Tutaj prezentujemy protokół badania przesiewowego biblioteki sgRNA typu heptamer pod kątem potencjalnych leków terapeutycznych przeciwko nowotworom krwi.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
TRUE Gene Silencing: Badania przesiewowe małej biblioteki przewodnikowego RNA typu heptamer pod kątem potencjalnych środków terapeutycznych przeciwnowotworowych
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
PRAWDZIWE wyciszanie genów (nazwane od tRNase ZL-u kategolizującego skuteczne wyciszanie genów) jest jedną z technologii wyciszania genów kierowanych przez RNA, która wykorzystuje sztuczny mały przewodnik RNA (sgRNA) do kierowania procesowaniem endorybonukleazy tRNA 3′, tRNazy ZL, w celu rozpoznania docelowego RNA. sgRNA mogą być wychwytywane przez komórki bez żadnych odczynników transfekcyjnych i mogą obniżać ich docelowe poziomy RNA i/lub indukować apoptozę w ludzkim raku Komórek. Przebadaliśmy bibliotekę sgRNA zawierającą 156 sgRNA typu heptamer pod kątem wpływu na żywotność ludzkich komórek szpiczaka i białaczki i stwierdziliśmy, że 20 z nich może skutecznie indukować apoptozę w co najmniej jednej z linii komórek rakowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół badań przesiewowych biblioteki sgRNA typu heptamer pod kątem potencjalnych leków terapeutycznych przeciwko nowotworom krwi. Protokół zawiera informacje o tym, jak konstruować bibliotekę sgRNA, jak oceniać wpływ każdego sgRNA na żywotność komórki oraz jak dalej oceniać skuteczne sgRNA za pomocą cytometrii przepływowej. Oczekuje się, że około 2000 trafień zostanie uzyskanych poprzez badanie przesiewowe pełnowymiarowej biblioteki sgRNA składającej się z 16 384 heptamerów.
Wprowadzenie
PRAWDZIWE wyciszanie genów (nazwane od tRNase ZL-u tilizing eficacious gene mutencing) jest jedną z technologii wyciszania genów kierowanych przez RNA1. Technologia ta została opracowana w oparciu o właściwości tRNazy ZL (lub 3′ tRNazy), enorybonukleazy przetwarzającej tRNA 3′: może ona rozszczepić dowolny docelowy RNA w dowolnym oczekiwanym miejscu pod kierunkiem sztucznego małego przewodnika RNA (sgRNA), rozpoznając strukturę podobną do pre-tRNA lub mikro-pre-tRNA utworzoną między docelowym RNA a sgRNA 2-9. sgRNA, który ma zwykle długość 7-31 nt, jest podzielony na cztery grupy: 5′-pół-tRNA, heptamer RNA, 14-nt liniowy RNA i hakowy RNA.
Wykazaliśmy skuteczność PRAWDZIWEGO wyciszania genów, wprowadzając różne sztucznie zaprojektowane sgRNA do żywych komórek10-15. Wykazaliśmy również, że sgRNA mogą być wychwytywane przez komórki bez żadnych odczynników do transfekcji i mogą obniżać docelowe poziomy RNA i / lub indukować apoptozę w ludzkich komórkach rakowych16-18. Wydaje się, że wyciszanie genów TRUE działa na wewnątrzkomórkowy i międzykomórkowy system regulacji genów poprzez tRNazę ZL i naturalne sgRNA19-21.
Skonstruowaliśmy bibliotekę sgRNA zawierającą 156 sgRNA typu heptamer, aby szukać potencjalnych terapeutycznych sgRNA typu heptamer dla nowotworów krwi22. Przebadaliśmy go pod kątem wpływu na żywotność ludzkich komórek szpiczaka i białaczki i stwierdziliśmy, że 20 z nich może skutecznie indukować apoptozę w co najmniej jednej z linii komórek rakowych. Wykazano, że 4 z nich zmniejszają tempo wzrostu guza w eksperymentach z ksenoprzeszczepami myszy.
Tutaj prezentujemy protokół badań przesiewowych biblioteki sgRNA typu heptamer pod kątem potencjalnych leków terapeutycznych przeciwko nowotworom krwi. Protokół zawiera informacje o tym, jak konstruować bibliotekę sgRNA, jak oceniać wpływ każdego sgRNA na żywotność komórki oraz jak dalej oceniać skuteczne sgRNA za pomocą cytometrii przepływowej. Analiza docelowych RNA komórkowych sgRNA i ocena skutecznych sgRNA w mysich modelach ksenoprzeszczepów może być przeprowadzona zgodnie z konwencjonalnymi metodami17,22, chociaż nie są one uwzględnione w tym protokole.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Budowa biblioteki sgRNA typu heptamer
- Wybierz podzbiór 16 384 (47) sekwencji 7-nt, chyba że ma być skonstruowana biblioteka pełnowymiarowa.
UWAGA: Sekwencje mogą być losowe i/lub zaprojektowane tak, aby celować w określone komórkowe RNA. W tym ostatnim przypadku za pomocą odpowiedniego programu komputerowego i/lub wizualnie znajdź struktury spinki do włosów przypominające ramię T tRNA w docelowym RNA i wybierz sekwencje komplementarne do sekwencji 7-nt bezpośrednio za strukturami spinki do włosów4,10,17,18. - Zsyntetyzuj każdy z wybranych heptamerów jako w pełni 2′-O-metylowany, 5′- i 3′-fosforylowany RNA za pomocą syntezatora DNA/RNA. Zastosować metodę fosforamidytu na podłożu ze szkła o kontrolowanych porach (CPG) i pozostawić 5′-końcową grupę ochronną 4,4′-dimetoksytrytylu (DMT) włączoną w ostatnim cyklu (dodanie fosforanu 5′) syntezy23,
UWAGA: Niestandardowe syntetyczne RNA można również uzyskać od dostawców oligonukleotydów. - Po zakończeniu ostatniego cyklu syntezy przenieść CPG ze zsyntetyzowanym oligonukleotydem z kolumny do szklanej fiolki z nakrętką z wkładką teflonową, dodać 1 ml 29% wodorotlenku amonu i inkubować w temperaturze 55 °C przez 8 godzin w celu oddzielenia oligonukleotydu od CPG i usunięcia grup ochronnych z zasad i fosforanów.
- Odparować wodorotlenek amonu za pomocą parownika odśrodkowego w temperaturze 40 °C i ponownie rozpuścić oligonukleotyd w 0,2 ml 0,1 M octanu n-heksyloamonu.
- Oczyść syntetyczny oligonukleotyd za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami przy użyciu kolumny polistyren-diwinylobenzen z buforem zawierającym 10-50% acetonitrylu/0,1 M octanu n-heksyloamoniowego. Uruchomić kolumnę z prędkością 2,0 ml/min przez 25 minut w temperaturze 80 °C.
- Dodać 0,25-0,5 ml stężonego kwasu octowego do frakcjonowanej próbki (1-2 ml), aby uzyskać 20% roztwór kwasu octowego i inkubować ten roztwór przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w celu usunięcia grupy DMT.
- Wysuszyć próbkę za pomocą parownika odśrodkowego w temperaturze 40 °C, ponownie rozpuścić ją w 1 ml 29% wodorotlenku amonu i inkubować roztwór przez 15 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia łańcucha bocznego fosforanu 5′.
- Zmniejszyć objętość (1 ml) próbki do około 0,3 ml za pomocą wyparki odśrodkowej o temperaturze 40 °C.
- Całą zagęszczoną próbkę należy dializować w wodzie destylowanej (500 ml) za pomocą rurki dializacyjnej o masie cząsteczkowej o wartości granicznej masy cząsteczkowej 1 000 w temperaturze 4 °C przez noc.
- Przenieść dializowaną próbkę z rurki dializacyjnej do probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety, wysuszyć ją za pomocą parownika odśrodkowego w temperaturze 40 °C, a następnie ponownie rozpuścić w wodzie do wstrzykiwań, której objętość powinna być na tyle mała, aby uzyskać roztwór większy niż 100 μM.
- Zmierzyć gęstość optyczną próbki RNA o długości fali 260 nm za pomocą spektrofotometru i dostosować jej stężenie do 100 μM, dodając wodę do wstrzykiwań. Przed użyciem roztwór RNA należy przechowywać w temperaturze poniżej -20 °C.
2. Badanie przesiewowe biblioteki sgRNA pod kątem żywotności komórek
- Przygotuj 103 komórek/99 μl/basenik (np. HL60 i RPMI-8226) na 96-dołkowej pożywce w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% roztworem penicyliny-streptomycyny. Przygotuj studzienki zawierające pożywkę tylko do odejmowania tła. Aby wyeliminować efekty krawędziowe, dodaj sterylną wodę do pustych studzienek otaczających studzienki na próbkę.
- Dodać 1 μl sgRNA typu heptamerowego (100 μM) rozpuszczonego w wodzie do wstrzykiwań do każdej studzienki. Oznacz każdy sgRNA w trzech egzemplarzach. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 przez 3 dni.
- Do każdej studzienki dodać odpowiednią objętość dostępnego w handlu roztworu WST-8. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w tym samym inkubatorze przez 1 do 4 godzin.
- Zmierzyć absorbancję przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
UWAGA: W większości przypadków liniowość między absorbancją a liczbą żywotnych komórek wydaje się być zachowana, chyba że wartość absorbancji przekracza 1,0.
3. Ocena skutecznych sgRNA za pomocą cytometrii przepływowej
- Przygotuj 103 komórek/99 μl/basenik (np. HL60) na 96-dołkowej szalce w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% roztworem penicyliny-streptomycyny. Przygotuj co najmniej 10 studzienek na jeden sgRNA do przetestowania. Aby wyeliminować efekty krawędziowe, dodaj sterylną wodę do pustych studzienek otaczających studzienki na próbkę.
- Dodać 1 μl sgRNA typu heptamerowego (100 μM) rozpuszczonego w wodzie do wstrzykiwań do każdej studzienki. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 przez 3 dni.
- Zebrać komórki potraktowane tym samym sgRNA z co najmniej 10 dołków do 5-mililitrowej probówki z pipetą. Wirować probówkę przez 5 minut w wirówce o masie 300 x g i wyrzucić pożywkę.
- Dodać 2 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) do probówki i ponownie zawiesić komórki. Wirować probówkę przez 5 minut w wirówce o sile 300 x g i wyrzucić PBS. Dodać 150 μl 1x buforu wiążącego anektynę V do probówki i ponownie zawiesić komórki.
- Dodać 2 μl sprzężonego z fikoerytryną (PE) roztworu aneksyny V i 1 μl roztworu 7-aminoaktynomycyny D (7AAD) do probówki, dobrze wymieszać i inkubować probówkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Przeanalizować próbkę za pomocą cytometru przepływowego24.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Sześć sgRNA typu heptamerowego: 5′-AUCUUCA-3′ (H1885), 5′-ACACACA-3′ (H3277), 5′-GGGGGCG-3′ (H10927), 5′-GGGGCCC-3′ (H10944), 5′-GCCCCCG-3′ (H12287) oraz 5′-CACCAGC-3′ (H13260) zostało zsyntetyzowane chemicznie jako RNA 2′-O-metylowane zawierające fosforany na końcach 5′ i 3′.
sgRNA te zbadano pod kątem wpływu na żywotność ludzkiej linii komórkowej białaczki HL60 oraz ludzkiej linii komórkowej szpiczaka RPMI-8226. Repre...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W większości przypadków w pełni 2′-O-metylowane, 5′- i 3′-fosforylowane sgRNA typu heptamerowego rozpuszczone w wodzie do wstrzykiwań (w stężeniu 100 μM) wydają się być stabilne w temperaturze poniżej -20 °C przez co najmniej rok, sądząc po ich aktywności w zakresie indukowania apoptozy w komórkach rakowych. Jednak ich stabilność zmieniałaby się w zależności od ich kolejności, jakości i czystości. W niektórych przypadkach 5′- lub 3′-fosforan części cząsteczek sgRNA wydaje się być usuwany spontanicznie podczas pr...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Uniwersytet Farmacji i Stosowanych Nauk Przyrodniczych w Niigata złożył wniosek patentowy dotyczący podzbioru sgRNA typu heptamerowego.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Adaptable and Seamless Technology Transfer Program poprzez Target-driven R&D, Japońską Agencję Nauki i Technologii, Fundusz Promocji Badań Naukowych z Korporacji Promocji i Wzajemnej Pomocy dla Prywatnych Szkół Japonii, oraz JSPS KAKENHI Granty o numerach 24300342 i 15H04313.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Niestandardowy heptamer RNA | Nippon Bioservice | ||
| OligoSep Prep HC Cartridge | Transgenomic | 99-3860 | |
| Woda do wstrzykiwań | Woda Otsuka Pharmaceutical | 7131400A2129 | |
| RPMI-1640 średni | Wako | 189-02025 | |
| Surowica bydlęca | płodu SIGMA-ALDRICH | 172012-500ML | |
| Roztwór mieszany penicyliny i streptomycyny | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
| 96 Płytka dołkowa | Greiner Bio-one | 655 180 | |
| Zestaw do liczenia komórek-8 | DOJINDO | 343-07623 | WST-8 rozwiązanie |
| Czytnik mikropłytek, Sunrise Thermo RC-R | TEKAN | 510-82851 | |
| FACS Rurka okrągłodenna | BD Falcon | 60819-820 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami | SIGMA-ALDRICH | P7059-1L | |
| PE Aneksyna V Bufor | wiążący BD Biosciences | 51-66121E | |
| PE Aneksyna V | BD Biosciences | 51-65875X | |
| 7AAD | SIGMA-ALDRICH | A9400-1MG | |
| , FACSCalibur | BD Biosciences | 342973 |
Bibliografia
- Scherer, L., Rossi, J. J. Therapeutic potential of RNA-mediated control of gene expression: Options and designs. RNA and the Regulation of Gene Expression: A hidden layer of complexity. Morris, K. V. , Caister Academic Press. 201-226 (2008).
- Nashimoto, M. Conversion of mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease to four-base-recognizing RNA cutters. Nucleic Acids Res. 23, 3642-3647 (1995).
- Nashimoto, M. Specific cleavage of target RNAs from HIV-1 with 5′ half tRNA by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. RNA. 2, 523-534 (1996).
- Nashimoto, M., Geary, S., Tamura, M., Kasper, R. RNA heptamers that directs RNA cleavage by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 26, 2565-2571 (1998).
- Nashimoto, M. Anomalous RNA substrates for mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. FEBS Lett. 472, 179-186 (2000).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A candidate prostate cancer susceptibility gene encodes tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 31, 2272-2278 (2003).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. The N-terminal half-domain of the long form of tRNase Z is required for the RNase 65 activity. Nucleic Acids Res. 32, 4429-4438 (2004).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A novel four-base-recognizing RNA cutter that can remove the single 3′ terminal nucleotides from RNA molecules. Nucleic Acids Res. 32, e91(2004).
- Shibata, H. S., Takaku, H., Takagi, M., Nashimoto, M. The T loop structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL. J. Biol. Chem. 280, 22326-22334 (2005).
- Tamura, M., Nashimoto, C., Miyake, N., Daikuhara, Y., Ochi, K., Nashimoto, M. Intracellular mRNA cleavage by 3′ tRNase under the direction of 2′-O-methyl RNA heptamers. Nucleic Acids Res. 31, 4354-4360 (2003).
- Habu, Y., et al. Inhibition of HIV-1 gene expression by retroviral vector-mediated small-guide RNAs that direct specific RNA cleavage by tRNase ZL. Nucleic Acids Res. 33, 235-243 (2005).
- Nakashima, A., et al. Gene-silencing by the tRNA maturase tRNase ZL under the direction of small guide RNA. Gene Ther. 14, 78-85 (2007).
- Elbarbary, R. A., Takaku, H., Tamura, M., Nashimoto, M. Inhibition of vascular endothelial growth factor expression by TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 379, 924-927 (2009).
- Sano, T., Takahashi, M., Nozaki, T., Takahashi, Y., Tamura, M., Nashimoto, M. Expanding the utility of heptamer-type sgRNA for TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 416, 427-432 (2011).
- Iizuka, S., Oridate, N., Nashimoto, M., Fukuda, S., Tamura, M. Growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma cells by sgRNA targeting the cyclin D1 mRNA based on TRUE gene silencing. PLoS One. 9 (114121), (2014).
- Takahashi, M., et al. Elimination of specific miRNAs by naked 14-nt sgRNAs. PLoS One. 7 (38496), (2012).
- Takahashi, M., et al. A naked RNA heptamer targeting the human Bcl-2 mRNA induces apoptosis of HL60 leukemia cells. Cancer Lett. 328, 362-368 (2013).
- Watanabe, N., et al. Induction of apoptosis of leukemic cells by TRUE gene silencing using small guide RNAs targeting the WT1 mRNA. Leukemia Res. 37, 580-585 (2013).
- Elbarbary, R. A., et al. Modulation of gene expression by human cytosolic tRNase ZL through 5′-half-tRNA. PLoS One. 4, 5908(2009).
- Elbarbary, R. A., et al. Human cytosolic tRNase ZL can downregulate gene expression through miRNA. FEBS Lett. 583, 3241-3246 (2009).
- Ninomiya, S., et al. Potential small guide RNAs for tRNase ZL from human plasma, peripheral blood mononuclear cells, and cultured cell lines. PLoS One. 10, 0118631(2015).
- Takahashi, M., et al. Screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic agents against hematological malignancies. Leukemia Res. 38, 808-815 (2014).
- Solid-phase oligonucleotide synthesis. ATD Bio. , Available from: http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis (2015).
- FACSCalibur Instructions For Use. BD Bio. , Available from: http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf (2007).
- Shivarov, V. TRUE gene silencing for hematologic malignancies. Leukemia Res. 38, 729(2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
