Method Article

Kapilarne odśrodkowe urządzenie mikroprzepływowe do formowania mikrokropel monodyspersyjnych o kontrolowanej wielkości

DOI:

10.3791/53860

⸱

February 22nd, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Computational Intelligence and Systems Science, Interdisciplinary Graduate School of Science and Engineering, Tokyo Institute of Technology, 2Graduate School of Bioscience and Biotechnology, Tokyo Institute of Technology, 3Department of Mechanical Engineering, Keio University, 4PRESTO, Japan Science and Technology Agency

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj demonstrujemy prostą metodę produkcji mikrokropelek o kontrolowanej wielkości, monodyspersyjnych, typu woda w oleju (W/O) za pomocą kapilarnego odśrodkowego urządzenia mikroprzepływowego. Metoda ta wymaga jedynie niewielkiej objętości próbki i umożliwia produkcję o wysokiej wydajności. Spodziewamy się, że ta metoda będzie przydatna do szybkich analiz biochemicznych i komórkowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj demonstrujemy prostą metodę szybkiej produkcji mikrokropel o kontrolowanej wielkości, monodyspersyjnych, W/O, za pomocą kapilarnego odśrodkowego urządzenia mikroprzepływowego. Mikrokropelki W/O są ostatnio wykorzystywane w potężnych metodach, które umożliwiają zminiaturyzowane eksperymenty chemiczne. Dlatego konieczne jest opracowanie wszechstronnej metody uzyskiwania monodyspersyjnych mikrokropelek W/O. Opracowaliśmy metodę generowania monodyspersyjnych mikrokropel W/O w oparciu o kapilarne odśrodkowe osiowosymetryczne współprzepływowe urządzenie mikroprzepływowe. Udało nam się kontrolować wielkość mikrokropel poprzez regulację otworu kapilarnego. Nasza metoda wymaga sprzętu, który jest łatwiejszy w użyciu niż w przypadku innych technik mikroprzepływowych, wymaga tylko niewielkiej objętości (0,1-1 μl) roztworu próbki do enkapsulacji i umożliwia produkcję setek tysięcy mikrokropelek W/O na sekundę. Oczekujemy, że ta metoda wspomoże badania biologiczne, które wymagają cennych próbek biologicznych, zachowując objętość próbek do szybkiej analizy ilościowej, badań biochemicznych i biologicznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrokropelki W/O1-5 mają wiele ważnych zastosowań w badaniach biochemii i bioinżynierii, w tym synteza białek6, krystalizacja białek7, emulsja PCR8,9, enkapsulacja komórek10 i budowa sztucznych systemów podobnych do komórek5,6. Aby wyprodukować mikrokropelki W/O do tych zastosowań, ważnymi kryteriami są kontrola wielkości i monodyspersyjności mikrokropel W/O. Urządzenia mikroprzepływowe do wytwarzania monodyspersyjnych, kontrolowanych rozmiarem mikrokropel W/O11 oparte są na metodzie współprzepływowej12,13, metodzie ogniskowania przepływu14,15 i metodzie trójnika16 w mikrokanałach. Chociaż metody te wytwarzają wysoce monodyspersyjne mikrokropelki W/O, proces mikrowytwarzania wymaga skomplikowanej obsługi i specjalistycznych technik przygotowania mikrokanałów, a także wymaga dużej ilości roztworu próbki (co najmniej kilkaset μl) ze względu na nieuniknioną martwą objętość w pompach strzykawkowych i rurkach, które doprowadzają roztwór próbki do mikrokanałów. W związku z tym potrzebna jest łatwa w użyciu metoda o niskiej objętości martwej do generowania monodyspersyjnych mikrokropel W/O.

Ten artykuł, wraz z filmami z procedur eksperymentalnych, opisuje odśrodkowe, kapilarne, osiowosymetryczne, współprzepływowe urządzenie mikroprzepływowe17 do generowania mikrokropel W/O wielkości komórki (Rysunek 1). Ta prosta metoda pozwala osiągnąć monodyspersję i kontrolę wielkości. Wymaga jedynie miniwirówki stołowej i kapilarnego, osiowosymetrycznego, współprzepływowego urządzenia mikroprzepływowego zamocowanego w mikroprobówce do pobierania próbek. Nasza metoda wymaga tylko bardzo małej objętości (0,1 μl) i nie marnuje znaczącej objętości próbki.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja kapilarnego urządzenia mikroprzepływowego

  1. Ustawienie uchwytów
    Uwaga: Konstrukcja uchwytu jest przedstawiona na rysunku 2A.
    1. Wyciąć każdą z czterech tarcz uchwytów (Rysunek 2A(i)-(iv)) z płyty z tworzywa poliacetalowego o grubości 2 mm za pomocą frezarki. Dla każdej z czterech tarcz uchwytu należy użyć następujących wymiarów: (i) średnica tarczy 1 8.5 mm, średnica otworu kapilary (CH) 1.3 mm, średnica otworu na (SH) 1.8 mm; (ii) tarcza 2 o średnicy 8,7 mm, średnica CH 2,0 mm, średnica SH 1,8 mm; (iii) tarcza 3 o średnicy 8,7 mm, średnica CO 0,5 mm, średnica SH 1,8 mm; oraz (iv) tarcza 4 o średnicy 9,1 mm, średnica CH 1,0 mm, średnica SH 1,8 mm.
    2. Zamontuj uchwyty za pomocą M2 × 40 (Rysunek 2B). Dolna część uchwytu (rysunek 2B) składa się z tarczy 1 i tarczy 2 na rysunku 2A(i), (ii), a górna część (rysunek 2B) uchwytu składa się z tarczy 3 i tarczy 4 na rysunku 2A(iii), (iv).
      1. Aby skonstruować dolną część uchwytu, włóż w trzy SH każdej tarczy 1 i 2. Skróć, odcinając kawałek części gwintowanej. Trzymaj długość na poziomie 0,9 cm (taka sama długość jak dolna część uchwytu).
      2. Aby skonstruować górną część uchwytu, włóż w dwie SH każdej tarczy 3 i 4. Skróć, odcinając kawałek części gwintowanej. Utrzymuj długość na poziomie 0,7 cm (taka sama długość jak górna część uchwytu).
      3. Aby zmontować uchwyt, połącz dolną i górną część uchwytu za pomocą długiej.
        nuta: Zachowaj dokładną długość każdej części uchwytu: dolna część ma 0,9 cm; górna część ma 0,7 cm (rysunek 2B).
  2. Wytwarzanie szklanych kapilar
    1. Należy stosować dwa rodzaje kapilar szklanych: kapilarnę wewnętrzną szklaną (średnica zewnętrzna (OD)/ średnica wewnętrzna (ID): 1.0/0.6 mm) i zewnętrzną szklaną kapilarnę (OD/ID: 2.0/1.12 mm).
    2. Użyj noża do szkła, aby podzielić zewnętrzną szklaną kapilę na trzy równe części, a następnie użyj noża do szkła, aby podzielić wewnętrzną szklaną kapilarnę na dwie równe części.
    3. Naostrz każdą podzieloną wewnętrzną i zewnętrzną szklaną kapilarnę za pomocą ściągacza do szklanych kapilar (Rysunek 3A). Ustaw wagę ściągacza na max. Ustaw poziom ciepła ściągacza na 60 stopni dla zewnętrznej szklanej kapilary i 70 stopni dla wewnętrznej kapilary. Ostrożnie naostrz szklaną kapilarę.
      1. Utrzymuj długość końcówki w zwężonej części szklanej kapilary: wewnętrzna kapila wynosi 1,5-1,8 cm; zewnętrzna kapilata ma 0,8-1,0 cm (ryc. 3C). Jeśli ta długość jest krótsza lub dłuższa niż opisana, wyreguluj poziom ciepła ściągacza.
    4. Przymocuj wewnętrzne lub zewnętrzne szklane kapilary do stojaka microforge za pomocą taśmy (Rysunek 3B).
    5. Odetnij końcówkę szklanej kapilary za pomocą mikrokuźni w trzech krokach (Rysunek 3B): (i) dotknij końcówką szklanej kapilary szklanych koralików na platynowym drucie, (ii) podgrzej drut platynowy, naciskając przełącznik nożny przez 1-2 sekundy, oraz (iii) po 1-2 sekundach odetnij końcówkę szklanej kapilary, chłodząc drut platynowy.
      1. Dostosuj średnice odpowiednio wewnętrznych (di) i zewnętrznych (do) otworów kapilary. Średnica otworu wewnętrznej szklanej kapilary wynosi 5, 10 i 20 μm (di = 5,10, 20 μm), a zewnętrznej szklanej kapilary (do) wynosi 60 μm (do = 60 μm) w tym doświadczeniu.
        nuta: Szklana kapilara jest jednorazowa. Powtórz wytwarzanie szklanych naczyń włosowatych.

2. Procedura generowania mikrokropelek bez

  1. Napełnij zewnętrzną szklaną kapilarnę środkiem powierzchniowo czynnym zawierającym olej. Mieszaniną oleju i środka powierzchniowo czynnego jest heksadekan zawierający 2% (w/w) monooleinianu sorbitolu w tym eksperymencie (ryc. 4A).
    nuta: Istnieje wiele kombinacji olejów i środków powierzchniowo czynnych (np. oleje mogą być fluorowane lub gazowane; środki powierzchniowo czynne mogą być jonowe, niejonowe lub fluorochemiczne).
    1. Wprowadzić 10 μl heksadekanu zawierającego monooleinian sorbitanu do zewnętrznej szklanej kapilary. Na rysunku 4A średnica otworu zewnętrznej szklanej kapilary (do) wynosi 60 μm (do = 60 μm). Aby wyregulować otwór szklanej kapilary, wróć do kroków 1.2.4-1.2.5.
  2. Ustaw zewnętrzną kapilarnę w dolnej części uchwytu (Rysunek 4B).
  3. Pobrać około 0,1 μl roztworu wodnego do wewnętrznej szklanej kapilary (rysunek 4C) przez działanie kapilarne. Na rysunku 4C średnica otworu wewnętrznej szklanej kapilary (di) wynosi 10 μm (di = 10 μm). Aby wyregulować otwór szklanej kapilary, wróć do kroków 1.2.4-1.2.5.
  4. Ustaw wewnętrzną kapilarnę w górnej części uchwytu (Rysunek 4D-a). Włóż kapilarnę wewnętrzną do kapilary zewnętrznej (Rysunek 4D-a). Patrząc na białe kółko punktowe, jak na rysunku 4D-a, obserwuj położenie wewnętrznej kapilary wewnątrz zewnętrznej kapilary (wewnętrzna średnica zewnętrznej kapilary (w) = 130 μm) (Rysunek 4D-b,c) za pomocą mikroskopu cyfrowego. Położenie kapilary wewnętrznej w kapilarze zewnętrznej musi być ustawione na w = 100-150 μm.
    nuta: Aby zmienić położenie wewnętrznej kapilary w zewnętrznej kapilarze, należy przekręcić w górnej części uchwytu. W ten sposób można precyzyjnie kontrolować odległość w.
  5. Wprowadzić 100 μl heksadekanu zawierającego monooleinian sorbitanu (2% w/w) na dno mikroprobówki o pojemności 1,5 ml próbki. Zamontuj uchwyt z wewnętrznymi i zewnętrznymi kapilarnami w mikroprobówce próbki (Rysunek 4E-a). Pamiętaj, aby sprawdzić zewnętrzną kapilarę, aby trzymać ją z dala od interfejsu powietrze-olej (Rysunek 4E-b).
  6. Odwirować mikroprobówkę próbki za pomocą miniwirówki stołowej z odchylanym wychyleniem przy ciężarze 1,600 x g przez 1-2 sekundy w celu wytworzenia mikrokropelek (rysunek 4F). Wszystkie eksperymenty należy przeprowadzić w RT.
    nuta: Użyj wirówki typu wahadłowego. Kropla może zderzyć się ze ścianą boczną mikroprobówki próbki i rozpaść się, gdy używana jest wirówka o stałym kącie nachylenia.
  7. Powoli wyciągnij kropelki W/O za pomocą pipety, a następnie umieść je na szkiełku podstawowym.
  8. Uchwyć obrazy mikrokropel generowanych za pomocą mikroskopu cyfrowego (powiększenie, 200X).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu prezentujemy prostą metodę generowania mikrokropel W/O wielkości komórki za pomocą kapilarnego odśrodkowego urządzenia mikroprzepływowego (Rysunek 1). Urządzenie mikroprzepływowe składało się z uchwytu kapilary (rysunek 2B), dwóch szklanych kapilar (wewnętrzne i zewnętrzne szklane kapilary na rysunku 3C) oraz mikrorurki zawierającej olej zawierający środek powierzchniowo czynny. Wstrzyknęliśmy 0,1 μl roztworu próbki do wewnę...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z tego urządzenia, monodyspersyjne mikrokropelki W/O zostały wygenerowane przez niestabilność Plateau-Rayleigha przepływu strumieniowego17. Badania mikroskopowe nie wykazały obecności kropel satelitarnych. Podczas produkcji urządzenia niezbędne są trzy kluczowe etapy, aby skutecznie wytworzyć monodyspersyjne mikrokropelki W/O. Po pierwsze, aby dostarczyć prosty strumień oleju zawierającego środek powierzchniowo czynny i roztwór wodny, otwory kapilarne czterech krążków muszą być ułożone w koncentryc...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie zgłasza się konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez obszar badawczy PRESTO "Projektowanie i Kontrola Funkcji Komórkowych" Japońskiej Agencji Nauki i Technologii (JST), Grant in-Aid na Badania Naukowe Innowacyjnych Obszarów "Robotyka Molekularna" (Projekt nr 24104002) z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii (MEXT), Japonia, Grant-in-Aid dla Młodych Naukowców (A) (Projekt nr 24680033) oraz Badania Naukowe (B) (Projekt nr 26280097) od Japońskiego Towarzystwa Promocja Nauki (JSPS) oraz kurs Kreatywne projektowanie dla nauk biologicznych i biotechnologii w School of Bioscience and Biotechnology na Tokyo Tech.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Płyta z tworzywa sztucznego poliacetalu o grubości 2 mmNarzędzie Nikkyo Technos, Co., Ltd. (Japonia)244-6432-08
FrezarkaNarzędzieRoland DG Co., Ltd. (Japonia)MDX-40A
Frez palcowy RSE230-0,5 * 2,5NarzędzieNS Tool Co., Ltd. (Japonia) 01-00644-00501
M2 * 40NarzędzieJujo Chemia syntetyczna Labo. (Japonia)0001-024
Narzędzie do ściągania szkła CapillryNarishige (Japonia)PC-10
Narzędzie MicroforgeNarishige (Japonia)MF-900
Narzędzie do kapilary ze szkła wewnętrznegoNarishige (Japonia)G-1
Narzędzie do kapilar ze szkła zewnętrznegoWorld Precision Instruments Inc. (USA)1B200-6
1,5 ml Narzędzie do probówek na próbkiINA OPTIKA CO., LTD (Japonia)ST-0150F
OdczynnikheksadekanowyWako Pure Chemical Industries Ltd. (Japonia)080-03685 
Monooleinian sorbitanu (zakres 80)OdczynnikTokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Japonia)S0060
System Milli QOdczynnikMerck Millipore Corporation (Niemcy)ZRQSVP030
Wahadłowe narzędzie do mini-wirówkiHitech Co., Ltd. (Japonia)ATT101
Mikroskop cyfrowyKEYENCE Corporation (Japonia)VHX-2001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Song, H., Chen, D. L., Ismagilov, R. F. Reactions in droplets in microfluidic channels. Angew. Chem., Int. Ed. 45 (44), 7336-7356 (2006).
  2. Huebner, A., et al. Microdroplets: a sea of applications? Lab Chip. 8, 1244-1254 (2008).
  3. Taly, V., Kelly, B. T., Griffiths, A. D. Droplets as microreactors for highthroughput biology. ChemBioChem. 8 (3), 263-272 (2007).
  4. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip . 8, 198-220 (2008).
  5. Takinoue, M., Takeuchi, S. Droplet microfluidics for the study of artificial cells. Anal. Bioanal. Chem. 400 (6), 1705-1716 (2011).
  6. Hase, M., Yamada, A., Hamada, T., Baigl, D., Yoshikawa, K. Manipulation of cell-sized phospholipid-coated microdroplets and their use as biochemical microreactors. Langmuir. 23 (2), 348-352 (2007).
  7. Zheng, B., Tice, J. D., Roach, L. S., Ismagilov, R. F. A Droplet-Based, Composite PDMS/Glass Capillary Microfluidic System for Evaluating Protein Crystallization Conditions by Microbatch and Vapor-Diffusion Methods with On-Chip X-Ray Diffraction. Angew. Chem., Int. Ed. 43 (19), 2508-2511 (2004).
  8. Nakano, M., et al. Single-molecule PCR using water-in-oil emulsion. J. Biotechnol. 102 (2), 117-124 (2003).
  9. Diehl, F., et al. BEAMing: single-molecule PCR on microparticles in water-in-oil emulsions. Nat. Methods. 3, 551-559 (2006).
  10. He, M., et al. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
  11. Baroud, C., Gallaire, F., Dangla, R. Dynamics of microfluidic droplets. Lab Chip. 10, 2032-2045 (2010).
  12. Utada, A. S., Nieves, A. F., Stone, H. A., Weitz, D. A. Dripping to jetting transitions in coflowing liquid streams. Phys. Rev. Lett. 99 (9), 094502(2007).
  13. Cramer, C., Fischer, P., Windhab, E. J. Drop formation in a co-flowing ambient fluid. Chem. Eng. Sci. 59 (15), 3045-3058 (2004).
  14. Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow-focusing" in microchannels. Appl. Phys. Lett. 82, 364-366 (2003).
  15. Takeuchi, S., Garstecki, P., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. An axisymmetric flow-focusing microfluidic device. Adv. Mater. 17 (8), 1067-1072 (2005).
  16. Thorsen, T., Roberts, R. W., Arnold, F. H., Quake, S. R. Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device. Phys. Rev. Lett. 86 (18), 4163-4166 (2001).
  17. Yamashita, H., et al. Generation of monodisperse cell-sized microdroplets using a centrifuge-based axisymmetric co-flowing microfluidic device. J. Biosci. Biotech. 119 (4), 492-495 (2015).
  18. Maeda, K., Onoe, H., Takinoue, M., Takeuchi, S. Controlled synthesis of 3D multi-compartmental particles with centrifuge-based microdroplet formation from a multi-barrelled capillary. Adv. Mater. 24 (10), 1340-1346 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Capillary based Centrifugal Microfluidic DeviceMonodisperse Microdroplet FormationSize controllable MicrodropletsWater in Oil MicrodropletsCentrifugal MicrofluidicsCapillary Orifice ControlMicrodroplet GenerationMicrofluidic Device AssemblyCentrifuge OperationMicrodroplet Size Control

Related Articles