Method Article

Wysokoprzepustowa konstrukcja wektora CRISPR i charakterystyka modyfikacji DNA przez generowanie owłosionych korzeni pomidora

DOI:

10.3791/53843

⸱

April 30th, 2016

 , 
1Boyce Thompson Institute for Plant Research, 2Section of Plant Pathology & Plant-Microbe Biology, School of Integrative Plant Science, Cornell University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z montażu DNA, wiele wektorów CRISPR może być konstruowanych równolegle w jednej reakcji klonowania, co sprawia, że budowa dużej liczby wektorów CRISPR jest prostym zadaniem. Owłosione korzenie pomidora są doskonałym systemem modelowym do walidacji wektorów CRISPR i generowania zmutowanych materiałów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ukierunkowane mutacje DNA generowane przez wektory z technologią CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 okazały się przydatne w badaniach genomiki funkcjonalnej. Chociaż większość strategii klonowania jest prosta do wykonania, zazwyczaj wykorzystują one wiele kroków i mogą wymagać kilku dni, aby wygenerować ostateczne konstrukty. Przedstawiona tutaj metoda opiera się na składaniu DNA i może wytworzyć w pełni funkcjonalne wektory CRISPR w jednej reakcji klonowania. Konstrukcja wektorowa może być również łączona, co dodatkowo zwiększa wydajność i użyteczność procesu. Modyfikacja metody służy do tworzenia wektorów CRISPR z wieloma celami genowymi. Wektory CRISPR są następnie przekształcane w owłosione korzenie pomidorów w celu wygenerowania materiałów transgenicznych z ukierunkowanymi modyfikacjami DNA. Owłosione korzenie są użytecznym systemem do testowania funkcjonalności wektorów, ponieważ są technicznie proste do wygenerowania i nadają się do produkcji na dużą skalę. Przedstawione tutaj metody będą miały szerokie zastosowanie, ponieważ mogą być wykorzystywane do generowania różnorodnych wektorów CRISPR i mogą być stosowane w szerokim zakresie gatunków roślin.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Możliwość generowania ukierunkowanych modyfikacji DNA za pomocą CRISPR/Cas9 ma ogromny potencjał dla badań genomiki funkcjonalnej. System CRISPR/Cas9 składa się z dwóch elementów; nukleaza Cas9, pochodząca ze Staphylococcus pyogenes i cząsteczki przewodnika RNA (gRNA) o objętości około 100-nt, która kieruje Cas9 do docelowego miejsca (miejsc) DNA1. Rozpoznawanie celu jest zapewnione przez pierwsze ~20-nt gRNA, co pozwala na wysokoprzepustową produkcję wektorów docelowych2,3. Większość organizmów, które można zmodyfikować, została już wyposażona w technologię CRISPR/Cas94,5.

W roślinach, konstytutywn....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projektowanie RNA i konstruowanie wektorów

  1. Zidentyfikuj sekwencje docelowe dla genów będących przedmiotem zainteresowania. Istnieje wiele internetowych programów do wyszukiwania celów CRISPR odpowiednich do tego kroku13,14.
    UWAGA: Tutaj używamy motywu docelowego GN20GG, ale inne projekty mogą być odpowiednie w zależności od zastosowanej aplikacji lub systemu wektorowego.
  2. Zaprojektuj 60-merowe oligonukleotydy gRNA tak, aby zawierały część GN19 docelowych motywów otoczonych sekwencjami 5' i 3' 20-nt, które są wymagane do złożenia DNA. Końcowy motyw 60-merowy to: 5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN 19-GTTTTAGAGCTAGA....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konstrukcja wektora CRISPR z montażem DNA zazwyczaj generuje dziesiątki do setek niezależnych klonów. Badania przesiewowe kolonii metodą PCR z łatwością identyfikują prawidłowe klony i mogą rozróżniać plazmidy z wstawkami i bez nich (Figura 2A), co jest przydatne w rozwiązywaniu problemów. Zazwyczaj wszystkie klony zawierają wstawkę, a użytkownik może zdecydować się na całkowite pominięcie etapów badania kolonii. Do kontroli jakości stosuje się wyciągi diagnostyczne (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ składanie DNA służy do rekombinacji wszelkich nakładających się na siebie sekwencji DNA, ta metoda klonowania może być zastosowana do dowolnej konstrukcji wektora CRISPR. Większość schematów klonowania CRISPR wykorzystuje syntezę genów gRNA, enzymy restrykcyjne typu IIS17,18 lub PCR z rozszerzeniem nakładaniasię 19. Każda z tych technik ma nieodłączne zalety i wady, ale zazwyczaj wymagają one wielu praktycznych kroków klonowania. Podstawową zaletą przedstawionej tutaj metody klonowania jest.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez grant Narodowej Fundacji Nauki IOS-1025642 (GBM). Dziękujemy Marii Harrison za dostarczenie szczepu ARqua1.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
NEBuilder® (Mieszanka montażowa HiFi DNA)New England BiolabsE5520
p201N:Cas9Addgene59175Plazmid p201H:Cas9 (59176) jest również zgodny z zgłoszonymi nakładkami i enzymami.
pUC gRNA ShuttleAddgene47024
SwaINew England BiolabsR0604S
SpeINew England BiolabsR0133S
ZymoResearchD4003
Bufor NEB 2.1New England BiolabsB7202S
NEB CutSmart (bufor 4)New England BiolabsB7204S
NEB Buffer 3.1New England BiolabsB7203S
(przygotowanie plazmidu)Epoka Nauki Przyrodnicze1910-050/250
EcoRV-HF®New England BiolabsR3195S
StyI-HF®New England BiolabsR3500S
Sole MS + Gamborg WitaminyLaboratoria fitotechnologiczneM404
Fitagel i handel; (guma gellan)Sigma AldrichP8169
GA-7 PudełkaSigma AldrichV8505
Taśma chirurgiczna Micropore&trade3M1535-0
Timentin® (Tikarcylina/kwas klawulanowy)Różne0029-6571-26
Podkłady 5' → 3'SwaI_MtU6F
 GATATTAATCTCTTCGATGA
AATTTATGCCTATCTTATAT
GATCAATGAGG
MtU6R   AAGCCTACTGGTTCGCTTG
AAG
RusztowanieF GTTTTAGAGCTAGAAATAGC
AAGTT
SpeI_Scaffold RGTCATGAATTGTAATACGACTC
AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG
StUbi3P218R ACATGCACCTAATTTCACTA
GATGT
ISceIRGTGATCGATTACCCTGTTAT
CCCTAG		Nie może być używany do sekwencjonowania Sangera, ponieważ na plazmidzie
UNS1_Scaffold R GAGAATGGATGCGAGTAATGAA
AAAAAGCACCGACTCGGTG
UNS1_MtU6 F   CATTACTCGCATCCATTCTCAT
GCCTATCTTATATGATCAATGAGG
p201R CGCGCCGAATTCTAGTGATCG
Pogrubione sekwencje oznaczają nakładanie się 20-nt ze zlinearyzowanymi p201N:Cas9.
Oczyszczanie w czystej i 5 kolumnach EconoSpin Mini wirowa kolumna znajduje się drugie miejsce wiązania

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  2. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CRISPR Vector ConstructionDNA Assembly MethodTomato Hairy RootsGuide RNA DesignRestriction Enzyme DigestionDNA Amplification PCRPlasmid PurificationAgrobacterium TransformationGenetic Mutation AnalysisFunctional Genomics Studies

Related Articles