Artykuł metodologiczny

Fluorescencyjne obrazowanie poklatkowe całego cyklu życiowego S. venezuelae przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego

16.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53863

⸱

28 lutego 2016

 ,  , 
1Department of Molecular Microbiology, John Innes Centre, Norwich Research Park, 2Department of Biology, Lund University

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Streptomyces charakteryzują się złożonym cyklem życiowym, który był eksperymentalnie trudny do zbadania za pomocą biologicznych metod komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykonywania fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej całego cyklu życia poprzez hodowlę Streptomyces venezuelae w urządzeniu mikroprzepływowym.

Streszczenie

Obrazowanie procesów biologicznych na poziomie pojedynczej komórki na żywych komórkach było kluczowe dla naszego obecnego zrozumienia subkomórkowej organizacji komórek bakteryjnych. Jednak zastosowanie mikroskopii poklatkowej do badania procesów biologicznych komórek leżących u podstaw rozwoju zarodnikujących bakterii nitkowatych Streptomyces było utrudnione ze względu na trudności techniczne.

Tutaj prezentujemy protokół do pokonania tych ograniczeń poprzez hodowlę nowego gatunku modelowego, Streptomyces venezuelae, w komercyjnie dostępnym urządzeniu mikroprzepływowym, które jest podłączone do mikroskopu szerokokątnego z odwróconą fluorescencją. W przeciwieństwie do klasycznego gatunku modelowego, Streptomyces coelicolor, S. venezuelae zarodnikuje w cieczy, co pozwala na zastosowanie mikroprzepływowych komór wzrostowych do hodowli i mikroskopowego monitorowania rozwoju komórkowego i różnicowania S. venezuelae w długich okresach czasu. Oprócz monitorowania zmian morfologicznych, czasoprzestrzenne rozmieszczenie znakowanych fluorescencyjnie białek docelowych można również uwidocznić za pomocą mikroskopii poklatkowej. Co więcej, platforma mikroprzepływowa oferuje eksperymentalną elastyczność w zakresie wymiany pożywki hodowlanej, która jest wykorzystywana w szczegółowym protokole do stymulowania zarodnikowania S. venezuelae w komorze mikroprzepływowej. Obrazy całego cyklu życiowego S. venezuelae są pozyskiwane w określonych odstępach czasu i przetwarzane w oprogramowaniu open source Fiji w celu wytworzenia filmów z zarejestrowanych szeregów czasowych.

Wprowadzenie

Streptomycety to bytujące w glebie bakterie, które charakteryzują się złożonym cyklem rozwojowym obejmującym różnicowanie morfologiczne od wielokomórkowego, poszukującego składników odżywczych mycelium do uśpionych, unigenomicznych przetrwalników 1-3.

W sprzyjających warunkach wzrostu typowa przetrwalnik Streptomyces zaczyna kiełkować poprzez wydłużanie jednej lub dwóch rurek kiełkowych (Rycina 1). Rurki te wydłużają się poprzez wzrost wierzchołkowy i przekształcają w rozgałęzioną sieć strzępek zwaną grzybnią wegetatywną. Wzrost polarny oraz rozgałęzianie się strzępek jest kierowane przez niezbędne białko DivIVA. To białko o strukturze zwiniętej spirali (coiled-coil) jest częścią dużego kompleksu cytoplazmatycznego zwanego polarysomem, który ma kluczowe znaczenie dla wbudowywania nowego materiału otoczki komórkowej w wydłużającym się wierzchołku 4-7. Podczas wzrostu wegetatywnego włókna strzępkowe ulegają przedziałowaniu poprzez rzadkie tworzenie tak zwanych ścian poprzecznych 8. Tworzenie tych ścian poprzecznych wymaga FtsZ, białka cytoszkieletowego podobnego do tubuliny, które jest niezbędne do podziału komórkowego u większości bakterii 9. Jednak w przypadku Streptomyces te wegetatywne ściany poprzeczne nie prowadzą do przewężenia i oddzielenia komórek, w związku z czym masa grzybni pozostaje siecią połączonych przedziałów syncytialnych. W odpowiedzi na ograniczenie składników odżywczych oraz inne, słabo poznane sygnały, wyspecjalizowane strzępki powietrzne oddzielają się od grzybni wegetatywnej i rosną w powietrze 3. Powstanie tych struktur inicjuje reprodukcyjną fazę rozwoju, podczas której długie, wielogenomowe strzępki powietrzne dzielą się na dziesiątki jednogenomowych przedziałów przetrwalnikowych o jednakowej wielkości. To masowe zdarzenie podziału komórkowego jest napędzane przez synchroniczne przewężenie wielu pierścieni FtsZ w obrębie pojedynczych strzępek sporogennych 2,10. Dyferencjację morfologiczną kończy uwolnienie uśpionych, grubościennych, pigmentowanych przetrwalników.

Schemat cyklu życiowego grzyba: kiełkowanie zarodników, grzybnia wegetatywna, strzępka powietrzna, przegroda sporulacyjna.
Rysunek 1: Streptomyces cykl życiowy na podłożach stałych. Jest to model cyklu życiowego oparty na klasycznych badaniach nad S. coelicolor wzrastanie na płytkach agarowych. Rozwój komórkowy zarodnika rozpoczyna się od utworzenia jednej lub dwóch rurek kiełkowania, które rosną poprzez wydłużanie wierzchołkowe, tworząc sieć rozgałęzionych strzępek. Wzrost polarny i rozgałęzianie się strzępek wegetatywnych jest kierowane przez białko DivIVA (kolor czerwony). Tworzenie wegetatywnych ścian poprzecznych wymaga obecności FtsZ (kolor zielony). W odpowiedzi na ograniczenie dostępności składników odżywczych oraz inne sygnały powstają strzępki powietrzne. Zatrzymanie wzrostu powietrznego jest ściśle skoordynowane ze składaniem się szeregu pierścieni FtsZ, które prowadzą do powstania przegród sporulacyjnych, dzielących strzępki sporogenne na przypominające pudełka przedmiędzykomórki zarodnikowe. W przedmiędzykomórkach tych powstaje gruba ściana zarodnika, a następnie zostają one uwolnione jako dojrzałe, pigmentowane zarodniki.

Kluczowe zdarzenia rozwojowe w cyklu życiowym Streptomyces są dobrze scharakteryzowane 1,3. Brakuje jednak badań biologii komórki z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej time-lapse, które dostarczyłyby wglądu w subkomórkowe procesy leżące u podstaw różnicowania, takie jak dynamika lokalizacji białek, ruch chromosomów oraz kontrolowany rozwojowo podział komórek. Obrazowanie żywych komórek podczas rozwoju Streptomyces było trudne ze względu na złożoność cyklu życiowego i charakterystykę fizjologiczną tego organizmu. W poprzednich badaniach nad wzrostem wegetatywnym i początkowymi etapami septacji podczas sporulacji stosowano przepuszczalne dla tlenu komory obrazowania lub hodowlę Streptomyces coelicolor na podłożu z agarozy na stole mikroskopu 1-15. Metody te są jednak ograniczone przez szereg czynników. Niektóre systemy umożliwiają jedynie krótkotrwałe obrazowanie wzrostu komórkowego i białek fluorescencyjnych, zanim komórki ucierpią z powodu niewystarczającej podaży tlenu lub wyrosną poza płaszczyznę ogniskowania ze względu na trójwymiarowy wzorzec rozwoju strzępek. W przypadkach, gdy możliwe jest długoterminowe obrazowanie, hodowla komórek na podkładkach agarowych ogranicza elastyczność eksperymentalną, ponieważ komórki nie mogą być poddane alternatywnym warunkom wzrostu lub stresu, a fluorescencja tła pochodząca z medium w podkładkach agarowych znacznie ogranicza możliwość monitorowania słabszych sygnałów fluorescencyjnych.

W niniejszej pracy opisujemy protokół obrazowania żywych komórek w całym cyklu życiowym Streptomyces z doskonałą precyzją i czułością. Dzięki hodowli Streptomyces w urządzeniu mikrofluidycznym połączonym z mikroskopem fluorescencyjnym z oświetleniem szerokopolowym (Rysunek 2), jesteśmy w stanie monitorować kiełkowanie, wzrost wegetatywny i septację podczas sporulacji w okresie do 30 hr. Jest to znacznie ułatwione dzięki zastosowaniu nowego organizmu modelowego Streptomyces venezuelae, ponieważ sporuluje on niemal całkowicie w kulturze zanurzonej, co pozwala przełamać ograniczenia klasycznego gatunku modelowego S. coelicolor, który sporuluje wyłącznie na podłożach stałych 16-20. Aby pomóc w wizualizacji wzrostu wegetatywnego i sporulacji, współwyrażamy wersje z fluorescencyjnymi znacznikami marker polarności komórkowej DivIVA oraz kluczowego białka podziału komórkowego FtsZ.

Stosujemy dostępny w sprzedaży układ mikroprzepływowy, który z powodzeniem wykorzystywano w badaniach nad prątkami, Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis oraz drożdże 21-25System ten więzi komórki w pojedynczej płaszczyźnie ogniskowej i umożliwia kontrolę ciągłej perfuzji pożywki hodowlanej z różnych zbiorników. W szczegółowym protokole wykorzystujemy tę funkcję, aby poddać działaniu *S. venezuelae* grzybnię wegetatywną do ograniczenia dostępności składników odżywczych w celu promowania sporulacji.

Opisany protokół służy do obrazowania żywych komórek w całym cyklu życiowym Streptomyces, jednak można wybrać alternatywne warunki hodowlane lub ustawienia mikroskopu, jeśli szczególnym zainteresowaniem objęte są konkretne stadia rozwojowe.

Schemat układu mikrofluidycznego do przygotowania próbek, hodowla S. venezuelae, analiza optyczna w programie Fiji.
Rysunek 2: Schemat przedstawiający przebieg prac eksperymentalnychPrzedstawiono trzy główne etapy opisane w protokole. Po pierwsze, z kultury w fazie stacjonarnej przygotowuje się zarodniki oraz zużyte podłoże. Po drugie, świeże zarodniki wprowadza się do systemu mikroprzepływowego i S. venezuelae obrazuje się przez cały cykl rozwojowy, wykorzystując w pełni zautomatyzowany mikroskop odwrócony z komorą inkubacyjną w celu utrzymania optymalnej temperatury wzrostu. Po trzecie, uzyskana seria obrazów time-lapse jest analizowana i przetwarzana przy użyciu oprogramowania otwartoźródłowego Fiji.

Protokół

1. Izolacja świeżych zarodników S. venezuelae i przygotowanie zużytej pożywki hodowlanej

  1. Zaszczepić 30 ml pożywki z ekstraktem z drożdży maltozowych i ekstraktu słodowego (MYM), uzupełnioną 60 μl roztworu pierwiastków śladowych R2 (TE), 10 μl zarodników szczepu SV60 [attBφBT1::p SS209 (PdivIVA-divIVA-mcherry PftsZ-ftsZ-ypet)]. W celu zapewnienia stałego wzrostu i zarodnikowania komórek należy użyć kolby z przegrodą lub kolby zawierającej sprężynę, aby umożliwić wystarczające napowietrzenie.
  2. Komórki hodowlane przez 35-40 godzin w temperaturze 30 °C i 250 obr./min.
  3. Zbadaj komórki za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym montowanym w cieczy. W tym momencie widoczne będą fragmenty grzybni i zarodniki.
  4. Odwirować 1 ml komórek w wirówce stołowej o sile 400 x g przez 1 minutę, aby osadzać grzybnię i większe fragmenty komórek.
  5. Przenieść około 300 μl supernatantu zawierającego zawiesinę zarodników do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i przechowywać na lodzie. Zachowaj pozostałą pożywkę hodowlaną na krok 1.7.
  6. Rozcieńczyć zarodniki w stosunku 1:20 w MYM-TE (końcowe stężenie: 0,5-5 x 107 zarodników/ml) i przechowywać na lodzie do momentu uzyskania potrzebnego (patrz krok 2.3).
    Uwaga: Chociaż dokładne warunki, które wywołują zarodnikowanie u Streptomyces, nie są zrozumiałe, użycie zużytej pożywki MYM-TE, w tym wszelkich nieznanych sygnałów zewnątrzkomórkowych z kultury zarodnikowej, stymuluje zarodnikowanie.
  7. Przefiltrować i wysterylizować 10 ml pozostałej pożywki hodowlanej, aby uzyskać zużyty MYM-TE, który jest wolny od zarodników i fragmentów grzybni. Użyj sterylnego filtra strzykawkowego 0,22 μm i przenieś zużyty MYM-TE do sterylnej probówki o pojemności 15 ml.
  8. Przygotowany zużyty MYM-TE należy przechowywać przez kilka dni w temperaturze 4 °C, jeżeli mają być przeprowadzone dodatkowe doświadczenia z zastosowaniem podobnych warunków wzrostu.

2. Przygotowanie urządzenia mikroprzepływowego

Uwaga: Każda płytka mikroprzepływowa umożliwia przeprowadzenie do czterech niezależnych eksperymentów. Aby uniknąć zanieczyszczenia nieużywanych komór przepływowych, podczas przygotowywania eksperymentu należy używać sterylnych roztworów i warunków pracy.

  1. Usunąć roztwór transportowy z płytki mikroprzepływowej i przepłukać studzienki sterylnym MYM-TE.
  2. Dodać 300 μl MYM-TE do studzienki wlotowej 1 i 300 μl zużytego MYM-TE do studzienek od 2 do 6.
  3. Załadować 40 μl rozcieńczonych zarodników z kroku 1.6 do studzienki ładowania komórek 8 na torze "A" i uszczelnić kolektor do płytki zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Uruchom oprogramowanie sterujące mikrofluidyką, wybierz odpowiedni typ płytki i skonfiguruj program przepływu, aby zalać kanał przepływowy i komorę hodowlaną poprzez przepływ medium ze studzienek wlotowych od 1 do 5 pod ciśnieniem 6 psi przez 2 minuty na studzienkę.
  5. W oprogramowaniu sterującym mikrofluidyką utwórz protokół przepływu dla eksperymentu: przepływ MYM-TE z dołka wlotowego 1 przez 6 godzin, aby umożliwić kiełkowanie i wzrost wegetatywny komórek. Następnie przełącz się na perfuzję zużytego MYM-TE z dołka 2 do 5 na pozostały czas eksperymentu. W trakcie eksperymentu utrzymuj ciśnienie przepływu na stałym poziomie 6 psi (co odpowiada około 9 μl pożywki/godz.). Uruchom program przepływu po kroku 3.5.

3. Konfiguracja mikroskopu i protokołu poklatkowego

Uwaga: Ta metoda została zaimplementowana na w pełni zmotoryzowanym i zautomatyzowanym mikroskopie szerokokątnym z odwróconym polem, wyposażonym w kamerę sCMOS, lampę metalohalogenkową, sprzętowy autofokus, uchwyt na płytki 96-dołkowe i komorę środowiskową.

  1. Wcześniej podgrzej komorę środowiskową do 30 °C, aby zapobiec problemom z autofokusem po rozpoczęciu eksperymentu. Wymagany czas zależy od zastosowanej komory środowiskowej, mikroskopu i systemu grzewczego. Rozpocznij podgrzewanie systemu w noc poprzedzającą eksperyment.
  2. Włącz oprogramowanie do automatyzacji i sterowania mikroskopem i mikroskopem. Aby uzyskać optymalne zbieranie sygnału i rozdzielczość przestrzenną, należy użyć obiektywu immersyjnego z olejkiem o dużej aperturze numerycznej (NA), takiego jak obiektyw DIC z olejem 100X, 1,46 NA. Wybierz odpowiednie filtry i lustra dichromatyczne, aby uzyskać obrazy różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) oraz obrazy fuzji białek żółto-fluorescencyjnych i czerwono-fluorescencyjnych.
  3. Umieść kroplę olejku immersyjnego na obiektywie i dodaj płyn immersyjny na dno okienka obrazowania na płytce mikroprzepływowej, aby poprawić ostrość komórek podczas akwizycji obrazu. Ostrożnie zamontuj szczelne urządzenie mikroprzepływowe (krok 2.5) na stoliku mikroskopu odwróconego. Upewnij się, że płytka jest bezpiecznie umieszczona w stage uchwyt i nie przesuwa się w trakcie eksperymentu.
  4. Ustaw ostrość w oknie obrazowania komory hodowli mikroprzepływowej, używając wbudowanych znaczników pozycji w celu orientacji. Ustaw ostrość na skrajnej lewej części pierwszej komory przepływowej (oznaczonej "A") z pułapką o rozmiarze 5, odpowiadającym wysokości pułapki 0.7 μm.
  5. W oprogramowaniu mikrofluidycznym załaduj komórki ze studzienki wlotowej 8 pod ciśnieniem 4 psi przez 15 sekund. Sprawdź gęstość komórek w komorze hodowlanej, przesuwając stolik po oknie obrazowania. Jeśli żadne zarodniki nie zostały uwięzione, powtórz etap ładowania komórek lub alternatywnie zwiększ ciśnienie ładowania i/lub czas ładowania do osiągnięcia pożądanej gęstości komórek (1-10 zarodników na okno obrazowania o wymiarach 2,048 x 2,048 pikseli). Unikaj przeciążania komory hodowlanej.
    Uwaga: Zwykle używamy pułapki o rozmiarze 5 do obrazowania Streptomyces, ale uzyskaliśmy również dobre wyniki z pułapkami o rozmiarach 4 i 3. Zapoznaj się z instrukcją dostawcy, aby uzyskać dodatkowe sugestie dotyczące optymalizacji procesu ładowania ogniw.
  6. Uruchom program przepływu w oprogramowaniu sterującym od kroku 2.5 i pozwól płytce mikroprzepływowej na zrównoważenie cieplne przez 1 godzinę na etapie mikroskopu przed rozpoczęciem akwizycji obrazu.
  7. W oprogramowaniu sterującym mikroskopem skonfiguruj wielowymiarową akwizycję, aby wykonać wiele obrazów w różnych pozycjach etapu w czasie:
    1. Dla automatycznego zapisywania: określ katalog do automatycznego zapisywania plików obrazów.
    2. W przypadku ustawień oświetlenia określ wcześniej optymalne ustawienia oświetlenia dla każdej konkretnej konstrukcji. Do opisanego eksperymentu użyj następujących czasów ekspozycji: DIC 150 ms, YFP 250 ms, RFP 100 ms.
    3. W przypadku szeregów czasowych: skonfiguruj szereg czasowy, aby uzyskać obrazy w żądanych punktach czasu w sekwencji. Aby zobrazować cykl życiowy S. venezuelae, wybierz 40-minutowy przedział czasu w okresie 24 godzin.
    4. Dla pozycji stolika i autofokusa: zeskanuj komorę hodowlaną, przesuwając stolik i zapisz pozycje stolika dla każdej pozycji obrazowania, która Cię interesuje. Upewnij się, że pozycje pojedynczego stopnia są wystarczająco oddalone od siebie, aby zminimalizować fotowybielanie i fototoksyczność. Zazwyczaj używa się do 12 pozycji. Uruchom procedurę autofokusa dla każdego punktu czasowego, aby skorygować powolny dryf ogniskowej. Jeśli jest to dostępne w oprogramowaniu sterującym mikroskopem, ustaw strategię autofokusa na "lokalna aktualizacja powierzchni przez sprzętowy autofokus". Po zweryfikowaniu współrzędnych Z wybranych pozycji stolika aktywuj sprzętowy autofokus.
  8. Rozpocznij eksperyment poklatkowy w oprogramowaniu sterującym mikroskopem.
  9. Sprawdź, czy wszystkie pozycje stołu montażowego są nadal ostre w późniejszych punktach. W przypadku eksperymentów poklatkowych trwających kilka godzin od czasu do czasu obserwujemy dryf sceny nawet podczas korzystania z autofokusa. Jeśli pozycje stolika muszą zostać ponownie ustawione na ostrości, zatrzymaj eksperyment w odpowiednim punkcie czasowym, dostosuj ostrość i uruchom ponownie eksperyment w zdefiniowanym przedziale czasu obrazowania (krok 3.7.3). Zobacz krok 4.3, aby dowiedzieć się, jak połączyć szeregi czasowe.
  10. Przerwij akwizycję obrazu po 24-30 godzinach lub gdy strzępki w obszarze zainteresowania zróżnicują się w zarodniki (patrz seria zdjęć DIC). Zatrzymaj program przepływu w oprogramowaniu i zdemontuj urządzenie mikroprzepływowe.
  11. Przygotuj zużytą płytkę mikroprzepływową do krótkotrwałego przechowywania. Usunąć pozostały MYM-TE i zużyty MYM-TE z dołka 1 do 6, opróżnić studzienkę na odpady 7 i studzienkę załadowczą komory 8. W sterylnych warunkach należy ponownie napełnić zużyte studzienki na pasie "A" i studzienki nieużywanych pasów ("B" do "D") na płytce sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Uszczelnić płytkę parafilmem, aby zapobiec jej wysychaniu i przechowywać w temperaturze 4 °C.

4. Generowanie filmów poklatkowych za pomocą oprogramowania Fidżi

Uwaga: Zwracamy uwagę, że dostępne są różne komercyjne i darmowe pakiety oprogramowania do przetwarzania obrazów z mikroskopii poklatkowej, w tym ZenBlue, Metamorph, ICY, ImagePro lub ImageJ. Tutaj skupiamy się na Fidżi, który jest programem do przetwarzania obrazów o otwartym kodzie źródłowym opartym na ImageJ, który zapewnia już szereg przydatnych wstępnie zainstalowanych wtyczek.

  1. Przenieś dane obrazowania z eksperymentu poklatkowego do komputera z zainstalowanym Fidżi.
  2. Uruchom program i zaimportuj plik obrazowania za pomocą "File>Import>Bio-Formats" lub po prostu przeciągając plik obrazowania na Fidżi. W "Opcjach importu formatów biologicznych" zaznacz pole "podziel kanały", aby uzyskać osobny stos obrazów dla każdego kanału oświetlenia (DIC, RFP, YFP).
  3. Opcjonalnie: Aby scalić oddzielne szeregi czasowe wynikające z przerwy w akwizycji obrazu spowodowanej ponownym ustawieniem ostrości (krok 3.9), otwórz odpowiednie stosy obrazów i uruchom "Image>Stacks>Tools>Concatenate" dla każdego kanału (DIC, RFP, YFP).
  4. Oceń jakość danych poklatkowych, przewijając stosy obrazów. Szukaj strzępek, które pozostały w centrum uwagi przez długi czas, pokazują wzrost grzybni i ostatecznie tworzą zarodniki (stos DIC). Zbadaj oczekiwaną lokalizację subkomórkową dla DivIVA-mCherry na końcach strzępek (stos RFP) i FtsZ-YPet tworzących pojedyncze pierścienie lub wiele struktur drabinkowych odpowiednio w strzępkach wegetatywnych lub sporogennych (stos YFP).
  5. Wyodrębnij obszar zainteresowania do dalszego przetwarzania obrazów. Mikroskopia poklatkowa często tworzy duże pliki, które mogą spowolnić przetwarzanie przez Fidżi. Dlatego zaleca się zidentyfikowanie i wyizolowanie obszaru zainteresowania (ROI) oraz wykonanie dalszych kroków przetwarzania obrazu na tej mniejszej wersji stosu obrazów.
    1. Wybierz narzędzie "Zaznaczanie prostokątne" w menu i narysuj prostokątny zwrot z inwestycji w stosie obrazów DIC w taki sposób, aby rozwijające się strzępki były otoczone przez ROI w całej serii obrazów.
    2. Zduplikowany stos ROI za pomocą "Ctrl"+"Shift"+"D".
    3. Kliknij pasek nazwy stosu obrazów YFP i wybierz "Edytuj>Wybór>Przywróć zaznaczenie" w menu, aby przywrócić poprzednie prostokątne zaznaczenie z oryginalnego stosu DIC do tej samej pozycji w stosie YFP i zduplikować ROI za pomocą "Ctrl" + "Shift" + "D".
    4. Powtórz ten proces dla stosu zapytania ofertowego.
  6. Wyrównaj obrazy w trzech stosach obrazów, aby usunąć dryfy stołu montażowego w płaszczyźnie xy w czasie. Przewiń do ostatniej klatki w stosie DIC i wybierz z menu "Plugin>Registration>StackReg> RigedBody". Powtórz ten krok dla zapytania ofertowego i stosu obrazów YFP. W razie potrzeby przytnij ROI, powtarzając kroki 4.5.1-4.5.3.
  7. Opcjonalnie: Dostosuj jasność i kontrast ręcznie dla każdego stosu obrazów za pomocą narzędzia "Dostosuj jasność i kontrast" ("Ctrl" + "Shift" + "C") lub wybierz z menu "Proces>Zwiększ kontrast" i zastosuj polecenie "Normalizuj" do wszystkich obrazów w stosie. Należy zauważyć, że to ostatnie polecenie zmieni wartości pikseli, a zatem może wpłynąć na dalszą analizę obrazu.
  8. Opcjonalnie: Połącz poszczególne stosy (przekonwertowane do formatu pliku RGB, patrz 4.11) poziomo lub pionowo za pomocą wtyczki "Image>Stacks>Tools>Combine".
  9. Dodaj pasek skali ("Analyze>Tools>Scale Bar") i znacznik czasu ("Image>Stacks>Time Stamper").
  10. Zapisz zmodyfikowane stosy obrazów jako sekwencję obrazów w formacie ".tiff". Aby utworzyć film, zapisz go jako ".avi". Alternatywnie można wyeksportować serie obrazów w formacie QuickTime za pomocą wtyczki "Bio-Formats>Bio-Formats Exporter" i wybrać typ pliku ".mov".
  11. Aby uzyskać zdjęcia z pojedynczych ramek, wybierz interesującą Cię ramkę i zduplikuj obraz "Ctrl"+"Shift"+"D". Zmień typ wynikowego obrazu na "RGB" lub "8-bitowy" w sekcji "Image>Type>RGB kolor lub 8-bitowy" i zapisz obraz jako ".tiff".
    Uwaga: Fiji oferuje szereg dodatkowych funkcji do dalszego dodawania adnotacji lub przetwarzania serii poklatkowych. Przejdź do strony pomocy technicznej online Fidżi, aby uzyskać szczegółowe informacje (http://fiji.sc/Fiji).

Wyniki

Pomyślne obrazowanie żywych komórek w całym cyklu życiowym S. venezuelae pozwala na uzyskanie ciągłej serii czasowej obejmującej kluczowe etapy rozwojowe: kiełkowanie, wzrost wegetatywny i sporulację (Rysunek 3, Film 1). Wizualizacja postępu cyklu życiowego jest dodatkowo ułatwiona dzięki odmiennej lokalizacji subkomórkowej białek DivIVA-mCherry i FtsZ-YPet. Podczas kiełkowania i wzrostu wegetatywnego białko DivIVA-mCherry gromadzi się wyłącznie na rosnących wierzchołkach strzępek lub oznacza nowo powstające punkty rozgałęzień (Rysunek 4A). Wyniki te są zgodne z wcześniej opisaną lokalizacją subkomórkową DivIVA 12,26. W przeciwieństwie do niego, FtsZ-YPet tworzy pojedyncze struktury pierścieniowate w nieregularnych odstępach w rosnącej grzybni (Rysunek 4B). Struktury te stanowią rusztowanie dla syntezy niezwężających się wegetatywnych ścian poprzecznych, co prowadzi do powstania połączonych przedziałów strzępkowych 8. Różnicowanie komórkowe rosnących strzępek w strzępki sporogenne staje się widoczne poprzez zanik polarnych ognisk DivIVA-mCherry, zatrzymanie wzrostu polarnego i towarzyszący temu wzrost fluorescencji FtsZ-YPet (Rysunek 4C). W strzępkach sporulujących wzorzec lokalizacji FtsZ-YPet zmienia się gwałtownie; najpierw helikalne filamenty FtsZ-YPet przemieszczają się wzdłuż strzępki, a następnie, w nagłym, niemal jednoczesnym zdarzeniu, helisy te zlewają się w drabinę regularnie rozmieszczonych pierścieni FtsZ-YPet. W opisanych tutaj warunkach eksperymentalnych równomiernie rozłożone drabiny FtsZ-YPet utrzymują się przez około 2 hr. Ostatecznie przegrody sporulacyjne stają się widoczne w obrazach kontrastu interferencyjnego (DIC) (Rysunek 4D), a w końcu uwalniane są nowe przetrwalniki.

Poniższy protokół opisujący przetwarzanie obrazów przy użyciu oprogramowania Fiji zawiera szczegółowe wyjaśnienie krok po kroku, jak przygotować film do publikacji z pozyskanej serii time-lapse (Film 1).

Time-lapse cyklu życiowego drobnoustrojów; kiełkowanie, wzrost, sporulacja; seria obrazów mikroskopowych.
Rycina 3: Zdjęcia z reprezentacyjnej serii mikroskopii fluorescencyjnej time-lapse przedstawiające S. venezuelae produkcja znakowanych fluorescencyjnie białek FtsZ (zielone) i DivIVA (czerwone). Przedstawiono wybrane klatki z nałożonych obrazów (panel górny: RFP-YFP-DIC, panel dolny: DIC), wizualizujące Streptomyces cykl życiowy obejmujący kiełkowanie, wzrost wegetatywny i sporulację. Obrazy pobrano z Filmu 1. Czas podano w formacie godz:min. Paski skali = 5 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces podziału komórkowego; lokalizacja białek DivIVA-mCherry i FtsZ-YPet; obrazy fluorescencyjne, mikroskopia.
Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki udanej serii obrazowania poklatkowego (time-lapse) dla Streptomyces cykl życiowy (A) Lokalizacja DivIVA-mCherry. Przedstawiono migawki z dwóch kolejnych punktów czasowych z Filmu 1 z nałożonymi obrazami kanałów RFP i DIC. DivIVA-mCherry znakuje miejsca powstawania nowych odgałęzień strzępek (pełna główka strzałki) i lokalizuje się wierzchołku strzępki, aby kierować wzrost polarny (pusta główka strzałki). Pasek skali = 10 µm (B) Lokalizacja FtsZ-YPet podczas wzrostu wegetatywnego (grot strzałki). FtsZ-YPet tworzy pojedyncze struktury pierścieniowate (panel górny), które nie ulegają zwężeniu (DIC, panel dolny). (C) lokalizacja FtsZ-YPet (zielony) podczas wrzecionowania procesu sporulacji. Punkty DivIVA-mCherry przedstawiono na czerwono, a upływ czasu wskazano poniżej (godz:min). Pasek skali: 5 µm. (D) Odpowiadające obrazy DIC sporulujących strzępek z (C), ukazujące tworzenie się przedzarodnikowych przedziałów z widocznymi przegrodami sporulacyjnymi (obraz po lewej), które ostatecznie dojrzewają do postaci łańcucha zarodników (obraz po prawej). Czas podano w formacie godz:min. Pasek skali = 5 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Mikroskopia fluorescencyjna, struktura komórkowa, porównanie, barwienie zielone/czerwone, badanie obrazowania komórkowego.
Film 1: Seria obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej time-lapse przedstawiająca Streptomyces venezuelae cykl życiowy Film składa się z połączonych obrazów RFP-YFP (po lewej) oraz odpowiadających im obrazów z kontrastu różnicowego (DIC, po prawej). DivIVA-mCherry przedstawiono kolorem czerwonym, a FtsZ-YPet kolorem zielonym. Odstęp czasu między poszczególnymi klatkami wynosi 40 min. Pasek skali = 10 µm. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film.

Dyskusja

Mikroskopia poklatkowa cyklu życiowego Streptomyces była w przeszłości wyzwaniem technicznym. Tutaj przedstawiamy solidny protokół do wykonywania obrazowania żywych komórek w całym cyklu życia przy użyciu fuzji białek fluorescencyjnych z markerem polaryzacji komórki DivIVA i białkiem podziału komórki FtsZ, aby pomóc w wizualizacji i śledzeniu postępu w programie rozwojowym (ryc. 2).

Kluczowe znaczenie dla tej metody ma hodowla S. venezuelae w urządzeniu mikroprzepływowym, które umożliwia stałą perfuzję pożywki i wymianę normalnej pożywki (MYM-TE) na zużytą pożywkę (zużytą MYM-TE). Zmiana warunków hodowli jest ważna dla opisanego protokołu, ponieważ przesunięcie w dół wartości odżywczych, jak również wszelkie jeszcze niezidentyfikowane sygnały zewnątrzkomórkowe (np. sygnały quorum sensing) w zużytej pożywce hodowlanej, sprzyjają zarodnikowaniu, podczas gdy ciągłe dostarczanie pożywki bogatej w składniki odżywcze stymuluje wzrost wegetatywny przy prawie zerowym tworzeniu się zarodników (dane nie pokazane). W związku z tym hodowla komórek w tym systemie mikroprzepływowym jest lepsza niż hodowla komórek na agarozie, ponieważ oferuje większą elastyczność eksperymentalną i umożliwia długoterminowe monitorowanie zmian we wzroście bakterii w odpowiedzi na zmieniające się warunki hodowli. Chociaż płytki mikroprzepływowe są przeznaczone wyłącznie do jednorazowego użytku, kanały przepływowe, które nie zostały zaszczepione komórkami, mogą być wykorzystane w kolejnych eksperymentach. Zalecamy użycie wszystkich kanałów płytki mikroprzepływowej w ciągu tygodnia, ponieważ doświadczyliśmy problemów z uszczelnieniem kolektora do płytek, które były otwarte przez dłuższy czas.

Podczas przygotowywania eksperymentu stwierdziliśmy, że świeżo przygotowane zarodniki kiełkowały w ciągu dwóch godzin od załadowania do komory przepływowej, podczas gdy zarodniki pochodzące z zamrożonego bulionu glicerolu wymagały co najmniej 6 godzin, zanim pojawiły się rurki zarodkowe (dane nie pokazane). To opóźnienie w kiełkowaniu wydłuża czas trwania eksperymentu i może zakłócać dostępność sprzętu i warunki eksperymentu. Ważne jest również, aby rozpocząć eksperyment od perfuzji MYM-TE przez co najmniej 3 godziny, aby zapewnić wystarczającą ilość składników odżywczych do rozwoju i wzrostu jajowodów. Perfuzja z MYM-TE może być przedłużona poza początkowe 3 godziny, jeśli eksperyment ma na celu badanie wzrostu wegetatywnego. Podczas gdy zarodniki stanowią preferowany wybór materiału wyjściowego, krótkie fragmenty strzępek mogą być również ładowane do płytki mikroprzepływowej. Jednakże, wydajność ładowania przy użyciu ściętej grzybni jest znacznie niższa i często wymaga kilku przebiegów ładowania, co może stanowić ograniczenie podczas badania mutantów niezarodnikujących. Niezależnie od rodzaju użytego inokulum, ważne jest, aby nie przeciążać komory hodowlanej zarodnikami lub fragmentami strzępek, ponieważ doprowadzi to do szybkiego przeludnienia, które może zakłócać dyfuzję pożywki i komplikować analizę obrazu.

Ważne jest, aby starannie zaplanować budowę białek reporterowych do wykorzystania we fluorescencyjnym obrazowaniu poklatkowym u Streptomyces. Długość łącznika między białkiem docelowym a reporterem fluorescencyjnym oraz wybór fuzji N- lub C-końcowych może mieć kluczowe znaczenie. Ponadto optymalne warunki eksperymentalne, w tym częstotliwość obrazowania i czas ekspozycji, muszą być określone z wyprzedzeniem dla każdego białka znakowanego fluorescencyjnie. Strzępki S. venezuelae wykazują autofluorescencję w kanale zielono-żółtym, która może stać się problematyczna podczas obrazowania znakowanego fluorescencyjnie białka, które ulega ekspresji na niskich poziomach. Ponadto należy zauważyć, że podczas kiełkowania i początkowej fazy wzrostu wegetatywnego S. venezuelae jest szczególnie wrażliwy na światło o krótkiej długości fali (np. podczas stosowania fuzji białek z CFP).

Pomimo ciągłego postępu w technikach obrazowania i fluorescencyjnych systemach reporterowych do obrazowania żywych komórek bakterii, większość pakietów oprogramowania (np. MicrobeTracker, Schnitzelcells, CellProfiler) do późniejszego automatycznego przetwarzania tego rodzaju zestawów danych nie obsługuje analizy obrazów pochodzących od bakterii nitkowatych o wielokomórkowym stylu życia 27-29. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania odpowiedniego algorytmu do ilościowej wysokoprzepustowej analizy danych obrazowych z Streptomyces i innych bakterii nitkowatych.

Podsumowując, opisana tutaj praca pokazuje ogromny potencjał S. venezuelae jako nowego modelowego systemu rozwojowego dla rodzaju, ze względu na jego zdolność do zarodnikowania w cieczy. Urządzenie do hodowli mikroprzepływowej jest proste w użyciu nawet dla niedoświadczonych użytkowników. Stanowi doskonałą platformę do badania procesów biologicznych komórek kluczowych dla cyklu życiowego Streptomyces , w tym dynamicznej lokalizacji białek, spolaryzowanego wzrostu i morfologicznego różnicowania się grzybni wielokomórkowej w łańcuchy jednogenomicznych zarodników. Ponadto ten zestaw eksperymentalny stanowi również kuszący punkt wyjścia do zbadania zdarzeń w rozwoju, które wymagają naprzemiennych warunków hodowli lub użycia barwników fluorescencyjnych, takich jak fluorescencyjne D-aminokwasy do monitorowania syntezy peptydoglikanu lub jodku propidyny i 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) do wizualizacji organizacji chromosomów 30,31.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Grantowi Calderowi za pomoc techniczną przy mikroskopie, Mattowi Bushowi za komentarze na temat protokołu, oraz Centrum Johna Innesa za zakup mikroskopu szerokokątnego Zeiss. Praca ta została sfinansowana z grantu BBSRC BB/I002197/1 (dla M.J.B.), z grantu BBSRC Institute Strategic Programme Grant BB/J004561/1 dla Centrum Johna Innesa, z grantu Szwedzkiej Rady ds. Badań Naukowych 621-2010-4463 (dla K.F.) oraz z Leopoldina Postdoctoral Fellowship (dla S.S.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
B04A CellAsic Płytka ONIX do komórek bakteryjnychMerck-MilliporeB04A-03-5PKPłytki do hodowli mikroprzepływowych
CellAsic ONIX Microfluidic Perfusion System i ONIX FG (wersja 5.0.2)Merck-MilliporeEV-262Najnowszą wersję ONIX (lipiec 2015) oraz instrukcję korzystania z programu można znaleźć tutaj: http://www.merckmillipore.com
Mikroskop Axio Observer.Z1Zeiss431007-9902-000W pełni zautomatyzowany i zmotoryzowany odwrócony mikroskop szerokokątny
Inkubator XL multi S1 z modułem temperatury S1 i jednostką grzewczą XL S2Zeiss411857-9061-000Komora środowiskowa otaczająca mikroskop
Plan-Apochromat 100x/1.46 Olej DIC obiektywZeiss420792-9800-000
Ocra FLASH 4 V2Hamamatsu Photonics K.K.C11440-22CU
Oświetlacz HXP 120VZeiss423013-9010-000
FL Zestaw filtrów 46 HE YFP Shift FreeZeiss489046-9901-000Zestaw filtrów fluorescencyjnych, wzbudzenie 500/25 nm, emisja 535/30 nm
FL Zestaw filtrów 63 HE RFP shift freeZeiss489063-0000-000Zestaw filtrów fluorescencyjnych, wzbudzenie 572/25 nm, emisja 629/30 nm
Ramka montażowa K-M do multiwell talerzeZeiss000000-1272-644Uchwyt stolika do płytki mikroprzepływowej
ZEN pro 2012Zeiss410135-1002-120Oprogramowanie sterujące mikroskopem
Moduł ZEN Upływ czasuZeiss410136-1031-110Moduł oprogramowania do konfiguracji eksperymentów z mikroskopią poklatkową
Moduł ZEN Kafelki/PozycjeZeiss410136-1025-110Moduł oprogramowania do zapisywania określonych pozycji stolika (xzy)
Pakiet oprogramowania open sourcez Fidżihttp://fiji.sc/FijiGeneracja filmów poklatkowych
Maltose-Yeast Exctract-Malt Extract (MYM)
4 g Maltoza
4 g Ekstrakt drożdżowy
10 g Ekstrakt słodowy
dodać 1 l H2O, używając 50% wody z kranu i 50% wody z odwróconej osmozy, i uzupełnić 200 ml roztworu pierwiastka śladowego R2 na 100 ml po autoklawowaniu		Pożywka zarodnikowa używana do hodowli S. venezuelae SV60
R2 Roztwór pierwiastków śladowych (TE)
8 mg ZnCl2
40 mg FeCl3-6H2O
2 mg CuCl2-2H2O
2 mg MnCl2-4H2O
2 mg Na2B4O7-10H2O
2 mg ( NH4)6Mo7O24-4H2O
dodać 200 ml autoklawu H2o
i przechowywać w temperaturze 4 oC		Dodać 0,002 objętości do MYM
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)SigmaP4417-100TABSłuży do napełniania studni wlotowych nieużywanych torów w płytkach B04A w celu przygotowania płytki do krótkotrwałego przechowywania.
0,22 &mikro; m filtry strzykawkoweSatorius stedim16532-KPrzygotowanie zużytego szczepu MYM-TE
SV60John Innes Centre strain collectionS. venezuelae szczep wykazujący ekspresję divIVA-mcherry i ftsZ-ypet

Bibliografia

  1. Bush, M. J., Tschowri, N., Schlimpert, S., Flärdh, K., Buttner, M. J. c-di-GMP signalling and the regulation of developmental transitions in streptomycetes. Nat. Rev. Microbiol. 13, 749-760 (2015).
  2. Jakimowicz, D., van Wezel, G. P. Cell division and DNA segregation in Streptomyces.: how to build a septum in the middle of nowhere? Mol. Microbiol. 85, 393-404 (2012).
  3. McCormick, J. R., Flärdh, K. Signals and regulators that govern Streptomyces development. FEMS Microbiol. Rev. 36, 206-231 (2012).
  4. Flärdh, K., Richards, D. M., Hempel, A. M., Howard, M., Buttner, M. J. Regulation of apical growth and hyphal branching in Streptomyces. Curr. Opin. Microbiol. 15, 737-743 (2012).
  5. Hempel, A. M., et al. The Ser/Thr protein kinase AfsK regulates polar growth and hyphal branching in the filamentous bacteria Streptomyces. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 109, E2371-E2379 (2012).
  6. Fuchino, K., et al. Dynamic gradients of an intermediate filament-like cytoskeleton are recruited by a polarity landmark during apical growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, E1889-E1897 (2013).
  7. Holmes, N. A., et al. Coiled-coil protein Scy is a key component of a multiprotein assembly controlling polarized growth in Streptomyces. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, E397-E406 (2013).
  8. McCormick, J. R., Su, E. P., Driks, A., Losick, R. Growth and viability of Streptomyces coelicolor. mutant for the cell division gene ftsZ. Mol. Microbiol. 14, 243-254 (1994).
  9. Margolin, W. FtsZ and the division of prokaryotic cells and organelles. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 862-871 (2005).
  10. Grantcharova, N., Lustig, U., Flärdh, K. Dynamics of FtsZ assembly during sporulation in Streptomyces coelicolor A3(2). J. Bacteriol. 187, 3227-3237 (2005).
  11. Richards, D. M., Hempel, A. M., Flärdh, K., Buttner, M. J., Howard, M. Mechanistic basis of branch-site selection in filamentous bacteria. PLoS Comput. Biol. 8, e1002423(2012).
  12. Hempel, A. M., Wang, S. B., Letek, M., Gil, J. A., Flärdh, K. Assemblies of DivIVA mark sites for hyphal branching and can establish new zones of cell wall growth in Streptomyces coelicolor. J. Bacteriol. 190, 7579-7583 (2008).
  13. Wolanski, M., et al. Replisome trafficking in growing vegetative hyphae of Streptomyces coelicolor A3(2). J. Bacteriol. 193, 1273-1275 (2011).
  14. Jyothikumar, V., Tilley, E. J., Wali, R., Herron, P. R. Time-lapse microscopy of Streptomyces coelicolor.growth and sporulation. Appl. Environ. Microbiol. 74, 6774-6781 (2008).
  15. Willemse, J., Borst, J. W., de Waal, E., Bisseling, T., van Wezel, G. P. Positive control of cell division: FtsZ is recruited by SsgB during sporulation of Streptomyces. Genes. Dev. 25, 89-99 (2011).
  16. Glazebrook, M. A., Doull, J. L., Stuttard, C., Vining, L. C. Sporulation of Streptomyces venezuelae. in submerged cultures. J. Gen. Microbiol. 136, 581-588 (1990).
  17. Bibb, M. J., Domonkos, A., Chandra, G., Buttner, M. J. Expression of the chaplin and rodlin hydrophobic sheath proteins in Streptomyces venezuelae.is controlled by sigma(BldN) and a cognate anti-sigma factor, RsbN. Mol. Microbiol. 84, 1033-1049 (2012).
  18. Al-Bassam, M. M., Bibb, M. J., Bush, M. J., Chandra, G., Buttner, M. J. Response regulator heterodimer formation controls a key stage in Streptomyces development. PLoS Genet. 10, e1004554(2014).
  19. Bush, M. J., Bibb, M. J., Chandra, G., Findlay, K. C., Buttner, M. J. Genes required for aerial growth, cell division, and chromosome segregation are targets of WhiA before sporulation in Streptomyces venezuelae. MBio. 4, e00684-e00613 (2013).
  20. Tschowri, N., et al. Tetrameric c-di-GMP mediates effective transcription factor dimerization to control Streptomyces development. Cell. 158, 1136-1147 (2014).
  21. Mirouze, N., Ferret, C., Yao, Z., Chastanet, A., Carballido-Lòpez, R. MreB-Dependent Inhibition of Cell Elongation during the Escape from Competence in Bacillus subtilis. PLoS Genet. 11, e1005299(2015).
  22. Zopf, C. J., Maheshri, N. Acquiring fluorescence time-lapse movies of budding yeast and analyzing single-cell dynamics using GRAFTS. J. Vis. Exp. (e50456), (2013).
  23. Meniche, X., et al. Subpolar addition of new cell wall is directed by DivIVA in mycobacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111, E3243-E3251 (2014).
  24. Donovan, C., Schauss, A., Kramer, R., Bramkamp, M. Chromosome segregation impacts on cell growth and division site selection in Corynebacterium glutamicum. PLoS One. 8, e55078(2013).
  25. Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. Response of Escherichia coli. growth rate to osmotic shock. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111, 7807-7812 (2014).
  26. Flärdh, K. Essential role of DivIVA in polar growth and morphogenesis in Streptomyces coelicolor A3(2). Mol. Microbiol. 49, 1523-1536 (2003).
  27. Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. High-throughput subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics. Mol. Microbiol. 80, 612-627 (2011).
  28. Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nat. Protoc. 7, 80-88 (2012).
  29. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100(2006).
  30. Kuru, E., Tekkam, S., Hall, E., Brun, Y. V., Van Nieuwenhze, M. S. Synthesis of fluorescent D-amino acids and their use for probing peptidoglycan synthesis and bacterial growth in situ. Nat. Protoc. 10, 33-52 (2015).
  31. Szafran, M., et al. Topoisomerase I (TopA) is recruited to ParB complexes and is required for proper chromosome organization during Streptomyces coelicolor. sporulation. J. Bacteriol. 195, 4445-4455 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device
Posted by JoVE Editors on 7/01/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

The author's name was updated from:

Mark Buttner

to:

Mark J. Buttner

Tagi

Streptomyces venezuelaemikroskopia fluorescencyjnaseptacja sporulacjilokalizacja bia ekkie kowaniewzrost wegetatywnyr nicowanie przetrwalnik woprogramowanie Fijimikroskop odwr cony
Fluorescencyjne obrazowanie poklatkowe całego cyklu życiowego S. venezuelae przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.