Method Article

Protokół autoradiografii receptorów do miejscowej wizualizacji receptorów angiotensyny II

DOI:

10.3791/53866

⸱

June 7th, 2016

 ,  ,  , 
1Farquhar College of Arts and Sciences, Nova Southeastern University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Nova Southeastern University, 3School of Medicine, University of Colorado

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół opisujący lokalizację receptorów angiotensyny II typu 1 w mózgu szczura za pomocą ilościowej, densytometrycznej autoradiografii receptorów in vitro przy użyciu analogu angiotensyny II, znakowanego jodem-125.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje wzorce wiązania receptora dla angiotensyny II (Ang II) w mózgu szczura za pomocą radioligandu specyficznego dla receptorów Ang II do przeprowadzenia autoradiograficznego mapowania receptorów.

Próbki tkanek są pobierane i przechowywane w temperaturze -80 °C. Kriostat służy do koronalnego cięcia tkanki (mózgu) i rozmrażania skrawków na naładowanych szkiełkach. Skrawki tkanek montowane na szkiełku są inkubowane w 125I-SI-Ang II w celu znakowania radioizotopem receptorów Ang II. Sąsiednie szkiełka rozdziela się na dwa zestawy: "niespecyficzne wiązanie" (NSP) w obecności stężenia nasycającego receptor nieznakowanego radioaktywnie Ang II lub selektywnego antagonisty receptora Ang II podtypu AT1 Ang II (AT1R) oraz "całkowite wiązanie" bez antagonisty AT1R. W buforze inkubacyjnym występuje również stężenie nasycające antagonisty podtypu AT2 Ang II (AT2R) (PD123319, 10 μM) w celu ograniczenia wiązania 125I-SI-Ang II z podtypem AT1R. Podczas 30-minutowej inkubacji wstępnej w temperaturze ~22 °C, szkiełka NSP są poddawane działaniu 10 μM PD123319 i losartanu, podczas gdy szkiełka "całkowitego wiązania" są poddawane działaniu 10 μM PD123319. Szkiełka są następnie inkubowane z 125I-SI-Ang II w obecności PD123319 w celu "całkowitego wiązania" oraz PD123319 i losartanu dla NSP w buforze testowym, a następnie kilka "płukań" w buforze i wodzie w celu usunięcia soli i niespecyficznie związanego radioligandu. Szkiełka są suszone za pomocą suszarek, a następnie poddawane działaniu filmu autoradiograficznego za pomocą specjalistycznej folii i kasety. Film jest wywoływany, a obrazy są skanowane do komputera w celu densytometrii wizualnej i ilościowej przy użyciu zastrzeżonego systemu obrazowania i arkusza kalkulacyjnego. Dodatkowy zestaw szkiełek jest barwionowany tioniną w celu porównań histologicznych.

Zaletą korzystania z autoradiografii receptorowej jest możliwość wizualizacji receptorów Ang II in situ, w obrębie przekroju próbki tkanki, oraz anatomicznej identyfikacji obszaru tkanki poprzez porównanie go z sąsiednim histologicznym odcinkiem referencyjnym.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroby układu krążenia nadal są główną przyczyną zgonów i niepełnosprawności w Stanach Zjednoczonych, powodując ponad 30% zgonów w USA w 2011 roku1. Najnowsze statystyki American Heart Association wskazują, że więcej niż jedna osoba na trzy cierpi na jeden lub więcej rodzajów chorób sercowo-naczyniowych. Badania sercowo-naczyniowe nadal czynią postępy w kierunku zrozumienia tej choroby, ale ponieważ pokolenia zaczynają się starzeć, konieczne jest kontynuowanie tych wysiłków. Układ renina-angiotensyna (RAS) odgrywa kluczową rolę w regulacji układu sercowo-naczyniowego, głównie poprzez promowanie miażdżycy, stanu zapalnego, ogólnoustrojowego zwężenia naczyń krwionośnych i aktywacji współczulnego układu nerwowego (ryc. 1)2-8.

RAS to system hormonalny, który jest aktywowany, gdy komórki przykłębuszkowe nerki wydzielają reninę do krwiobiegu w odpowiedzi na obniżone ciśnienie krwi, zwiększoną stymulację układu współczulnego lub zmniejszony przepływ sodu przez plamkę gęstą. Renina metabolizuje angiotensynogen (syntetyzowany w wątrobie) do powstania angiotensyny I (Ang I). Ang I jest następnie metabolizowany przez enzym konwertujący angiotensynę (ACE), ektoenzym po stronie światła komórek śródbłonka naczyń krwionośnych, głównie w płucach i nerkach, tworząc angiotensynę II (Ang II), główny peptyd efektorowy RAS. Ang II jest zdolny do aktywacji dwóch podtypów receptorów; receptor typu 1 (AT1R) i receptor typu 2 (AT2R), które regulują pracę układu sercowo-naczyniowego, utrzymują homeostazę płynów i elektrolitów i są obecnie uważane za wpływające na funkcje poznawcze i procesy chorób neurodegeneracyjnych8,9. Doniesiono, że lokalny, specyficzny dla mózgu RAS niezależnie syntetyzuje Ang II. W mózgu białko prekursorowe angiotensynogen jest syntetyzowane w astrogleju10 przekształcane w Ang I przez enzym podobny do reniny3, prawdopodobnie proreninę związaną z receptorem proreniny11, a następnie przekształcane w Ang II przez enzym konwertujący angiotensynę, który ulega obfitej ekspresji na zewnątrzkomórkowej powierzchni neuronów w mózgu12. Ten wytwarzany wewnątrz mózgu Ang II jest agonistą receptorów mózgu AT1 i AT2, które są izolowane z przenoszonego przez krew Ang II.

Chociaż AT1R odgrywa ważną rolę fizjologiczną, jest lepiej znany ze swoich patofizjologicznych efektów w całym ciele, głównie wpływając na układ sercowo-naczyniowy i nerki (Rysunek 2). Kiedy Ang II wiąże się z AT1R, powoduje zwężenie naczyń krwionośnych; zwiększenie oporu przepływu krwi i podniesienie ciśnienia krwi. Wspomaga również syntezę i wydzielanie aldosteronu i wazopresyny, co prowadzi do zwiększonej retencji sodu i wody. Efekty te mogą również wywoływać niedokrwienne uszkodzenie mózgu i upośledzenie funkcji poznawczych i są związane z chorobą Parkinsona, chorobą Alzheimera i cukrzycą, a także niedawno zidentyfikowano wpływ na uczenie się i pamięć13-15. W RAS występuje pętla sprzężenia zwrotnego, w której AT1R na komórkach przykłębuszkowy w nerce hamuje wydzielanie reniny. Co ciekawe, AT2R ogólnie przeciwreguluje działanie AT1R, powodując między innymi rozszerzenie naczyń krwionośnych, rozrost neurytów, regenerację aksonów, antyproliferację i ochronę mózgu16-20. AT2R został również zidentyfikowany jako cel dla leków przeciwnadciśnieniowych, a ostatnio także przeciwnowotworowych21. Określenie lokalizacji i gęstości receptorów Ang II w różnych tkankach oraz wpływu różnych metod leczenia i stanów chorobowych za pomocą ilościowej densytometrycznej autoradiografii receptorów pomoże odkryć rolę, jaką RAS odgrywa w określonych chorobach.

Autoradiografia receptorów jest stosowana od ponad 30 lat jako skuteczna metoda oznaczania obecności receptorów angiotensyny II i innych składników RAS w mózgu i innych tkankach szczura, myszy, świnki morskiej, psa i człowieka w różnych warunkach eksperymentalnych22-34. Znaczenie lokalizacji receptorów Ang II w mózgu polega na tym, że można zastosować neuroanatomię funkcjonalną do działania Ang II w mózgu, np. obecność AT1R w jądrze przykomorowym podwzgórza (PVN) sugeruje funkcję Ang II w mózgu w celu stymulowania uwalniania wazopresyny, oksytocyny lub hormonu uwalniającego kortykotropinę (CRH), lub aktywacja współczulnego układu nerwowego. Tak więc leki, które blokują AT1R, mogą zmniejszać niektóre z tych efektów za pośrednictwem PVN związanych z nadmierną aktywnością RAS w mózgu. Trwające prace sugerują, że stosowanie antagonistów AT1R może zmniejszać uwalnianie CRH wywołane zespołem stresu pourazowego (PTSD) i łagodzić objawy PTSD (Hurt i wsp., przedłożone do publikacji). PVN, narząd podogonowy (SFO) i ciało migdałowate są znane z regulacji homeostazy, apetytu/pragnienia, snu, pamięci, reakcji emocjonalnych i są obszarami docelowymi tego badania demonstracyjnego. Obszary te badano poprzez pobieranie wycinków koronalnych mózgu na szkiełkach mikroskopowych i traktowanie tych skrawków specyficznymi inhibitorami wraz ze specyficznym radioligandem dla receptorów Ang II. W tym badaniu wymieniono wszystkie materiały i odczynniki wraz z sugerowanymi dostawcami, Jod-125 użyto do znakowania radioaktywnego antagonisty receptora Ang II, sarkozyny1, izoleucyny8 Ang II (SI Ang II), która następnie została oczyszczona jako mono125 I-SI Ang II przy użyciu metod HPLC, jak opisano wcześniej35. Zastosowanie tego radioligandu o wysokiej aktywności specyficznej pozwala na wizualizację obszarów o niskiej, umiarkowanej i wysokiej gęstości receptorów po ekspozycji znakowanych radioaktywnie skrawków na kliszę rentgenowską. Kalibrując film za pomocą wzorców pasty mózgowej zawierających znane ilości jodu-125, można określić ilościowo określoną ilość wiązania receptora Ang II w danym obszarze. W badaniach eksperymentalnych wiązanie receptora Ang II w mózgach osób eksperymentalnych można porównać do tego w mózgach osób z grupy kontrolnej. Może to wskazywać, czy działanie Ang II jest zmienione w odpowiedzi na chorobę genetyczną, nieprawidłowość fenotypową, stan chorobowy lub leczenie farmakologiczne. Wiedza ta może być następnie wykorzystana do opracowania terapii w leczeniu chorób związanych z rozregulowaniem RAS. Alternatywnymi technikami, które identyfikują miejsca wiązania receptorów, ale o zmniejszonej rozdzielczości anatomicznej, są testy wiązania, które wykorzystują preparaty błon tkankowych pochodzące z homogenatów tkankowych, które są inkubowane z radioligandem w zakresie stężeń w celu oceny powinowactwa wiązania radioligandu jako stałej dysocjacji (KD) i maksymalnej zdolności wiązania (Bmax) tkanki będącej przedmiotem zainteresowania.

Opisany tutaj protokół można podzielić na 5 głównych elementów: Przygotowanie skrawków tkanek do autoradiografii receptorów; Autoradiografia receptorów; Ekspozycja i wywołanie filmu; Histologia; i densytometryczna analiza obrazu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach przeprowadzone w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Nova Southeastern University zgodnie z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych, wydanie 8 (The National Academies Press, Waszyngton, DC, 2011).

1. Przygotowanie skrawków tkanek do autoradiografii receptorowej

  1. Po złożeniu w ofierze zbierz świeże tkanki mózgowe, zawiń w folię aluminiową i umieść w zamrażarce o temperaturze -20 °C tak szybko, jak to możliwe. Aby zachować prawidłowy kształt, umieść mózgi w formie mózgowej, która symuluje wnętrze czaszki, zawiń w folię aluminiową i umieść w zamrażarce o temperaturze -20 °C. Po 30 minutach umieść chusteczki w zamykanej torbie do zamrażania i przenieś do zamrażarki o temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.
    1. Pobrać świeżo zamrożoną próbkę tkanki będącą przedmiotem zainteresowania z zamrażarki w temperaturze -80 °C i przenieść do kriostatu ustawionego na minimum -10 °C i maksymalnie -18 °C, aby uniknąć rozmrożenia.
    2. Umieścić próbkę na uchwycie tkankowym za pomocą podłoża do zatapiania na bazie glikolu i żywicy, osadzając w pożywce tylko niewielką część próbki. W przypadku mózgu mózg jest zamontowany pionowo, aby umożliwić sekcję w płaszczyźnie koronalnej.
  2. Umieść uchwyt tkanki na mikrotomie w kriostacie i mocno dokręć. Upewnij się, że lewa i prawa strona mózgu znajdują się w tych samych współrzędnych przednio-tylnych i że oś grzbietowo-brzuszna jest prostopadła do powszechnie używanych atlasów mózgu.
  3. Rozpocznij cięcie z żądaną grubością (zalecane 20 μm) i rozmroź Zamontuj sekcje na szkiełkach mikroskopowych w kierunku pionowym, aby uzyskać większą powierzchnię przestrzeni w szkiełku. Zbierz sekcje na szkiełkach w sekwencyjnych zestawach po pięć, tj. pierwszy zestaw szkiełek jest oznaczony jako 1-1, 1-2, 1-3, 1-4 i 1-5 (rysunek 3).
  4. Po napełnieniu zestawu szkiełek sekcjami pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu do 1 godziny, a następnie umieść szkiełka w plastikowym pudełku na suwaki w samozamykającej się torbie do zamrażania i przechowuj w temperaturze -20 °C.

2. Autoradiografia receptorowa

UWAGA: Radioaktywność. Używaj odzieży ochronnej do radzenia sobie z radioaktywnością. Utylizacja zależy od zakładu, i musi być zgodna z wytycznymi, aby prawidłowo rozkładać się (okres półtrwania 60 dni) lub być odebrany przez certyfikowaną firmę.

  1. Wyjmij interesujące Cię szkiełka "-1" i "-2" z zamrażarki w temperaturze -20 °C i zamontuj w uchwytach ślizgowych (Rysunek 5). Zamontuj szkiełka "-1" razem dla leczenia "niespecyficznego", a szkiełka "-2" dla leczenia "całkowitego". "Niespecyficzne" słoiki będą zawierały 10 μM końcowych stężeń PD123319 antagonisty AT2R i losartanu antagonisty AT1R w buforze pożywki testowej (AM5) (tabela 1), "całkowite" słoiki wiążące będą zawierać tylko 10 μM PD123319 w AM5.
  2. Odwróć uchwyty szkiełka, aby umieścić szkiełka w słoikach z koplinu przed inkubacją wypełnionych 35-40 ml AM5 i odpowiednimi inhibitorami na 30 minut w temperaturze pokojowej. Kolejne serie należy rozpoczynać w kąpieli wstępnej w odstępach 4-minutowych.
  3. Natychmiast przenieść szkiełka z roztworu do inkubacji do szkiełek do inkubacji, zawierających 10 ml AM5 plus z góry określone stężenie 125I-SI-Ang II (obliczone na rysunku 4) z odpowiednimi inhibitorami, przez 60-90 minut w temperaturze pokojowej. Jeśli jest wystarczająca ilość radioligandu, 10 szkiełek można umieścić (tyłem do siebie) w zmodyfikowanych uchwytach szkiełkowych i inkubować ze 125I-SI-Ang II w słoikach z Coplinu.
  4. Umieść szkiełka z powrotem w uchwytach szkiełkowych (w razie potrzeby), osusz i spłucz, delikatnie obracając przez 1-2 sekundy w 400 ml wody destylowanej w dwóch oddzielnych pojemnikach.
  5. Przenieś szkiełka sekwencyjnie do czterech słoików Coplin zawierających 35-40 ml AM5 każdy, dokładnie przez 1 minutę każdy (jak pokazano na rysunku 4).
  6. Po ostatnich 1 minutach płukania delikatnie obracaj sekcje przez 1-2 sekundy w czterech zmianach lodowatej wody destylowanej.
  7. Wysusz szkiełka chłodnym powietrzem (Uwaga: gorące powietrze ulatnia związek radioaktywny) za pomocą czterech suszarek do włosów ustawionych pod różnymi kątami na 4 minuty (Rysunek 5), aż wszystkie sekcje wyschną, a następnie połóż na ręczniku papierowym.
  8. Zamontuj szkiełka z chusteczkami skierowanymi do góry na kartonie w celu nałożenia na film rentgenowski za pomocą taśmy dwustronnej.
  9. Zamontuj co najmniej jedną szkiełko wzorcowe 125 jodu na każdym kartonie (Rysunek 6).
    Uwaga: Wzorce kalibracyjne składają się z pasty mózgowej dokładnie zmieszanej ze 125jodem związanym ze związkiem zawierającym pierścień fenolowy, zagęszczonej przez odwirowanie w strzykawce tuberkulinowej o pojemności 1 ml, które są kriostatem pociętym na te same grubości co skrawki mózgu i rozmrożone na szkiełkach mikroskopowych. Alternatywnie można uzyskać komercyjnie wzorce kalibracyjne 125I z żywicy z tworzywa sztucznego o grubości 20 μm. Żywica z tworzywa sztucznego w tych standardach częściowo chroni folię przed promieniowaniem, tak że przy kalibracji należy uwzględnić równoważność tkankową ~40%.

3. Ekspozycja i wywołanie filmu

  1. Udaj się do ciemni z kasetą rentgenowską z taśmą i filmem do autoradiografii. Otwórz kasetę i umieść w niej karton ze szkiełkami (Rysunek 6).
    1. Wyłącz światła i włącz światło awaryjne. Ostrożnie otwórz pudełko z filmem rentgenowskim, wyjmij jeden film i umieść film błyszczącą stroną do góry (z postrzępioną krawędzią w prawym dolnym rogu) na wierzchu szkiełek w kasecie. Ostrożnie zamknij kasetę i przekręć pręty blokujące, aby uszczelnić światło (Rysunek 6). Szkiełka należy naświetlać przez kilka dni do kilku tygodni w temperaturze -20 °C.
  2. W ciemni otwórz kasetę i kontynuuj proces wywoływania filmu.
    1. Umieść szkiełka w tacach kolejno: wywoływacz na 2 minuty, woda zawierająca 5% lodowatego kwasu octowego przez 30 sekund i utrwalacz przez 5 minut. Folie umieszcza się na tacy z bieżącą wodą na 20 minut, a następnie umieszcza w Photoflo na nie dłużej niż 10 sekund i zawiesza.
      Uwaga: Czas naświetlania jest określany empirycznie i może obejmować wiele filmów o różnych czasach naświetlania: wystarczająco długi, aby uzyskać mierzalne sygnały z obszarów o słabym wiązaniu, ale nie tak długi, aby nasycić film obszarami o wysokim wiązaniu. Po uzyskaniu akceptowalnych ekspozycji przejdź do następnego kroku.

4. Histologia

  1. Przygotować odczynniki do barwienia tioniny i barwienia (Tabela 2, Rysunek 7).
    1. Umieść szkiełka "-3" w stojaku na szkiełka i przenoś w kolejności sekwencyjnej, zaczynając od wody dejonizowanej przez 1 minutę, następnie roztworu barwienia tioniny przez 10 minut, a następnie trzykrotnie zanurz w wodzie dejonizowanej i przemyj jedno 30-sekundowe mycie w wodzie dejonizowanej.
    2. Po wodzie umieść ruszt szkiełkowy w płuczkach z etanolem w następujący sposób: 50%, 70% i 90% na 30 sekund, a następnie wykonaj dwa płukania etanolem w 100% przez 1 minutę każde. Na koniec umieść ruszt do szkiełek w ksylenie na 3 minuty, a następnie przenieś do drugiego roztworu ksylenu na 5 minut.
  2. Wyjmować po jednym szkiełku z ostatniej kąpieli ksylenowej i przykryć górną krawędź szkiełka podstawą z żywicy w podłożu montażowym rozpuszczalnika organicznego, a następnie umieścić szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 mm x 60 mm na szkiełku. Pozostaw slajdy do wyschnięcia na ~48 godzin, a następnie zeskanuj je do komputera w skali szarości 2,400 dpi.

5. Densytometryczna analiza obrazu

  1. Umieść film błyszczącą stroną do dołu, z postrzępioną krawędzią w lewym dolnym rogu i zeskanuj za pomocą zastrzeżonego skanera, który jest w stanie przesyłać informacje o gęstości filmu bez żadnych zniekształceń w komputerze systemu obrazowania.
  2. Otwórz zastrzeżony system obrazowania i wykorzystaj paski kalibracyjne do ustalenia standardów kalibracji dla przyszłej analizy densytometrycznej obrazów na kliszy (rysunki 9-12).
  3. Zmierz obszary zainteresowania, ustanawiając szablon lub empirycznie przedstawiając obszary zainteresowania. Dane są zbierane i rozdzielane na podstawie folii, typu kontrolnego lub dzikiego (sekcja) i regionu. Upewnij się, że w pomiarach uwzględniono gęstość (fmol/g), obszar skanowania i całkowity obszar docelowy (Rysunek 9).
    1. Dostosuj paski obszaru skanowania, upewniając się, że obszar zainteresowania mieści się między parametrami podświetlania (Rysunek 10).
    2. Eksportowanie danych do arkusza kalkulacyjnego (Tabela 4). Pomnóż gęstość razy całkowity obszar docelowy, a następnie podziel przez obszar skanowania, aby uzyskać wartość powiązania tego konkretnego obszaru. Gdy zostanie to zrobione dla wszystkich zmierzonych wartości, należy substratować ustaloną niespecyficzną wartość od całkowitej, aby uzyskać określone wiązanie. Dla tych wartości można również przeprowadzić uśrednienia.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przegląd szlaku metabolicznego układu renina-angiotensyna jest pokazany na rysunku 1, a bezpośrednie skupienie się na podtypach receptora angiotensyny II (AT1R i AT2R) jest opisane na rysunku 2. Rycina 3 przedstawia przeniesienie koronalnych odcinków mózgu na szkiełka mikroskopowe, które są następnie poddawane procedurze autoradiografii receptorowej przy użyciu z góry określonego stężenia 125I-SIAng II, ja...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany protokół identyfikuje wizualizację "całkowitego" i "niespecyficznego" wiązania radioligandu w sąsiednich odcinkach koronalnych mózgu gryzonia, uprzednio pobranego i przechowywanego w temperaturze -80 °C i może być łatwo stosowany do praktycznie każdej tkanki, która ma anatomicznie rozwiązane podstruktury, które wykazują zróżnicowane ilości receptorów lub miejsc wiązania radioligandu. Procedury opisane w protokole są proste, a analiza ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej interpretacji wyników. Grubość 20 μm uznan...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Robert Speth udzielił komercyjnemu sprzedawcy licencji na stosowanie przeciwciał przeciwko receptorom angiotensyny II i otrzymuje tantiemy ze sprzedaży tych przeciwciał. Pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez NIH Grant HL-113905

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
500 ml Zlewki plastikoweFisher02-591-30
24 mm x 60 mm Szkiełka nakrywkoweFisher22-050-25
Folia do obrazowania autoradiograficznego 24 mm x 30 cmCarestream-Biomax MR Film891-2560
Bacytracyna (z Bacillus licheniformis)SigmaB-0125
Arkusz tektury 8 x 11Tablica ilustracji półksiężyca #201201
Słoiki CoplinFisher ScientificE94
Komercyjne suszarki do włosówConairModel SD6X
Jednorazowe probówki hodowlaneFisher14-961-26
EDTA (sól disodowa, dihydrat)USB Corporation15-699
EtanolFisher16-100-210 
Substytut receptury dla D-19 DeveloperPhotographers Formulary, Inc. 01-0036
Lodowaty kwas octowyFisherA38 SI-212
Histoprep/OCTFisherSH75-125D
Film FixerKodak5160320
Photo floKodak1464502
LosartanFisher/Tocris37-985-0
MCID™ Core 7.0MCIDN/A
NaClFisherS271
Uchwyty ślizgowe Peel-A-WayVWR48440-003
PermountFisherSP15-100
PD123319Fisher13-615-0
Premium Charged Slides, drobno szlifowaneProwadnice mikroskopowe Premiere9308W
125I LigandsPerkin ElmerNEX- 248
125SI-Ang II George Washington UniversityRadiojodowany przez Dr. Speth
Slide MailersFisher ScientificHS15986
Bezwodny fosforan dwuzasadowy sodu (Na2PO4)FisherRDCS0750500
Octan sodu (bezwodny)FisherBP333-500
Tionina KasetaT409-25
(10 x 12)Spectronics CorporationCztery kwadratowe
ksylenyFisher X3P-1GAL
rentgenowska Fisher

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), 29-322 (2015).
  2. Peart, W. S. The Renin-Angiotensin System. Pharmacol Rev. 17, 143-182 (1965).
  3. Ganten, D., et al. Angiotensin-forming enzyme in brain tissue. Science. 173 (3991), 64-65 (1971).
  4. Ganten, D., Fuxe, K., Phillips, M. I., Mann, J. F. E., Ganten, U. Frontiers in Neuroendocrinology. Ganong, W. F., Martini, L. , Raven Press. N.Y. Vol. 5 61-99 (1978).
  5. Fyhrquist, F., Metsarinne, K., Tikkanen, I. Role of angiotensin II in blood pressure regulation and in the pathophysiology of cardiovascular disorders. J Hum Hypertens. 9, Suppl 5 19-24 (1995).
  6. von Bohlenund und Halbach, O., Albrecht, D. The CNS renin-angiotensin system. Cell Tissue Res. 326 (2), 599-616 (2006).
  7. Speth, R., Giese, M. Update on the renin-angiotensin system. J Pharmacol Clin Toxicol. 1 (1), 1004(2013).
  8. de Kloet, A. D., Liu, M., Rodriguez, V., Krause, E. G., Sumners, C. Role of neurons and glia in the CNS actions of the renin-angiotensin system in cardiovascular control. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2015).
  9. Saavedra, J. M., Sanchez-Lemus, E., Benicky, J. Blockade of brain angiotensin II AT1 receptors ameliorates stress, anxiety, brain inflammation and ischemia: Therapeutic implications. Psychoneuroendocrinology. 36 (1), 1-18 (2011).
  10. Stornetta, R. L., Hawelu-Johnson, C. L., Guyenet, P. G., Lynch, K. R. Astrocytes synthesize angiotensinogen in brain. Science. 242, 1444-1446 (1988).
  11. Li, W., Peng, H., Seth, D. M., Feng, Y. The Prorenin and (Pro)renin Receptor: New Players in the Brain Renin-Angiotensin System. Int.J.Hypertens. 2012, 290635(2012).
  12. Strittmatter, S. M., Kapiloff, M. S., Snyder, S. H. [3H]captopril binding to membrane associated angiotensin converting enzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 1027-1033 (1983).
  13. Bild, W., Hritcu, L., Stefanescu, C., Ciobica, A. Inhibition of central angiotensin II enhances memory function and reduces oxidative stress status in rat hippocampus. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 43, 79-88 (2013).
  14. Wright, J. W., Harding, J. W. Brain renin-angiotensin-A new look at an old system. Progress in Neurobiology. 95 (1), 49-67 (2011).
  15. Tashev, R., Stefanova, M. Hippocampal asymmetry in angiotensin II modulatory effects on learning and memory in rats. Acta Neurobiol Exp (Wars). 75 (1), 48-59 (2015).
  16. Reudelhuber, T. L. The continuing saga of the AT2 receptor: a case of the good, the bad, and the innocuous. Hypertension. 46 (6), 1261-1262 (2005).
  17. Carey, R. M. Cardiovascular and renal regulation by the angiotensin type 2 receptor: the AT2 receptor comes of age. Hypertension. 45 (5), 840-844 (2005).
  18. Valero-Esquitino, V., et al. Direct angiotensin type 2 receptor (AT2R) stimulation attenuates T-cell and microglia activation and prevents demyelination in experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Clin Sci (Lond). 128 (2), 95-109 (2015).
  19. Chen, J., et al. Neuronal over-expression of ACE2 protects brain from ischemia-induced damage. Neuropharmacology. 79, 550-558 (2014).
  20. Kalra, J., Prakash, A., Kumar, P., Majeed, A. B. Cerebroprotective effects of RAS inhibitors: Beyond their cardio-renal actions. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. , (2015).
  21. Zhao, Y., et al. Activation of intracellular angiotensin AT(2) receptors induces rapid cell death in human uterine leiomyosarcoma cells. Clin Sci (Lond). 128 (9), 567-578 (2015).
  22. Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Quantitative autoradiography of angiotensin II receptors in the SHR brain. Peptides. 7 (6), 1021-1027 (1986).
  23. Mendelsohn, F. A., Quirion, R., Saavedra, J. M., Aguilera, G., Catt, K. J. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in rat brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (5), 1575-1579 (1984).
  24. Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in the rat brain and kidney. Eur J Pharmacol. 98 (1), 145-146 (1984).
  25. Speth, R. C., et al. Angiotensin II receptor localization in the canine CNS. Brain Res. 326 (1), 137-143 (1985).
  26. Santos, R. A. S., et al. Angiotensin-(1-7) is an endogenous ligand for the G protein-coupled receptor Mas. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (14), 8258-8263 (2003).
  27. Karamyan, V. T., Gembardt, F., Rabey, F. M., Walther, T., Speth, R. C. Characterization of the brain-specific non-AT(1), non-AT(2) angiotensin binding site in the mouse. Eur J Pharmacol. 590 (1-3), 87-92 (2008).
  28. Karamyan, V. T., Speth, R. C. Distribution of the non-AT1, non-AT2 angiotensin-binding site in the rat brain: preliminary characterization. Neuroendocrinology. 88 (4), 256-265 (2008).
  29. Karamyan, V. T., Stockmeier, C. A., Speth, R. C. Human brain contains a novel non-AT1, non-AT2 binding site for active angiotensin peptides. Life Sci. 83 (11-12), 421-425 (2008).
  30. Miller-Wing, A. V., et al. Central angiotensin IV binding sites: distribution and specificity in guinea pig brain. J Pharmacol Exp Ther. 266 (3), 1718-1726 (1993).
  31. Castren, E., Kurihara, M., Saavedra, J. M. Autoradiographic localization and characterization of angiotensin II binding sites in the spleen of rats and mice. Peptides. 8 (4), 737-742 (1987).
  32. MacGregor, D. P., et al. Angiotensin II receptor subtypes in the human central nervous system. Brain Res. 675 (1-2), 231-240 (1995).
  33. Plunkett, L. M., Correa, F. M. A., Saavedra, J. M. Quantitative autoradiographic determination of angiotensin-converting enzyme binding in rat pituitary and adrenal glands with 125I-351/A, a specific inhibitor. Regul Pept. 12, 263-272 (1985).
  34. Armando, I., et al. Increased angiotensin II AT(1) receptor expression in paraventricular nucleus and hypothalamic-pituitary-adrenal axis stimulation in AT(2) receptor gene disrupted mice. Neuroendocrinology. 76 (3), 137-147 (2002).
  35. Speth, R. C., Harding, J. W. Angiotensin Protocols Vol. 51 Methods in Molecular Medicine. Wang, D. H. , Humana Press. 275-295 (2001).
  36. Widdop, R. E., Jones, E. S., Hannan, R. E., Gaspari, T. A. Angiotensin AT2 receptors: cardiovascular hope or hype. Br J Pharmacol. 140 (5), 809-824 (2003).
  37. Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol. 379 (4), 385-388 (2009).
  38. Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 409-412 (2009).
  39. Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 389-395 (2009).
  40. Hamdani, N., van der Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 403-407 (2009).
  41. Bodei, S., Arrighi, N., Spano, P., Sigala, S. Should we be cautious on the use of commercially available antibodies to dopamine receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 413-415 (2009).
  42. Lu, X., Bartfai, T. Analyzing the validity of GalR1 and GalR2 antibodies using knockout mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 417-420 (2009).
  43. Everaerts, W., et al. Where is TRPV1 expressed in the bladder, do we see the real channel. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 421-425 (2009).
  44. Adams, J. M., McCarthy, J. J., Stocker, S. D. Excess dietary salt alters angiotensinergic regulation of neurons in the rostral ventrolateral medulla. Hypertension. 52 (5), 932-937 (2008).
  45. Herrera, M., Sparks, M. A., Alfonso-Pecchio, A. R., Harrison-Bernard, L. M., Coffman, T. M. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of Angiotensin type 1 receptor protein. Hypertension. 61 (1), 253-258 (2013).
  46. Rateri, D. L., et al. Endothelial Cell-Specific Deficiency of Ang II Type 1a Receptors Attenuates Ang II-Induced Ascending Aortic Aneurysms in LDL Receptor(-/-) Mice. Circ Res. 108 (5), 574-583 (2011).
  47. Benicky, J., Hafko, R., Sanchez-Lemus, E., Aguilera, G., Saavedra, J. M. Six Commercially Available Angiotensin II AT(1) Receptor Antibodies are Non-specific. Cell Mol Neurobiol. 32 (8), 1353-1365 (2012).
  48. Elliott, K. J., Kimura, K., Eguchi, S. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of angiotensin type-1 receptor protein. Hypertension. 61 (4), 31(2013).
  49. Hafko, R., et al. Commercially available angiotensin II At(2) receptor antibodies are nonspecific. PLoS One. 8 (7), 69234(2013).
  50. Gonzalez, A. D., et al. Distribution of angiotensin type 1a receptor-containing cells in the brains of bacterial artificial chromosome transgenic mice. Neuroscience. 226, 489-509 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Receptor AutoradiographyAngiotensin II ReceptorsBrain Tissue SectioningRadioligand Binding AssayNon Specific BindingTotal BindingCryostat SectioningAutoradiography Film ExposureThionin Histological StainingDensitometry Analysis

Related Articles