Amplifikacja, sekwencjonowanie nowej generacji i mapowanie genomowego DNA miejsc integracji retrowirusowej

Summary

Opisujemy protokół amplifikacji miejsc integracji retrowirusowej z genomowego DNA zakażonych komórek, sekwencjonowania amplifikowanych połączeń wirus-gospodarz, a następnie mapowania tych sekwencji do genomu referencyjnego. Opisujemy również techniki ilościowego określania rozmieszczenia miejsc integracji w odniesieniu do różnych adnotacji genomowych za pomocą BEDTools.

Abstract

Retrowirusy wykazują preferencje integracji sygnatur zarówno w skali lokalnej, jak i globalnej. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół (1) generowania różnorodnych bibliotek miejsc integracji retrowirusowej przy użyciu amplifikacji PCR (LM-PCR) za pośrednictwem ligacji i sekwencjonowania nowej generacji (NGS), (2) mapowania lokalizacji genomowej każdego połączenia wirus-gospodarz za pomocą BEDTools oraz (3) analizy danych pod kątem istotności statystycznej. Genomowe DNA wyekstrahowane z zakażonych komórek jest fragmentowane przez trawienie enzymami restrykcyjnymi lub przez sonikację. Po odpowiedniej naprawie końca DNA, dwuniciowe łączniki są ligowane na końcach DNA, a częściowo zagnieżdżony PCR jest przeprowadzany przy użyciu starterów komplementarnych zarówno do końca długiego końcowego powtórzenia (LTR) wirusa, jak i ligowanego DNA łącznikowego. Startery PCR przenoszą sekwencje wymagane do grupowania DNA podczas NGS, negując wymóg oddzielnej ligacji adaptera. Kontrola jakości (QC) jest przeprowadzana w celu oceny rozkładu wielkości fragmentów DNA i włączenia adaptera DNA przed NGS. Pliki wyjściowe sekwencji są filtrowane pod kątem odczytów zawierających LTR, a sekwencje definiujące LTR i konsolidator są przycinane. Przycięte sekwencje komórek gospodarza są mapowane do genomu referencyjnego za pomocą BLAT i są filtrowane pod kątem minimalnej 97% tożsamości do unikalnego punktu w genomie referencyjnym. Unikalne miejsca integracji są badane pod kątem sekwencji i rozmieszczenia sąsiednich nukleotydów (nt) w odniesieniu do różnych cech genomu. Korzystając z tego protokołu, biblioteki ośrodków integracji o wysokiej złożoności mogą zostać zbudowane z genomowego DNA w ciągu trzech dni. Cały protokół, który obejmuje egzogenne zakażenie wirusowe podatnych komórek hodowli tkankowej do analizy miejsca integracji, można zatem przeprowadzić w ciągu około jednego do dwóch tygodni. Najnowsze zastosowania tej technologii dotyczą podłużnej analizy miejsc integracji pacjentów zakażonych wirusem HIV.

Introduction

Integracja wirusowego DNA (vDNA) z genomem komórki gospodarza jest niezbędnym krokiem w cyklu życia retrowirusa. Integracja odbywa się za pomocą enzymu wirusowego integrazy (IN), który przeprowadza dwa odrębne procesy katalityczne, które prowadzą do powstania stabilnie wprowadzonego prowirusa ¹. Podjednostki IN angażują się w końce liniowego vDNA, który jest generowany przez odwrotną transkrypcję, tworząc intasomy wyższego rzędu z końcami vDNA utrzymywanymi razem przez multimer IN ^2-4. IN rozszczepia końce 3' vDNA za niezmiennymi sekwencjami 5'-CA-3' w procesie znanym jako przetwarzanie 3', pozostawiając zagłębione końce 3' z reaktywnymi grupami ....

Protocol

1. Generuj zapasy wirusów

Uwaga: Schemat blokowy aspektu mokrego stanowiska w tym protokole jest pokazany na rysunku 1. Szczegóły dotyczące produkcji stada wirusowego i późniejszej infekcji komórek hodowli tkankowej będą na ogół miały zastosowanie do różnych typów retrowirusów. W przypadku niektórych eksperymentów komórka docelowa może nie wyrażać endogennego receptora (receptorów) wirusa, a w takich przypadkach do zakażenia wymagana będzie budowa pseudotypowanych cząstek retrowirusowych zawierających heterologiczną glikoproteinę otoczki wirusa, np. glikoproteinę G z wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV-G....

Results

Tabela 4 zawiera wyniki reprezentatywnego eksperymentu ilustrującego czułość NGS w odzyskiwaniu miejsc integracji z hodowli zainfekowanych komórek. Niezakażone DNA komórkowe wykorzystano do seryjnego rozcieńczania genomowego DNA z infekcji, w której każda komórka zawierała średnio jedną integrację ⁴⁰. Rozcieńczenia przygotowywano w krokach od pięciu do maksymalnego rozcieńczenia 1:15,625. Genomowe DNA w serii miareczkowania zostało następnie rozdrobnione przez .......

Discussion

Opisano protokół analizy miejsc integracji retrowirusowej, począwszy od początkowego etapu infekcji wirusem, poprzez mapowanie wzorców dystrybucji genomu. Protokół ten ma zastosowanie do każdego retrowirusa i każdego typu komórek zakaźnych. Co więcej, proces testowy jest dość wrażliwy, z potencjałem do odzyskania zadowalającej liczby unikalnych miejsc integracji z seryjnych rozcieńczeń genomowego DNA równoważnego infekcji zainicjowanej MOI 6,4 x ^10-5. Ta czułość sprawia, że protokół jest szczególnie przydatny .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	11965-084	Standardowa pożywka do hodowli komórkowych, kompatybilna z komórkami HEK293T
Płodowa surowica bydlęca	Thermo Scientific	SH 30088.03	Różne partie surowicy mogą wymagać wstępnego badania przesiewowego w celu optymalnej produkcji wirusa
Penicylina/Streptomycyna	Corning	30-002-Cl	Antybiotyki, które należy dodać do
DMEM Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Mediatech	21-040-CV	Służy do mycia komórek
Trypsyna EDTA	Corning	25-053-CI	Służy do oddzielania przylegających komórek od płytek do hodowli tkankowych
PolyJet	SignaGen Laboratories	SL100688	Odczynnik do transfekcji DNA
0,45 i mikro; m Filtry	Thermo Scientific	09-740-35B	Służy do filtrowania pożywek do hodowli komórkowych zawierających cząstki wirusa
Turbo DNase	Ambion	AM2239	Służy do degradacji przeniesionego plazmidowego DNA z zapasów wirusów
HIV-1 p24 Test wychwytywania antygenu	ABL Inc.	5447	Służy do ilościowego określania wydajności produkcji wirusa
DNeasy Blood & Zestaw tkanek	Qiagen	69506	Służy do oczyszczania genomowego DNA z komórek
Sonicator	Covaris	S2	Dzięki temu modelowi sonikatora wykonaj dwie rundy cyklu pracy, 5%; intensywność, 3; cykle na serię, 200; czas, 80 sekund
Woda wolna od nukleaz	GeneMate	G-3250-125	Zaleca się dostępną na rynku wodę, aby zmniejszyć możliwość zanieczyszczenia krzyżowego próbki
QIAQuick PCR Purification Zestaw	Qiagen	28106	Służy do oczyszczania DNA podczas budowy biblioteki
End-It DNA End-Repair	Kit Epicentre	ER81050	Służy do naprawy końcówek DNA sonikowanych próbek DNA
Fragment Klenowa (3'-5' egzo–)	New England Biolabs (NEB)	M0212S	Używany z dATP do naprawionych fragmentów DNA z ogonem A
dATP	Thermo Scientific	R0141	Trifosforan deoksyadenozyny
MseI	NEB	R0525L	Endonukleaza restrykcyjna do rozszczepienia genomowego DNA
BglII	NEB	R0144L	Endonukleaza restrykcyjna w celu zahamowania amplifikacji sekwencji HIV-1 U5
T4 Ligaza DNA	NEB	M0202L/6218	Enzym do kowalencyjnego łączenia kompatybilnych końców DNA
Oligonukleotydy DNA	Zintegrowane technologie DNA	na zamówienie	Niech firma oczyści oligonukleotydy. Oczyszczanie metodą HPLC wystarcza dla DNA < 30 nukleotydów; STRONA oczyszcza dłuższe DNA
Advantage 2 Polymerase Mix	Clontech	639202	Komercyjna mieszanka zawierająca polimerazę DNA do PCR
dNTP (roztwory 100 mM)	Thermo Scientific	R0181	Rozcieńczyć cztery substancje chemiczne na lodzie sterylną wodą, aby osiągnąć pośrednie stężenia wzmacniające 2,5 mM każdy dNTP
NanoDrop	Thermo Scientific	NanoDrop 2000	Spektrofotometr do oznaczania stężenia DNA
Fluorymetr kubitowy	Life Technologies	Fluorometr Qubit® 3.0	używany do potwierdzania koncentracji DNA w bibliotece miejsca integracji
2200 System TapeStation	Agilent	G2964AA	Test oparty na taśmie w celu potwierdzenia rozkładu wielkości DNA biblioteki miejsca integracji
MiSeq	Illumina	SY-410-1003	Używany do NGS