Wysokoprzepustowa konstrukcja wektora CRISPR i charakterystyka modyfikacji DNA przez generowanie owłosionych korzeni pomidora

Summary

Korzystając z montażu DNA, wiele wektorów CRISPR może być konstruowanych równolegle w jednej reakcji klonowania, co sprawia, że budowa dużej liczby wektorów CRISPR jest prostym zadaniem. Owłosione korzenie pomidora są doskonałym systemem modelowym do walidacji wektorów CRISPR i generowania zmutowanych materiałów.

Abstract

Ukierunkowane mutacje DNA generowane przez wektory z technologią CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 okazały się przydatne w badaniach genomiki funkcjonalnej. Chociaż większość strategii klonowania jest prosta do wykonania, zazwyczaj wykorzystują one wiele kroków i mogą wymagać kilku dni, aby wygenerować ostateczne konstrukty. Przedstawiona tutaj metoda opiera się na składaniu DNA i może wytworzyć w pełni funkcjonalne wektory CRISPR w jednej reakcji klonowania. Konstrukcja wektorowa może być również łączona, co dodatkowo zwiększa wydajność i użyteczność procesu. Modyfikacja metody służy do tworzenia wektorów CRISPR z wieloma celami genowymi. Wektory CRISPR są następnie przekształcane w owłosione korzenie pomidorów w celu wygenerowania materiałów transgenicznych z ukierunkowanymi modyfikacjami DNA. Owłosione korzenie są użytecznym systemem do testowania funkcjonalności wektorów, ponieważ są technicznie proste do wygenerowania i nadają się do produkcji na dużą skalę. Przedstawione tutaj metody będą miały szerokie zastosowanie, ponieważ mogą być wykorzystywane do generowania różnorodnych wektorów CRISPR i mogą być stosowane w szerokim zakresie gatunków roślin.

Introduction

Możliwość generowania ukierunkowanych modyfikacji DNA za pomocą CRISPR/Cas9 ma ogromny potencjał dla badań genomiki funkcjonalnej. System CRISPR/Cas9 składa się z dwóch elementów; nukleaza Cas9, pochodząca ze Staphylococcus pyogenes i cząsteczki przewodnika RNA (gRNA) o objętości około 100-nt, która kieruje Cas9 do docelowego miejsca (miejsc) ^DNA1. Rozpoznawanie celu jest zapewnione przez pierwsze ~20-nt gRNA, co pozwala na wysokoprzepustową produkcję wektorów docelowych^2,3. Większość organizmów, które można zmodyfikować, została już wyposażona w technologię CRISPR/Cas9^4,5.

W roślinach, konstytutywne promotory, takie jak promotor CaMV 35S, są powszechnie używane do napędzania ekspresji nukleazy Cas9⁶. GRNA są wyrażane przy użyciu promotorów polimerazy RNA III, U6 lub U3, która ogranicza pierwszą zasadę gRNA do G dla U6 lub A dla U3 w celu wydajnej transkrypcji. Jednak promotory polimerazy RNA II, które są wolne od tych ograniczeń, zostały również wykorzystane^7,8.

Różne gRNA wywołują mutacje DNA z różną skutecznością, dlatego ważne może być najpierw zweryfikowanie wektorów CRISPR przed zainwestowaniem w transformacje całej rośliny lub utworzeniem rozległych badań fenotypowych. Przejściowa ekspresja konstruktów CRISPR w roślinach, na przykład za pomocą agroinfiltracji, na ogół skutkuje niższą częstotliwością modyfikacji DNA w porównaniu ze stabilnymi roślinami⁶, co utrudnia wykrywanie mutacji, a testy fenotypowe są niepraktyczne przy takich podejściach. Tak zwane owłosione korzenie są wygodnym, alternatywnym systemem, ponieważ duża liczba niezależnych, stabilnie przekształconych materiałów może zostać wygenerowana w ciągu kilku tygodni, a nie miesięcy w przypadku stabilnych roślin. Wektory CRISPR są bardzo skuteczne w indukowaniu mutacji DNA w owłosionych korzeniach^9,10.

Metody składania DNA skutecznie ligatują fragmenty DNA zawierające nakładające się na siebie końce¹¹. Główną zaletą niektórych metod składania DNA jest możliwość włączenia ssDNA (tj. oligonukleotydów) do złożonych produktów. Ponieważ gRNA mają tylko ~20-nt długości, a nowe cele można tworzyć za pomocą zsyntetyzowanych oligonukleukleotów, te metody składania DNA dobrze nadają się do klonowania CRISPR. Opisane tutaj protokoły oparte są na serii wektorów CRISPR p201, która została z powodzeniem zastosowana w soi¹⁰, topoli¹², a teraz pomidorach. Przedstawiona procedura klonowania ma kilka zalet w porównaniu z obecną metodą klonowania¹⁰. Mianowicie, w pełni funkcjonalne wektory mogą być generowane w jednej reakcji klonowania w ciągu jednego dnia. Konstrukcja wektorowa może być również łączona w celu równoległego generowania wielu wektorów CRISPR, co jeszcze bardziej skraca czas pracy i koszty materiałów. Przedstawiamy również protokół generowania owłosionych korzeni pomidora jako skuteczną metodę wytwarzania materiałów transgenicznych z celowanymi delecjami genów. Owłosione korzenie są wykorzystywane do walidacji wektorów CRISPR i dostarczają materiału do kolejnych eksperymentów.

Protocol

1. Projektowanie RNA i konstruowanie wektorów

1. Zidentyfikuj sekwencje docelowe dla genów będących przedmiotem zainteresowania. Istnieje wiele internetowych programów do wyszukiwania celów CRISPR odpowiednich do tego kroku^13,14.
   UWAGA: Tutaj używamy motywu docelowego GN₂₀GG, ale inne projekty mogą być odpowiednie w zależności od zastosowanej aplikacji lub systemu wektorowego.
2. Zaprojektuj 60-merowe oligonukleotydy gRNA tak, aby zawierały część GN₁₉ docelowych motywów otoczonych sekwencjami 5' i 3' 20-nt, które są wymagane do złożenia DNA. Końcowy motyw 60-merowy to: 5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN 19-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3'.
   UWAGA: Standardowe, odsolone podkłady działają bez zarzutu.
3. Przygotuj cztery DNA do złożenia (ryc. 1). Zobacz plik uzupełniający dla sekwencji DNA.
   1. Trawić 1 - 5 μg plazmidu p201N:Cas9¹⁰ z enzymem restrykcyjnym SpeI w 1x buforze 4 w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Oczyszczać traw w kolumnie zgodnie z instrukcjami producenta. Zawiesić w ~15 μl 10 mM Tris-HCl i określić ilościowo za pomocą spektrofotometrii UV.
   2. Wykonaj drugie trawienie enzymem restrykcyjnym SwaI w 1x buforze 3,1 w temperaturze 25 °C przez 2 godziny. Sprawdź 100 - 200 ng na 0,8% żelu agarozowym, aby potwierdzić całkowite trawienie.
      UWAGA: Prawidłowo strawiony plazmid będzie miał pojedyncze pasmo przy 14 313 pz. Uwaga: Inaktywacja termiczna enzymu i defosforylacja nie są wymagane. Strawiony plazmid może być przechowywany w temperaturze -20 °C.
   3. PCR amplifikuje promotor Medicago truncatula (Mt) U6 i rusztowanie DNA z plazmidu pUC gRNA Shuttle¹⁰ przy użyciu odpowiednio starterów SwaI_MtU6F / MtU6R i ScaffoldF / SpeI_ScaffoldR. Użyj polimerazy o wysokiej wierności w warunkach PCR: 95 °C przez 3 min; 31 cykli (98 °C przez 20 sekund, 60 °C przez 15 sekund, 72 °C przez 30 sekund); i 72 °C przez 5 min.
      1. Wizualizuj ~ 3 μl porcji produktów PCR na 1% żelu agarozowym, aby potwierdzić amplifikację. Amplikon MtU6 wynosi 377 pz, a amplikon rusztowania 106 pz. Pozostałe produkty PCR należy oczyścić kolumnowo zgodnie z instrukcjami producenta, określić ilościowo za pomocą spektrofotometrii UV i przechowywać w temperaturze -20 °C.
   4. Zawiesić całą probówkę oligonukleotydów gRNA do 100 μM w wodzie o jakości laboratoryjnej. Dodać 1 μl 100 μM oligo do 500 μl 1x bufor 2.1. Dobrze wymieszaj. W przypadku łączenia wielu oligonukleotydów, dodaj 1 μl każdego oligonukleotydu o wielkości 100 μM do probówki 1x Buffer 2.1. Rozcieńczone oligonukleotydy można przechowywać w temperaturze -20 °C.
4. Zaprogramować termocykler tak, aby utrzymywał temperaturę 50 °C za pomocą podgrzewanej pokrywy. Połączyć 100 ng (0,011 pmol) zlinearyzowanego wektora, 50 ng (0,2 pmol) promotora MtU6, 12 ng (0,2 pmol) rusztowania, 1 μl (0,2 pmol) rozcieńczonego oligonukleotydy gRNA i wodę do objętości 5 μl. Dodaj 5 μl 2x wysokiej jakości mieszanki głównej do montażu DNA, dobrze wymieszaj i odwiruj. Inkubować reakcję przez 60 minut w termocyklerze o temperaturze 50 °C. Następnie umieść reakcję na lodzie.
   Uwaga: Objętości reakcji można zwiększyć, aby dostosować się do niskiej wydajności DNA.
5. Przekształć 2 μl reakcji w właściwe komórki E. coli przy użyciu standardowych technik i płytkę na LB uzupełnioną 50 mg ^L-1 kanamycyny (Kan₅₀). Hodować platerowane komórki w temperaturze 37 °C przez noc. Pozostałą reakcję składania DNA należy zachować w temperaturze -20 °C.
6. Badanie kolonii metodą PCR przy użyciu starterów StUbi3P218R i ISceIR. Rozcieńczyć podwielokrotność pozostałej reakcji składania DNA wodą w stosunku 1:5. Użyj 1 μl jako kontroli pozytywnej dla ekranu kolonii i 1 ng okrągłego plazmidu p201N: Cas9 jako kontroli bez wstawiania.
   1. PCR amplifikować w zależności od warunków; 95 °C przez 3 min; 31 cykli (95 °C przez 30 sekund, 58 °C przez 30 sekund, 72 °C przez 30 sekund); i w temperaturze 72 °C przez 5 minut. Wizualizacja produktów PCR na 1% żelu agarozowym. Upewnij się, że prawidłowe wstawienia mają pasmo 725 pz, a wektory bez wstawień (np. wektor nieobcięty) będą miały pasmo 310 pz.
7. Hodować dodatnie kolonie w płynnych kulturach LB Kan₅₀ przez noc w temperaturze 37 °C i oczyszczać plazmidy zgodnie z instrukcjami producenta. Sekwencjonuj plazmidy Sangera za pomocą startera StUbi3P218R i dopasuj chromatogramy do sekwencji promotora, celu i rusztowania MtU6, aby upewnić się, że podczas klonowania nie wprowadzono żadnych błędów.
8. Wykonaj diagnostyczne trawienie, trawiąc ~1 μg plazmidu za pomocą EcoRV i StyI. Wizualizuj na 0,8% żelu agarozowym. Fragmenty (w bp) to: 4192, 2001, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318 i 174.
9. Użyj złożenia DNA do budowy wektorów z wieloma gRNA.
   1. Aby skonstruować wektor z dwiema kasetami gRNA, PCR amplifikuje gRNA pierwszej pozycji za pomocą starterów SwaI_MtU6F / UNS1_ScaffoldR, a gRNA drugiej pozycji za pomocą starterów UNS1_MtU6F / SpeI_ScaffoldR od 1 ng każdego z odpowiednich plazmidów skonstruowanych w krokach 1.1 - 1.8. Użyj warunków PCR w kroku 1.3.3. Wizualizuj ~ 3 μl porcji produktów PCR na 1% żelu agarozowym, aby potwierdzić amplifikację. Amplikony wynoszą ~500 pz.
   2. Połącz i wymieszaj w przybliżeniu równe ilości nieoczyszczonych produktów PCR w probówce o pojemności 200 μl (zwykle 3-4 μl każdej). Do montażu dodaj 1 μl połączonych produktów PCR, 50 ng zlinearyzowanych P201N:Cas9 SwaI i SpeI, wodę klasy laboratoryjnej do 2,5 μl i 2,5 μl 2x wysokiej jakości mieszanki wzorcowej do montażu DNA. Inkubować w termocyklerze o temperaturze 50 °C przez 15 min.
      Uwaga: Instrukcja montażu DNA zaleca 15-minutową inkubację dla 2 - 3 fragmentów.
   3. Przekształć 1 - 2 μl w kompetentne komórki E. coli i umieść na płytce LB Kan₅₀. Hodować posiane komórki w temperaturze 37 °C przez noc. Zachować pozostałą reakcję w temperaturze -20 °C.
   4. Badanie kolonii metodą PCR ze starterami StUbi3P218R i ISceIR w takich samych warunkach, jak w kroku 1.6. Prawidłowe klony będą miały amplikon 1,200 pz. Hoduj dodatnie kolonie w płynnych kulturach LB Kan₅₀ przez noc i oczyszczaj plazmidy.
   5. Plazmidy sekwencji Sangera ze starterami StUbi3P218R (obejmuje gRNA pierwszej pozycji) i p201R (obejmuje gRNA drugiej pozycji). Dopasuj chromatogramy do sekwencji promotora, celu i rusztowania MtU6. Przegląd diagnostyczny z EcoRV i StyI da wynik w postaci następujących fragmentów (w bp): 4192, 2476, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, 174. Pogrubiony fragment zawiera drugie gRNA.
10. Po spełnieniu wszystkich oczekiwań związanych z kontrolą jakości, przekształć plazmidy w Agrobacterium rhizogenes szczep ARqua1¹⁵. Dodać 1 μl preparatu plazmidowego do 50 μl ogniw elektrokompetentnych i elektroporować w kuwecie 1 mm z ustawieniami: 2,4 kV, 25 μF i 200 Ω. Odzyskaj komórki w ~500 μl SOC i wstrząsaj w temperaturze 28 °C przez 2 godziny. Talerz na LB Kan₅₀ i rosnąć w temperaturze 28 °C przez 2 dni. Przeprowadzić badanie przesiewowe kolonii przy użyciu tych samych starterów i warunków PCR, co w ppkt 1.3.3. Wytwarzaj zapasy glicerolu z dodatnich klonów.

2. Transformacja owłosionego korzenia

1. Sterylizuj nasiona pomidorów w 20% domowym wybielaczu przez 15 minut, stale mieszając. W okapie z przepływem laminarnym usuń wybielacz i umyj 3 razy w sterylnej wodzie laboratoryjnej.
2. Umieść 30 nasion w pudełku GA-7 zawierającym 1/2 MS pożywki (2,22 g soli ^L-1 MS + witaminy Gamborg, 10 g sacharozy ^L-1, 3 g gumy ^L-1 gellan, pH 5,8). Kiełkuj przez ~ 2 dni w ciemności, a następnie przenieś pudełka GA-7 do światła. Hoduj sadzonki jeszcze przez ~ 4 dni w świetle.
3. Dzień przed przemianą rozsiać kultury A. rhizogenes na stałym LB Kan₅₀ i hodować w temperaturze 28 °C przez noc.
4. W dniu przemiany, w okapie z przepływem laminarnym zbierz sterylne materiały: 12 ml probówek hodowlanych, 50 ml probówki stożkowej, 1/2 MS płynu (bez gumy gellan), 200 μM acetosyringonu, bibułę filtracyjną, szalki Petriego, kleszcze i skalpel, pipety i końcówki do pipet. Dodać 25 μl acetosyringonu do 50 ml 1/2 MS i wlać ~ 6 ml do każdej probówki hodowlanej.
5. Za pomocą wygiętej końcówki o objętości 200 μl zeskrobać komórki A. rhizogenes z płytki i ponownie zawiesić w 6 ml 1/2 MS płynu. Odwiruj rurkę, aby całkowicie zawiesić komórki. Po ponownym zawieszeniu komórek z każdego wektora zmierz gęstość optyczną (OD) 1 ml komórek o stałej długości fali 600 nM. Upewnij się, że średnica zewnętrzna wynosi od 0,2 do 0,4; W razie potrzeby rozcieńczyć lub dodać więcej komórek. Powtórz te czynności dla każdej konstrukcji.
6. Dodać ~ 2 ml 1/2 MS płynu na szalkę Petriego za pomocą sterylnej bibuły filtracyjnej. Wyciąć liścienie z sadzonek i umieścić na zwilżonej bibule filtracyjnej. Po zebraniu wszystkich liścieni odetnij dystalną warstwę o ~ 1 cm od liścieni, w wyniku czego otrzymasz kawałki liścienia z dwoma odciętymi końcami. Dodaj eksplantaty do roztworów A. rhizogenes, wymieszaj i inkubuj przez 20 minut, od czasu do czasu odwracając.
   Uwaga: Rutynowo stosuje się około 12 eksplantatów na konstrukt, chociaż aż 80 eksplantatów zaszczepiono w 6 ml roztworu A. rhizogenes.
7. Podczas inkubacji A. rhizogenes dodać bibułę filtracyjną do szalek Petriego, po jednej na przekształcony konstrukt. Ustaw również 1/2 MS pożywki stałej, bez antybiotyków, w okapie z przepływem laminarnym do wyschnięcia.
8. Wyciągnij liścienie z roztworu A. rhizogenes za pomocą sterylnych kleszczyków i umieść na suchej bibule filtracyjnej. Przykryj pokrywką Petriego, aby upewnić się, że tkanki nie wyschną podczas przechodzenia do następnej przemiany. Osuszyć liścienie na bibule filtracyjnej i przenieś, stroną odtłuszczoną do góry, do pożywki 1/2 MS. Owiń talerze taśmą chirurgiczną i współuprawiaj w ciemności w temperaturze pokojowej przez 2 dni.
9. Po wspólnej hodowli przenieść liścienie, stroną odtłuszczającą do góry, na 1/2 pożywki MS uzupełnionej 300 mg ^L-1 tikarcyliny/kwasu klawulanowego (Tim₃₀₀, aby zapobiec wzrostowi resztkowych A. rhizogenes) i Kan₅₀ (do selekcji roślin) i owinąć taśmą chirurgiczną. Utrzymuj kultury pod lampami fluorescencyjnymi w temperaturze pokojowej z 16-godzinnym fotoperiodem.
10. Po ~1,5 - 2 tygodniach korzenie o długości co najmniej 2 cm wycina się z liścieni za pomocą sterylnych kleszczy i skalpela i przenosi na pożywkę 1/2 MS Kan₅₀ Tim₃₀₀. Przenieś od 10 do 15 korzeni na jedną płytkę. Zaznacz położenie końcówek korzeni markerem, owiń taśmą chirurgiczną i utrzymuj w pomieszczeniu hodowlanym.
11. Po tygodniu na selektywnych podłożach widać rosnące przekształcone korzenie. Zbierz podpróbkę przekształconych korzeni w celu ekstrakcji DNA przy użyciu preferowanej metody ekstrakcji DNA. Uwaga: Talerze z liścieniami można przechowywać przez 2-3 tygodniowe zbiory, po czym korzenie zamieniają się w splątany bałagan i są trudne do odizolowania. Niepobrane tkanki korzeniowe mogą być utrzymywane w nieskończoność. Na wyizolowanych próbkach DNA można przeprowadzić różne testy w celu określenia częstotliwości i typu mutacji DNA. Wyniki kilku takich testów opisano poniżej.

Results

Konstrukcja wektora CRISPR z montażem DNA zazwyczaj generuje dziesiątki do setek niezależnych klonów. Badania przesiewowe kolonii metodą PCR z łatwością identyfikują prawidłowe klony i mogą rozróżniać plazmidy z wstawkami i bez nich (Figura 2A), co jest przydatne w rozwiązywaniu problemów. Zazwyczaj wszystkie klony zawierają wstawkę, a użytkownik może zdecydować się na całkowite pominięcie etapów badania kolonii. Do kontroli jakości stosuje się wyciągi diagnostyczne (

Discussion

Ponieważ składanie DNA służy do rekombinacji wszelkich nakładających się na siebie sekwencji DNA, ta metoda klonowania może być zastosowana do dowolnej konstrukcji wektora CRISPR. Większość schematów klonowania CRISPR wykorzystuje syntezę genów gRNA, enzymy restrykcyjne typu IIS^17,18 lub PCR z rozszerzeniem nakładania^{się 19}. Każda z tych technik ma nieodłączne zalety i wady, ale zazwyczaj wymagają one wielu praktycznych kroków klonowania. Podstawową zaletą przedstawionej tutaj metody klonowania jest...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NEBuilder® (Mieszanka montażowa HiFi DNA)	New England Biolabs	E5520
p201N:Cas9	Addgene	59175	Plazmid p201H:Cas9 (59176) jest również zgodny z zgłoszonymi nakładkami i enzymami.
pUC gRNA Shuttle	Addgene	47024
SwaI	New England Biolabs	R0604S
SpeI	New England Biolabs	R0133S
Zymo	Research	D4003
Bufor NEB 2.1	New England Biolabs	B7202S
NEB CutSmart (bufor 4)	New England Biolabs	B7204S
NEB Buffer 3.1	New England Biolabs	B7203S
(przygotowanie plazmidu)	Epoka Nauki Przyrodnicze	1910-050/250
EcoRV-HF®	New England Biolabs	R3195S
StyI-HF®	New England Biolabs	R3500S
Sole MS + Gamborg Witaminy	Laboratoria fitotechnologiczne	M404
Fitagel i handel; (guma gellan)	Sigma Aldrich	P8169
GA-7 Pudełka	Sigma Aldrich	V8505
Taśma chirurgiczna Micropore&trade	3M	1535-0
Timentin® (Tikarcylina/kwas klawulanowy)	Różne	0029-6571-26
Podkłady 5' → 3'SwaI_MtU6F
	GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATAT GATCAATGAGG
MtU6R	AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG
RusztowanieF	GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT
SpeI_Scaffold R	GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG
StUbi3P218R	ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT
ISceIR	GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG	Nie może być używany do sekwencjonowania Sangera, ponieważ na plazmidzie
UNS1_Scaffold R	GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG
UNS1_MtU6 F	CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG
p201R	CGCGCCGAATTCTAGTGATCG
Pogrubione sekwencje oznaczają nakładanie się 20-nt ze zlinearyzowanymi p201N:Cas9.