Urządzenia akustofluidyczne wykorzystują fale ultradźwiękowe w kanałach mikroprzepływowych do manipulowania, koncentracji i izolowania zawieszonych mikro i nanoskopowych jednostek. Protokół ten opisuje produkcję i działanie takiego urządzenia obsługującego masowe akustyczne fale stojące w celu skupienia cząstek w centralnym strumieniu bez pomocy płynów osłonowych.
Artykuł metodologiczny
Wytwarzanie i eksploatacja urządzeń akustyczno-przepływowych wspomagających masowe akustyczne fale stojące do bezosłonowego ogniskowania cząstek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Akustoforeza odnosi się do przemieszczenia zawieszonych obiektów w odpowiedzi na siły kierunkowe energii dźwięku. Biorąc pod uwagę, że zawieszone obiekty muszą być mniejsze niż padająca długość fali dźwięku, a szerokość kanałów fluidycznych wynosi zwykle od dziesiątek do setek mikrometrów, urządzenia akustofluidyczne zwykle wykorzystują fale ultradźwiękowe generowane przez przetwornik piezoelektryczny pulsujące z wysokimi częstotliwościami (w zakresie megaherców). Przy charakterystycznych częstotliwościach, które zależą od geometrii urządzenia, możliwe jest wywołanie powstawania fal stojących, które mogą skupiać cząstki wzdłuż pożądanych linii strumienia płynów w przepływie masowym. W tym miejscu opisujemy metodę wytwarzania urządzeń akustycznych z powszechnych materiałów i wyposażenia pomieszczeń czystych. Pokazujemy reprezentatywne wyniki dla ogniskowania cząstek o dodatnim lub ujemnym kontraście akustycznym, które przemieszczają się odpowiednio w kierunku węzłów ciśnieniowych lub antywęzłów fal stojących. Urządzenia te oferują ogromną praktyczną użyteczność do precyzyjnego pozycjonowania dużej liczby mikroskopijnych jednostek (np. komórek) w stacjonarnych lub przepływających płynach do zastosowań od cytometrii po montaż.
Wprowadzenie
Urządzenia akustofluidyczne są wykorzystywane do wywierania sił kierunkowych na obiekty mikroskopowe (np. cząsteczki lub komórki) w celu ich koncentracji, wyrównania, montażu, uwięzienia lub separacji w płynach spoczywających lub laminarnych strumieniach przepływu.1 W ramach tej szerokiej klasy urządzeń siły mogą być generowane przez objętościowe fale stojące, powierzchniowe fale akustyczne stojące (SSAWs)2 lub akustyczne fale bieżące.3 Choć skupiamy się na wytwarzaniu i działaniu urządzeń wykorzystujących objętościowe fale stojące, urządzenia obsługujące SSAWs zyskały ostatnio dużą uwagę ze względu na ich zdolność do precyzyjnego manipulowania komórkami wzdłuż powierzchni4 oraz szybkiego sortowania komórek w kanałach przepływu ciągłego.5 Urządzenia wykorzystujące objętościowe fale stojące przekształcają natomiast rozmieszczenie cząsteczek na podstawie mechanicznych wibracji ścianek urządzenia generowanych przez przetwornik piezoelektryczny, który wzbudza fale stojące w kawitacjach mikrofluidycznych przy geometrycznie zdefiniowanych częstotliwościach rezonansowych. Umożliwia to generowanie wyższych amplitud ciśnienia w porównaniu do urządzeń SSAW, a tym samym szybszy transport akustoforetyczny obiektów mikroskopowych.6
Te fale stojące składają się z przestrzennie okresowego zbioru węzłów i strzałek ciśnienia, których położenie jest stałe, podczas gdy ciśnienie oscyluje w czasie. Cząstki reagują na fale stojące poprzez migrację do węzłów lub strzałek ciśnienia, w zależności od właściwości mechanicznych cząstek w stosunku do płynu, które opisuje czynnik kontrastu akustycznego:
gdzie zmienne ρ i β reprezentują gęstość i ściśliwość oraz indeksy dolne p oraz ƒ reprezentują zawieszony obiekt (np., odpowiednio cząsteczki lub komórki) oraz cieczy.7 Obiekty posiadające dodatni współczynnik kontrastu akustycznego (t. j., ɸ >0) migrują do węzłów ciśnienia; natomiast jednostki posiadające ujemny współczynnik kontrastu akustycznego (t. j., ɸ <0) przemieszczają się do węzłów ciśnienia.7 Podczas gdy większość materiałów syntetycznych (np., kulek polistyrenowych) oraz komórki wykazują dodatkowy kontrast akustyczny, natomiast cząstki elastomeryczne wykonane z materiałów na bazie silikonu,8 cząsteczki tłuszczowe9 lub inne wysokoelastyczne składniki wykazują negatywny kontrast akustyczny w wodzie. Cząstki elastomerowe w urządzeniach akustofluidycznych mogą być wykorzystywane do izolacji małych cząsteczek10 or jako środek do ograniczania cząstek syntetycznych11 lub komórek12 w celu sortowania różnicowego.13
Urządzenia akustofluidyczne są zazwyczaj wytwarzane ze standardowych materiałów (np. krzemu i szkła), które posiadają wystarczającą sztywność, aby utrzymać akustyczną falę stojącą. W wielu urządzeniach akustofluidycznych (w tym w urządzeniu przedstawionym w niniejszej pracy) fale mechaniczne są zaprojektowane tak, aby rezonowały w najniższym trybie harmonicznym, który składa się z fali stojącej o długości półfali obejmującej szerokość mikrokanału. Taka konfiguracja posiada węzeł ciśnienia w centrum kanału oraz strzałki ciśnienia wzdłuż obrzeży kanału. Wykazano wcześniej, że systemy te mogą być wykorzystywane w zastosowaniach cytometrycznych opartych na chipach14-16 oraz w zastosowaniach obejmujących zakres od wychwytywania komórek po ich zagęszczanie.17,18
Opisujemy proces wykonania, metody użytkowania oraz reprezentatywne możliwości wydajnościowe urządzenia akustofluidycznego, które wspiera objętościowe fale akustyczne stojące. Urządzenie to wymaga jednego etapu fotolitografii, jednego etapu trawienia oraz jednego etapu stapiania w celu trwałego połączenia szklanej „pokrywy” z wytrawionym podłożem krzemowym. Zauważamy, że inne urządzenia akustofluidyczne wspierające objętościowe fale akustyczne stojące mogą być wykonane z kapilar szklanych lub kwarcowych połączonych z przetwornikami piezoelektrycznymi, co zostało opisane w innych źródłach.19,20 Urządzenia oparte na krzemie oferują zalety w postaci wytrzymałości oraz kontroli nad geometrią kanału przepływowego, co łącznie umożliwia liczne rodzaje przetwarzania próbek zawierających zawiesiny cząsteczek i komórek. Urządzenia są wielokrotnego użytku, pod warunkiem że są odpowiednio czyszczone pomiędzy zastosowaniami (t.j. poprzez płukanie urządzenia buforami i detergentami).
Protokół
1. Fotolitografia
- Zaprojektuj fotomaskę za pomocą odpowiedniego pakietu oprogramowania i prześlij projekt do wykwalifikowanej drukarki fotomaski. 21
- W pomieszczeniu czystym opłucz 6-calową, jednostronnie polerowaną płytkę krzemową stałym strumieniem acetonu (≥99,5%; patrz Tabela 1), a następnie stałym strumieniem metanolu (99,8%; patrz Tabela 1). Wysuszyć wafel, spryskując go gazemN2 i umieszczając go na płycie grzejnej w temperaturze 95 °C na 2 minuty
UWAGA: Profil domieszkowy i orientacja kryształów płytek nie mają wpływu na następujące procedury. - Chroń koryto na zewnątrz powlekarki wirowej (w standardowym kapturze wirowym), przykrywając arkuszem folii aluminiowej i umieść czystą płytkę Si na środku uchwytu próżniowego w powlekarce wirowej, aby zabezpieczyć wafel.
- Umieść dodatni fotorezystor bezpośrednio na środku płytki, ostrożnie wlewając, aż fotorezystor pokryje większość płytki. Uważaj, aby w fotorezyście nie było pęcherzyków powietrza.
UWAGA: Dokładne procedury w krokach 1.5-1.10 odpowiadają fotorezystorowi przedstawionemu w Tabeli 1; Dla różnych fotorezystorów mogą być wymagane różne procedury. - Rozpocznij cykl wirowania, wykonując następujące procedury:
- Zaprogramuj prędkość 300 obr./min, rampę 100 obr./min / s i czas wirowania 5 sekund, aby rozpocząć cykl wirowania.
- Zaprogramuj na prędkość 1 800 obr./min, rampę 1 000 obr./min / s i czas wirowania 60 sekund, aby równomiernie rozłożyć fotorezystor.
- Zaprogramuj na prędkość 0 obr./min, rampę 1,000 obr./min / s i czas wirowania 0 s, aby zakończyć cykl wirowania.
- Zwolnij podciśnienie na uchwycie i użyj pęsety do wafli, aby wyjąć wafel z uchwytu. Następnie umieść wafel na gorącej płycie, aby piec w temperaturze 110 °C przez 165 sek.
UWAGA: Ten krok jest określany jako "miękkie pieczenie". - Załaduj fotomaskę do uchwytu wyrównywacza maski/maszyny do fotolitografii.
- Edytuj parametry maszyny fotolitograficznej, aby zapewnić dawkę energii 1,400 mJ/cm2 (np. dla intensywności wyjściowej 13,5 mW/cm2 użyj czasu naświetlania ∼103,7 s).
- Wyjąć wafel z fotowzorem z uchwytu i umieścić go w roztworze odpowiedniego wywoływacza (patrz Tabela 1) na 5 minut.
- Wyjmij wafel z wywoływacza, umyj go stałym strumieniem dejonizowanegoH2Oi osusz gazemN2.
UWAGA: Nadmierne wywołanie może spowodować pęcznienie wzorów, podczas gdy niedostateczne rozwinięcie może spowodować niepełne usunięcie fotorezystu wzdłuż cech fotowzorów. - Sprawdź płytkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że wzory wydrukowane na fotomasce zostały przeniesione do fotorezystu.
2. Głębokie reaktywne trawienie jonowe
- Załaduj fotowzorzystą płytkę Si do komory przyrządu do głębokiego reaktywnego trawienia jonowego i wytraw kanały płynowe w płytce Si na żądaną głębokość, postępując zgodnie ze standardowymi procedurami trawienia. 22 Rozdział 22
- Ostrożnie wyładuj próbkę z komory po zakończeniu procesu trawienia.
- Aby usunąć nadmiar fotorezystu z płytki, należy przygotować dużą zlewkę z roztworem środka do usuwania fotorezystu (patrz Tabela 1) w dobrze wentylowanym kapturze przeznaczonym do stosowania rozpuszczalnika i umieścić go na płycie grzejnej w temperaturze 65 °C.
- Zanurz wafel w roztworze do usuwania fotorezystu i pozwól mu moczyć się przez 1 godz.
UWAGA: Do usunięcia fotorezystu można użyć różnych roztworów (np. roztwór acetonu (≥99,5%; patrz Tabela 1) może usunąć fotorezystor przez namoczenie przez noc). - Wyjąć wafel z zlewki i przepłukać go naprzemiennymi strumieniami acetonu (≥99,5%; patrz tabela 1) i alkoholu izopropylowego (≥99,7%; patrz tabela 1). Osuszyć wafel gazemN2.
3. Czyszczenie piranii
- W dobrze wentylowanym okapie (przeznaczonym do stosowania kwasów) przygotuj roztwór piranii, dodającH2O2(30,0% wag. w wodzie; patrz tabela 1) do H2SO4 (95,0-98,0%; patrz tabela 1) w stosunku 1:3 w dużej, czystej zlewce.
UWAGA: Roztwory piranii są silnie, są silnym utleniaczem i są bardzo niebezpieczne. Zachowaj szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z roztworami piranii i noś odpowiedni sprzęt ochronny. - Zanurz wafel trawiony jonowo wytrawionymi elementami skierowanymi do góry i pozostaw na 5 minut. Ostrożnie wyjmij wafel i całkowicie spłucz dejonizowanymH2O.
- Ponownie zanurz wafel w roztworze piranii na 2 minuty. Ostrożnie wyjmij wafel i całkowicie spłucz dużą ilością dejonizowanegoH2O.
- W oddzielnym, dobrze wentylowanym kapturze przeznaczonym do stosowania rozpuszczalników umyć wafel stałym strumieniem acetonu (≥99,5%; patrz Tabela 1), a następnie stałym strumieniem metanolu (99,8%; patrz Tabela 1) i wysuszyć wafel gazemN2. Roztwór piranii należy utylizować zgodnie z odpowiednimi procedurami bezpieczeństwa.
4. Przygotuj pokrywkę ze szkła borokrzemianowego
- Za pomocą narzędzia do rysowania wytraw proste linie w szkle borokrzemianowym, aby utworzyć prostokątne segmenty (np. 8 x 4 cm2). Ostrożnie zatrzaśnij szkło, aby odzyskać prostokątne segmenty.
- Weź jeden z tych szklanych segmentów i umieść go na wydrukowanej kopii żądanego wzoru (z rzeczywistymi wymiarami), aby zaznaczyć położenie wlotów i wylotów na szkle czarnym markerem.
- Wywierć otwory wlotowe i wylotowe w szkle borokrzemianowym.
UWAGA: Przez cały czas należy nosić odpowiedni sprzęt ochronny.- Zamocuj wiertło 1/8" w otworze wiertarki. Umieść prostokątny segment szkła na górze płytki aluminiowej z wywierconymi otworami, tak aby oznaczenia na szkle znajdowały się nad otworami w płycie aluminiowej. Przymocuj szkło do płytki Al taśmą.
- Ostrożnie opuść uchwyt podający, aby rozpocząć wiercenie małych otworów w szkle i kontynuuj opuszczanie uchwytu, aż otwór zostanie wykonany przez szkło. Po zakończeniu otworu usuń taśmę i powoli podnieś szkło, aby usunąć proszek szklany. Umieścić szklany proszek w zlewce z wodą i wyrzucić, stosując odpowiednie procedury bezpieczeństwa.
- Ostrożnie osusz szkło chłonną ściereczką, która nie tworzy kłaczków, i postępuj zgodnie z tymi samymi procedurami (kroki 4.3.1-4.3.2), aby wywiercić pozostałe otwory wlotowe i wylotowe.
- Postępuj zgodnie z tą samą procedurą (sekcja 3 powyżej), aby wyczyścić prostokątny segment szkła roztworem piranii.
UWAGA: Roztwory piranii są silnie, są silnym utleniaczem i są bardzo niebezpieczne. Zachowaj szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z roztworami piranii i noś odpowiedni sprzęt ochronny.
5. Klejenie anodowe
- Za pomocą narzędzia do rysowania wytrawić proste linie w płytce krzemowej na obwodzie chipa mikroprzepływowego tak, aby był nieco mniejszy niż prostokątny segment szkła (np. 7 x 3 cm2). Ostrożnie zatrzaśnij wafel wzdłuż wytrawionych linii.
- Przepłukać segment krzemu stałym strumieniem acetonu (≥99,5%; patrz Tabela 1), a następnie stałym strumieniem metanolu (99,8%; patrz Tabela 1). Umieść wafel na płycie grzejnej w temperaturze 95 °C na 2 minuty do wyschnięcia.
- Trzymając wytrawione elementy na segmencie Si skierowanymi do góry, ostrożnie dodaj czyste szkło na górze segmentu Si i upewnij się, że otwory są prawidłowo wyrównane.
- Ostrożnie odwróć segmenty, upewniając się, że otwory są wyrównane. Ponieważ segment szkła jest większy niż segment Si, zabezpiecz oba segmenty taśmą dwustronną, gdzie połowa taśmy zabezpiecza pionowe krawędzie segmentu Si, a druga połowa taśmy zabezpiecza wystające szkło. Następnie ponownie odwróć segmenty tak, aby segment szklany znalazł się na górze, i umieść segmenty na metalowej płycie na płycie grzejnej.
- Ostrożnie dodać drugą metalową płytę (np. stalową) o wystarczająco dużej wadze (tj. co najmniej 5 kg) bezpośrednio na wierzch zmontowanych segmentów szklanych i krzemowych.
UWAGA: Ta metalowa płyta nie powinna stykać się z segmentem Si ani taśmą przewodzącą. - Korzystając z zasilacza wysokonapięciowego, podłącz jeden przewód (zasilanie) do metalowej płyty na górze zmontowanego szkła i segmentów Si, a drugi przewód (uziemienie) do dolnej metalowej płyty.
- Ustaw napięcie na znajdującej się pod spodem płycie grzejnej na 1,000 V. Sprawdź przyłożone napięcie za pomocą multimetru; dociśnij jedną sondę do dolnej płyty, a drugą sondę do górnej płyty.
UWAGA: Wysokie napięcie jest niezwykle niebezpieczne; Uważaj, aby nie dotknąć metalowych płyt ani przewodów połączeniowych. - Pozostaw płytę grzejną w temperaturze 450 °C na 2 godziny, aby szklana "pokrywka" mogła anodowo związać się z podłożem Si. Wróć po 2 godzinach, aby wyłączyć płytę grzejną, wyłącz zasilanie prądem stałym i wyjmij urządzenie z metalowych płyt.
UWAGA: Metalowe płyty będą bardzo gorące podczas i po procesie klejenia, więc pozwól materiałom ostygnąć przez co najmniej 1 godzinę po wyłączeniu płyty grzejnej.
6. Finalizacja urządzenia akustofluidycznego
- Zeskrob powierzchnię szkła brzytwą, aby usunąć brud powstały w wyniku wiązania anodowego i wyczyść powierzchnię szkła acetonem.
- Przygotować arkusz polidimetylosiloksanu (PDMS) o grubości około 5 mm i wyciąć kilka małych, kwadratowych płyt o wymiarach około 10 x 10 mm2 (patrz Tabela 1). 23
- Użyj dziurkacza do biopsji o średnicy 3 mm, aby wyciąć jeden otwór w środku każdej płyty PDMS, aby wprowadzić przez nią silikonową rurkę. Umieść płyty bezpośrednio na otworach w podłożu szklanym i przyklej płyty żywicą epoksydową.
UWAGA: Uważaj, aby nie użyć zbyt dużej ilości kleju, ponieważ spowoduje to zatkanie otworów urządzenia. - Ostrożnie przyklej przetwornik tytanianu cyrkonianu ołowiu (PZT) do segmentu Si z tyłu urządzenia, wyśrodkowany pod mikrokanałem.
- dwa przewody do dwóch obszarów przewodzących na przetworniku PZT. Zadbaj o to, aby przewody były dobrze przymocowane do przetwornika PZT. Włóż silikonową rurkę przez otwory w płytach PDMS i dodaj dodatkowy klej wokół płyt i rurki, aby zabezpieczyć ich mocowanie.
7. Obsługa urządzenia akustycznego
- Bezpiecznie zamontuj urządzenie na stoliku mikroskopu z mikrokanalikiem bezpośrednio pod obiektywem.
UWAGA: Upewnij się, że przetwornik PZT nie styka się ze stolikiem, umieszczając małą wkładkę pod urządzeniem. - Za pomocą znormalizowanych łączników podłącz silikonowe rurki z wylotów urządzenia do strzykawek zamocowanych na pompach strzykawkowych.
UWAGA: Ta konfiguracja jest przeznaczona dla "trybu wypłaty"; Alternatywnie można użyć pomp strzykawkowych do wstrzykiwania próbki do urządzenia. - Umieścić silikonową rurkę prowadzącą do wlotu urządzenia w fiolce zawierającej próbkę płynu (np. zawiesinę kulek lub komórek polistyrenu).
- Umieścić fiolkę zawierającą próbkę płynu na płytce mieszającej, aby w sposób ciągły mieszać próbkę i zapewnić utrzymanie stałego stężenia cząstek lub komórek przez cały czas trwania eksperymentu.
- Podłącz przewody z przetwornika PZT do wyjścia ze wzmacniacza mocy szeregowo z generatorem funkcyjnym. Zaprogramuj ustawienia generatora funkcyjnego (np. napięcie międzyszczytowe i częstotliwość) i monitoruj sygnał wyjściowy ze wzmacniacza za pomocą oscyloskopu. Włącz generator funkcyjny i wzmacniacz mocy, aby rozpocząć uruchamianie przetwornika PZT. 6
- Aby oszacować częstotliwość rezonansową urządzenia, postępuj zgodnie z równaniem c = λ * ƒ, gdzie c to prędkość dźwięku ośrodka (tj. wody), λ to długość fali akustycznej, a ƒ to częstotliwość przetwornika PZT. W przypadku harmonicznej o połowie długości fali (którą pokazujemy w sekcji Reprezentatywne wyniki) szerokość mikrokanału powinna być równa połowie długości fali stojącej.
- Użyj napięcia międzyszczytowego w zakresie 0-50 V.
UWAGA: Wzrost przyłożonego napięcia powoduje większe amplitudy ciśnienia, a co za tym idzie szybszą akustoforezę.
- Włącz mikroskop i upewnij się, że kanał mikroprzepływowy jest wyraźnie ostry.
- Włącz pompę strzykawkową, aby zastosować przepływ i wprowadzić próbkę do urządzenia. Monitoruj jednostki przepływające przez urządzenie za pomocą mikroskopu w trybie fluorescencji.
- Upewnij się, że urządzenie skutecznie skupia cząstki, dostosowując napięcie międzyszczytowe dostarczane do przetwornika PZT w celu modyfikacji amplitudy ciśnienia oraz wykonując przemiatanie częstotliwości w pobliżu oczekiwanej częstotliwości rezonansowej w celu zidentyfikowania empirycznej częstotliwości rezonansowej.
Wyniki
Zaprojektowaliśmy urządzenie akustofluidyczne zawierające rozwidlone wloty, kanał główny o szerokości 300 µm oraz rozwidlony wylot (Rysunek 1A-B). Należy zauważyć, że we wszystkich eksperymentach w niniejszym badaniu wykorzystaliśmy tylko jeden wlot (t.j. w celu uzyskania ogniskowania cząsteczek bez użycia przepływu osłonowego za pomocą akustycznych sił promieniowania), blokując pozostałe wloty za pomocą wyjmowanych korków. Postępując zgodnie z opisanymi powyżej procedurami, skonstruowaliśmy chip o szerokości kanału 313 µm, z błędem wynoszącym ∼4% wynikającym z niedoskonałości procesu mikrofabrykacji (Rysunek 1C-D). Urządzenie pracowało przy częstotliwości wzbudzenia 2,366 MHz w celu wywołania harmonicznej fali stojącej o połowie długości fali.
Do generowania wysokoczęstotliwościowego przebiegu sinusoidalnego w celu wzbudzenia przetwornika PZT wykorzystaliśmy generator sygnałów podłączony do wzmacniacza mocy. Do pomiaru szczytowego napięcia wyjściowego (Vpp) użyliśmy oscyloskopu.pp) generowany z wzmacniacza mocy w celu weryfikacji wierności kształtu i amplitudy sygnału. Przy użyciu pompy strzykawkowej wstrzyknięto najpierw zawiesinę zielonych fluorescencyjnych kulek polistyrenowych z szybkością 100 µl/min bez aktywacji przetwornika PZT jako kontroli negatywnej (Rycina 2A). Następnie wzbudziliśmy urządzenie z częstotliwością 2,366 MHz, aby utworzyć falę stojącą o długości połowy fali w poprzek szerokości mikrokanału (Vpp = 40 V; Rycina 2B). Stwierdzono, że cząstki te, wykazujące dodatni współczynnik kontrastu akustycznego, skupiały się wzdłuż węzła ciśnienia, zgodnie z oczekiwaniami.6 Wstrzyknęliśmy również czerwone fluorescencyjne cząsteczki o ujemnym współczynniku kontrastu akustycznego (t.j., ɸ ≈ −0,88, zsyntetyzowany zgodnie z procesem opisanym wcześniej)8 aby zweryfikować, czy nasze urządzenie może wywołać ich koncentrację wzdłuż węzłów ciśnienia (Rysunek 2C).
Na koniec zbadano stopień ogniskowania cząsteczek o dodatnim współczynniku kontrastu akustycznego dla różnych szybkości przepływu (t.j. od 0 do 1 000 µl/min regulowanych za pomocą pompy strzykawkowej) oraz napięć (t.j. od 0 do 50 Vpp). Dla każdego wariantu doświadczalnego zarejestrowano filmy składające się z 15 klatek. Do pobrania pięciu profili natężenia fluorescencji w poprzek szerokości mikrokanału wykorzystano oprogramowanie ImageJ. Program do obliczeń numerycznych posłużył do wyznaczenia średnich profili natężenia dla każdego wariantu oraz do wygładzenia uśrednionych danych przy użyciu programu filtrującego w linii. Zgodnie z oczekiwaniami, stopień ogniskowania cząsteczek (t.j. definiowany przez szerokość piku fluorescencji, odpowiadającą szerokości strumienia cząsteczek) malał wraz ze wzrostem szybkości przepływu (Ryc. 3A). Stwierdzono również, że stopień ogniskowania cząsteczek wzrastał wraz ze wzrostem przyłożonego napięcia (Ryc. 3B).
Rycina 1: Urządzenie akustofluidyczne wspierające objętościowe stojące fale akustyczne. Widoki schematyczne górnej (A) i dolnej (B) części urządzenia składającego się z trawionego podłoża krzemowego stopionego z „pokrywką” ze szkła borokrzemianowego, bloków polidimetylosiloksanu (PDMS) połączonych z silikonowymi rurkami oraz przetwornika piezoelektrycznego przylutowanego do przewodów przyklejonych do spodu urządzenia. Przedstawiono również fotografie górnej (C) i dolnej (D) części urządzenia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Akustyczne ogniskowanie cząsteczek o dodatnich i ujemnych współczynnikach kontrastu akustycznego. (A) Przed aktywacją przetwornika z cyrkonu i tytanu ołowianego (PZT), cząsteczki o dodatnim współczynniku kontrastu akustycznego (10 µm, żółto-zielone kuleksy polistyrenowe) przepływające z prędkością 100 µl/min zajmowały całą szerokość mikrokanału. (B) Po aktywacji przetwornika PZT (Vpp = 40 V oraz ƒ = 2.366 MHz), cząsteczki z (A) ogniskują się wzdłuż węzła ciśnienia fali stojącej. (C) Cząsteczki o ujemnym współczynniku kontrastu akustycznego ogniskują się wzdłuż strzałek ciśnienia fali stojącej w przypadku braku przyłożonego przepływu (Vpp = 40 V oraz ƒ = 2.366 MHz). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Wydajność ogniskowania urządzenia akustofluidycznego. Wykresy intensywności fluorescencji kulek polistyrenowych (pokazanych na Rycini 2A-B) przedstawiono dla (A) różnych szybkości przepływu (w zakresie od 0 do 1,000 μl/min) przy stałym napięciu szczyt-szczyt 40 V oraz (B) różnych przyłożonych napięć (w zakresie od 0 do 50 Vpp) przy stałej szybkości przepływu 100 µl/min. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Akustoforeza oferuje proste i szybkie podejście do precyzyjnego rozmieszczenia mikroskopijnych elementów w mikrokanałach płynowych bez konieczności stosowania płynów osłonowych stosowanych w hydrodynamicznych podejściach do ogniskowania. 24 Urządzenia te mają kilka zalet w porównaniu z innymi metodami manipulacji cząstkami lub komórkami (np. magnetoforezą25,26, dielektroforezą27 lub wymuszaniem inercyjnym28) ze względu na ich zdolność do przetwarzania elementów bez wysokiej podatności magnetycznej, polaryzacji elektrycznej lub wąskiej dyspersji. Co więcej, węzły skupiające akustycznej fali stojącej mogą być umieszczone daleko od źródła wzbudzenia, co nie jest możliwe przez statyczne pola magnetyczne lub elektryczne, zgodnie z twierdzeniem Earnshawa. 29 Dodatkową zaletą jest to, że urządzenia akustyczne mogą skupiać cząstki w szerokim zakresie stosowanych natężeń przepływu i niezależnie od kierunku przepływu, co nie jest możliwe w urządzeniach, które skupiają się na siłach bezwładności,28 zapewniając środki do efektywnego transportu cząstek lub komórek w celu lepszej kontroli cząstek w zastosowaniach takich jak cytometria przepływowa i wymiarowanie cząstek. 30,31 Łatwość produkcji i obsługi urządzenia może bezpośrednio pozwolić na wdrożenie podobnych urządzeń do ogniskowania, zagęszczania, frakcjonowania i sortowania obiektów zawieszonych w płynach. Rozdział 32
Wykazaliśmy, że pierwotne siły promieniowania, które są najsilniejszymi siłami wytwarzanymi przez akustyczne fale stojące,1 mogą skupiać mikrocząstki przepływające przez kanał mikroprzepływowy z natężeniem przepływu przekraczającym 10 ml/h dla konstrukcji z pojedynczym otworem. Dla stałego natężenia przepływu 100 μl/min pokazujemy, że nasze urządzenie może skupiać cząstki w wąskiej linii strumienia (tj. o średnicy 50 μm) bez żadnych płynów osłonowych przy napięciach tak niskich jak 20 V od szczytu do szczytu, umożliwiając metodę niskiej mocy do grupowego ogniskowania 10 milionów cząstek/min podczas przetwarzania gęsto stężonych roztworów (np. 6 x 108 cząstek/ml), na przykład. Co więcej, przepustowość tę można znacznie zwiększyć, wytwarzając wielootworowe układy akustofluidyczne lub kanały, które są uruchamiane wyższymi harmonicznymi w celu wytworzenia zestawów równoległych węzłów. 33 Rozdział 33
Chociaż przedstawione tutaj urządzenie wymaga jedynie materiałów i metod stosowanych w konwencjonalnej mikroprodukcji, podkreślamy, że istnieje kilka innych technik, które można wykorzystać do budowy podobnych urządzeń. 19,34,35 Do zalet tego podejścia należy jego prostota, a także trwałość końcowego urządzenia.
Kluczowe etapy produkcji tych urządzeń obejmują fotolitografię w celu zdefiniowania geometrii mikrokanału, reaktywne trawienie jonowe w celu uformowania kanału w krzemie oraz wiązanie anodowe w celu stopienia krzemu z przezroczystą "pokrywą" w celu obserwacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Wszystkie te kroki wymagają pomieszczeń czystych, aby uniknąć gromadzenia się kurzu lub zanieczyszczeń w urządzeniu. Jednak po wykonaniu tych czynności połączenie przetwornika PZT i portów płynowych jest stosunkowo proste i można je wykonać poza czystym pomieszczeniem.
Jednak odpowiednie obchodzenie się z urządzeniem jest niezbędne dla jego długowieczności. Obejmuje to (1) inkubację urządzenia z odczynnikami pasywacyjnymi (np. poli(glikolem etylenowo-silanowym)) przed każdym doświadczeniem w celu ochrony kanału przed gromadzeniem się pozostałości oraz (2) przepłukiwanie urządzenia detergentami po każdym doświadczeniu. Nagromadzenie zanieczyszczeń może zagrozić wierności akustycznej fali stojącej i może zmniejszyć zdolność do efektywnego skupiania cząstek lub komórek w urządzeniu. Zauważamy również, że urządzenia te nie nadają się dobrze do próbek o wysokiej polidyspersji lub próbek zawierających jednostki zbliżające się do połowy wielkości fali stojącej.
Urządzenia akustofluidyczne zapewniają ogromną użyteczność w różnych zastosowaniach, od montażu koloidalnego po separację komórek i cytometrię przepływową. Zdolność do precyzyjnego przetwarzania próbek biologicznych przy dużych natężeniach przepływu może pozwolić na zwiększenie przepustowości przez te urządzenia mikroprzepływowe, przy jednoczesnym zmniejszeniu kosztów związanych ze zbędnymi odczynnikami, dużymi objętościami próbek lub nieporęcznymi urządzeniami do dozowania płynów osłonowych. Metody wytwarzania wymagane do produkcji urządzeń akustycznych są proste, a procedury wymagane do ich działania są przyjazne dla użytkownika. Mamy nadzieję, że procedury te zachęcą do powszechnego rozwoju podobnych urządzeń, aby katalizować nowe obszary badań do zastosowań w materiałoznawstwie, biotechnologii i medycynie.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez National Science Foundation (poprzez granty DMR-1121107, CMMI-1363483 i Graduate Research Fellowships (GRF-1106401) dla C.W.S., D.F.C. i K.A.O.) oraz National Institutes of Health (R21GM111584). Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Wafle krzemowe | Addison Engineering, Inc. | 3P1 | 6-calowy mechaniczny wafel krzemowy < 111 |
| >AZ 9260 photoresist | MicroChemicals GmbH | AZ9260-Q | Dodatni fotorezystor |
| AZ 400K deweloper | MicroChemicals GmbH | AZ400K CONC-CS | Rozcieńczyć 1 część AZ 400k w 4 częściach dejonizowanych H2O |
| H2O2 | Sigma Aldrich, Co. | 216763 | 30% wag. w H2O |
| H2SO4 | Sigma Aldrich, Co. | 320501 | Odczynnik ACS, 95,0-98,0% |
| 1165 Środek do usuwania fotorezystu | Dow Chemical, Co. | DEM-10018073 | na bazie 1-metylo-2-pirolidynonu |
| Sigma Aldrich, Co. | 320110 | Odczynnik ACS, ≥ 99,5% | |
| Alkohol izopropylowy | Sigma Aldrich, Co. | W292907 | ≥ 99,7%, FCC, FG |
| Metanol | Sigma Aldrich, Co. | 322415 | Szkło borokrzemianowe, 99,8% |
| (szkło Nexterion B) | Schott AG | 2098576 | Rozmiar: 120 x60 ± 0,1 mm Grubość: 1 ± 0,005 mm |
| Wiertło do szkła i ceramiki | McMaster-Carr, Inc. | 2954A1 | Rozmiar wiertła: 1/8" Długość całkowita: 2 3/16" Średnica trzpienia: 7/64" |
| Zestaw polidimetylosiloksanu (PDMS) | Sigma Aldrich, Co. | 761036 | Dow Corning, Co.; ul. Sylgard 184®; 10 g clip-pack |
| Dziurkacz do biopsji | Ted Pella, Inc. | 15078 | Harris uni-core Średnica końcówki: 3,0 mm Końcówka OD: 3,40 mm |
| Przetwornik tytanianu cyrkonianu ołowiu (PZT) | APC International, Ltd. | Na zamówienie, (841 WFB) | Długość: 30.0 mm, Szerokość: 5.0 mm, Częstotliwość: 2.46 MHz, 2.0 mm Owijka końcowa do przewodów |
| Rurki silikonowe | Instrument Cole'a Parmera, Co. | 07625-22 | Średnica wewnętrzna 0,6 mm |
| Koraliki polistyrenowe | Thermo Fischer Scientific, Inc. | F-8836 | 10 &mikro; m fluorescencja żółto-zielona |
Bibliografia
- Laurell, T., Petersson, F., Nilsson, A. Chip integrated strategies for acoustic separation and manipulation of cells and particles. Chem Soc Rev. 36 (3), 492-506 (2007).
- Ding, X., et al. Surface acoustic wave microfluidics. Lab Chip. 13 (18), 3626-3649 (2013).
- Schmid, L., Weitz, D. A., Franke, T. Sorting drops and cells with acoustics: acoustic microfluidic fluorescence-activated cell sorter. Lab Chip. 14 (19), 3710-3718 (2014).
- Guo, F., et al. Controlling cell-cell interactions using surface acoustic waves. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (1), 43-48 (2015).
- Li, P., et al. Acoustic separation of circulating tumor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (16), 4970-4975 (2015).
- Gao, L., et al. Two-dimensional spatial manipulation of microparticles in continuous flows in acoustofluidic systems. Biomicrofluidics. 9 (1), 014105(2015).
- Bruus, H. Acoustofluidics 7: The acoustic radiation force on small particles. Lab Chip. 12 (6), 1014-1021 (2012).
- Shields, C. W. IV, et al. Nucleation and growth synthesis of siloxane gels to form functional, monodisperse, and acoustically programmable particles. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (31), 8070-8073 (2014).
- Petersson, F., Nilsson, A., Holm, C., Jonsson, H., Laurell, T. Separation of lipids from blood utilizing ultrasonic standing waves in microfluidic channels. Analyst. 129 (10), 938-943 (2004).
- Cushing, K. W., et al. Elastomeric negative acoustic contrast particles for affinity capture assays. Anal Chem. 85 (4), 2208-2215 (2013).
- Johnson, L. M., et al. Elastomeric microparticles for acoustic mediated bioseparations. J Nanobiotechnology. 11, 22(2013).
- Shields, C. W. IV, Johnson, L. M., Gao, L., Lopez, G. P. Elastomeric negative acoustic contrast particles for capture, acoustophoretic transport, and confinement of cells in microfluidic systems. Langmuir. 30 (14), 3923-3927 (2014).
- Shields, C. W. IV, Reyes, C. D., Lopez, G. P. Microfluidic cell sorting: a review of the advances in the separation of cells from debulking to rare cell isolation. Lab Chip. 15, 1230-1249 (2015).
- Goddard, G., Martin, J. C., Graves, S. W., Kaduchak, G. Ultrasonic particle-concentration for sheathless focusing of particles for analysis in a flow cytometer. Cytometry A. 69 (2), 66-74 (2006).
- Goddard, G. R., Sanders, C. K., Martin, J. C., Kaduchak, G., Graves, S. W. Analytical Performance of an Ultrasonic Particle Focusing Flow Cytometer. Anal Chem. 79 (22), 8740-8746 (2007).
- Goddard, G., Kaduchak, G. Ultrasonic particle concentration in a line-driven cylindrical tube. J Acoust Soc Am. 117 (6), 3440(2005).
- Lenshof, A., Magnusson, C., Laurell, T. Acoustofluidics 8: applications of acoustophoresis in continuous flow microsystems. Lab Chip. 12 (7), 1210-1223 (2012).
- Carugo, D., et al. A thin-reflector microfluidic resonator for continuous-flow concentration of microorganisms: a new approach to water quality analysis using acoustofluidics. Lab Chip. 14 (19), 3830-3842 (2014).
- Austin Suthanthiraraj, P. P., et al. One-dimensional acoustic standing waves in rectangular channels for flow cytometry. Methods. 57 (3), 259-271 (2012).
- Wiklund, M., Nilsson, S., Hertz, H. M. Ultrasonic trapping in capillaries for trace-amount biomedical analysis. J App Phys. 90 (1), 421(2001).
- Shields, C. W. IV, et al. Field-directed assembly of patchy anisotropic microparticles with defined shape. Soft Matter. 9 (38), 9219(2013).
- Yeom, J., Wu, Y., Selby, J. C., Shannon, M. A. Maximum achievable aspect ratio in deep reactive ion etching of silicon due to aspect ratio dependent transport and the microloading effect. J Vac Sci Technol B Microelectron Nanometer Struct Process Meas Phenom. 23 (6), 2319(2005).
- McDonald, J. C., Whitesides, G. M. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices. Acc Chem Res. 35 (7), 491-499 (2002).
- Golden, J. P., Justin, G. A., Nasir, M., Ligler, F. S. Hydrodynamic focusing--a versatile tool. Anal Bioanal Chem. 402 (1), 325-335 (2012).
- Hejazian, M., Li, W., Nguyen, N. T. Lab on a chip for continuous-flow magnetic cell separation. Lab Chip. 15 (4), 959-970 (2015).
- Shields, C. W. IV, Livingston, C. E., Yellen, B. B., Lòpez, G. P., Murdoch, D. M. Magnetographic array for the capture and enumeration of single cells and cell pairs. Biomicrofluidics. 8 (4), 041101(2014).
- Voldman, J. Electrical forces for microscale cell manipulation. Annu Rev Biomed Eng. 8, 425-454 (2006).
- Di Carlo, D. Inertial microfluidics. Lab Chip. 9 (21), 3038-3046 (2009).
- Earnshaw, S. On the nature of the molecular forces which regulate the constitution of the luminferous ether. Trans Camb Phil Soc. 7, 97-112 (1842).
- Piyasena, M. E., Graves, S. W. The intersection of flow cytometry with microfluidics and microfabrication. Lab Chip. 14, 1044-1059 (2014).
- Grenvall, C., Antfolk, C., Bisgaard, C. Z., Laurell, T. Two-dimensional acoustic particle focusing enables sheathless chip Coulter counter with planar electrode configuration. Lab Chip. 14 (24), 4629-4637 (2014).
- Au, A. K., Lee, W., Folch, A. Mail-order microfluidics: evaluation of stereolithography for the production of microfluidic devices. Lab Chip. 14 (7), 1294-1301 (2014).
- Piyasena, M. E., et al. Multinode acoustic focusing for parallel flow cytometry. Anal Chem. 84 (4), 1831-1839 (2012).
- Lenshof, A., Evander, M., Laurell, T., Nilsson, J. Acoustofluidics 5: Building microfluidic acoustic resonators. Lab Chip. 12 (4), 684-695 (2012).
- Evander, M., Tenje, M. Microfluidic PMMA interfaces for rectangular glass capillaries. J Micromech Microeng. 24 (2), 027003(2014).
Przedruki i uprawnienia
