Artykuł metodologiczny

Prosty test biologiczny do oceny czynników wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych

DOI:

10.3791/53867

⸱

15 marca 2016

 ,  ,  ,  , 
1Tumour Angiogenesis Program, Peter MacCallum Cancer Centre

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy prosty test biologiczny oparty na komórkach do wykrywania, ilościowego określania i monitorowania aktywności członków rodziny ligandów czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego. Test wykorzystuje receptory chimeryczne ulegające ekspresji w linii komórkowej zależnej od czynnika, aby zapewnić półilościową lub ilościową ocenę wiązania receptora i sieciowania przez ligand.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza receptorowych kinaz tyrozynowych i ich oddziałujących ligandów zaangażowanych w biologię naczyniową jest często trudna ze względu na konstytutywną ekspresję rodzin pokrewnych receptorów, szeroki zakres pokrewnych ligandów i trudność w radzeniu sobie z pierwotnymi kulturami wyspecjalizowanych komórek śródbłonka. W tym miejscu opisujemy test biologiczny do wykrywania ligandów receptora czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego-2 (VEGFR-2), kluczowego przetwornika sygnałów promujących angiogenezę i limfangiogenezę. CDNA kodujące fuzję zewnątrzkomórkowego (wiążącego ligand) regionu VEGFR-2 z regionami transbłonowymi i cytoplazmatycznymi receptora erytropoetyny (EpoR) ulega ekspresji w zależnej od czynnika linii komórkowej Ba / F3. Ta linia komórkowa rozwija się w obecności interleukiny-3 (IL-3), a wycofanie tego czynnika powoduje śmierć komórek w ciągu 24 godzin. Ekspresja fuzji receptora VEGFR-2 / EpoR zapewnia alternatywny mechanizm sprzyjający przetrwaniu i potencjalnej proliferacji stabilnie transfekowanych komórek Ba / F3 w obecności liganda zdolnego do wiązania i sieciowania zewnątrzkomórkowej części białka fuzyjnego (tj. takiego, który może sieciować region zewnątrzkomórkowy VEGFR-2). Test można przeprowadzić na dwa sposoby: podejście półilościowe, w którym małe objętości liganda i komórek pozwalają na szybki wynik w ciągu 24 godzin, oraz podejście ilościowe obejmujące zastępcze markery liczby żywych komórek. Test jest stosunkowo łatwy do przeprowadzenia, jest wysoce wrażliwy na znane ligandy VEGFR-2 i może pomieścić zewnątrzkomórkowe inhibitory sygnalizacji VEGFR-2, takie jak przeciwciała monoklonalne przeciwko receptorowi lub ligandom oraz rozpuszczalne pułapki ligandów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rodzina czynników wzrostu wydzielanych białek (VEGF) wydzielanych przez czynniki wzrostu białek i ich pokrewne receptory na powierzchni komórek to ważna i zróżnicowana grupa rozpuszczalnych ligandów i receptorów osadzonych w błonie, które działają w transdukowaniu sygnałów przez błony komórkowe. Funkcjonują głównie w komórkach śródbłonka, ale także w komórkach pochodzenia nabłonkowego i komórek układu odpornościowego 1,2. Szlaki sygnałowe zaangażowane przez receptory VEGF aktywowane ligandem (VEGFR) mają kluczowe znaczenie w głównych patologiach, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem i rak, a terapie ukierunkowane na nie są często stosowane klinicznie (np. przeciwciało monoklonalne bewacyzumab, które jest skierowane przeciwko VEGF-A) 3,4.

Jedną z zawiłości rodziny VEGF jest różnorodność rozpuszczalnych ligandów obecnych w przyrodzie (białka VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF kodowane przez rodzinę wirusów parapox orf i jad węża VEGF, plus inne hamujące izoformy VEGF-A)2.

Te ligandy oddziałują z trzema członkami rodziny receptorowych kinaz tyrozynowych, a mianowicie VEGFR-1, VEGFR-2 i VEGFR-3. Receptory te ulegają zmiennej ekspresji na różnych typach komórek, ale często ulegają koekspresji na powierzchni komórek śródbłonka, które wyściełają naczynia krwionośne i limfatyczne wszystkich rozmiarów 5. VEGFR-2 może wiązać ligandy ssaków VEGF-A 6, VEGF-C 7 i VEGF-D 8,9, a także wirusa orf VEGF10 i jadu węża VEGF11. VEGFR-2 odgrywa główną rolę w napędzaniu angiogenezy (wzrostu nowych naczyń krwionośnych z wcześniej istniejących naczyń) w rozwoju embrionalnym, gojeniu się ran, nowotworach i chorobach oczu. W tych kontekstach ligandy, takie jak VEGF-A, -C i -D, wiążą i aktywują receptor na komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych12-15. Na komórkach śródbłonka limfatycznego VEGFR-2 odgrywa rolę w limfangiogenezie, tworzeniu nowych naczyń limfatycznych 16. VEGFR-2 może również sprzyjać rozszerzaniu i rozszerzaniu głównych tętnic i limf w zdrowych tkankach i chorobach 17. Pełne zrozumienie interakcji VEGFR-2:ligand jest zatem ważne dla opracowania inhibitorów do stosowania w leczeniu chorób zależnych od angiogenezy18. Podczas gdy większość izoform VEGF-A wiąże się z VEGFR-2, proteolityczne rozszczepienie VEGF-C i VEGF-D jest wymagane do uwolnienia fragmentu składającego się z domeny homologii VEGF, która wykazuje wysokie powinowactwo wiązania do VEGFR-2 19,20.

Opracowaliśmy test biologiczny do monitorowania ligandów VEGFR-2, który ma na celu obejście potrzeby pierwotnych komórek śródbłonka, które są technicznie trudne do przejścia, drogie w zakupie i hodowli (wymagają specjalistycznej pożywki) 21 i wyrażają wiele VEGFR i związanych z nimi koreceptorów 22. Heterodimeryzacja VEGFR-2 z innymi receptorami lub koreceptorami VEGF może powodować niepożądaną złożoność podczas badania binarnych interakcji receptor-ligand, oceny aktywności przypisywanej określonemu receptorowi lub oceny wpływu odczynników hamujących. 23. Test biologiczny zachowuje ruchliwość odpowiedniego receptora w błonie komórkowej i umożliwia ocenę zdolności liganda do wiązania i sieciowania regionu zewnątrzkomórkowego VEGFR-2.

Test biologiczny polega na stworzeniu chimerycznego receptora, w którym zewnątrzkomórkowy region receptora VEGF (w tym przypadku VEGFR-2) jest połączony z transbłonowymi i wewnątrzkomórkowymi regionami receptora erytropoetyny (EpoR), członka rodziny receptorów cytokin 8,24. To białko fuzyjne ulega następnie ekspresji w zależnej od czynnika linii komórkowej pro-B Ba/F3, na której stymulacja ligandem zdolnym do wiązania i sieciowania domeny zewnątrzkomórkowej receptora powoduje aktywację regionu efektora cytoplazmatycznego, który jest zdolny do przekazywania sygnału przeżycia za pośrednictwem kinaz janusowych (JAK) w celu promowania przeżycia i / lub proliferacji komórki. W przeciwieństwie do tego, ekspresja pełnej długości VEGFR-2 w tym samym typie komórki i stymulacja ligandem nie sprzyja przeżyciu i proliferacji komórek, co wskazuje, że proksymalne efektory sygnalizacyjne szlaku VEGFR-2 nie są dostępne w tym typie komórki.

Użyliśmy tego testu w różnych kontekstach, aby zbadać wiązanie nowych ligandów VEGFR-2 10,19,20,24-29. W połączeniu z testem VEGFR-3-EpoR-Ba/F3 porównaliśmy względną aktywność czynników wzrostu VEGF-C i VEGF-D pod kątem wiązania i sieciowania VEGFR-2 i VEGFR-3 30. Test został wykorzystany do scharakteryzowania hamującej aktywności neutralizujących przeciwciał monoklonalnych przeciwko VEGFR-2 lub VEGF-D, rozpuszczalnej pułapki VEGFR-2 i peptydomimetyków ukierunkowanych na rodzinę VEGF31. Test wykorzystano również do wykazania zdolności VEGF z różnych szczepów wirusa orf do wiązania i sieciowania VEGFR-2 przed testem w pierwotnych komórkach śródbłonka 10,26. Test ten jest szczególnie przydatny do szybkich badań przesiewowych mutantów VEGF, które można szybko ocenić pod kątem aktywności, zanim zostaną wprowadzone do bardziej pracochłonnych testów komórek śródbłonka 25 lub podczas oceny protokołów oczyszczania czynników wzrostu 27.

Opisany przez nas test jest łatwy do wykonania, a wersja półilościowa pozwala na szybkie oznaczenia, które czasami są wymagane podczas monitorowania produkcji lub oczyszczania czynników wzrostu, przeciwciał lub rozpuszczalnych domen receptorowych dla innych eksperymentów. Łatwość użycia testu sprawia, że jest on idealnym uzupełnieniem dalszych i bardziej kompletnych badań wykonywanych na pierwotnych komórkach śródbłonka pochodzących z krwi lub naczyniach limfatycznych z określonych tkanek lub układów narządowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło IL-3 i przygotowanie podłoża kondycjonowanego przez WEHI-3D

Uwaga: Mysia linia komórkowa białaczki granulocytowej WEHI-3D jest hodowana w celu wytworzenia kondycjonowanej pożywki zawierającej IL-3.

  1. Hodowla WEHI-3D w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, 10% płodowa surowica bydlęca (FBS), 1% suplement glutaminy o przedłużonym okresie przydatności, 50 μg/ml gentamycyny. Zaszczepić 5 × 106 komórek w logarytmicznej fazie wzrostu do 50 ml świeżej pożywki hodowlanej w kolbie do hodowli tkankowej T175 cm3 i hodować przez około 7 dni lub do momentu, gdy komórki przejdą logarytmiczną fazę wzrostu przez około 24 - 48 godzin (należy unikać nadmiernej śmierci komórek w hodowli). Kondycjonowane podłoża mogą być przechowywane przez wiele lat w temperaturze -20 °C, dzięki czemu można jednorazowo produkować partie po 200-500 ml.
  2. Zdekantować płyn i komórki z kolb i wirować w temperaturze 1 000 x g przez 15 minut w celu usunięcia komórek i resztek komórkowych. Usunąć górne 90% supernatantu. Przefiltruj przez jednostkę filtrującą 0,22 μm.
  3. Podwielokrotność kondycjonowanej pożywki (CM) WEHI-3D na objętości 1 ml, 50 ml i 200 ml do przechowywania w temperaturze -20 °C lub -70 °C. Mniejsze podwielokrotności są przydatne do przygotowania testów, pośrednie objętości do wytwarzania pożywki hodowlanej do przejścia linii komórkowych zależnych od czynnika, a większe objętości do długotrwałego przechowywania. IL-3 jest stosunkowo stabilna w temperaturze 4 °C, więc rozmrożone podłoże może być przechowywane przez kilka tygodni, jeśli jest używane w sterylnych warunkach.
  4. Alternatywnie, należy użyć rekombinowanej mysiej IL-3 na poziomie 50 ng/ml rozcieńczonej do pożywki hodowlanej, po przefiltrowaniu przez jednostkę filtrującą 0,22 μm.

2. Hodowla i ocena linii komórkowych VEGFR-2-EpoR-BA/F3 i kontrolnych Ba/F3

  1. Kontrola hodowli komórek Ba/F3 w DMEM, 10% FBS, 50 μg/ml gentamycyny lub suplementu penicyliny/streptomycyny, 1% stabilizowanej L-glutaminy i 10% WEHI-3D-CM. Pasaż komórek w rozcieńczeniach 1:15 mniej więcej co trzy dni od komórek rosnących w fazie logarytmicznej.
  2. Hodowla komórek VEGFR2-EpoR-Ba/F3 w DMEM, 10% FBS, 50 μg/ml gentamycyny, 1% stabilizowanej L-glutaminy i 10% WEHI-3D-CM oraz 1 mg/ml G418. Pasaż komórek w rozcieńczeniach 1:15 z komórek rosnących w fazie logarytmicznej. Zobacz 24, aby uzyskać więcej szczegółów na temat budowy i ekspresji receptora chimerycznego.
  3. Kontroluj zbiory komórek Ba/F3 lub VEGFR2-EpoR-Ba/F3 z kultur w środkowej fazie logarytmicznej. Delikatnie odpipetować pipetą, aby usunąć te nieprzylegające komórki z dna kolby. Przemyć trzykrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem toniczności myszy, pH 7,3 (PBS), (10 ml, odwirować przy 750 x g przez 5 minut w celu odzyskania osadu komórkowego) w celu usunięcia pożywki zawierającej IL-3.
  4. Przemyć komórki raz DMEM i dodatkami, bez WEHI-3D-CM lub rekombinowanego IL-3, a następnie ponownie zawiesić w tym podłożu w stężeniu 7,4 ×10 4 komórek/ml (tj. 1000 komórek na 13,5 μl; 10 000 komórek na 135 μl, jak określono przez zliczenie za pomocą hemocytometru) do użycia odpowiednio w półilościowych lub ilościowych wersjach testu.
  5. Oceń komórki pod kątem żywotności przez wykluczenie błękitu trypanowego (UWAGA). Wymieszaj błękit trypanowy w PBS (0,4%) 1:1 z populacją komórek i policz co najmniej 100 komórek na hemocytometrze. Komórki, które pobierają barwnik, są uważane za martwe lub umierające. Do przeprowadzenia testu wymagana jest żywotność większa niż 98%.

3. Test półilościowy

  1. Dodać przemyte komórki (1,000 komórek) zawarte w 13,5 μl pożywki z niedoborem IL-3 do dołków 72-dołkowej płytki mikrodołkowej w temperaturze pokojowej. Należy uważać, aby wymieszać zawiesinę komórek podczas porcjowania, aby upewnić się, że osiadanie komórek pod wpływem grawitacji nie wpływa na stężenie komórek. Używaj dobrze skalibrowanej pipety automatycznej P20 i końcówek sterylizowanych w autoklawie.
  2. Dodać próbki testowe i kontrole do studzienek przy 10% objętości (1,5 μl, co daje końcową objętość 15 μl zawierającą 1000 komórek na studzienkę) za pomocą skalibrowanej pipety P20 lub, najlepiej, pipety P2. Należy upewnić się, że próbki są zgodne z warunkami hodowli komórek Ba/F3 pod względem pH, soli i innych substancji potencjalnie cytotoksycznych/cytostatyków. Tam, gdzie to możliwe, należy użyć kompatybilnego podłoża lub buforu (np. odpowiednio DMEM lub PBS) lub rozcieńczyć w takim pożywce lub buforze. Rozcieranie tą samą końcówką zapewni mieszanie.
  3. W przypadku próbek kontrolnych należy uwzględnić: (i) samą pożywkę niezawierającą IL-3; (ii) WEHI-3BD-CM dodany do samej pożywki w ilości 10% objętości końcowej; i/lub (iii) VEGF-A rozcieńczony do 100 ng/ml w samym pożywce, niezawierający IL-3.
  4. Napełnij wszelkie niewykorzystane studzienki płytki mikrodołkowej sterylną wodą, PBS lub pożywką i umieść płytkę w nawilżonym pojemniku (z bibułką nasączoną wodą), umożliwiając wymianę gazową. Inkubować komórki w pojemnikach w wilgotnej atmosferze 10% CO2 . Test ten może być wygodnie skonfigurowany w ciągu 3 godzin przez jedną osobę, jeśli dostępne są próbki testowe i składniki pożywki.
  5. Oceniać płytki zazwyczaj po 16 godzinach inkubacji, w którym to czasie wyraźna jest różnica między próbkami dodatnimi i ujemnymi. Na rysunku 3 przedstawiono przykłady wyglądu komórek w hodowli. Analizuj płytki za pomocą standardowego mikroskopu z odwróconym kontrastem fazowym przy powiększeniu 40 − 100×.
    Uwaga: Studzienki zawierające wspomagające czynniki wzrostu, takie jak IL-3 lub VEGF-A, będą zawierać komórki, które wydają się okrągłe i półprzezroczyste. Studnie bez wspomagających czynników wzrostu lub z samym podłożem będą miały zmniejszoną liczbę okrągłych komórek, a także martwe lub umierające komórki i szczątki komórkowe (np. Ryc. 3C). Ocena testu w ciągu 24−48 godzin po inkubacji jest optymalna dla czułości.

4. Ilościowy test biologiczny

  1. Dodać umyte komórki (10 000 komórek w 135 μl) w pożywce z niedoborem IL-3 do dołków standardowej 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania w temperaturze pokojowej. Należy zachować ostrożność, aby wymieszać zawiesinę komórek podczas porcjowania, aby upewnić się, że osiadanie komórek pod wpływem grawitacji nie wpływa na stężenie komórek.
  2. Dodać próbki testowe i kontrole do studzienek przy 10% objętości (15 μl) za pomocą skalibrowanej pipety (P20). Należy upewnić się, że próbki są zgodne z warunkami hodowli komórek Ba/F3 pod względem pH, soli lub innych substancji potencjalnie cytotoksycznych/cytostatyków. Tam, gdzie to możliwe, należy użyć kompatybilnego podłoża lub buforu (np. DMEM lub PBS) lub rozcieńczyć w takim pożywce lub buforze. Filtr sterylizuje małe objętości za pomocą jednostki filtrującej z rurką wirówkową z octanu celulozy o porach 0,22 μm.
  3. Mieszaninę komórek, czynników wzrostu i/lub czynników hamujących inkubować w wilgotnej atmosferze 10% CO2 przez 48 godzin. Przeprowadzić test w wilgotnym pojemniku z bibułką nasączoną wodą i umożliwiającym wymianę gazową. Po zakończeniu okresu inkubacji ocenić test, stosując jedną z alternatywnych metod wymienionych poniżej, które są zastępczymi markerami liczby zdolnych do życia komórek w studzience.
  4. Alternatywa#1: Inkorporacja 3H-tymidyny
    Uwaga: Ta kwantyfikacja jest przeznaczona dla formatu płytki 96-dołkowej.
    1. Po inkubacji płytek do oznaczania przez 48 godzin w temperaturze 37 °C (objętość 150 μl na studzienkę), dodać 3H-tymidynę do objętości 50 μl pożywki do oznaczania (pożywka hodowlana Ba/F3 bez IL-3/WEHI-3D CM) na basenik w stężeniu 20 μCi/ml, uzyskując ostateczną dawkę 1 μCi na basenik.
    2. Inkubować płytki przez kolejne 4 godziny w temperaturze 37 °C przed pobraniem komórek za pomocą kombajnu komórkowego. Ekstrahuj pojedyncze próbki, umieszczając filtry w scyntylatorze i oznaczaj ilościowo za pomocą licznika scyntylacji cieczy.
  5. Alternatywa#2: Bioluminescencyjna detekcja komórkowego ATP
    Uwaga: To podejście wykorzystuje odczynnik monitorujący ATP, który w połączeniu z lizatem komórkowym może generować sygnał bioluminescencyjny, który odzwierciedla żywe komórki w populacji.
    1. Lizuj komórki w celu ekstrakcji ATP i użyj odczynnika monitorującego ATP, aby wygenerować sygnał luminescencyjny zgodnie z instrukcjami producenta. Odczyt luminescencji za pomocą luminometru kompatybilnego z formatem płytki 96-dołkowej.
  6. Alternatywa#3: Enzymatyczna redukcja barwnika wskaźnikowego przez żywotne komórki
    Uwaga: Testy na bazie resazuryny wykazują dobrą korelację z żywotnością komórek.
    1. Połączyć hodowane komórki z barwnikiem na bazie rezazuryny i określić ilościowo testy za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych zgodnie z instrukcjami producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tej sekcji przedstawiamy wyniki eksperymentu demonstrującego kluczowe cechy bioanalizy VEGFR-2-EpoR-Ba/F3 (zasady analizy przedstawiono na Rysunku 1). Inne opublikowane badania wykazują szersze zastosowania tej metody w odniesieniu do alternatywnych ligandów VEGFR-2, zmutowanych cząsteczek VEGF oraz inhibicyjnych przeciwciał monoklonalnych 8,10,19,24-30.

Dane przedstawione w niniejszym opracowaniu r...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj test opiera się na wykorzystaniu komórek o wysokiej żywotności, które są zależne od czynników wzrostu. Komórki muszą być zatem starannie hodowane, aby upewnić się, że są zależne od czynnika i zachowują ekspresję receptora chimerycznego. Ważne jest, aby pożywka była świeżo przygotowana i nie była przechowywana przez zbyt długi okres oraz aby WEHI-3D CM był wysoce aktywny. Komórki muszą być dokładnie umyte z pożywki zawierającej IL-3 do pożywki testowej, aby upewnić się, że żadna pozostałość IL-3 nie zanieczy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Steven A. Stacker i Marc M. Achen są udziałowcami Circadian Technologies Ltd., firmy rozwijającej terapie ukierunkowane na rodzinę czynników wzrostu VEGF.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SAS i MGA są wspierane przez Granty Projektowe, Granty Programowe i Stypendia Badawcze od Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych Australii (NHMRC) oraz przez fundusze z Programu Wsparcia Infrastruktury Operacyjnej zapewnione przez Rząd Wiktorii w Australii. MMH jest wspierane przez Fundację Petera MacCalluma Grant.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Trypan BlueSigma-AldrichT81540,4% roztwór w PBS stosuje się 1:1 z zawiesinami komórkowymi do pomiaru żywych komórek. Hazard-może powodować raka
G418 Siarczan (Genetycyna)Invivogenant-gn-5Środek do selekcji transfekowanych komórek eukariotycznych. Zagrożenie - może powodować objawy alergii lub astmy lub trudności w oddychaniu.
3H-ThymidinePerkinElmerNET-027Ten radioaktywny nukleozyd jest wbudowywany w chromosomalne DNA podczas mitozy. Zestaw
Vialight Plus Hazard-radiation LonzaLT07-221Bioluminescencyjne wykrywanie komórkowego ATP w celu ilościowego określenia żywotności, przy użyciu odczynnika do monitorowania ATP
Odczynnik do żywotności komórek PrestoblueInvitrogenA13261Wskaźnik żywotności komórek na bazie resazuryny. Zmienia kolor na czerwony w środowisku redukującym komórkę
Nunc Minitray z powierzchnią Nunclon Delta (72 dołki)Thermo Scientific136528Mała płytka do mikromiareczkowania
96-dołkowa płytka do hodowli tkankowychFalcon, Corning Inc.
DMEM (1X)Gibco11965-92
GlutaMAX (100X)Gibco35050-061
Surowica bydlęcapłodu Gibco  10099-141
Kombajn komórkowyTomtec Nauki przyrodniczeTomtec Harvester, 96 Mach 3M Kombajn komórkowy
Licznik scyntylacji cieczyLKB Wallac1205LKB Wallac 1205 Betaplate Licznik scyntylacyjny
UniFilter-96 GF/BPerkin Elmer6005177Biała 96-dołkowa mikropłytka Barex z filtrem GF / B 1 i mikro; m wielkość porów
GentamycynaGibco, Life Technologies15750-060
Penicylina/StreptomycynaGibco, Life Technologies15140-122
0,22 um Jednostka filtrująca probówkę wirówkową z octanu celulozy 0,22 umCostar, Corning Inc.8160Filtry probówkowe wirówkowe mają 0,22 &mikro; Jednostka filtrująca zawierająca membranę CA o m porach w 500 &mikro; l pojemność polipropylenowej mikrowirówki.
Czytnik fluorescencyjnyBioTekBioTek Synergy 4 Hybrydowy czytnik mikropłytek 
353072

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ferrara, N., Gerber, H. P., LeCouter, J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 9, 669-676 (2003).
  2. Achen, M. G., Stacker, S. A. Vascular endothelial growth factor-D:signalling mechanisms, biology and clinical relevance. Growth Factors. 5, 283-296 (2012).
  3. Ferrara, N., Mass, R. D., Campa, C., Kim, R. Targeting VEGF-A to treat cancer and age-related macular degeneration. Annu Rev Med. 58, 491-504 (2007).
  4. Ferrara, N., Hillan, K. J., Gerber, H. P., Novotny, W. Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer. Nat Rev Drug Discov. 3, 391-400 (2004).
  5. Korpelainen, E. I., Alitalo, K. Signaling angiogenesis and lymphangiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 10, 159-164 (1998).
  6. Senger, D. R., et al. Tumour cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascities fluid. Science. 219, 983-985 (1983).
  7. Joukov, V., et al. A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt-4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases. EMBO J. 15, 290-298 (1996).
  8. Achen, M. G., et al. Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF receptor 3 (Flt4). Proc Natl Acad Sci USA. 95, 548-553 (1998).
  9. Leppanen, V. M., et al. Structural determinants of vascular endothelial growth factor-D receptor binding and specificity. Blood. 117, 1507-1515 (2011).
  10. Wise, L. M., et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF)-like protein from orf virus NZ2 binds to VEGFR2 and neuropilin-1. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 3071-3076 (1999).
  11. Yamazaki, Y., Takani, K., Atoda, H., Morita, T. Snake venom vascular endothelial growth factors (VEGFs) exhibit potent activity through their specific recognition of KDR (VEGF receptor 2). J Biol Chem. 278, 51985-51988 (2003).
  12. Stacker, S. A., Achen, M. G., Jussila, L., Baldwin, M. E., Alitalo, K. Lymphangiogenesis and cancer metastasis. Nat Rev Cancer. 2, 573-583 (2002).
  13. Stacker, S. A., et al. VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics. Nat Med. 7, 186-191 (2001).
  14. Skobe, M., et al. Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis. Nat Med. 7, 192-198 (2001).
  15. Mandriota, S. J., et al. Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promotes tumour metastasis. EMBO J. 20, 672-682 (2001).
  16. Stacker, S. A., et al. Lymphangiogenesis and lymphatic vessel remodelling in cancer. Nat Rev Cancer. 14, 159-172 (2014).
  17. Karnezis, T., et al. VEGF-D promotes tumor metastasis by regulating prostaglandins produced by the collecting lymphatic endothelium. Cancer Cell. 21, 181-195 (2012).
  18. Folkman, J. Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 6, 273-286 (2007).
  19. Stacker, S. A., et al. Biosynthesis of vascular endothelial growth factor-D involves proteolytic processing which generates non-covalent homodimers. J Biol Chem. 274, 32127-32136 (1999).
  20. McColl, B. K., et al. Plasmin activates the lymphangiogenic growth factors VEGF-C and VEGF-D. J Exp Med. 198, 863-868 (2003).
  21. Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52, 2745-2756 (1973).
  22. Shibuya, M., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Exp Cell Res. 312, 549-560 (2006).
  23. Pacifici, R. E., Thomason, A. R. Hybrid tyrosine kinase/cytokine receptors transmit mitogenic signals in response to ligand. J Biol Chem. 269, 1571-1574 (1994).
  24. Stacker, S. A., et al. A mutant form of vascular endothelial growth factor (VEGF) that lacks VEGF receptor-2 activation retains the ability to induce vascular permeability. J Biol Chem. 274, 34884-34892 (1999).
  25. Davydova, N., Roufail, S., Streltsov, V. A., Stacker, S. A., Achen, M. G. The VD1 neutralizing antibody to vascular endothelial growth factor-D: binding epitope and relationship to receptor binding. J Mol Biol. 407, 581-593 (2011).
  26. Wise, L. M., et al. Viral vascular endothelial growth factors vary extensively in amino acid sequence, receptor-binding specificities, and the ability to induce vascular permeability yet are uniformly active mitogens. J Biol Chem. 278, 38004-38014 (2003).
  27. Davydova, N., et al. Preparation of human vascular endothelial growth factor-D for structural and preclinical therapeutic studies. Protein Expr. Purif. 82, 232-239 (2012).
  28. Baldwin, M. E., et al. Multiple forms of mouse vascular endothelial growth factor-D are generated by RNA splicing and proteolysis. J. Biol. Chem. 276, 44307-44314 (2001).
  29. Baldwin, M. E., et al. The specificity of receptor binding by vascular endothelial growth factor-D is different in mouse and man. J. Biol. Chem. 276, 19166-19171 (2001).
  30. Makinen, T., et al. Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth, survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3. EMBOJ. 20, 4762-4773 (2001).
  31. Achen, M. G., et al. Monoclonal antibodies to vascular endothelial growth factor-D block its interactions with both VEGF receptor-2 and VEGF receptor-3. Eur J Biochem. 267, 2505-2515 (2000).
  32. Bamford, S., et al. The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) database and website. Br J Cancer. 91, 355-358 (2004).
  33. Pleasance, E. D., et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome. Nature. 463, 191-196 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

czynnik wzrostu r db onka naczywi zanie ligandu VEGFR 2linia kom rkowa Ba F3test odstawienia IL 3pomiar ywotno ci kom rekmetoda wykluczania b kitu trypanuliczenie kom rek za pomoc hemocytometruinkubacja w komorze nawil anejanaliza mikroskopowa w kontra cie fazowymkwantyfikacja marker w zast pczych

Powiązane artykuły