczki wirusa, np. glikoproteinę G z wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV-G) ^44,45.

Uwaga: Należy zachować ostrożność podczas pracy z HIV-1. Chociaż szczegółowe wytyczne będą się różnić w zależności od instytucji, wszystkie prace związane z wirusami powinny być prowadzone w dedykowanej, ograniczonej dla operatora komorze bezpieczeństwa biologicznego (zwykle nazywanej kapturem do hodowli tkankowych). Przez cały czas należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, które obejmują ochronę twarzy, ochraniacze na buty, podwójną warstwę rękawic i kombinezon zakrywający całe ciało. Wszystkie odpady płynne powstałe w wyniku eksperymentów związanych z wirusami powinny być dezaktywowane wybielaczem (10% stężenie końcowe), a wszystkie odpady, w tym ciała stałe, powinny być autoklawowane przed usunięciem.

1. Na dzień przed transfekcją płytka 3,3 x 10⁶ HEK293T komórek w 10 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionego 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej i 1% (v/v) penicyliny/streptomycyny (10 000 U/ml zapasu) w każdej z pięciu szalek o średnicy 100 mm.
   Uwaga: Od tego momentu Supplemented-DMEM jest określany jako DMEM-FPS.
2. Następnego dnia należy przetoczyć transfekcję komórek 10 μg plazmidu przenoszącego pełnowymiarowe retrowirusowe klony molekularne lub 9 μg wektorów jednookrągłych z delecją otoczki za pomocą 1 μg konstruktu ekspresji VSV-G przy użyciu dostępnych w handlu odczynników do transfekcji lub fosforanu wapnia.
   1. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych z 5% stężeniem CO₂ (stan ten określany jest dalej jako "inkubator do hodowli tkankowych"). Po około 48 godzinach należy pobrać pożywkę komórkową zawierającą wirusa za pomocą pipety miarowej i przepuścić ją przez filtr 0,45 μm za pomocą przepływu grawitacyjnego.
   2. Zagęścić wirusa przez ultrawirowanie w temperaturze 200 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad wirusa w 500 μl DMEM-FPS zawierającym 20 U DNazy i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
      Uwaga: Etap DNazy pomaga zmniejszyć odzyskiwanie niepożądanych sekwencji plazmidowych poprzez wyeliminowanie ciężaru plazmidowego DNA, który utrzymuje się po procedurze transfekcji.
3. Oznacz stężenie p24 ⁴⁶ za pomocą zestawu do wychwytywania antygenu HIV-1 p24 zgodnie z instrukcjami producenta.
   Uwaga: Stężenie wirusa można również określić za pomocą testu aktywności odwrotnej transkryptazy ^47,48. Alternatywnie, poziom funkcjonalnego wirusa można określić, mierząc MOI. Najłatwiej jest to osiągnąć za pomocą aktywowanego fluorescencją sortowania komórek za pomocą wirusów, które wyrażają fluorescencyjne geny reporterowe, takie jak wzmocnione białko zielonej fluorescencji. Oznaczanie MOI może być szczególnie przydatne podczas pracy z komórkami pierwotnymi, które mogą nie obsługiwać tego samego poziomu infekcji, co zoptymalizowane linie komórkowe.

2. Zainfekuj komórki wirusem

1. Płytka 3,0 x 10⁵ HEK293T komórek na basenie na płytce 6-dołkowej w 2,5 ml DMEM-FPS i inkubować przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych.
   Uwaga: Liczba unikalnych miejsc integracji odzyskanych za pomocą tego protokołu jest wprost proporcjonalna do liczby komórek i ilości aktywnego wirusa użytego w infekcji.
2. Zakażone komórki końcowym stężeniem wirusa p24 wynoszącym 500 ng/ml w końcowej objętości 500 μl świeżego DMEM-FPS przez 2 godziny w inkubatorze do hodowli tkankowych, następnie dodać 2 ml DMEM-FPS podgrzanego do 37 °C na studzienkę i kontynuować inkubację.
3. Po 48 godzinach od zakażenia usuń pożywkę i przemyj komórki 2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Dodać 0,5 ml trypsyny-EDTA podgrzanej do temperatury 37 °C, a po kilku sekundach przeprowadzić wzrokową kontrolę studzienek pod kątem przemieszczenia komórek.
4. Dodać 2 ml wstępnie podgrzanego DMEM-FPS i ponownie zawiesić komórki poprzez delikatne pipetowanie w górę/w dół pipetą miarową ~10 razy. Przenieść roztwór do kolby do hodowli tkankowej o długości 75^cm2 zawierającej 18 ml wstępnie podgrzanego DMEM-FPS i inkubować komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych.
5. Po upływie co najmniej pięciu dni od początku infekcji należy zebrać komórki, usuwając pożywkę, przemyć 5 ml PBS, dodać 2 ml wstępnie podgrzanej trypsyny-EDTA i ponownie zamieszać z 5 ml wstępnie podgrzanego DMEM-FPS przez pipetowanie. Odwirować roztwór przez 5 minut w temperaturze pokojowej przy 2 500 x g i wyrzucić supernatant.
   Uwaga: Chociaż integracja w tych warunkach utrzymuje się na stałym poziomie około 48 godzin po zakażeniu ^49,50, dodatkowe 3 dni hodowli są wymagane, aby wystarczająco rozcieńczyć stężenie niezintegrowanych cząsteczek DNA, które wynikają z rekombinacji DNA opartej na komórkach lub autointegracji za pośrednictwem wirusa.
6. Ekstrahować genomowe DNA z osadu komórkowego za pomocą dostępnego w handlu zestawu (np. patrz ⁵¹). Eluować DNA z dostarczonej kolumny jonowymiennej za pomocą 200 μl 10 mM Tris-HCl, pH 8,5,
   Uwaga: Podwielokrotność komórek powinna zostać podzielona po 48 godzinach od zakażenia (krok 2.3) w celu przeprowadzenia testu zakaźności, aby zapewnić prawidłowe zakażenie wirusem przed NGS.

3. Fragmentacja genomowego DNA za pomocą sonikacji lub trawienia enzymów restrykcyjnych

Uwaga: Sonikacja fragmentuje genomowe DNA w sposób praktycznie niezależny od sekwencji, a zatem jest preferowanym sposobem fragmentacji podczas sekwencjonowania próbek o niskim oczekiwanym wskaźniku odzysku (np. zakażone komórki pacjenta lub infekcje zainicjowane przy stosunkowo niskim MOI). Co więcej, sonikacja pozwala na odróżnienie duplikatów PCR określonej sekwencji miejsca integracji od unikalnych integracji w tym samym miejscu, co ma kluczowe znaczenie dla rozróżnienia klonalnej ekspansji komórek zawierających prowirusa u zakażonych pacjentów (patrz krok 11 poniżej) ^39,52-54.
Uwaga: DNA należy rozszczepić bezpośrednio za LTR, aby zmniejszyć amplifikację wewnętrznych sekwencji wirusa podczas LM-PCR. Enzym restrykcyjny BglII, który leży 43 pz za sekwencją U5 i który jest niezgodny z późniejszą ligacją z końcami DNA generowanymi przez MseI, działa dobrze z wieloma szczepami HIV-1 (Figura 1B). Podczas przygotowywania DNA metodą sonikacji, enzym restrykcyjny rozszczepiający się wewnętrznie powinien być stosowany po podwiązaniu łącznika (patrz Rysunek 1C-E i Krok 4.3 poniżej).

1. W przypadku sonikacji należy zmieszać 10 μg genomowego DNA w wodzie wolnej od nukleaz do końcowej objętości 120 μl. Sonikować używając parametrów dla średniej wielkości przerwy 500 pz (dwie rundy następujących parametrów: cykl pracy: 5%; intensywność: 3; cykle na serię: 200; czas: 80 sekund).
2. Oczyść sonikowane DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR. Napraw końce DNA za pomocą zestawu do naprawy końcówek DNA i oczyść DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR. Ogon DNA za pomocą ^egzoenzymu Klenowa i oczyść DNA z ogonem A za pomocą zestawu do oczyszczania PCR. Patrz ^51,52, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat korzystania z zestawu.
3. W celu trawienia endonukleazy restrykcyjnej należy pociąć 10 μg genomowego DNA przez noc w temperaturze 37 °C w objętości 100 μl z buforem dostarczonym przez producenta i koktajlem enzymów (100 U każdy), które generują zwisy 5'-TA, a także niekompatybilnego enzymu, takiego jak BglII, który rozszczepia się za poprzedzającym wirusem LTR. Oczyść DNA następnego dnia za pomocą zestawu do oczyszczania PCR.
   Uwaga: Żaden z enzymów restrykcyjnych nie powinien przecinać się w obrębie końca ~30 pz wirusowego DNA, który jest amplifikowany przez protokół LM-PCR. Protokół ten specyficznie amplifikuje koniec U5 DNA HIV-1.

4. Oligonukleotydy łącznika wyżarzania i ligat do rozdrobnionego genomowego DNA

Uwaga: Przygotuj asymetryczny łącznik zawierający zwis, który jest kompatybilny z powyższymi fragmentami DNA (zobacz Tabela 1 dla sekwencji oligonukleotydów wykorzystanych w tym protokole). Łącznik, który ma być używany z sonikowanym DNA, musi zawierać zgodny zwis T-3', podczas gdy łącznik dla DNA trawionego przez MseI musi zawierać zgodny zwis 5'-TA (Figura 1). Krótka nić łącznikowa musi dodatkowo zawierać nierozciągliwą modyfikację chemiczną, taką jak 3'-amina, aby ograniczyć późniejsze reakcje amplifikacji w kierunku DNA będącego przedmiotem zainteresowania.
Uwaga: W przypadku przygotowywania wielu różnych bibliotek ośrodków integracji równolegle i/lub podczas multipleksowania unikalnych próbek w tym samym przebiegu sekwencjonowania, zaleca się stosowanie unikalnych łączników dla każdej próbki, aby ograniczyć możliwość zanieczyszczenia krzyżowego próbki podczas PCR. Oznacza to dodatkowo użycie unikalnych starterów łącznikowych dla każdej próbki podczas półzagnieżdżonego PCR (opisanego poniżej). Unikalne nici łącznikowe i startery łącznikowe mogą być zaprojektowane przez zaszyfrowanie sekwencji oligonukleotydów łącznikowych wymienionych w tabeli 1 przy zachowaniu podobnej ogólnej zawartości %GC i odpowiednich pozycji zwisu.

1. Wyżarzać krótkie i długie pasma łącznikowe w 35 μl 10 mM Tris-HCl, pH 8,0-0,1 mM EDTA (końcowe stężenie 10 μM każdego oligonukleotydu) przez podgrzanie do 90 °C i powolne schładzanie do temperatury pokojowej w krokach co 1 °C na minutę.
2. Przygotować co najmniej cztery równoległe reakcje ligacji na próbkę genomowego DNA, które zawierają 1,5 μM ligated linker, 1 μg fragmentaryzowanego DNA i 800 U T4 DNA ligazy w 50 μl. Ligować przez noc w temperaturze 12 °C. Oczyszczać następnego dnia za pomocą zestawu do oczyszczania PCR.
3. W przypadku próbek przygotowanych metodą sonikacji, oczyszczoną reakcję ligacji należy roztrawić za pomocą 100 M enzymu restrykcyjnego, który rozszczepia się za LTR (np. BglII dla HIV-1) w warunkach zalecanych przez producenta przez noc. Oczyść DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR.

5. Wzmacnianie wirusowych połączeń genomowego DNA LTR-gospodarz za pomocą półzagnieżdżonego PCR

Uwaga: Aby zapewnić optymalną różnorodność biblioteki, należy przygotować co najmniej 4-8 równoległych PCR, w zależności od stężenia DNA odzyskanej reakcji ligacji, dla każdej próbki dla obu rund PCR. Stężenie matrycy DNA należy określić ilościowo za pomocą spektrofotometrii. W tym protokole pierwsza i druga runda PCR wykorzystują zagnieżdżone startery specyficzne dla LTR, ale ten sam starter specyficzny dla łącznika jest używany w obu rundach (Tabela 1). Starter specyficzny dla LTR w drugiej rundzie i starter specyficzny dla łącznika kodują sekwencje adaptera do grupowania DNA, a także sekwencjonowania miejsc wiązania starterów. Zagnieżdżony starter specyficzny dla LTR koduje również sekwencję indeksu 6 nt, która może być zmieniana między różnymi starterami dla bibliotek multipleksowania w ramach tego samego przebiegu sekwencjonowania.

1. Przygotować pierwszą rundę PCR zawierającą składniki w probówce, jak podano w tabeli 2.
   Uwaga: Starter specyficzny dla łącznika zawiera 22 nt komplementarności z łącznikiem, temperaturę topnienia 53 °C, zawartość GC 45%, a jego koniec 3' znajduje się 15-16 pz przed końcami 3' różnych długich pasm łącznika (tabela 1). Pierwsza runda startera 27 nt LTR ma temperaturę topnienia 59 °C, zawartość GC 48%, a jego koniec 3' znajduje się 34 pz przed końcem HIV-1 U5. Region drugiego rundy startera 26 nt LTR, który jest komplementarny do HIV-1 LTR, ma temperaturę topnienia 60 °C, zawartość GC 50%, a jego koniec 3' znajduje się 18 pz przed końcem wirusa U5. Zaleca się, aby temperatura topnienia oligonukleotydów i zawartość GC naśladowały te parametry, jeśli użytkownicy projektują startery PCR ze zmienionymi sekwencjami (w tym do stosowania z innymi retrowirusami) ²¹.
2. Przeprowadzić pierwszą rundę PCR przy następujących parametrach termocyklera: Jeden cykl: 94 °C przez 2 min; 30 cykli: 94 °C przez 15 sekund, 55 °C przez 30 sekund, 68 °C przez 45 sekund; jeden cykl: 68 °C przez 10 minut.
3. Pula reakcji i oczyszczanie za pomocą zestawu do oczyszczania PCR. Przygotować drugą rundę PCR zawierającą składniki w probówce zgodnie z tabelą 3. Uruchom drugą rundę PCR, używając parametrów termocyklera opisanych w kroku 5.2. Połącz reakcje i oczyść DNA za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta.
   Uwaga: Dostępnych jest wiele zalecanych sekwencji indeksowych kompatybilnych z grupowaniem DNA NGS ⁷¹.

6. Wykonaj kontrolę jakości i NGS (zazwyczaj wykonywane przez urządzenie do sekwencjonowania)

1. (Test QC #1) Potwierdź stężenie DNA w bibliotece Krok 5.3 za pomocą fluorometru ⁵⁵. Krótko mówiąc, przygotuj wzorce i próbki doświadczalne w końcowej objętości 200 μl wody wolnej od nukleaz. Wirować probówki przez 2-3 sekundy, inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty, a następnie odczytać próbki we fluorometrze.
   Uwaga: Próbki powinny zawierać minimalne stężenie 2 nM DNA z biblioteki w minimalnej objętości 15 μl.
2. (Test QC #2) Potwierdź rozkład wielkości fragmentu DNA za pomocą testu opartego na taśmie ⁵⁶.
   Uwaga: Idealny rozkład to stosunkowo szeroki pik DNA o długości około 500 pz. Jeśli znaczna ilość materiału jest większa niż 1 kb, zaleca się włączenie procedury selekcji wielkości w celu wyeliminowania dłuższych gatunków DNA, które utrudnią amplifikację mostka podczas grupowania. W przeciwieństwie do tego, jeśli znaczny pik jest widoczny około 100 do 200 pz, podczas PCR mógł powstać dimer startera. W takim przypadku procedura powinna być zoptymalizowana, aby zminimalizować tworzenie się dimerów starterowych.
3. (Test QC #3) Potwierdź prawidłowe włączenie adapterów do biblioteki DNA za pomocą ilościowego PCR ⁵⁷.
4. Wykonaj NGS zgodnie z literaturą aplikacyjną producenta. Wykorzystaj skok 10% (w/w) DNA ΦX174, który zoptymalizuje wskaźniki jakości w czasie rzeczywistym, zapewniając zrównoważony skład zasady w przebiegu sekwencjonowania.
   Uwaga: Eksperymenty sekwencjonowania w miejscu integracji są zwykle poddawane sekwencjonowaniu pojedynczemu końcowi 150 pz (SE150) lub sparowanemu końcowi 150 pz (PE150). PE150 jest szczególnie przydatny do wychwytywania punktu przyłączenia łącznika na każdej cząsteczce DNA (np. podczas badania miejsc integracji w poszukiwaniu dowodów na ekspansję klonalną komórki gospodarza).

7. Użyj niestandardowego skryptu Pythona lub PERL do analizowania danych sekwencjonowania dla sekwencji zawierających LTR, przycinania sekwencji LTR i linkera oraz mapowania do genomu referencyjnego za pomocą BLAT

1. Skanuj pliki FASTA w poszukiwaniu odczytów sekwencji zawierających LTR, przycinaj sekwencje LTR i linkera z dala od sekwencji genomowego DNA gospodarza i eksportuj te sekwencje do nowego pliku FASTA. Mapuj przycięte odczyty zarówno do genomu referencyjnego (np. wersji genomu ludzkiego hg19 lub GRCh38), jak i genomu wirusa przy użyciu BLAT ⁵⁸, ze współrzędnymi wyjściowego miejsca integracji wyeksportowanymi do oddzielnego pliku .txt, przy użyciu następujących ustawień:
   stepSize = 6, minIdentity = 97 i maxIntron = 0
2. Przeanalizuj plik .txt wyjściowej BLAT, usuń autointegracje (tj. dowody na to, że koniec LTR zintegrował się z wewnętrznym regionem genomu wirusa DNA) i inne sekwencje mapujące do genomu HIV-1, a następnie utwórz oddzielny plik .txt wyjściowej, w którym wszystkie zduplikowane miejsca integracji zostały skondensowane w pojedyncze, unikalne trafienia współrzędnych.

8. Utwórz pliki .bed zawierające 15-nitowe interwały otaczające integracje, przekonwertuj je na pliki FASTA i skonstruuj logo sekwencji, aby wyświetlić podstawowe preferencje dotyczące stron integracji

1. Utwórz pliki .bed, które zawierają listę interwałów baz dla każdej lokacji integracji. Do generowania logo sekwencji sugerowanych jest co najmniej 15 zasad (5 w górę i 10 w dół). Wygeneruj plik FASTA z tych plików .bed za pomocą funkcji fastaFromBed z BEDTools ⁵⁹ i tego polecenia:
   fastaFromBed -fi /katalog/do/odniesienia/genomu/ -name -s -bed 15_base_pair_file.bed -fo output_file.fasta
   Uwaga: Niezmienny wirusowy dinukleotyd 5'-CA-3' jest łączony z DNA gospodarza podczas integracji, a weryfikacja połączenia końca LTR z DNA komórkowym jest ważnym filtrem początkowym do identyfikacji miejsc integracji w dobrej wierze. Dodatkowo kompilujemy logo sekwencji z tej populacji sekwencji DNA gospodarza, aby zweryfikować wyniki eksperymentalne. Ponieważ retrowirusy wykazują preferencje dotyczące podstaw sygnatur otaczających ich miejsca integracji ^14,15, logo sekwencji służy do potwierdzenia, że zmapowane miejsca genomowe powstały w wyniku integracji za pośrednictwem IN, w porównaniu z innymi mechanizmami rekombinacji, takimi jak niehomologiczne łączenie końców DNA ^60,61.
2. Użyj WebLogo 3 (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi), aby utworzyć logo sekwencji z plików FASTA. Kliknij "Wybierz plik", aby przesłać plik FASTA i użyj następujących ustawień: Format wyjściowy, PDF (wektorowy); Rozmiar logo, duży; Numer pierwszej pozycji, -5; Zakres logo, od -5 do 5; Skala osi Y, 0,1, odstępy tyczne w osi Y, 0,5, Schemat kolorów, klasyczny (NA).

9. Utwórz centralną parę bazową .bed plików, sprawdź, czy próbka nie została zanieczyszczona krzyżowo, i zmapuj rozkład unikalnych miejsc integracji w odniesieniu do odpowiednich cech genomu

1. Ponieważ integracja retrowirusowa zachodzi w sposób rozłożony w czasie w obrębie nici tDNA, należy dostosować dokładne współrzędne miejsc integracji, aby odzwierciedlić centralne ciśnienie duplikacji miejsca docelowego w celu prawidłowego mapowania dystrybucji genomowej w stosunku do cech genomu.
   1. W związku z tym w przypadku wirusów duplikujących 5 pz, takich jak HIV-1, utwórz plik .bed z centralnym przesunięciem bp od witryny integracji o dwie bazy w dół dla mapowania integracji na nić dodatnią i dwie zasady nadrzędne dla mapowania integracji na nić ujemną.
2. Aby sprawdzić, czy próbka nie jest zanieczyszczona krzyżowo, należy obliczyć liczbę miejsc integracji wspólnych dla różnych bibliotek, korzystając z funkcji BEDTools intersect w celu przecięcia centralnych plików bp .bed dla dwóch różnych próbek i wykonując następujące polecenie:
   Bedtools intersect -a central_basepair_1.bed -b central_basepair_2.bed -f 1.00 -r -s > overlap1v2.txt
3. Policz liczbę wierszy w pliku wyjściowej overlap1v2.txt, aby określić ilościowo dokładną liczbę witryn wspólnych dla dwóch bibliotek za pomocą następującego polecenia:
   wc -l overlap1v2.txt
4. Pobierz plik adnotacji RefSeq .bed dla wersji genomu referencyjnego, która została użyta do mapowania miejsca integracji, z bazy danych adnotacji genomu UCSC (np. http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg38/database) ⁶².
   1. Oblicz liczbę miejsc integracji przypadających na geny RefSeq, używając funkcji przecięcia BEDTools, aby przeciąć plik .bed centralnej pary zasad, który został wygenerowany dla próbki, z plikiem RefSeq .bed zgodnie z tym poleceniem:
      Bedtools Intersect -a central_basepair_1.łóżko -b RefSeq_hg38.łóżko -u > RefSeq_sample1.łóżko
5. Policz liczbę wierszy w wyjściowym pliku RefSeq_sample1.bed, aby określić ilościowo dokładną liczbę miejsc przypadających na geny RefSeq za pomocą następującego polecenia:
   WC -l RefSeq_sample1.łóżko
6. Powtórz kroki 9.3 i 9.4 dla mapowania witryn integracji na dowolną inną interesującą adnotację, dla której dostępny jest plik .bed interwału. Pobierz najbardziej aktualny plik .bed adnotacji wyspy CpG dla interesującego nas genomu referencyjnego z bazy danych UCSC Genome Annotation Database, zgodnie z zaleceniami w kroku 9.4.
   1. Oblicz liczbę miejsc integracji leżących w określonej odległości (zilustrowanej w tym przykładzie jest to okno 5 kb) wysp CpG za pomocą funkcji okna BEDTools i postępuj zgodnie z tym poleceniem:
      Okno Bedtools –W 2500 central_basepair_1.łóżko -b CpG_hg38.łóżko -u > CpG_sample1.łóżko
7. Policz liczbę wierszy w wyjściowym pliku CpG_sample1.bed, aby określić dokładną liczbę witryn mieszczących się w promieniu 2,5 kb w górę lub w dół rzeki od wysp CpG, używając następującego polecenia:
   WC -l CpG_sample1.łóżko
8. Powtórz kroki 9.6 i 9.7 dla mapowania miejsc integracji w pobliżu TSS. Wygeneruj alternatywną wersję pliku RefSeq.bed, w której współrzędne genomowe mapujące więcej niż jeden gen zostały dostosowane tak, aby odzwierciedlały tylko jeden gen obecny w tej pozycji. Zapobiega to przeszacowaniu gęstości genów otaczających miejsca integracji. Oblicz gęstość genów w regionie 1 Mb otaczającym każde miejsce integracji, używając funkcji okna BEDTools i wykonując następujące polecenie:
   Bedtools okno -w 500000 central_basepair_1.łóżko -b RefSeq_hg38_NonRedundant.łóżko -u > GeneDensity_sample1.łóżko
9. Oblicz średnią gęstość genów dla wszystkich integracji w zestawie danych, wykonując następujące polecenie:
   awk '(suma+=$7) END ( print "Średnia = ",suma/NR)" GeneDensity_sample1.bed

10. Statystycznie porównaj rozkłady miejsc integracji między próbkami za pomocą dwustronnego dokładnego testu Fishera i dwustronnego testu sumy rang Wilcoxona w R

Uwaga: Użyj dokładnego testu Fishera do porównania proporcji miejsc integracji w obrębie genów RefSeq lub w oknie wysp CpG lub TSS, ale użyj testu sumy rang Wilcoxona do porównania rozkładu gęstości genów otaczających miejsca integracji. Program R jest dostępny pod adresem http://www.r-project.org/.
Dokładny test Fishera dwustronnego:

1. Korzystając z liczb obliczonych zgodnie z instrukcjami w krokach 9.4 i 9.7, utwórz macierze dla każdego porównania w R obserwowanych wystąpień (integracji w adnotacji lub w oknie otaczającym adnotację) z pozostałymi witrynami, wykonując następujące polecenie:
   (annotation_of_interest <- macierz(c(PróbkaA#in, PróbkaA#pozostała, PróbkaB#in, PróbkaB#pozostała),nrow=2,dimnames=list(c('Centrum', 'Pozostałość'),c('PróbkaA', 'PróbkaB'))))
2. Oblicz wartość P dla porównania za pomocą dwustronnego dokładnego testu Fishera za pomocą następującego polecenia:
   fisher.test(annotation_of_interest, alternative = 'dwustronny')$p.wartość
   Dwustronny test sumy rang Wilcoxona:
3. Utwórz plik .txt rozdzielany tabulatorami, w którym każda kolumna zawiera nazwę próbki w górnej komórce, a poniżej wartości gęstości genów dla wszystkich miejsc integracji w tej bibliotece (uzyskane z pliku .bed wygenerowanego w kroku 9.9). Zaimportuj ten plik .txt rozdzielany tabulatorami do języka R za pomocą następującego polecenia i przechodząc do odpowiedniego katalogu plików:
   NAZWA PLIKU <- as.data.frame(read.delim(file.choose(), header=T,check.names=FALSE, fill=TRUE,sep='\t'))
4. Oblicz wartość P do porównania za pomocą dwustronnego testu sumy rang Wilcoxona za pomocą następującego polecenia:
   wilcox.test(NAZWA_PLIKU$PróbkaA,NAZWA_PLIKU$PróbkaB,alternatywa ='dwustronny', sparowany = F, dokładny = T)$p.wartość
   Uwaga: Wartości P można obliczyć tylko do pewnego (bardzo niskiego) limitu w R, po przekroczeniu którego program zwróci zero. W przypadku masowo różnych próbek, które dają P = 0 w R, oszacuj wartość P jako <2,2 x ^10-308.

11. Zbadaj surowe dane sekwencjonowania pod kątem dowodów na klonalną ekspansję komórek zawierających zintegrowane wirusowe DNA

Uwaga: Istnieje niewielki potencjał dla więcej niż jednej integracji w dokładnie tym samym nt w genomie referencyjnym. Alternatywnie, pojedyncze zdarzenie integracyjne może stać się nadmiarowo obecne w danych sekwencjonowania ze względu na użycie PCR podczas przygotowywania biblioteki i/lub duplikację komórek przed przygotowaniem DNA. Niedawne analizy genomowego DNA od pacjentów zakażonych wirusem HIV wyróżniły te możliwości, identyfikując unikalne punkty ścinania sonikacji/punkty przyłączenia łącznika (które mogą powstać tylko przed PCR) w sekwencjach DNA zawierających identyczne miejsca integracji ^52-54. Obecnie toczy się debata na temat tego, czy prowirusy ukryte w klonalnie rozszerzonych komórkach przyczyniają się do utajonego rezerwuaru wirusa, a zatem szczególnie interesujące jest scharakteryzowanie ich poziomu ekspansji podczas badania miejsc integracji u ludzi.

1. Podobnie jak w przypadku procedury opisanej w Kroku 8.1, wygeneruj pliki .bed z listą interwałów baz rozciągających, w tym przypadku, 25 nt downstream od każdej unikalnej lokacji integracji (bazy nadrzędne nie są tutaj potrzebne). Wygeneruj plik FASTA z tych plików .bed (zgodnie z instrukcjami w kroku 8.1), używając funkcji fastaFromBed z BEDTools i wykonując następujące polecenie:
   fastaFromBed -fi /katalog/do/odniesienia/genomu/ -name -s -bed 25_base_pair_file.bed -fo output_file.fasta
   Uwaga: Aby poprawić szczegółowość każdego wyszukiwania, zaleca się wyodrębnienie co najmniej 25 nt w dół z każdego miejsca integracji w celu przeprowadzenia analiz ekspansji klonalnej.
2. Najlepiej za pomocą dostosowanego skryptu, przeszukać plik FASTA z surowymi danymi sekwencji pod kątem wszystkich ciągów zawierających dokładne dopasowanie do 25 nt downstream z każdego unikalnego miejsca integracji i zdeponować te sekwencje w nowym pliku. Przytnij sekwencje LTR i konsolidatora z nieprzetworzonych ciągów. Scalanie odczytów sekwencji PE przez konwertowanie odczytów na odwrotne uzupełnienie, przycinanie sekwencji LTR i konsolidatora, a następnie przypisywanie ciągów read2 do ich pary read1, jeśli ciągi mają co najmniej 20 nakładających się nt.
3. Skanuj punkty dołączania konsolidatora każdego bloku lokacji integracji. Klasyfikuj każdą integrację jako "rozszerzoną klonalnie", jeśli punkty dołączenia konsolidatora są oddalone od siebie o ≥3 pz.
   Uwaga: Opisano protokół analizy ekspansji klonalnej bez łączenia odczytów sekwencji ⁵².
   Uwaga: Fragmentacja genomu w dokładnie tym samym miejscu przez sonikację prowadzi do niedoszacowania zakresu ekspansji klonalnej, a metody korygowania wynikającego z tego błędu eksperymentalnego zostały opisane ^63,64.

Wyniki

Tabela 4 zawiera wyniki reprezentatywnego eksperymentu ilustrującego czułość NGS w odzyskiwaniu miejsc integracji z hodowli zainfekowanych komórek. Niezakażone DNA komórkowe wykorzystano do seryjnego rozcieńczania genomowego DNA z infekcji, w której każda komórka zawierała średnio jedną integrację ⁴⁰. Rozcieńczenia przygotowywano w krokach od pięciu do maksymalnego rozcieńczenia 1:15,625. Genomowe DNA w serii miareczkowania zostało następnie rozdrobnione przez ...

Dyskusja

Opisano protokół analizy miejsc integracji retrowirusowej, począwszy od początkowego etapu infekcji wirusem, poprzez mapowanie wzorców dystrybucji genomu. Protokół ten ma zastosowanie do każdego retrowirusa i każdego typu komórek zakaźnych. Co więcej, proces testowy jest dość wrażliwy, z potencjałem do odzyskania zadowalającej liczby unikalnych miejsc integracji z seryjnych rozcieńczeń genomowego DNA równoważnego infekcji zainicjowanej MOI 6,4 x ^10-5. Ta czułość sprawia, że protokół jest szczególnie przydatny ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Gibco	11965-084	Standardowa pożywka do hodowli komórkowych, kompatybilna z komórkami HEK293T
Płodowa surowica bydlęca	Thermo Scientific	SH 30088.03	Różne partie surowicy mogą wymagać wstępnego badania przesiewowego w celu optymalnej produkcji wirusa
Penicylina/Streptomycyna	Corning	30-002-Cl	Antybiotyki, które należy dodać do
DMEM Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Mediatech	21-040-CV	Służy do mycia komórek
Trypsyna EDTA	Corning	25-053-CI	Służy do oddzielania przylegających komórek od płytek do hodowli tkankowych
PolyJet	SignaGen Laboratories	SL100688	Odczynnik do transfekcji DNA
0,45 i mikro; m Filtry	Thermo Scientific	09-740-35B	Służy do filtrowania pożywek do hodowli komórkowych zawierających cząstki wirusa
Turbo DNase	Ambion	AM2239	Służy do degradacji przeniesionego plazmidowego DNA z zapasów wirusów
HIV-1 p24 Test wychwytywania antygenu	ABL Inc.	5447	Służy do ilościowego określania wydajności produkcji wirusa
DNeasy Blood & Zestaw tkanek	Qiagen	69506	Służy do oczyszczania genomowego DNA z komórek
Sonicator	Covaris	S2	Dzięki temu modelowi sonikatora wykonaj dwie rundy cyklu pracy, 5%; intensywność, 3; cykle na serię, 200; czas, 80 sekund
Woda wolna od nukleaz	GeneMate	G-3250-125	Zaleca się dostępną na rynku wodę, aby zmniejszyć możliwość zanieczyszczenia krzyżowego próbki
QIAQuick PCR Purification Zestaw	Qiagen	28106	Służy do oczyszczania DNA podczas budowy biblioteki
End-It DNA End-Repair	Kit Epicentre	ER81050	Służy do naprawy końcówek DNA sonikowanych próbek DNA
Fragment Klenowa (3'-5' egzo–)	New England Biolabs (NEB)	M0212S	Używany z dATP do naprawionych fragmentów DNA z ogonem A
dATP	Thermo Scientific	R0141	Trifosforan deoksyadenozyny
MseI	NEB	R0525L	Endonukleaza restrykcyjna do rozszczepienia genomowego DNA
BglII	NEB	R0144L	Endonukleaza restrykcyjna w celu zahamowania amplifikacji sekwencji HIV-1 U5
T4 Ligaza DNA	NEB	M0202L/6218	Enzym do kowalencyjnego łączenia kompatybilnych końców DNA
Oligonukleotydy DNA	Zintegrowane technologie DNA	na zamówienie	Niech firma oczyści oligonukleotydy. Oczyszczanie metodą HPLC wystarcza dla DNA < 30 nukleotydów; STRONA oczyszcza dłuższe DNA
Advantage 2 Polymerase Mix	Clontech	639202	Komercyjna mieszanka zawierająca polimerazę DNA do PCR
dNTP (roztwory 100 mM)	Thermo Scientific	R0181	Rozcieńczyć cztery substancje chemiczne na lodzie sterylną wodą, aby osiągnąć pośrednie stężenia wzmacniające 2,5 mM każdy dNTP
NanoDrop	Thermo Scientific	NanoDrop 2000	Spektrofotometr do oznaczania stężenia DNA
Fluorymetr kubitowy	Life Technologies	Fluorometr Qubit® 3.0	używany do potwierdzania koncentracji DNA w bibliotece miejsca integracji
2200 System TapeStation	Agilent	G2964AA	Test oparty na taśmie w celu potwierdzenia rozkładu wielkości DNA biblioteki miejsca integracji
MiSeq	Illumina	SY-410-1003	Używany do NGS