Artykuł metodologiczny

Nagrywanie wokalizacji ultradźwiękowych myszy w celu oceny komunikacji społecznej

26.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53871

⸱

5 czerwca 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Human Genetics and Cognitive Functions, University Paris Diderot, CNRS UMR 3571, Institut Pasteur, 2Neurophysiology and Behavior, University Pierre et Marie Curie Paris 6, CNRS UMR 7102, 3Bio Image Analysis, CNRS URA 2582, Institut Pasteur

W tym artykule

Podsumowanie

Mysie ultradźwiękowe wokalizacje są używane jako proxy do modelowania genetycznych podstaw deficytów komunikacji głosowej w mysich modelach zaburzeń neuropsychiatrycznych. Niniejszy protokół opisuje trzy konteksty eksperymentalne, które niezawodnie wywołują ultradźwiękowe wokalizacje od szczeniąt (w trakcie rozwoju) i dorosłych myszy (interakcje tej samej płci, interakcje samca-samicy w rui).

Streszczenie

Myszy emitują ultradźwiękowe wokalizacje w różnych kontekstach podczas rozwoju i w wieku dorosłym. Te sygnały głosowe są obecnie wykorzystywane jako wskaźniki zastępcze do modelowania genetycznych podstaw deficytów komunikacji głosowej. Scharakteryzowanie zachowań wokalnych modeli myszy niosących mutacje w genach związanych z zaburzeniami neuropsychiatrycznymi, takimi jak zaburzenia ze spektrum autyzmu, pomoże zrozumieć mechanizmy prowadzące do deficytów komunikacji społecznej. Udostępniamy tutaj protokoły niezawodnego wywoływania wokalizacji ultradźwiękowej u szczeniąt i dorosłych myszy. Ta standaryzacja pomoże zmniejszyć zmienność między badaniami wynikającą z warunków eksperymentalnych. Odgłosy izolacji szczeniąt są rejestrowane przez cały okres rozwoju od pojedynczych szczeniąt odizolowanych od matki i rodzeństwa z miotu. W wieku dorosłym wokalizacje są rejestrowane podczas interakcji osób tej samej płci (bez komponentu płciowego) poprzez wystawienie społecznie motywowanych mężczyzn lub kobiet na nieznanego przedstawiciela tego samego gatunku. Udostępniamy również protokół nagrywania wokalizacji dorosłych samców narażonych na samicę rui. W tym kontekście w interakcji pojawia się komponent seksualny. Protokoły te zostały ustanowione w celu wywołania dużej ilości wokalizacji ultradźwiękowych u myszy laboratoryjnych. Zwracamy jednak uwagę na istotną zmienność międzyosobniczą w zachowaniu wokalnym myszy, którą należy wziąć pod uwagę, rejestrując minimalną liczbę osobników (co najmniej 12 w każdym stanie). Te nagrania wokalizacji ultradźwiękowych są wykorzystywane do oceny częstotliwości połączeń, repertuaru wokalnego i struktury akustycznej rozmów. Dane są łączone z analizą synchronicznych nagrań wideo, aby zapewnić pełniejszy obraz komunikacji społecznej u myszy. Protokoły te są wykorzystywane do scharakteryzowania deficytów komunikacji głosowej u myszy pozbawionych genu ProSAP1 / Shank2 związanego z zaburzeniami ze spektrum autyzmu. Więcej nagrań wokalizacji ultradźwiękowych można również znaleźć w bazie danych mouseTube, opracowanej w celu sprzyjania wymianie takich danych.

Wprowadzenie

Pacjenci z zaburzeniami neuropsychiatrycznymi zazwyczaj wykazują deficyty w komunikacji społecznej (np. pacjenci z zaburzeniami ze spektrum autyzmu, schizofrenią lub chorobą Alzheimera)1. Genetycznie modyfikowane myszy są coraz częściej wykorzystywane do modelowania genetycznych przyczyn tych zaburzeń2. Badanie komunikacji społecznej w tych mysich modelach jest bardzo interesujące dla zrozumienia mechanizmów mutacji genetycznych prowadzących do nietypowych dysfunkcji społecznych oraz dla testowania nowych terapii. Ponieważ myszy są zwierzętami społecznymi i komunikują się ze sobą za pomocą sygnałów węchowych, dotykowych, wizualnych i akustycznych, są odpowiednimi modelami do oceny komunikacji społecznej.

Mysie ultradźwiękowe wokalizacje są obecnie używane jako proxy do modelowania genetycznych podstaw deficytów komunikacji głosowej3,4 (ale istnienie uczenia się głosu u tego gatunku jest nadal dyskutowane5,6, nawet jeśli najnowsze badania dowodzą braku uczenia się głosu7). Stwierdzono, że myszy laboratoryjne emitują ultradźwiękowe wokalizacje w relacjach matka-dziecko, w interakcjach społeczno-seksualnych mężczyzna-kobieta, w interakcjach społecznych osób tej samej płci (omówione w odnośniku8) oraz w interakcjach społecznych młodocianych i młodocianych9. Młode myszy emitują odgłosy izolacji w ciągu pierwszych dwóch tygodni życia, gdy są odizolowane od matki i rodzeństwa z miotu10. Samce emitują ultradźwiękowe wokalizacje, gdy znajdują się w obecności samicy rui (lub sygnałów moczowych od niej)11,12. Samce i samice emitują ultradźwiękową wokalizację podczas interakcji z nieznanym przedstawicielem tego samego gatunku13,14. Organizacja i funkcje tych wokalizacji nie są do końca jasne i wymagają dalszych badań. Obecna wiedza na temat aspektu funkcjonalnego ogranicza się do wywoływania zachowań związanych z aportem u matek słyszących odgłosy izolacji szczeniąt, ułatwiania bliskości dorosłych samic w stosunku do wokalizacji dorosłych samców15 oraz zwiększonych zachowań eksploracyjnych dorosłych samców słyszących wokalizacje dorosłych samic16.

Charakteryzacja nieprawidłowości w komunikacji głosowej w mysich modelach zaburzeń neuropsychiatrycznych powinna być przeprowadzona w standardowych warunkach, aby wykluczyć główny wkład warunków eksperymentalnych. Takie charakterystyki, w połączeniu z oceną jednoczesnych interakcji społecznych i badaniami neurobiologicznymi, w różnych modelach genetycznych, powinny poszerzyć naszą wiedzę na temat wkładu genetycznego w różne aspekty komunikacji ultradźwiękowej myszy. W dłuższej perspektywie powinno to rzucić więcej światła na niektóre neurobiologiczne podstawy komunikacji społecznej u ludzi. Obecnie naszym celem jest zapewnienie prostych protokołów, aby niezawodnie wywoływać wokalizacje ultradźwiękowe podczas rozwoju i w wieku dorosłym zarówno dla samców, jak i samic myszy w laboratorium. Takie protokoły powinny ułatwić standaryzację nagrań, aby bardziej wiarygodnie porównywać emisje wokalizacji ultradźwiękowej między szczepami a laboratoriami. Powinno to również ułatwić tworzenie takich nagrań w laboratoriach, które nie mają wcześniejszego doświadczenia z nagraniami wokalizacji ultradźwiękowych myszy. Zwracamy również uwagę na obecną możliwość łączenia danych o wokalizacjach ultradźwiękowych ze szczegółowymi danymi behawioralnymi zbieranymi jednocześnie podczas interakcji społecznych u dorosłych myszy, w celu uzyskania kluczowych informacji na temat upośledzenia społecznego, a także na temat kontekstu emisji wokalizacji ultradźwiękowych. Takie analizy rzucą nowe światło na organizację i funkcje ultradźwiękowych wokalizacji myszy. Na koniec zamieszczamy również informację o możliwości udostępniania nagrań wokalizacji ultradźwiękowej całemu środowisku naukowemu w bazie danych mouseTube (http://mousetube.pasteur.fr). Otwarty dostęp do danych dotyczących nagrań dźwiękowych powinien poszerzyć wiedzę na temat komunikacji ultradźwiękowej myszy, umożliwiając naukowcom porównywanie własnych danych z wokalizacjami ultradźwiękowymi zarejestrowanymi w innych laboratoriach (z podobnymi lub różnymi szczepami/protokołami) i/lub kwestionowanie ich metod analizy plików nagranych w innych warunkach.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Comité d'Ethique en Expérimentation animale (CETEA) n°89 w Institut Pasteur w Paryżu.

1. Przygotowanie zwierząt

  1. Aby zarejestrować wołania izolacyjnych szczeniąt, należy pozyskać ciężarne samice badanej linii myszy. Uwaga: Krzyżuj samce i samice heterozygوطiczne, aby uzyskać co najmniej 10 miotów zawierających szczenięta typu dzikiego, heterozygوطyczne i knock-out, co pozwoli na uzyskanie wiarygodnych zwierząt kontrolnych.
  2. Pozyskaj dwie grupy dorosłych myszy w celu rejestracji wokalizacji podczas interakcji osobników tej samej płci.
    1. Pozyskaj co najmniej 12 samców lub 12 samic każdego genotypu jako myszy testowe z badanej linii (aby uwzględnić zmienność osobniczą). Uwaga: Protokół ten jest dobrze dostosowany do osobników dorosłych, ale można go zmodyfikować dla osobników młodocianych, skracając czas izolacji przed eksperymentem9. Test ten można przeprowadzać u samców lub samic. Należy jednak unikać testowania samców z linii myszy, które wykazują wyraźny fenotyp agresywny w teście interakcji społecznych samiec-samiec.
    2. Aby zmaksymalizować liczbę interakcji afiliacyjnych, izoluj zwierzęta testowe przed eksperymentami. Samce trzymaj indywidualnie przez 3 tygodnie (aby zminimalizować interakcje agresywne14,17), a samice przez 3 dni (E. Ey, niepublikowane dane), aby zwiększyć ich motywację społeczną.
    3. Pozyskaj samce lub samice z linii reprezentatywnych dla tła genetycznego linii testowej, aby wykorzystać je jako „nowych przybyszów” (np. jako myszy wchodzące w interakcję, patrz 3.1.3). Na przykład, jeśli badana linia mutantów została stworzona na tle C57BL/6J, użyj myszy C57BL/6J jako nowych przybyszów. Oblicz liczbę potrzebnych zwierząt tak, aby każda z tych myszy nie była wykorzystywana częściej niż 2 razy dziennie jako nowy przybysz. Trzymaj je w grupach.
  3. Pozyskaj dwie grupy dorosłych myszy w celu rejestracji wokalizacji samców w obecności samicy w rui.
    1. Pozyskaj co najmniej 12 dojrzałych płciowo samców każdego genotypu z badanej linii (aby uwzględnić zmienność osobniczą). Uwaga: Jeśli samce nie miały wcześniej kontaktu z samicami, umieść je w indywidualnych klatkach i pozwól im spędzić jedną noc z samicą na dwa dni przed testem, aby zwiększyć ich motywację do emitowania wokalizacji ultradźwiękowych6.
    2. Pozyskaj dojrzałe płciowo samice z linii stanowiącej tło genetyczne rejestrowanych samców. Na przykład, jeśli badane samce mutanty zostały stworzone na tle C57BL/6J, użyj samic C57BL/6J. Oblicz liczbę potrzebnych samic tak, aby każda z tych myszy nie była wykorzystywana częściej niż 3 razy dziennie. Trzymaj je w grupach.

2. Wołania izolacyjne młodych

  1. Identyfikacja młodych
    1. Na trzy dni przed przewidywanym dniem narodzin odizolować ciężarne samice.
    2. Sprawdzać samice pod kątem narodzin każdego ranka i każdego wieczora. Dzień narodzin oznaczyć jako P0.
    3. Zidentyfikować młode w dniu P1, wykonując trwałe tatuaże na łapkach (podskórne wstrzyknięcie zielonej pasty do tatuaży igłą 0,3 mm x 13 mm [30 G ½"]). Stworzyć kod, zaznaczając jedną, dwie, trzy lub cztery łapki. Działać jak najszybciej, aby zminimalizować niepokój młodych, i jak najszybciej umieścić je z powrotem w gnieździe.
  2. Przygotowanie klatki do rejestracji wołań izolacyjnych młodych.
    1. Użyć własnoręcznie wykonowanej komory wygłuszającej (Rycina 1A) lub zwykłego pudełka styropianowego. Wewnątrz pudełka umieścić termometr, aby monitorować temperaturę podczas każdego nagrania. Upewnić się, że temperatura utrzymuje się w zakresie od 18 °C do 22 °C.
    2. Umieścić mikrofon na górze (przez otwór w górnej części pudełka). Dostosować wysokość mikrofonu tak, aby membrana znajdowała się 12-15 cm nad dnem pudełka, na którym będzie leżeć młode. Podłączyć mikrofon do karty dźwiękowej, a kartę dźwiękową do komputera.
    3. Aby dostosować wzmocnienie karty dźwiękowej, przeprowadzić próbne nagranie z młodym, które nie będzie wykorzystywane w eksperymencie. Umieścić młode w takich samych warunkach, jak w eksperymencie (patrz 2.3.1). Zamknąć drzwiczki. Dostosować wzmocnienie na karcie dźwiękowej tak, aby osiągnęło maksymalną wartość (w celu uzyskania jak najwyższej amplitudy wokalizacji), ale bez przeciążenia sygnału (sprawdzić na wyświetlaczu spektrogramu w czasie rzeczywistym w oprogramowaniu do nagrywania).
      Uwaga: Kilka wołań może być przeciążonych, jeśli amplituda większości wołań zostanie utrzymana na najwyższym możliwym poziomie.
    4. Zarejestrować poziom wzmocnienia dla każdej sesji nagraniowej i nie zmieniać go pomiędzy młodymi/miotami/sesjami. Zróżnicowanie poziomów wzmocnienia prowadziłoby do nieprawidłowego wykrywania wołań i błędnych pomiarów zmiennych akustycznych przy zastosowaniu tych samych progów w analizach z wykorzystaniem automatycznej detekcji i pomiarów (patrz 5.1 do 5.4).

Układ do analizy akustycznej z komorą dźwiękoszczelną; schematy przedstawiają wzorce częstotliwości w kHz.
Rycina 1: Układ do rejestracji wołań izolacyjnych młodych myszy oraz spektrogramy wokalizacji ultradźwiękowych. (A) Przykład własnoręcznie wykonanej komory dźwiękoszczelnej do rejestracji wołań izolacyjnych młodych. (B) Spektrogramy różnych typów wołań zastosowanych w niniejszej klasyfikacji typów wołań; opis znajduje się w Tabeli 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Rejestrację wołań izolacyjnych szczeniąt należy przeprowadzać co dwa dni. W przypadku szczeniąt urodzonych w nocy nagrania wykonuje się rano, a w przypadku szczeniąt urodzonych w dzień – po południu, aby uniknąć przypisania do tej samej klasy wiekowej szczeniąt różniących się wiekiem o pół doby. Jest to najbardziej zauważalne w bardzo wczesnych stadiach P2 i P4.
    1. Wyjąć jedno szczenię z miotu. Umieścić je tak szybko i delikatnie, jak to możliwe, w plastikowym pojemniku umytym 10% etanolem i osuszonym (średnica: 9 cm; wysokość: 10 cm, aby zapobiec ucieczce starszych szczeniąt z obszaru objętego mikrofonem). Postawić pojemnik bezpośrednio pod mikrofonem.
    2. Zamknąć pudełko tak szybko i cicho, jak to możliwe. Rozpocząć rejestrację ultradźwiękowych wokalizacji szczeniąt w oprogramowaniu do nagrywania (format 16-bitowy, częstotliwość próbkowania 300 kHz, aby wysokiej jakości zarejestrować amplitudę dźwięku do 150 kHz).
    3. Po upływie wymaganego czasu nagrywania (do 5 min) zatrzymać rejestrację. Wyjąć szczenię z pudełka. Zapisać tatuaże na łapach szczenięcia.
    4. Zmierzyć temperaturę pachową szczenięcia za pomocą termometru sondowego. Oznaczyć szczenię na grzbiecie małą kropką bezzapachowego pisaka (tusz wodny), aby łatwiej rozpoznawać już nagrane osobniki w gnieździe podczas wyboru kolejnego i uniknąć manipulowania wszystkimi szczeniętami przy każdym wyborze. Odłożyć szczenię z powrotem do gniazda.
    5. Umyć plastikowy pojemnik oraz plastikową wyściółkę jego dna 10% etanolem i dobrze osuszyć przed umieszczeniem w środku kolejnego szczenięcia.
    6. Wybrać kolejne szczenię z miotu i powtórzyć kroki 2.3.
  2. Po 1 h odpoczynku, aby umożliwić szczeniętom regenerację po wyczerpującej emisji wokalizacji ultradźwiękowych, sprawdzić masę ciała, koordynację ruchową, negatywną geotaksję oraz wskaźniki rozwojowe (szczegóły dotyczące zredukowanego zestawu testów znajdują się w sekcjach metodologicznych u Schmeisser et al.18 oraz Ey et al.19). W przypadku przeprowadzenia pełnego zestawu testów rozwojowych, takich jak u Chadman et al.20 i Scattoni et al.21, należy wykorzystać inną kohortę zwierząt.
  3. Powtarzać te nagrania co dwa dni od P2 do P12, aby scharakteryzować zachowania wokalne i rozwój szczeniąt w ciągu pierwszych dwóch tygodni życia.

3. Wokalizacje ultradźwiękowe podczas interakcji społecznych osobników tej samej płci

  1. Nagrania wokalizacji
    1. Przygotować klatkę testową (50 x 25 cm x 30 cm)3; Plexiglas, 100 luksów [białe światło o niskim natężeniu]) wyczyszczone wodą z mydłem, osuszone i wypełnione 2 cm świeżej ściółki w komorze dźwiękoszczelnej.
      1. Umieść mikrofon w taki sposób, aby możliwe było zarejestrowanie wokalizacji emitowanych z każdego narożnika klatki. Zamocuj mikrofon w narożniku klatki testowej (bezpośrednio na klatce lub na statywie) i dostosuj kąt nachylenia mikrofonu względem dna klatki tak, aby objął on całą jej powierzchnię.
        Uwaga: Ultradźwięki są bardzo kierunkowe.
      2. Umieść kamerę wideo na górze komory dźwiękoszczelnej, aby objąć całą powierzchnię klatki testowej.
        Uwaga: Należy sprawdzić, czy mikrofon nie zasłania narożnika klatki testowej na nagraniu wideo.
      3. Przed rozpoczęciem testów należy dostosować wzmocnienie karty dźwiękowej, wykorzystując do tego zapasowego samca i zapasową samicę, które nie będą później używane w eksperymencie. Umieść te zwierzęta w klatce testowej w komorze rejestracyjnej. Dostosuj poziom wzmocnienia na karcie dźwiękowej tak, aby zmaksymalizować amplitudę rejestrowanych wokalizacji, jednocześnie minimalizując przesterowanie, co można monitorować na spektrogramie wyświetlanym w czasie rzeczywistym w oprogramowaniu do rejestracji.
        Uwaga: Wzmocnienie zależy od odległości między mikrofonem a wokalizującymi zwierzętami.
    2. Umieść zwierzę przeznaczone do badania (samca lub samicę; będzie ono określane jako „lokator”) w klatce testowej na świeżej ściółce. Pozostaw je w klatce testowej w wyciszonej komorze na 20 min w celu habituacji, aby zmaksymalizować jego zainteresowanie nieznanym osobnikiem tego samego gatunku, który zostanie wprowadzony w punkcie 3.1.3.
    3. Po tym czasie habituacji wprowadź 2nd zwierzę do interakcji (samiec lub samica, tej samej płci co osobnik przebywający w klatce, ale z innymi oznaczeniami ucha / tatuażem na łapie w celu późniejszej identyfikacji; będzie ono nazywane „nowym przybyszem”).
      1. Rozpocznij rejestrację wokalizacji ultradźwiękowych (format 16-bitowy, częstotliwość próbkowania 300 kHz w celu wysokiej jakości rejestracji amplitudy dźwięku do 150 kHz) oraz wideo, aby utrwalić wprowadzenie nowego osobnika do klatki testowej. Rozpocznij rejestrację wokalizacji ultradźwiękowych podczas habituacji (samotnego przebywania osobnika w klatce), jeśli wymagane jest porównanie bazowego poziomu emisji wokalizacji podczas eksploracji klatki z interakcją społeczną.
      2. Zsynchronizuj ręcznie/wizualnie nagrania audio i wideo, naciskając stoper („bip” przy mikrofonie) dokładnie w momencie, gdy tylne łapy nowo wprowadzonej myszy dotkną podłoża.
      3. Pozostaw dwa zwierzęta w interakcji przez pożądany czas (na przykład 4 min, co jest czasem wystarczającym do zebrania odpowiedniej liczby wokalizacji ultradźwiękowych).
    4. Umieść osobnika zajmującego klatkę oraz nowo wprowadzonego osobnika z powrotem w ich odpowiednich klatkach macierzystych. Usuń zużytą ściółkę z klatki testowej, umyj ją wodą z mydłem i osusz ręcznikami papierowymi. Wsyp świeżą ściółkę i umieść klatkę z powrotem w komorze dźwiękochłonnej w celu przeprowadzenia kolejnego testu.

4. Wokalizacje samców podczas interakcji z samicą w rui

  1. Rano, w dniu testowania samców, pobierz wymazy z pochwy od każdej samicy, aby określić ich status seksualny w cyklu rujowym.
    1. Przytrzymaj samicę za ogon, utrzymując ją na kratce klatki. Za pomocą pipety kilkakrotnie przemyj pochwę za pomocą 20 µl PBS (bufor fosforanowy)t. j., wstrzyknąć i ponownie zebrać to samo 20 µl (kilkukrotnie w PBS). Ponownie zebrać 20 µl PBS za pomocą tej samej końcówki do pipety. Należy używać sterylnego roztworu PBS, aby uniknąć infekcji, jeśli samice mają być badane przez kilka kolejnych dni.
    2. Rozprowadzić PBS zawierający zawiesinę komórek pochwy na szkiełku przedmiotowym. Na jednym szkiełku umieścić cztery próbki (oznaczyć osoby na boku szkiełka za pomocą ołówka). Pozostawić szkiełka do wyschnięcia przed przystąpieniem do barwienia.
    3. Pracować pod dygestorium laboratoryjnym.
      1. Przygotuj jedną kąpiel z czystym barwnikiem May-Grünwalda, jedną kąpiel z roztworem buforu fosforanowego (0,1 M) oraz jedną kąpiel z barwnikiem Giemsa R (rozcieńczenie 1/20 w roztworze buforu fosforanowego).
      2. Zanurz preparaty w kąpieli z czystym roztworem May-Grünwalda na 3 min, następnie płucz je w kąpieli z roztworem buforu fosforanowego przez 1 min i na koniec przenieś na 10 min do kąpieli z Giemsą R (rozcieńczenie 1/20 w roztworze buforu fosforanowego).
      3. Następnie ponownie wypłucz preparaty w kąpieli z roztworu buforu fosforanowego przez 10 s i pozostaw do wyschnięcia.
    4. Obejrzyj barwione preparaty pod mikroskopem. Samice, które mogą być wykorzystane w ciągu dnia, to te, których próbki zawierają wyłącznie duże zrogowaciałe komórki nabłonka (bez jąder, zabarwione na niebiesko; pełna ruja).
  2. Umieść samce w pomieszczeniu testowym co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem testów.
  3. Nagrania wokalizacji
    1. W razie potrzeby powtórzyć krok 3.1.
    2. Wprowadź samca przeznaczonego do badania (na świeżą ściółkę). Pozostaw go w klatce testowej w komorze wygłuszonej na 10 min w celu habituacji.
    3. Po tym czasie habituacji wprowadź samicę w rucie (wybraną spośród osobników wytypowanych na podstawie barwienia).
      1. Rozpocząć rejestrację wokalizacji ultradźwiękowych oraz nagrywanie wideo, aby uchwycić moment wprowadzenia samicy do klatki testowej. Rozpocząć rejestrację wokalizacji ultradźwiękowych podczas habituacji (samiec pozostaje sam), jeśli wymagane jest porównanie bazowego poziomu emisji wokalizacji podczas eksploracji klatki z interakcją społeczną.
      2. Zsynchronizuj ręcznie/wizualnie nagrania audio i wideo, naciskając stoper (dźwięk „bip” w pobliżu mikrofonu) dokładnie w momencie, gdy tylne łapy samicy myszy dotykają podłoża.
      3. Pozostaw dwa zwierzęta w interakcji przez pożądany czas (na przykład 4 min, co jest czasem wystarczającym do zebrania odpowiedniej liczby wokalizacji ultradźwiękowych).
    4. Przenieś samca i samicę z powrotem do ich odpowiednich klatek domowych. Usuń zużytą ściółkę z klatki testowej, umyj ją wodą z mydłem i osusz ręcznikami papierowymi. Wsyp świeżą ściółkę i umieść klatkę z powrotem w komorze wyciszonej w celu przeprowadzenia kolejnego testu.
      Uwaga: Optymalnie jest wykorzystać każdą samicę w rui tylko raz dziennie (jeśli jednak jest to konieczne, można ją wykorzystać do 3 razy w tym samym dniu, ale nie bezpośrednio po sobie).

5. Zmienne do wyekstrahowania

  1. Przygotuj pliki audio do analizy. Uwaga: poniższa procedura jest specyficzna dla Avisoft SASLab Pro i mogą ulegać zmianie w zależności od zastosowanego oprogramowania.
    1. Przytnąć pliki tak, aby rozpoczynały się dokładnie w momencie sygnału dźwiękowego („bip”) stoperem i kończyły po pożądanym czasie trwania (5 min w przypadku pomiarów u szczeniąt, 4 min w przypadku pomiarów u osobników dorosłych).
    2. Odsącz amplitudę poniżej 30 kHz, stosując filtr górnoprzepustowy (Edytuj>Filtr>filtr FIR w dziedzinie czasu; filtr górnoprzepustowy z częstotliwością odcięcia 30 kHz). Użyj przetwarzania wsadowego, aby przefiltrować wszystkie interesujące pliki (Akcje>Przetwarzanie wsadowe>filtr FIR (filtr o skończonej odpowiedzi impulsowej).
    3. Zidentyfikuj każdą wokalizację ultradźwiękową, etykietując je za pomocą oprogramowania.
      1. Użyj automatycznego wykrywania do rejestracji szczeniąt (Narzędzia>Etykiety>Twórz etykiety sekcji na podstawie zdarzeń przebiegu fali. Dostosuj próg, czas podtrzymania (hold time) oraz margines, aby uzyskać najdokładniejszą detekcję. Ręcznie sprawdź wyniki detekcji i w razie potrzeby skoryguj etykiety (zalecane).
      2. W przypadku nagrań osobników dorosłych z szumem tła należy zastosować detekcję wizualną (ręczne wstawianie etykiet) (wybrać wokalizacje, kliknąć prawym przyciskiem myszy i wstawić etykietę sekcji z markera).
    4. Utwórz spektrogram. Aktywuj automatyczne pomiary parametrów (Narzędzia>Automatyczne pomiary parametrów>Konfiguracja automatycznych pomiarów parametrów).
    5. Zaznacz pola „Enable automatic measurements”, „Compute parameters from entire spectrogram” oraz „Automatic update”. W opcji „Element separation” wybierz: interactively (section labels).
    6. Zaznacz pola wyboru, aby obliczyć żądane parametry czasowe (Czas trwania elementu, Interwał, Czas rozpoczęcia/zakończenia) i parametry oparte na widmie (Częstotliwość szczytowa) oraz miejsce pomiarów (Początek elementu, Koniec elementu, Średnia, Maksimum, Minimum).
    7. Skopiuj pomiary i wklej je do arkusza kalkulacyjnego.
      Uwaga: W przypadku nagrań przeprowadzonych z udziałem osób dorosłych pomiary parametrów opartych na widmie mogą być niemożliwe ze względu na szum tła. Należy zastosować ręczny pomiar częstotliwości szczytowej, klikając w odpowiednie wartości częstotliwości bezpośrednio na spektrogramie i wprowadzając te wartości ręcznie do tabeli.
  2. Wyznacz stopień odczytu (call rate), tj. liczbę sygnałów na minutę, najpierw określając liczbę emitowanych wokalizacji (całkowitą liczbę etykiet). Następnie oblicz częstotliwość sygnałów, dzieląc całkowitą liczbę zarejestrowanych wokalizacji przez czas trwania pliku (w minutach).
  3. Określenie organizacji czasowej, t. j., rozkład odstępów czasowych między wołaniami w celu określenia organizacji sekwencji.
    1. Oblicz odstępy czasowe pomiędzy końcem wokalizacji n a początkiem wokalizacji n+1, korzystając z czasu rozpoczęcia/zakończenia każdej etykiety.
    2. Wyznacz gęstość rozkładu odstępów czasowych między wokalizacjami ultradźwiękowymi.
  4. Określenie repertuaru sygnałów dźwiękowych, t. j. zdefiniuj typy sygnałów występujące w nagraniu. Wykorzystaj przykład klasyfikacji przedstawiony w Tabela 1 i Rycina 1B.
    1. Podczas etykietowania każdej wokalizacji w punkcie 5.1.3 w etykiecie należy wpisać nazwę typu sygnału.
    2. Oblicz dokładną liczbę i proporcję każdego typu głosu w celu zbudowania repertuaru wokalnego.
  5. Wyznacz charakterystykę akustyczną dla każdej wokalizacji, t.j. czas trwania, częstotliwość szczytowa (t. j. częstotliwość o najwyższej amplitudzie) na początku i na końcu wokalizacji, maksymalną i minimalną częstotliwość szczytową oraz częstotliwość średnią, jeśli możliwe jest automatyczne pomiar (Rycina 1B).
    1. Użyj funkcji automatycznego pomiaru parametrów w oprogramowaniu, aby automatycznie zmierzyć czas trwania oraz charakterystyki częstotliwości szczytowej (np., start, koniec, średnia, maksimum, minimum) w rejestracjach szczeniąt.
    2. W przypadku nagrań osobników dorosłych przyjmij czas trwania etykiety jako czas trwania wokalizacji. Na oknie spektrogramu zmierz ręcznie charakterystyki częstotliwości szczytowej (np. początek, koniec, maksimum, minimum).
  6. skoreluj dane dotyczące wokalizacji ultradźwiękowych z danymi dotyczącymi interakcji społecznych (MiceProfiler wtyczka z platformy ICY22).
    1. Należy zadbać o jak najdokładniejszą synchronizację nagrań audio i wideo, zgodnie z opisem zawartym w protokole.
    2. Zakoduj nagranie wideo interakcji społecznej za pomocą System śledzenia profilu myszy wtyczka platformy ICY opisana przez de Chaumonta i wsp..22Rozpocznij śledzenie dokładnie w momencie, gdy tylne łapy wprowadzonego zwierzęcia dotkną podłoża.
    3. Prześlij zakodowany plik wideo oraz odpowiadający mu plik xml (wygenerowany przez Kierowca śledzenia profilu myszy) w Tworzenie etykiet wideo dla programu Mice Profiler wtyczka platformy ICY opisana przez de Chaumonta i in..22.
      Uwaga: Tworzenie etykiet wideo w programie Mice Profiler Wtyczka automatycznie połączy plik wideo z plikiem tekstowym wygenerowanym z analizy pliku audio, jeśli mają one tę samą nazwę (patrz: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Video_Label_Maker).
    4. Po upewnieniu się, że skala myszy jest prawidłowa, kliknij „Create USV stats” dla każdego pliku, aby uzyskać liczbę i proporcję wokalizacji emitowanych podczas każdego zdarzenia społecznego w osobnym pliku.

6. Przesyłanie plików do bazy danych mouseTube

  1. Upewnij się, że pliki znajdują się na serwerze dyskowym, który jest dostępny spoza instytucji.
    Uwaga: Serwery hostowane w niektórych instytucjach o wysokim poziomie bezpieczeństwa będą wymagały specyficznej konfiguracji, aby były dostępne dla osób łączących się spoza instytucji.
  2. Wejdź na stronę internetową mouseTube (http://mousetube.pasteur.fr). Zaloguj się (login i hasło są przydzielane każdemu użytkownikowi przez administratorów).
  3. Sprawdź, czy zarejestrowana szczep myszy istnieje już w bazie danych mouseTube, klikając przycisk „Strains”. Jeśli nie, poproś administratorów o jej utworzenie.
  4. Utwórz podmioty, korzystając z przycisku „Subjects>Create”. Wprowadź kody identyfikacyjne zarejestrowanych zwierząt. Pogrupuj je, aby ułatwić późniejsze wyszukiwanie danych.
  5. Wprowadź opis protokołu użytego do rejestracji wokalizacji ultradźwiękowych, korzystając z przycisku „Protocols>Create”.
  6. Utwórz eksperyment dla każdej sesji nagraniowej, korzystając z przycisku „Experiments>Create”. Określ protokół, grupę nagranych osobników, wykorzystany sprzęt i oprogramowanie oraz ich specyfikację.
    Uwaga: Eksperyment gromadzi wszystkie metadane odpowiadające plikom z wokalizacjami.
  7. Utwórz link do plików z wokalizacjami, korzystając z przycisku „Vocalisations>Create”. Wybierz eksperyment z listy. Skopiuj i wklej adres URL pliku z wokalizacją (link ten zaczyna się od http://…) do odpowiedniego pola w kolumnie „Files to link”. Zatwierdź wpisy, klikając przycisk „Create a link between mouseTube and the files”.
    Uwaga: Nie jest wymagane wypełnianie wszystkich pól dla każdego pliku w tym samym czasie.
  8. W razie potrzeby zmodyfikuj wprowadzone linki w dowolnym momencie i dodaj szczegóły w sekcji „Notes”. Nie wahaj się zapisywać notatek, aby podać więcej szczegółów. Na przykład, jeśli wprowadzono link do pliku wideo, który został zarejestrowany jednocześnie z plikiem audio, można to określić w sekcji „Notes”.

Wyniki

W ramach niniejszych protokołów scharakteryzowaliśmy zachowanie wokalne myszy z brakiem ProSAP1/Shank2, genu powiązanego z zaburzeniami spektrum autyzmu (ASD)23-25. ASD charakteryzują się deficytami w komunikacji społecznej oraz stereotypowymi zachowaniami1. Nasze myszy Shank2-/- wykazywały nadaktywność, zwiększony lęk oraz atypową komunikację wokalną18,26. Rzeczywiście odnotowaliśmy, że myszy Shank2-/- wykazywały atypowy profil rozwojowy w częstotliwości emisji wołań izolacyjnych młodych w porównaniu z typową krzywą w kształcie odwróconej litery U u ich rodzeństwa typu dzikiego. Myszy Shank2-/- wykazywały zwiększoną częstotliwość wołań w P4 i zmniejszoną częstotliwość w P6 w porównaniu z rodzeństwem typu dzikiego (Rycina 2). Zaobserwowaliśmy również zmniejszoną częstotliwość wołań w interakcjach samic z udziałem samicy Shank2-/- w porównaniu z interakcjami z udziałem rodzeństwa typu dzikiego (Rycina 2). Zbadaliśmy repertuar 5 różnych kategorii wołań. Okazał się on różny pomiędzy młodymi (np. tutaj P2, P6 i P10) a osobnikami dorosłymi (Rycina 3). Różnice związane z genotypem były istotne głównie w wieku dorosłym. Podczas interakcji społecznych dorosłych samców lub samic Shank2-/- z samicą C57BL/6N zarejestrowano więcej krótkich wołań i wołań nieustrukturyzowanych w porównaniu z interakcjami z udziałem ich rodzeństwa typu dzikiego (Rycina 3D i E). Mniej złożonych wołań oraz wołań z przeskokami częstotliwości zarejestrowano również podczas interakcji dorosłych samic Shank2-/- z samicą C57BL/6N w porównaniu z interakcjami samic Shank2+/+ (Rycina 3E). Na koniec dokonaliśmy również ręcznego pomiaru zmiennych akustycznych. W trakcie rozwoju nie stwierdzono istotnych różnic związanych z genotypem. W przeciwieństwie do tego, czas trwania wołań zarejestrowanych podczas interakcji dorosłych samic Shank2-/- był krótszy niż tych zarejestrowanych podczas interakcji ich rodzeństwa typu dzikiego (Rycina 4A). Podkreśliliśmy również, że częstotliwość szczytowa wokalizacji ultradźwiękowych wzrastała podczas rozwoju młodych bez istotnych różnic związanych z genotypem26. Podczas interakcji samców lub samic Shank2-/- z samicą C57BL/6N wokalizacje ultradźwiękowe miały niższą częstotliwość szczytową w porównaniu z wołaniami zarejestrowanymi podczas interakcji ich rodzeństwa typu dzikiego (Rycina 4B).

Ponadto niniejszy protokół umożliwił badanie kontekstu emisji wokalizacji ultradźwiękowych poprzez połączenie danych z nagrań audio z danymi behawioralnymi uzyskanymi z programu MiceProfiler (oprogramowanie ICY, Institut Pasteur, Paryż). Na przykład w interakcjach samica-samica większość wokalizacji ultradźwiękowych była emitowana, gdy zwierzęta były w kontakcie, a konkretnie gdy osobnik przebywający w klatce wąchał obszar anogenitalny nowo wprowadzonego osobnika lub gdy przynajmniej znajdował się za nim. Myszy emitowały również wiele wokalizacji ultradźwiękowych, gdy osobnik przebywający w klatce zbliżał się do nowo wprowadzonego osobnika (Rysunek 5, panel górny). Odnotowano mniej wokalizacji, gdy myszy Shank2-/- przebywające w klatce były w kontakcie fizycznym z nowo wprowadzonym osobnikiem (np. wąchając obszar anogenitalny nowo wprowadzonego osobnika), niż gdy osobnik przebywający w klatce był myszą typu dzikiego. Mniej wokalizacji było wyzwalanych, gdy osobnik znajdujący się za nowo wprowadzonym zwierzęciem był myszą Shank2-/-, niż gdy była to mysz typu dzikiego. Więcej wokalizacji zarejestrowano również wtedy, gdy nowo wprowadzony osobnik znajdował się w polu widzenia myszy przebywającej w klatce, przy czym zjawisko to było wyraźniejsze u osobników typu dzikiego niż u mutantów (Rysunek 5, panel dolny).

Wykres porównawczy częstości wokalizacji, typy dzikie vs Shank2 -/-, istotność statystyczna zaznaczona gwiazdkami.
Rycina 2: Częstość emisji wokalizacji ultradźwiękowych podczas rozwoju oraz u dorosłych samców i samic myszy Shank2-/- oraz ich rodzeństwa typu dzikiego. Częstość wokalizacji szczeniąt (co dwa dni od P2 do P12, n = 18-19 Shank2+/+, n = 15-16 Shank2-/-) i osobników dorosłych podczas interakcji samca z samicą w rui (n = 15 Shank2+/+, n = 16 Shank2-/-) oraz interakcji samica-samica (n = 15 Shank2+/+, n = 13 Shank2-/-) u myszy typu dzikiego (panel lewy) i myszy Shank2-/- (panel prawy). Dane przedstawiono jako średnia+/-SEM oraz punkty indywidualne (nieparzysty test Wilcoxona: *p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Proporcja sygnałów wokalnych u myszy typu dzikiego i Shank2-/-; wielokrotne wykresy słupkowe; analiza wokalizacji.
Rysunek 3: Repertuar wokalny myszy Shank2-/- i ich rodzeństwa typu dzikiego. Proporcje pięciu różnych typów sygnałów emitowanych przez szczenięta P2 (A; n = 20 Shank2+/+, n = 18 Shank2-/-), szczenięta P6 (B; n = 19 Shank2+/+, n = 18 Shank2-/-), szczenięta P10 (C; n = 20 Shank2+/+, n = 18 Shank2-/-), dorosłych samców w obecności samicy w rutcie (D; n = 16 Shank2+/+, n=16 Shank2-/-) oraz dorosłych samic w obecności innej samicy (E; n = 15 Shank2+/+, n=13 Shank2-/-) u myszy typu dzikiego (panele lewe) i myszy Shank2-/- (panele prawe). Dane przedstawiono jako średnia+/-SEM oraz punkty indywidualne (testy chi-kwadrat: *p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Porównanie czasu trwania sygnału i maksymalnej częstotliwości szczytowej; typ dziki vs Shank2-/-. Wykres słupkowy; analiza statystyczna.
Rysunek 4: Zmienne akustyczne wyekstrahowane z wokalizacji ultradźwiękowych u myszy Shank2-/- oraz ich rodzeństwa typu dzikiego. (A) Czas trwania wszystkich połączonych typów sygnałów emitowanych przez młode w dniu P2 (n = 20 Shank2+/+, n = 18 Shank2-/-), młode w dniu P6 (n = 19 Shank2+/+, n = 18 Shank2-/-), młode w dniu P10 (n = 20 Shank2+/+, n = 18 Shank2-/-), dorosłe samce z samicą w rutcie (n = 16 Shank2+/+, n = 16 Shank2-/-) oraz dorosłe samice z inną samicą (n = 15 Shank2+/+, n = 13 Shank2-/-) u myszy typu dzikiego (panel lewy) i myszy Shank2-/- (panel prawy). (B) Maksymalna częstotliwość szczytowa zmierzona dla wszystkich połączonych typów sygnałów u młodych w dniu P2, P6, P10, dorosłych samców z samicą w rutcie oraz dorosłych samic z inną samicą (te same wartości N co powyżej). Dane przedstawiono jako średnia+/-SEM oraz punkty indywidualne (nieparametryczne testy Wilcoxona: *p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Procenty wokalizacji ultradźwiękowych, genotypy Shank2, analiza wykresu słupkowego, porównanie statystyczne.
Rycina 5: Konteksty emisji ultradźwiękowych wokalizacji myszy w dorosłych interakcjach społecznych samica-samica. Proporcja wokalizacji ultradźwiękowych emitowanych przez pary składające się z myszy Shank2+/+ i myszy C57BL/6N (n = 16, A) oraz pary składające się z myszy Shank2-/- i myszy C57BL/6N (n = 13, B) podczas następujących typów zdarzeń behawioralnych (czerwony: osobnik przebywający w klatce, zielony: osobnik nowy): kontakty społeczne, kontakt oro-oralny, węszenie anogenitalne przez osobnika przebywającego w klatce, węszenie anogenitalne przez osobnika nowego, osobnik przebywający w klatce za osobnikiem nowym, osobnik nowy za osobnikiem przebywającym w klatce, bezruch osobnika przebywającego w klatce, bezruch osobnika nowego, podejście osobnika przebywającego w klatce i ucieczka osobnika nowego, podejście osobnika nowego i ucieczka osobnika przebywającego w klatce, podejście i ucieczka osobnika przebywającego w klatce, podejście i ucieczka osobnika nowego, osobnik przebywający w klatce podążający za osobnikiem nowym, osobnik nowy w polu widzenia osobnika przebywającego w klatce, osobnik przebywający w klatce w polu widzenia osobnika nowego. Dane przedstawiono jako średnia+/-SEM i punkty indywidualne (nieparzyste testy Wilcoxona: *p <0,05, **p <0,01). Dane niepublikowane. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Typy połączeńOpis
krótkiczas trwania ≤5 ms i zakres częstotliwości ≤6,25 kHz
prostyczas trwania >5 ms i zakres częstotliwości ≤6,25 kHz (płaska charakterystyka), lub modulacja częstotliwości tylko w jednym kierunku (w górę lub w dół) z zakresem częstotliwości >6,25 kHz
kompleksmodulacje częstotliwości w więcej niż jednym kierunku i zakresie częstotliwości >6,25 kHz (modulowane) lub włączenie jednej lub więcej dodatkowych składowych częstotliwości (harmonicznych lub zjawisk nieliniowych, ale bez nasycenia), przy czym nie ma ograniczeń co do zakresu częstotliwości (złożone)
skoki częstotliwościuwzględnienie jednego skoku (jednego skoku częstotliwości) lub większej liczby skoków (skoków częstotliwości, innych) w częstotliwości bez przerwy czasowej między kolejnymi składowymi częstotliwości, z (mieszaną) lub bez jakiejkolwiek części szumowej w obrębie czystego sygnału dźwiękowego
niestrukturalnybrak identyfikowalnej składowej czystego tonu; sygnały „szumiące”

Tabela 1: Charakterystyka pięciu typów ultradźwiękowych wokalizacji myszy.Przykłady kryteriów czasu trwania, zakresu częstotliwości, modulacji częstotliwości oraz skoków częstotliwości wykorzystywanych do określenia 5 różnych typów wokalizacji w ramach ultradźwiękowych wokalizacji myszy.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół zapewnia ustandaryzowane i niezawodne sposoby zbierania wokalizacji ultradźwiękowych myszy w laboratorium. Te bardzo ograniczone sytuacje stanowią zaletę standaryzacji. Są one z powodzeniem wykorzystywane do porównywania szczepów lub genotypów w obrębie szczepów18,19,26,27. Jak przedstawiono w reprezentatywnych wynikach, metody te pozwalają na identyfikację nietypowej komunikacji społecznej u myszy zmutowanych na Shank2, gen związany z zaburzeniami ze spektrum autyzmu. Porównania między szczepami myszy, między różnymi kontekstami, a nawet między laboratoriami, będą wywołane dostępnością większych zbiorów danych w bazie danych mouseTube . To narzędzie powinno przyspieszyć badania nad ultradźwiękowymi wokalizacjami myszy, umożliwiając analizy wielowymiarowe.

Opisane tutaj protokoły są zoptymalizowane pod kątem testowania myszy o różnych genotypach w obrębie szczepu, tak jak ma to miejsce w większości badań modelujących genetyczny wkład w zaburzenia neuropsychiatryczne. Zaleca się eksperymentalne zaprojektowanie każdego badania w taki sposób, aby zapewnić jak najlepszą kontrolę. Rzeczywiście, efekty zaśmiecania mogą maskować lub sztucznie zawyżać skutki genetyczne28,29. W związku z tym zaleca się włączenie kontroli rodzeństwa z miotu dla każdego genotypu. Należy zatem faworyzować hodowlę heterozygotycznych rodziców, ponieważ pozwoli to na prawidłowe dopasowanie myszy zmutowanych i kontrolnych w miocie. Uzasadnia to oznaczanie tatuaży na łapach wszystkich szczeniąt (ślepych na genotyp) w celu śledzenia osobników w nagraniach co dwa dni. Genotypowanie przeprowadza się po odsadzeniu, pobierając próbki ogona. W przypadku nagrywania rozmów izolacyjnych szczeniąt od P2 nie zalecamy pobierania próbek ogona już u szczeniąt, ponieważ operacja ta obejmuje dodatkową manipulację i stres bardzo blisko sesji nagraniowej.

Sugerowane tutaj protokoły mające na celu wywołanie wokalizacji ultradźwiękowych u dorosłych nie pozwalają na wyraźną identyfikację emitera wokalizacji. To wyjaśnia, dlaczego manipulujemy motywacją zwierzęcia doświadczalnego. Rzeczywiście, myszy testowe są izolowane, a nie nowicjusze, a zwierzęta testowe przyzwyczajają się przez długi czas do klatki testowej podczas interakcji z osobami tej samej płci. W interakcjach męsko-żeńskich wprowadzona samica nie jest izolowana, a badany samiec przyzwyczaja się przez krótszy czas, ponieważ motywacja może być wyższa w tym kontekście seksualnym. Te manipulacje motywacją powinny maksymalizować prawdopodobieństwo, że mysz testowa emituje wokalizacje, a nie wprowadzona. Aby zarejestrować męskie wokalizacje ultradźwiękowe w kontekście seksualnym, do klatki można również wprowadzić prosty wacik ze świeżym (tj. nie zamrożonym) moczem samicy w rui30. Metoda ta pozwala na przypisanie wokalizacji ultradźwiękowych badanemu samcowi ze 100% pewnością, ale uniemożliwia zebranie jakichkolwiek konkretnych informacji na temat rzeczywistego kontekstu społecznego emisji tych wokalizacji. Dlatego faworyzujemy opisany tutaj protokół (ze swobodnie poruszającą się samicą rui). Zalecamy również, aby zawsze używać wprowadzonych myszy z tego samego szczepu podczas testowania myszy ze zmutowanego szczepu i analizować dane jako parę myszy wokalizujących. Jedno z ostatnich badań promuje zastosowanie triangulacji do lokalizacji emitera31. W tym badaniu stwierdzono, że samice emitują również wokalizacje ultradźwiękowe podczas spotkań z samcem. Można to wytłumaczyć tym, że byli izolowani przez co najmniej dwa tygodnie przed sesją nagraniową. Uogólnienie zastosowania triangulacji zaproponowane w tym badaniu powinno jednak pozwolić na identyfikację emitera wokalizacji w większości przypadków, jeśli nagrania wideo są prawidłowo zsynchronizowane.

Odgłosy izolacyjne szczeniąt nagrane podczas rozwoju nie są zakłócane przez hałas tła z ściółki. Zazwyczaj bardzo dobrze sprawdza się automatyczna analiza, która pozwala wyodrębnić główne zmienne. Natomiast wokalizacje nagrane przez dorosłe osobniki są zakłócane przez hałas tła zwierząt poruszających się po ściółce. Analiza automatyczna może zakończyć się niepowodzeniem i dlatego należy użyć analizy ręcznej. Niemniej jednak dodanie ściółki w klatce testowej powinno zapewnić warunki, które są mniej stresujące dla zwierząt niż goła gleba (której myszy nie lubią). Dalsze wysiłki społeczności koncentrują się na poprawie automatycznego wykrywania wokalizacji ultradźwiękowych w różnych warunkach, nawet tych, które sugerują dźwięki tła. Na przykład oprogramowanie VoICE pozwala analizować wokalizacje, które zostały ręcznie wybrane pod kątem braku szumu tła32. W tym oprogramowaniu ekstrakcja zmiennych akustycznych jest automatyczna, ale wymaga wstępnego wyboru ręcznego.

Należy zauważyć, że zmienność międzyosobnicza jest bardzo ważna w zachowaniu wokalnym myszy. Na przykład częstość nawoływania dorosłych samców w obecności samicy rui jest bardzo rozłożona (ryc. 1). Sugerujemy te ustandaryzowane protokoły, aby wywołać wokalizacje ultradźwiękowe już teraz, aby ograniczyć zmienność związaną z kontekstem eksperymentalnym. Niemniej jednak chcielibyśmy zwrócić uwagę na to, jak ważne jest przedstawienie nie tylko średniej i SEM dla danych, ale przede wszystkim poszczególnych punktów w próbkach o małej wielkości33. Bardzo istotne – jeśli nie konieczne – jest również rejestrowanie co najmniej 12 osobników z każdej grupy/genotypu w celu zebrania reprezentatywnych danych. W wielu przypadkach zmienność międzyosobnicza nie powinna być ukrywana (zwykle nie może być) i może mieć duże znaczenie dla identyfikacji osobników będących nosicielami badanej mutacji genetycznej, ale niewykazujących żadnego nietypowego fenotypu. Takie osoby mogą dostarczyć wskazówek na temat kompensacji, co może otworzyć nowe ścieżki terapii zaburzeń genetycznych.

W większości charakterystyk behawioralnych mysich modeli zaburzeń neuropsychiatrycznych zachowanie wokalne i kontakty społeczne są rozpatrywane oddzielnie (np. 19,27,34,35). Najnowsze metody analizy zapewniają obecnie półautomatyczną, szczegółową charakterystykę zdarzeń społecznych i sekwencji zdarzeń podczas interakcji (na przykład za pomocą MiceProfiler)36, a także możliwość łączenia tej analizy z danymi z nagrań dźwiękowych. Główną zaletą tej metody jest zapewnienie kompleksowego wglądu w komunikację społeczną w mysich modelach ASD, aby dokładniej określić, które aspekty komunikacji społecznej są dotknięte tym problemem. W obecnym protokole synchronizacja jest nadal ręczna, ale można to poprawić, uruchamiając nagrywanie wideo za pomocą oprogramowania do nagrywania dźwięku. Tego typu analizy powinny stać się standardem, aby zapewnić bardziej kompleksowe spojrzenie na deficyty komunikacji społecznej w mysich modelach zaburzeń neuropsychiatrycznych. Ponadto do tej pory sygnały głosowe analizowane są głównie od strony emitera (tzn. testy są budowane tak, aby sprzyjać emisji sygnałów głosowych przez badaną mysz, tak jak w obecnych protokołach). Należy teraz skupić się również na odbiorniku tych sygnałów, aby lepiej zidentyfikować funkcje tych sygnałów akustycznych. Powinno się to odbywać poprzez ocenę zachowania nowo przybyłych myszy w obecnych protokołach u dorosłych (na przykład przy użyciu MiceProfiler)36, poprzez wykorzystanie eksperymentów z odtwarzaniem16 lub poprzez ustanowienie nowych protokołów. Rzeczywiście, obecne protokoły przewidują bardzo ograniczone sytuacje, które mogą nie odzwierciedlać dokładnych warunków etologicznych emisji wokalizacji u myszy. Spontaniczna emisja wokalizacji ultradźwiękowych będzie musiała być lepiej scharakteryzowana za pomocą ciągłych nagrań audio i wideo, aby rzucić więcej światła na spontaniczne zachowanie wokalne myszy.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Fondation de France; przez ANR FLEXNEURIM [ANR09BLAN034003]; przez ANR [ANR- 08-MNPS-037-01-SynGen]; przez Neuron-ERANET (EUHF-AUTISM); przez Fondation Orange; przez Fondation FondaMentale; przez Fondation de France; przez Fondation Bettencourt-Schueller. Badania, które doprowadziły do powstania niniejszego artykułu, otrzymały również wsparcie Wspólnego Przedsięwzięcia Inicjatywy Innowacyjnej Medycyny na podstawie umowy o udzielenie dotacji nr 115300, której środki stanowią wkład finansowy z Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej (7PR/2007-2013) oraz wkład rzeczowy firm EFPIA. Dziękujemy Julie Lévi-Strauss za pomocne komentarze do manuskryptu oraz sześciorgu anonimowym recenzentom, których komentarze znacznie poprawiły rękopis.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
igły 0,3mm x 13 mm [30  G 1/2"]BD Microlance304000-zielona
pasta do tatuażuKetchum Manufacturing Inc., Ottawa, Kanada329AA-termometr
Fisherbrand, Waltham, USA4126 (W255NA)-
własnoręcznie wykonana komora dźwiękoszczelna (szczenięta)Instytut Pasteura, Paryż-piankaakustyczna + plexi; wymiary wewnętrzne (szer. x wys. x gł.): 32 cm x 33 cm x 32 cm
termister o małej powierzchni + termopara z pojedynczą sondąAparatura Harvarda599814 +
601956-bezwonny długopisna przykład: Tusz Giottowykonany z wody, zmywalny: te pisaki są przeznaczone dla niemowląt
Absolutny etanol (100%)Sigma Aldrich,  Saint-Quentin Fallavier, Francja24103rozcieńczony 1/10
Kondensacyjny mikrofon ultradźwiękowy Avisoft-Bioacoustics CM16/CMPAAvisoft Bioacoustics, Berlin, Niemcy#40011wyposażony w przedłużacze firmy Avisoft
Bramka ultradźwiękowa 416HAvisoft Bioacoustics, Berlin, Niemcy#34163karta dźwiękowa
Avisoft Recorder USGHAvisoft Bioacoustics, Berlin, Niemcy#10301; #10302oprogramowanie do nagrywania dla Windows Vista, 7 i 8
Avisoft SASLab ProAvisoft Bioacoustics, Berlin, Niemcy#10101, 10111; #10102, 10112;  Windows 10, 8.1, 8, 7 lub Vista, w tym komputer Apple Macintosh z procesorem Intel z oprogramowaniem Boot Camp, Parallels lub podobnym oprogramowaniem do wirtualizacji.
Laptop lub komputer Apple Macintosh z systemem Boot Camp—z systemem Windows 10, 8.1, 8, 7 lub Vista; w przypadku komputerów Apple Macintosh Boot Camp jest preferowany zamiast oprogramowania do wirtualizacji, takiego jak Parallels, ze względu na ograniczenia pamięci
plastikowy odbiornik (nagrania pup)Lock & Zamek, Chatswood, Stany ZjednoczoneHPL932DLock & Zamek Hermetyczny pojemnik do układania w stosy okrągły 700  Ml; używać bez pokrowca; Wymiary: 9  cm średnicy, 10 cm wysokości
PBS 1x (pH = 7,4)Gibco (Life Technologies)10010-023-szkiełka
Menzel-Glä ser, Thermo ScientificJ1800AMNZSuperfrost Plus
May-Grü nwald roztwór 500 mlRAL Ré actifs, Martillac, Francja320070-0500-Giemsa
R 500 mlRAL Ré actifs, Martillac, Francja720-1107rozcieńczony 1/20 w roztworze buforu fosforanowego
Fosforanowy roztwór buforowy (własnej roboty)--pH = 7, 0,1 M: 39 ml NaH2PO4 0,2 M + 61 ml Na2HPO4 0,2 M + 100  ml H2O (objętość końcowa: 200  ml)
klatka testowaInstitut Pasteur,Paryż-50  x  25  cm, 30  cm wysokości;
Własnoręcznie wykonana komora dźwiękoszczelna z pleksiglasu (nagrania dla dorosłych)Instytut Pasteura, Paryż-pianka akustyczna + PVC; wymiary wewnętrzne (szer. x wys. x gł.): 66 cm x 90 cm x 46 cm
kamera wideoZ Noldus Information Technologies, Wageningen, Holandia-kamera wideo CamTech Super-Hi-Res o wysokiej rozdzielczości; 25 kl./s 
EthoVision XTNoldus Information Technology, Wageningen, Holandiahttp://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xtoprogramowanie do akwizycji wideo
Wtyczka Mice Profiler Tracker z platformy ICYBio Image Analysis, Institut Pasteur, Paryżhttp://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Trackeroprogramowanie śledzące do analizy zdarzeń behawioralnych podczas interakcji społecznych

Bibliografia

  1. American Psychiatric Association. Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fifth Edition (DSM-V). , (2013).
  2. Ey, E., Leblond, C. S., Bourgeron, T. Behavioral Profiles of Mouse Models for Autism Spectrum Disorders. Autism Res. 4 (1), 5-16 (2011).
  3. Bourgeron, T., Jamain, S., Granon, S. Animal Models of Autism - Proposed Behavioral Paradigms and Biological Studies. Contemporary Clinical Neuroscience: Transgenic and Knockout Models of Neuropsychiatric Disorders. , 151-174 (2006).
  4. Scattoni, M. L., Crawley, J., Ricceri, L. Ultrasonic vocalizations: A tool for behavioural phenotyping of mouse models of neurodevelopmental disorders. Neurosci. Biobehav. Rev. 33 (4), 508-515 (2009).
  5. Portfors, C. V., Perkel, D. J. The role of ultrasonic vocalizations in mouse communication. Cur. Opin. Neurobiol. 28, 115-120 (2014).
  6. Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice, birds, and men: the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and song-learning birds. PLOS ONE. 7, e46610(2012).
  7. Hammerschmidt, K., Schreiweis, C., Minge, C., Pääbo, S., Fischer, J., Enard, W. A humanized version of Foxp2 does not affect ultrasonic vocalization in adult mice: Ultrasonic vocalization of "humanized" FoxP2 mice. Genes Brain Behav. , (2015).
  8. Portfors, C. V. Types and functions of ultrasonic vocalizations in laboratory rats and mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 46, 28-34 (2007).
  9. Panksepp, J. B., et al. Affiliative Behavior, Ultrasonic Communication and Social Reward Are Influenced by Genetic Variation in Adolescent Mice. PLOS ONE. 2, (2007).
  10. Zippelius, H. -M., Schleidt, W. M. Ultraschall-Laute bei jungen Mäusen. Naturwissenschaften. 43, 502(1956).
  11. Whitney, G., Coble, J. R., Stockton, M. D., Tilson, E. F. Ultrasonic emissions: do they facilitate courtship of mice. J. Comp. Physiol. Psychol. 84, 445-452 (1973).
  12. Holy, T. E., Guo, Z. S. Ultrasonic songs of male mice. PLOS Biol. 3, 2177-2186 (2005).
  13. Maggio, J. C., Whitney, G. Ultrasonic vocalizing by adult female mice (Mus musculus). J. Comp. Psychol. 99, 420-436 (1985).
  14. Chabout, J., et al. Adult Male Mice Emit Context-Specific Ultrasonic Vocalizations That Are Modulated by Prior Isolation or Group Rearing Environment. PLOS ONE. 7 (1), e29401(2012).
  15. Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. Female mice respond to male ultrasonic "songs" with approach behaviour. Biol. Lett. 5, 589-592 (2009).
  16. Wöhr, M., Moles, A., Schwarting, R. K. W., D'Amato, F. R. Lack of social exploratory activation in male -opioid receptor KO mice in response to playback of female ultrasonic vocalizations. Soc. Neurosci. 6, 76-87 (2011).
  17. Granon, S., Faure, P., Changeux, J. -P. Executive and social behaviors under nicotinic receptor regulation. Proc. Nat. Acad. Sci. 100 (16), 9596-9601 (2003).
  18. Schmeisser, M. J., et al. Autistic-like behaviours and hyperactivity in mice lacking ProSAP1/Shank2. Nature. 486 (7402), 256-260 (2012).
  19. Ey, E., et al. Absence of Deficits in Social Behaviors and Ultrasonic Vocalizations in Later Generations of Mice Lacking Neuroligin4. Genes Brain Behav. 11, 928-941 (2012).
  20. Chadman, K. K., et al. Minimal Aberrant Behavioral Phenotypes of Neuroligin-3 R451C Knockin Mice. Autism Res. 1, 147-158 (2008).
  21. Scattoni, M. L., Gandhy, S. U., Ricceri, L., Crawley, J. N. Unusual Repertoire of Vocalizations in the BTBR T plus tf/J Mouse Model of Autism. PLOS ONE. 3, (2008).
  22. De Chaumont, F., Coura, R. D. -S., et al. Computerized video analysis of social interactions in mice. Nat. Methods. 9, 410-417 (2012).
  23. Leblond, C. S., et al. Genetic and Functional Analyses of SHANK2 Mutations Suggest a Multiple Hit Model of Autism Spectrum Disorders. PLOS Genet. 8 (2), e1002521(2012).
  24. Berkel, S., et al. Mutations in the SHANK2 synaptic scaffolding gene in autism spectrum disorder and mental retardation. Nat. Genet. 42, 489-491 (2010).
  25. Pinto, D., et al. Functional impact of global rare copy number variation in autism spectrum disorders. Nature. 466, 368-372 (2010).
  26. Ey, E., et al. The autism ProSAP1/Shank2 mouse model displays quantitative and structural abnormalities in ultrasonic vocalisations. Behav. Brain Res. 256, 677-689 (2013).
  27. Scattoni, M. L., Ricceri, L., Crawley, J. N. Unusual repertoire of vocalizations in adult BTBR T plus tf/J mice during three types of social encounters. Genes Brain Behav. 10, 44-56 (2010).
  28. Zorrilla, E. P. Multiparous species present problems (and possibilities) to developmentalists. Dev. Psychobiol. 30 (2), 141-150 (1997).
  29. Lazic, S. E., Essioux, L. Improving basic and translational science by accounting for litter-to-litter variation in animal models. BMC Neurosci. 14 (1), 37(2013).
  30. Hoffmann, F., Musolf, K., Penn, D. J. Freezing urine reduces its efficacy for eliciting ultrasonic vocalizations from male mice. Physiol. Behav. 96, 602-605 (2009).
  31. Neunuebel, J. P., Taylor, A. L., Arthur, B. J., Egnor, S. R. Female mice ultrasonically interact with males during courtship displays. eLife. 4, (2015).
  32. Burkett, Z. D., Day, N. F., Peñagarikano, O., Geschwind, D. H., White, S. A. VoICE: A semi-automated pipeline for standardizing vocal analysis across models. Sci. Rep. 5, 10237(2015).
  33. Weissgerber, T. L., Milic, N. M., Winham, S. J., Garovic, V. D. Beyond Bar and Line Graphs: Time for a New Data Presentation Paradigm. PLOS Biol. 13 (4), e1002128(2015).
  34. Jamain, S., et al. Reduced social interaction and ultrasonic communication in a mouse model of monogenic heritable autism. Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 105, 1710-1715 (2008).
  35. Won, H., et al. Autistic-like social behaviour in Shank2-mutant mice improved by restoring NMDA receptor function. Nature. 486, 261-265 (2012).
  36. Ferhat, A. -T., Le Sourd, A. -M., de Chaumont, F., Olivo-Marin, J. -C., Bourgeron, T., Ey, E. Social Communication in Mice - Are There Optimal Cage Conditions? PLOS ONE. 10 (3), e0121802(2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Modele mysiezaburzenia ze spektrum autyzmugen Shank2d wi koszczelna skrzynkakondensacyjny mikrofon ultrad wi kowybaza danych mouseTubewo ania izolacyjne szczeni tinterakcje samc w i samic w wieku doros ym
Nagrywanie wokalizacji ultradźwiękowych myszy w celu oceny komunikacji społecznej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.