Artykuł metodologiczny

Jednoczesne wykrywanie aktywacji c-FOS z mezolimbicznych i mezokortykalnych miejsc nagrody dopaminy po naiwnym spożyciu cukru i tłuszczu u szczurów

DOI:

10.3791/53897

⸱

24 sierpnia 2016

 ,  , 
1Behavioral and Cognitive Neuroscience Cluster, Psychology Doctoral Program, The Graduate Center, CUNY, New York, NY, 2Department of Psychology, Queens College, CUNY, Flushing, NY, 3Behavioral and Cognitive Neuroscience Cluster, Psychology Doctoral Program, The Graduate Center, CUNY, Flushing, NY

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego badania jest zidentyfikowanie rozproszonych sieci mózgowych związanych z nagrodą poprzez nakreślenie niezawodnej techniki immunohistologicznej wykorzystującej komórkową aktywację c-fos do pomiaru jednoczesnych zmian w szlakach dopaminy i miejscach końcowych po nowym spożyciu tłuszczu i cukru u szczurów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie wykorzystuje komórkową aktywację c-fos do oceny wpływu nowego spożycia tłuszczu i cukru na szlaki dopaminy (DA) w mózgu u szczurów. Spożycie cukrów i tłuszczów jest zapośredniczone przez ich wrodzoną atrakcyjność, a także wyuczone preferencje. Dopamina w mózgu, zwłaszcza projekcje mezolimbiczne i mezokorowe z brzusznego obszaru nakrywki (VTA), jest zaangażowana w obie te niewyuczone i wyuczone reakcje. Zaproponowano koncepcję rozproszonych sieci mózgowych, w których oddziałuje na siebie kilka miejsc i systemów przekaźnik/peptyd, aby pośredniczyć w przyjmowaniu smacznego pokarmu, ale istnieją ograniczone dowody empirycznie wykazujące takie działania. W ten sposób spożycie cukru wywołuje uwalnianie DA i zwiększa immunoreaktywność podobną do c-fos (FLI) z poszczególnych stref projekcji VTA DA, w tym jądra półleżącego (NAC), ciała migdałowatego (AMY) i przyśrodkowej kory przedczołowej (mPFC), a także prążkowia grzbietowego. Co więcej, centralne podawanie selektywnych antagonistów receptora DA do tych miejsc w różny sposób zmniejsza nabywanie i ekspresję uwarunkowanych preferencji smakowych wywoływanych przez cukry lub tłuszcze. Jednym z podejść do określenia, czy te miejsca oddziaływały na siebie jako rozproszona sieć mózgowa w odpowiedzi na spożycie cukru lub tłuszczu, byłaby jednoczesna ocena, czy VTA i jego główne strefy projekcji mezotelencefalicznego DA (przedlimbiczne i podlimbiczne mPFC, rdzeń i powłoka NAc, podstawno-boczne i centralno-korowo-przyśrodkowe AMY), a także prążkowie grzbietowe wykazywałyby skoordynowaną i jednoczesną aktywację FLI po podaniu doustnym, Bezwarunkowe spożycie roztworów oleju kukurydzianego (3,5%), glukozy (8%), fruktozy (8%) i sacharyny (0,2%). Podejście to jest udanym pierwszym krokiem w kierunku określenia wykonalności jednoczesnego wykorzystania komórkowej aktywacji c-fos w odpowiednich miejscach w mózgu do badania uczenia się związanego z nagrodą w spożywaniu smacznego pokarmu u gryzoni.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dopamina w mózgu (DA) została zaangażowana w centralne reakcje na spożycie smacznych cukrów poprzez proponowane hedoniczne1,2, związane z wysiłkiem3 i oparte na nawykumechanizmy działania 4,5. Pierwotny szlak DA zaangażowany w te efekty wywodzi się z brzusznego obszaru nakrywki (VTA) i rzutuje na rdzeń i powłokę jądra półleżącego (NAC), ciało migdałowate podstawno-boczne i środkowo-korowo-przyśrodkowe (AMY) oraz przedlimbiczną i podlimbiczną przyśrodkową korę przedczołową (mPFC) (patrz przeglądy6,7). VTA jest związana ze spożyciem sacharozy8,9, a uwalnianie DA obserwuje się po spożyciu cukru w NAC10-15, AMY16,17 i mPFC18-20. Spożycie tłuszczu stymuluje również uwalnianie DANAC 21, a inna bogata w DA strefa projekcji do prążkowia grzbietowego (ogoniastego-skorupy) jest również związana z karmieniem za pośrednictwem DA22,23. Kelley24-27 zasugerował, że te liczne strefy projekcyjne tego systemu, w którym pośredniczy DA, tworzą zintegrowaną i interaktywną rozproszoną sieć mózgową poprzez rozległe i intymne wzajemne połączenia.

Oprócz zdolności antagonistów receptorów DA D1 i D2 do zmniejszania spożycia cukrów35-37 i tłuszczów38-40, sygnalizacja DA jest również zaangażowana w pośredniczenie w zdolności cukrów i tłuszczów do wytwarzania uwarunkowanych preferencji smakowych (CFP)41-46. Mikroiniekcja antagonisty receptora DA D1 do NAC, AMY lub mPFC47-49 eliminuje nabywanie CFP wywołanego przez glukozę w żołądku. Podczas gdy mikrowstrzyknięcia antagonistów receptora DA D1 lub D2 do mPFC eliminują nabywanie fruktozy-CFP50, nabywanie i ekspresja fruktozy-CFP są w różny sposób blokowane przez antagonistów DA w NAC i AMY51,52.

Technika c-fos53,54 została wykorzystana do zbadania aktywacji neuronalnej wywołanej przez smaczne spożycie i aktywację neuronalną. Termin "aktywacja c-fos" będzie używany w całym manuskrypcie i jest operacyjnie zdefiniowany przez zwiększoną transkrypcję c-Fos podczas depolaryzacji neuronów. Przyjmowanie sacharozy zwiększało immunoreaktywność podobną do fos (FLI) w centralnym jądrze AMY, VTA, a także w powłoce, ale nie w rdzeniu NAC55-57. Podczas gdy spożycie sacharozy u szczurów karmiących pozorami znacznie zwiększyło FLI w AMY i NAC, ale nie w VTA58, dożołądkowe wlewy sacharozy lub glukozy znacznie zwiększyły FLI w NAC oraz jądrach centralnych i podstawno-bocznych AMY59,60. Wielokrotne dodawanie sacharozy do zaplanowanego dostępu do karmy zwiększało FLI w mPFC, a także w powłoce NAC i rdzeniu61. Paradygmat obniżania stężenia sacharozy ujawnił, że największy wzrost FLI wystąpił w podstawno-bocznym AMY i NAC, ale nie w VTA62. Po kondycjonowaniu, wygaśnięcie naturalnych zachowań nagrody związanych z cukrem zwiększyło FLI w podstawno-bocznym AMY i NAC63. Co więcej, połączenie dostępności cukru z tonem spowodowało, że ton następnie zwiększył poziom FLI w podstawno-bocznym AMY64. Spożycie dużej ilości tłuszczu zwiększyło również FLI w miejscach NAC i mPFC65-67.

Większość wcześniej cytowanych badań dotyczyła wpływu cukru i tłuszczu na aktywację c-fos w pojedynczych miejscach, które nie dostarczają informacji na temat identyfikacji rozproszonych sieci mózgowych związanych z nagrodą24-27. Co więcej, wiele badań nie określiło również względnego wkładu podobszarów NAC (rdzeń i powłoka), AMY (podstawno-boczny i centralno-korowo-przyśrodkowy) oraz mPFC (przedlimbiczny i infralimbiczny), które mogłyby być potencjalnie zbadane przez przewagę doskonałej rozdzielczości przestrzennej, pojedynczej komórki w mapowaniu c-Fos68. Nasze laboratorium69 niedawno wykorzystało aktywację c-fos i jednocześnie zmierzyło zmiany w szlaku VTA DA i jego strefach projekcji (NAC, AMY i mPFC) po spożyciu nowych tłuszczów i cukrów u szczurów. W niniejszym badaniu opisano kroki proceduralne i metodologiczne mające na celu jednoczesną analizę, czy ostre narażenie na sześć różnych roztworów (olej kukurydziany, glukoza, fruktoza, sacharyna, woda i kontrola emulsji tłuszczowej) w różny sposób aktywowałoby FLI w podobszarach NAC, AMY, mPFC, a także w prążkowiu grzbietowym. To jednoczesne wykrycie różnic pozwoliło potwierdzić znaczący wpływ na FLI w każdym miejscu i określić, czy zmiany w jednym konkretnym miejscu korelują ze zmianami w powiązanych miejscach, zapewniając w ten sposób wsparcie dla rozproszonej sieci mózgowej24-27. Procedury te sprawdzały, czy VTA, mPFC przedlimbiczny i podlimbiczny, rdzeń i powłoka NAC oraz podstawno-boczny i centralno-korowo-przyśrodkowy AMY), a także prążkowie grzbietowe będą wykazywać skoordynowaną i jednoczesną aktywację FLI po doustnym, bezwarunkowym spożyciu roztworów glukozy (8%), fruktozy (8%), oleju kukurydzianego (3,5%) i sacharyny (0,2%).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt, poświadczając, że wszystkie tematy i procedury są zgodne z Przewodnikiem Narodowych Instytutów Zdrowia dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Tematy

  1. Zakup i/lub hodowla samców szczurów Sprague-Dawley (260 - 300 g).
  2. Szczury domowe pojedynczo w klatkach z siatki drucianej. Utrzymuj je w cyklu światło/ciemność o godzinie 12:12 z karmą dla szczurów i wodą dostępną ad libitum.
  3. Odpowiednie wielkości próby (np. n ≈ 6 - 8) należy losowo podzielić na grupy.

2. Aparatura testowa i procedury przyjmowania

  1. Użyj skalibrowanych probówek wirówkowych z gumowymi korkami i metalową rurką spijającą pod kątem 45°, aby zapewnić dokładny pomiar (± 0,1 ml) prezentowanych roztworów. Przymocuj je do klatek domowych za pomocą napiętej metalowej sprężyny, aby zapewnić widoczność kalibracji.
  2. Ogranicz racje pokarmowe (~ 15 / g / dzień) szczurów, aby zmniejszyć wagę do 85% ich pierwotnej masy ciała, aby zwiększyć motywację do spożywania roztworów. Uwaga: Redukcja masy ciała powinna trwać od 3 do 5 dni.
  3. Zapewnij roztwory przedtreningowe (10 ml) 0,2% sacharyny przez cztery dni podczas 1-godzinnej sesji, aby zmaksymalizować prawdopodobieństwo, że szczury będą pobierać próbki kolejnych roztworów testowych z krótkim (mniej niż 1 min) opóźnieniem.
  4. Potwierdź przepływ przez probówkę wirówkową, rozlewając kilka kropli.
  5. Zważ probówki przed i po każdej sesji, aby uzyskać pomiar spożycia.
  6. Wykonaj test spożycia piątego dnia na podgrupach otrzymujących jeden z sześciu roztworów (10 ml, 1 godz.): a) woda, b) o nowym smaku (0,05% smaku wiśniowego), 0,2% sacharyny, c) 8% fruktozy, d) 8% glukozy, e) 3,5% oleju kukurydzianego zawieszonego w 0,3% gumie ksantanowej i f) 0,3% gumy ksantanowej.
  7. Upewnij się, że pożywki są izokaloryczne, a zatem stężenie 3,5% oleju kukurydzianego jest izokaloryczne w stosunku do 8% roztworów cukru.
  8. Upewnij się, że szczury pobierają próbki roztworów z krótkim opóźnieniem (mniej niż 1 min). Jeśli ten wymóg nie zostanie spełniony, należy odrzucić uczestnika z badania.

3. Przygotowanie tkanek

  1. Znieczulić każde zwierzę przez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu 90 minut po początkowym narażeniu na każdy badany roztwór. Potwierdź, że zwierzęta są odpowiednio znieczulone, wykazując, że zwierzę nie reaguje już na takie odruchy, jak wycofanie się do szczypania stopy, mruganie po bezpośrednim ucisku na rogówkę lub potrząsanie głową w celu głębokiej stymulacji małżowiny usznej.
  2. Wykonaj perfuzję przesierdziową każdego zwierzęcia, jak opisano wcześniej69.
    1. Znieczulić szczury przedawkowaniem pentobarbitalu sodu (65 mg/kg), usunąć klatkę piersiową i odsłonić klatkę piersiową, aby uzyskać swobodny dostęp do serca69.
    2. Umieść igłę w wierzchołku lewej zastawki serca i przetnij żyłę główną. Podać buforowy roztwór fosforanowy (PBS, ~ 180 ml), a następnie utrwalacz buforowany fosforanem zawierający 4% paraformaldehydu (~ 180 ml).
    3. Upewnij się, że zwierzę jest prawidłowo ukrwione, badając, czy płyn opuszcza inne jamy, takie jak nos, usta i okolice narządów płciowych. Uwaga: Prawidłowemu utrwaleniu za pomocą paraformaldehydu będą towarzyszyć duże ruchy mięśni. Jeśli tak się nie stanie, należy ponownie wyregulować igłę, aż do wystąpienia tej reakcji.
  3. Szybko usuń mózg z czaszki, odcinając futro i skórę od czaszki. Użyj rongeurs, aby złamać i usunąć kość z mózgu, przesuwając się od tyłu do przodu. Pracuj początkowo w obszarze poniżej i za móżdżkiem, upewniając się, że rongeur znajduje się między kością a oponami mózgowo-rdzeniowymi. Po usunięciu górnej i bocznej części czaszki użyj małej szpatułki, aby podnieść mózg z podstawy i przeciąć nerwy czaszkowe małymi nożyczkami. Uważaj, aby nie uszkodzić mózgu podczas próby usunięcia kości.
  4. Utrwal mózgi w 4% roztworze paraformaldehydu na noc w temperaturze 4 °C. Umieść mózgi w roztworze 30% sacharozy/70% PBS w temperaturze pokojowej, aż osiądą na dnie pojemnika.
  5. Zablokuj mózg
    1. Usuń rostralną część mózgu, przecinając poprzecznie ogonowo do opuszki węchowej.
    2. Usuń ogonową część mózgu, przecinając poprzecznie na poziomie móżdżku i mostu.
  6. Zamontuj mózg koronalnie z częścią ogonową przymocowaną do stopnia przesuwającego się mikrotomu i przetnij odcinki koronalne (40 μm) przez mPFC (+2,86 – +2,20 mm rostral do bregma), rdzeń i muszlę NAC oraz prążkowie grzbietowe (+1,76 – +1,60 mm rostral do bregma), AMY (-2,12 – -2,92 mm ogonowo do bregma), i VTA (-5,20 – -5,60 mm ogonowo do bregma). Użyj atlasu mózgu szczura70 w celu uzyskania wskazówek.
  7. Zebrać swobodnie pływające sekcje do indywidualnych dołków 24-dołkowej płytki wypełnionej PBS w celu ostatecznej analizy immunohistochemicznej71. Użyj Parafilm, aby uszczelnić 24-dołkową płytkę, aby upewnić się, że PBS nie wyparuje w pojemniku i nie wysuszy mózgu. Przechowywać tkankę mózgową w temperaturze 4 °C.

4. Procedury c-fos (Dostosowane z 71)

  1. Potraktuj każdą sekcję 5 ml 5% normalnej surowicy koziej i 0,2% Triton x-100 w PBS przez 1 godzinę.
  2. Inkubować poddane działaniu substancji sekcje z pierwszorzędowymi przeciwciałami (króliczy anty-c-fos, 1:5 000) w temperaturze 4 °C przez 36 godzin w studzienkach zawierających 1 ml PBS.
  3. Płukać sekcje 3x PBS (5 ml) przez 10 min każda.
  4. Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi (biotynylowany kozioł anty-królik; 1:200) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny w studzienkach zawierających 1 ml PBS.
  5. Płucz każdą sekcję 3x w PBS (5 ml) przez 10 min każda.
  6. Inkubować wypłukane skrawki przez 2 godziny w dostępnej w handlu mieszaninie awidyny i peroksydazy chrzanowej, która jest dostarczana w zestawie składającym się z Avadin DH (100 μl) i biotynylowanej peroksydazy chrzanowej H (100 μl) w 5 ml PBS.
  7. Ponownie przepłukać sekcje 3x w PBS (5 ml) przez 10 minut każda.
  8. Skrawki reagować z 0,05% diaminobenzydyną (DAB) w obecności 0,0015% H2O2 przez 5 - 10 minut, w zależności od reaktywności tkanki w studzienkach zawierających 5 ml roztworu DAB.
  9. Oznacz dwukrotnie sekcje VTA. Inkubować je z przeciwciałem przeciwko hydroksylazie tyrozynowej (TH) (królicze przeciwciało przeciw szczurom TH, 1:2 000) w PBS (5 ml) przez noc w temperaturze 4 °C.
  10. Płukać sekcje 3x w PBS (5 ml) przez 10 min każda.
  11. Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi (biotynylowany kozioł anty-królik; 1:200) w PBS (5 ml) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
  12. Płukać sekcje 3x w PBS (5 ml) przez 10 min każda.
  13. Wizualizacja przeciwciał za pomocą drugorzędowego kompleksu przeciwciało-peroksydaza. Reagować z kombinacją 0,05% DAB i 0,3% roztworu siarczanu niklu przez 5 - 10 minut, w zależności od reakcji tkanki w studzienkach zawierających 5 ml roztworu DAB/NiCl.
  14. Upewnij się, że roztwór DAB ma mleczny jasnozielony kolor w wyniku reakcji z 0,3% siarczanem niklu. Jeśli roztwór jest zbyt zielony, reakcja będzie zbyt ciemna.
  15. Zamontuj wszystkie sekcje na szkiełkach pokrytych żelatyną. Pozostaw je do wyschnięcia na noc, a następnie nakryj je kilkoma kroplami roztworu na bazie toluenu (TBS).
  16. Kod przesuwa się tak, że warunek eksperymentalny jest nieznany obserwatorom.

5. Oznaczanie liczby immunoreaktywnych c-fos

  1. Przypisz pary bezstronnych obserwatorów do policzenia neuronów fos-dodatnich w tych regionach zainteresowania (ROI): przedlimbiczny mPFC, podlimbiczny mPFC, rdzeń NAC, powłoka NAC, podstawno-boczne jądra AMY, centralno-korowo-przyśrodkowe AMY, prążkowie grzbietowe i VTA. Określ, czy immunoreaktywność c-Fos była obecna w komórkach TH+ i TH- w VTA. Rysunek 1 przedstawia zrzut ekranu NAC z mikroskopu.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Reprezentatywna sekcja jądra półleżącego (NAC) przedstawiająca obszary zainteresowania nakreślone przez siatkę, za pomocą której dokonuje się zliczania c-fos. Powłoka NAC znajduje się przyśrodkowo i brzusznie do rdzenia NAC. Rdzeń NAC otacza spoidło przednie (Anterior Comm.). Widoczny jest brzuszny zasięg komory bocznej (Lateral Vent.). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Przeanalizować co najmniej trzy reprezentatywne wycinki na miejsce wspólne dla wszystkich zwierząt we wszystkich warunkach badania.
  2. Użyj oprogramowania i mikroskopu optycznego, aby przeanalizować cały obszar dla każdego zwrotu z inwestycji, śledząc kontur (rysunek 1).
    1. Dla danej witryny otwórz aplikację i kliknij w menu rozwijane akwizycji, a następnie kliknij "Live Image". Ustaw ostrość na ROI i kliknij ekran, aby ustalić punkt odniesienia. Następnie prześledź wybrany obszar mózgu, korzystając z siatki jako przewodnika. Po zakończeniu śledzenia policz komórki (kroki 5.3.1.1 - 5.3.1.3).
      1. Kliknij dwukrotnie ikonę oprogramowania. Przejdź do paska menu, kliknij "Akwizycja", a następnie "Obraz na żywo". Ustaw ostrość na ROI i kliknij ekran, aby ustalić punkt odniesienia.
      2. Przejdź do paska narzędzi siatki i kliknij "Wyświetl siatkę" i "Użyj etykiet siatki". Określ zwrot z inwestycji za pomocą wcześniej określonego śladu.
      3. Policz wszystkie komórki w każdym obszarze ROI, wybierz "+" na pasku bocznym po lewej stronie, aby zliczać komórki c-fos. Kliknij każdą komórkę pojedynczo, aby zarejestrować liczby. Rozważ komórkę dodatnią dla c-fos, gdy obserwuje się zdefiniowany ciemny czerwony okrąg (ryc. 1).
    2. Powtórz ten proces dla każdej witryny.
    3. Zapisuj liczby w notatniku laboratoryjnym i na komputerze do przyszłej analizy. Przejdź do paska menu, kliknij "Plik", "Zapisz plik danych", aby zapisać śledzenie i zliczenia.
  3. Upewnij się, że wiarygodność między oceniającymi (przy użyciu korelacji liczb) dwóch niedoinformowanych oceniających dla każdej sekcji w każdym ROI zawsze przekracza 0,8.

6. Statystyki

  1. Oceń wyjściowe spożycie sacharyny w ciągu pierwszych czterech dni, korzystając z powtarzanej jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), porównując spożycie sacharyny w dniach 1, 2, 3 i 469.
  2. Porównaj spożycie sacharyny (dzień 4) ze spożyciem testowym (dzień 5) sześciu grup przy użyciu randomizowanego bloku 2-drożnego ANOVA69.
  3. Użyj porównań Tukeya (p < 0,05), aby określić poszczególne znaczące efekty69.
  4. Określ wiarygodność między oceniającymi, a następnie użyj wspólnych zliczeń obserwatora.
  5. Średnia liczba c-fos dla trzech reprezentatywnych wycinków dla każdej lokalizacjiwynosi 69.
    1. Wykonaj 1-kierunkową ANOVA aktywacji c-fos indukowanej spożyciem sześciu roztworów (3,5% oleju kukurydzianego, 8% glukozy, 8% fruktozy, 0,2% smakowej sacharyny, kontroli gumy ksantanowej i wody) dla okołolimbicznego mPFC69.
    2. Powtórz równoległe analizy sześciu grup dla podlimbicznego mPFC, rdzenia NAC, powłoki NAC, podstawno-bocznego AMY, centralno-korowo-przyśrodkowego AMY, VTA i prążkowia grzbietowego. Użyj porównań Tukeya (p < 0,05), aby ujawnić indywidualne znaczące efekty69.
  6. Porównaj spożycie oleju kukurydzianego zarówno ze spożyciem wody, jak i spożyciem jego zawiesiny, gumy ksantanowej. Porównaj spożycie fruktozy i glukozy zarówno ze spożyciem wody, jak i spożyciem nieodżywczego słodzika, sacharyny.
  7. Ustal, czy zaobserwowano istotne zależności między spożyciem roztworu a aktywacją c-fos w każdym z miejsc za pomocą korelacji Bonferroni r (p < 0,05).
    1. Systematycznie porównuj liczbę c-fos w okołolimbicznej i infralimbicznej korze przedczołowej dla każdego zwierzęcia w grupie 3,5% oleju kukurydzianego.
    2. Powtarzaj systematycznie równoległe analizy każdej pary sześciu miejsc (VTA, prążkowie grzbietowe, mPFC infralimbiczne, mPFC okołolimbiczne, rdzeń NAC, powłoka NAC, AMY podstawno-boczny, AMY centralno-korowo-przyśrodkowe) dla 3,5% oleju kukurydzianego.
    3. Powtarzaj systematycznie równoległe analizy tych sześciu miejsc dla pozostałych pięciu eksperymentalnych warunków spożycia (8% glukozy, 8% fruktozy, 0,2% smakowej sacharyny, kontrola gumy ksantanowej i woda).
  8. Skorzystaj z faktu, że te same zwierzęta w warunkach roztworu oceniano we wszystkich miejscach, określając istotne relacje między aktywacją c-fos w różnych roztworach i w każdym roztworze za pomocą korelacji Bonferroni r (p < 0,05).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie reprezentatywne wyniki opisane poniżej zostały opublikowane wcześniej69 i są ponownie prezentowane tutaj, aby wesprzeć "dowód koncepcji" wskazujący na skuteczność techniki.

Spożycia roztworu
Istotne różnice w wyjściowym spożyciu sacharyny zaobserwowano w ciągu pierwszych czterech dni dla wszystkich zwierząt (F(3,108) = 57,27, p < 0,001) przy spożyciu (Dzień 1: 1,3 (± 0,2) ml; Dzień 2:...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem badania było ustalenie, czy źródło (VTA) i cele projekcji przodomózgowia (NAC, AMY, mPFC) neuronów związanych z nagrodą DA były jednocześnie aktywowane po nowym spożyciu tłuszczu i cukru u szczurów przy użyciu techniki komórkowej c-fos. Niniejsze badanie jest szczegółowym opisem protokołów badania opublikowanego wcześniej69. Postawiono hipotezę, że VTA, jego główne strefy projekcyjne do przedlimbicznego i podlimbicznego mPFC, rdzeń i powłoka NAC oraz podstawno-boczny i centralno-korowo-przyśrodkowy AMY, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podziękowania dla Diany Icaza-Culaki, Cristal Sampson i Theologia Karagiorgis za ich ciężką pracę nad tym projektem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Equipment
Sprague-Dawley szczuryCharles River LaboratoriesCD-1
Klatki z siatki drucianejProdukty laboratoryjne, Seaford, DEStojak
Rat ChowPMI Nutrition International5001
Taut Metal SpringLab Products, Seaford, DEn/a
Waga do ważenia szczurówFisher Scientific Companyn/a
Probówki wirówkowe NalgeneProdukty laboratoryjne, Seaford, DE10-0501
Gumowy korekProdukty laboratoryjne, Seaford, DEn/a
Metal SippersLab Products, Seaford, DEnie dotyczy
sacharynySigma Chemical Co82385-42-0
Kool-Aid, wiśniaKool-AidKomercyjny
Kool-Aid, winogronoKool-AidKomercyjna
fruktozaSigma Chemical CoF0127
GlukozaSigma Chemical CoG8270
Olej kukurydzianyMazzolaKomercyjna
guma ksantanowaSigma Chemical Co11138-66-2
Przesuwny mikrotomMicrom Internationaln/a
Neurolucida CameraMBF BioscienceAplikacja
Szkiełka powlekane żelatynąFisher Scientific Company12-550-343
Szkło nakrywkoweFisher Scientific Company12-545-M
Złote nylonowe szczotkiLoew-Cornell 2037
Naturalne sobole do włosów Loew-Cornell 2022
Płytki 24-dołkoweFisher Scientific3527
Płytki 6-dołkoweFisher Scientific3506
Butelki Pyrex 1 LFisher Scientific1395-1L
Wkładka tkankowa (sitko do tkanek)Pipety Fisher Scientific7200214
Eagle World Precision InstrumentsE10 dla 1-10μ l
Pipety Eagle World Precision InstrumentsE100 dla 20-100μ l
Pipety Eagle World Precision InstrumentsE200 dla 50-200μ l
Pipety Eagle World Precision InstrumentsE1000 dla 100-1000μ l
Pipety Eagle World Precision InstrumentsE5000 dla 1000-5000μ l 
Uniwersalne końcówki .1-10 μ lŚwiatowe instrumenty precyzyjne500192
końcówki uniwersalne 5-200 i #956; lŚwiatowe instrumenty precyzyjne500194
końcówki uniwersalne 500-5,000 μ lWorld Precision Instruments500198
Blade Vibroslice 100World Precision InstrumentsBLADE
DPX Medium montażowe Mikroskopia elektronowa 13510
Probówki wirówkowe 15 mlBiologix Research Co.10-0501
Pudełka na slajdyBiologix Research Co.41-6100
Wytrząsarka orbitalna Korporacja Madell   Łodzie wagowe ZD-9556
 Fisher Scientific02-202-100
Pipety jednorazowe 5 mlFisher Scientific13-711-5AM
Stereo Investigator SoftwareMicro Bright FieldSoftware aplikacja
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
odczynniki
Paraformaldehyde granulowanyFisher Scientific19210
NaClFisher ScientificS271-1
Monozasadowy Monozasadowy Sodowy PfhatowyFisherScientific S468-500
Fosforan sodu DifazowyFisher ScientificBP332-500
Wodór Nadtlenek Fisher ScientificH324-500
SafeClear II Fisher Scientific23-044-192
Metanol Fisher ScientificA412-1
Normalna surowica koziaWektorS-1000
Biotynylowany anty-króliczy IgG (H + L)VectorBA-1000
ABC Zestaw ABC Peroksydaza StandardowywektorPK-4000
Anti-cFos (Ab-5) KrólikEMD chem/Cal BiochemPC38
Triton X 100SigmaAldrichX-100
3,3' tetrachlorowodorek diaminobenzydyny SigmaAldrichD5905
Wodorotlenek soduSigmaAldrich5881
Pierwotne przeciwciało THEMD MiliporeAB152
EuthosolVirbac AH
na 30 klatekoprogramowania

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Koob, G. F. Neural mechanisms of drug reinforcement. Ann. N.Y. Acad. Sci. 654, 171-191 (1992).
  2. Wise, R. A. Role of brain dopamine in food reward. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1149-1158 (2006).
  3. Salamone, J. D., Correa, M. The mysterious motivational functions of mesolimbic dopamine. Neuron. 76, 470-485 (2012).
  4. Horvitz, J. C., Choi, W. Y., Morvan, C., Eyny, Y., Balsam, P. D. A "good parent" function of dopamine: transient modulation of learning and performance during early stages of training. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1104, 270-288 (2007).
  5. Wickens, J. R., Horvitz, J. C., Costa, R. M., Killcross, S. Dopaminergic mechanisms in actions and habits. J. Neurosci. 27, 8181-8183 (2007).
  6. Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
  7. Swanson, L. W. The projections of the ventral tegmental area and adjacent regions: a combined fluorescent retrograde tracer and immunofluorescence study in the rat. Brain Res. Bull. 9, 321-353 (1982).
  8. Cacciapaglia, F., Wrightman, R. M., Careli, R. M. Rapid dopamine signaling differentially modulates distinct microcircuits within the nucleus accumbens during sucrose-directed behavior. J. Neurosci. 31, 13860-13869 (2011).
  9. Martinez-Hernandez, J., Lanuza, E., Martinez-Garcia, F. Selective dopaminergic lesions of the ventral tegmental area impair preference for sucrose but not for male sex pheromones in female mice. Eur. J. Neurosci. 24, 885-893 (2006).
  10. Bassareo, V., Di Chiara, G. Differential influence of associative and nonassociative learning mechanisms on the responsiveness of prefrontal and accumbal dopamine transmission to food stimuli in rats fed ad libitum. J. Neurosci. 17, 851-861 (1997).
  11. Bassareo, V., Di Chiara, G. Differential responsiveness of dopamine transmission to food-stimuli in nucleus accumbens shell/core compartments. Neurosci. 89, 637-641 (1999).
  12. Cheng, J., Feenstra, M. G. Individual differences in dopamine efflux in nucleus accumbens shell and core during instrumental conditioning. Learn. Mem. 13, 168-177 (2006).
  13. Genn, R. F., Ahn, S., Phillips, A. G. Attenuated dopamine efflux in the rat nucleus accumbens during successive negative contrast. Behav. Neurosci. 118, 869-873 (2004).
  14. Hajnal, A., Norgren, R. Accumbens dopamine mechanisms in sucrose intake. Brain Res. 904, 76-84 (2001).
  15. Hajnal, A., Smith, G. P., Norgren, R. Oral sucrose stimulation increases accumbens dopamine in the rat. Am. J. Physiol. 286, R31-R37 (2003).
  16. Bassareo, V., Di Chiara, G. Modulation of feeding-induced activation of mesolimbic dopamine transmission by appetitive stimuli and its relation to motivational state. Eur. J. Neurosci. 11, 4389-4397 (1999).
  17. Hajnal, A., Lenard, L. Feeding-related dopamine in the amygdala of freely moving rats. Neuroreport. 8, 2817-2820 (1997).
  18. Bassareo, V., De Luca, M. A., Di Chiara, G. Differential expression of motivational stimulus properties by dopamine in nucleus accumbens shell versus core and prefrontal cortex. J. Neurosci. 22, 4709-4719 (2002).
  19. Feenstra, M., Botterblom, M. Rapid sampling of extracellular dopamine in the rat prefrontal cortex during food consumption, handling, and exposure to novelty. Brain Res. 742, 17-24 (1996).
  20. Hernandez, L., Hoebel, B. G. Feeding can enhance dopamine turnover in the prefrontal cortex. Brain Res. Bull. 25, 975-979 (1990).
  21. Liang, N. C., Hajnal, A., Norgren, R. Sham feeding corn oil increases accumbens dopamine in the rat. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 291, R1236-R1239 (2006).
  22. Dunnett, S. B., Iversen, S. D. Regulatory impairments following selective kainic acid lesions of the neostriatum. Behav. Brain Res. 1, 497-506 (1980).
  23. Salamone, J. D., Zigmond, M. J., Stricker, E. M. Characterization of the impaired feeding behavior in rats given haloperidol or dopamine-depleting brain lesions. Neurosci. 39, 17-24 (1990).
  24. Kelley, A. E. Ventral striatal control of appetitive motivation: role in ingestive behavior and reward-related learning. Neurosci. Biobehav. Rev. 27, 765-776 (2004).
  25. Kelley, A. E. Memory and addiction: shared neural circuitry and molecular mechanisms. Neuron. 44, 161-179 (2004).
  26. Kelley, A. E., Baldo, B. A., Pratt, W. E. A proposed hypothalamic-thalamic-striatal axis for the integration of energy balance, arousal and food reward. J. Comp. Neurol. 493, 72-85 (2005).
  27. Kelley, A. E., Baldo, B. A., Pratt, W. E., Will, M. J. Corticostriatal-hypothalamic circuitry and food motivation: integration of energy, action and reward. Physiol. Behav. 86, 773-795 (2005).
  28. Berendse, H. W., Galis-de-Graaf, Y., Groenewegen, H. J. Topographical organization and relationship with ventral striatal compartments of prefrontal corticostriatal projections in the rat. J. Comp. Neurol. 316, 314-347 (1992).
  29. Brog, J. S., Salyapongse, A., Deutch, A. Y., Zahm, D. S. The patterns of afferent innervation of the core and shell in the "accumbens" part of rat ventral striatum: immunohistochemical detection of retrogradely transported fluoro-gold. J. Comp. Neurol. 338, 255-278 (1993).
  30. McDonald, A. J. Organization of amygdaloid projections to the prefrontal cortex and associated stritum in the rat. Neurosci. 44, 1-14 (1991).
  31. McGeorge, A. J., Faull, R. L. The organization of the projection from the cerebral cortex to the striatum in the rat. Neurosci. 29, 503-537 (1989).
  32. Sesack, S. R., Deutch, A. Y., Roth, R. H., Bunney, B. S. Topographical organization of the efferent projections of the medial prefrontal cortex in the rat: an anterograde tract-tracing study with Phaseolus vulgaris leucoagglutinin. J. Comp. Neurol. 290, 213-242 (1989).
  33. Wright, C. I., Beijer, A. V., Groenewegen, H. J. Basal amygdaloid complex afferents to the rat nucleus accumbens are compartmentally organized. J. Neurosci. 16, 1877-1893 (1996).
  34. Wright, C. I., Groenewegen, H. J. Patterns of convergence and segregation in the medial nucleus accumbens of the rat: relationships of prefrontal cortical, midline thalamic and basal amygdaloid afferents. J. Comp. Neurol. 361, 383-403 (1995).
  35. Geary, N., Smith, G. P. Pimozide decreases the positive reinforcing effect of sham fed sucrose in the rat. Pharmacol. Biochem. Behav. 22, 787-790 (1985).
  36. Muscat, R., Willner, P. Effects of selective dopamine receptor antagonists on sucrose consumption and preference. Psychopharmacol. 99, 98-102 (1989).
  37. Schneider, L. H., Gibbs, J., Smith, G. P. D-2 selective receptor antagonists suppress sucrose sham feeding in the rat. Brain Res. Bull. 17, 605-611 (1986).
  38. Baker, R. W., Osman, J., Bodnar, R. J. Differential actions of dopamine receptor antagonism in rats upon food intake elicited by mercaptoacetate or exposure to a palatable high-fat diet. Pharmacol. Biochem. Behav. 69, 201-208 (2001).
  39. Rao, R. E., Wojnicki, F. H., Coupland, J., Ghosh, S., Corwin, R. L. Baclofen, raclopride and naltrexone differentially reduce solid fat emulsion intake under limited access conditions. Pharmacol. Biochem. Behav. 89, 581-590 (2008).
  40. Weatherford, S. C., Smith, G. P., Melville, L. D. D-1 and D-2 receptor antagonists decrease corn oil sham feeding in rats. Physiol. Behav. 44, 569-572 (1988).
  41. Azzara, A. V., Bodnar, R. J., Delamater, A. R., Sclafani, A. D1 but not D2 dopamine receptor antagonism blocks the acquisition of a flavor preference conditioned by intragastric carbohydrate infusions. Pharmacol. Biochem. Behav. 68, 709-720 (2001).
  42. Baker, R. M., Shah, M. J., Sclafani, A., Bodnar, R. J. Dopamine D1 and D2 antagonists reduce the acquisition and expression of flavor-preferences conditioned by fructose in rats. Pharmacol. Biochem. Behav. 75, 55-65 (2003).
  43. Dela Cruz, J. A., Coke, T., Icaza-Cukali, D., Khalifa, N., Bodnar, R. J. Roles of NMDA and dopamine D1 and D2 receptors in the acquisition and expression of flavor preferences conditioned by oral glucose in rats. Neurobiol. Learn. Mem. 114, 223-230 (2014).
  44. Dela Cruz, J. A., et al. Roles of dopamine D1 and D2 receptors in the acquisition and expression of fat-conditioned flavor preferences in rats. Neurobiol. Learn. Mem. 97, 332-337 (2012).
  45. Yu, W. Z., Silva, R. M., Sclafani, A., Delamater, A. R., Bodnar, R. J. Pharmacology of flavor preference conditioning in sham-feeding rats: effects of dopamine receptor antagonists. Pharmacol. Biochem. Behav. 65, 635-647 (2000).
  46. Yu, W. Z., Silva, R. M., Sclafani, A., Delamater, A. R., Bodnar, R. J. Role of D(1) and D(2) dopamine receptors in the acquisition and expression of flavor-preference conditioning in sham-feeding rats. Pharmacol. Biochem. Behav. 67 (1), 537-544 (2000).
  47. Touzani, K., Bodnar, R. J., Sclafani, A. Activation of dopamine D1-like receptors in nucleus accumbens is critical for the acquisition, but not the expression, of nutrient-conditioned flavor preferences in rats. Eur. J. Neurosci. 27, 1525-1533 (2008).
  48. Touzani, K., Bodnar, R. J., Sclafani, A. Dopamine D1-like receptor antagonism in amygdala impairs the acquisition of glucose-conditioned flavor preference in rats. Eur. J. Neurosci. 30, 289-298 (2009).
  49. Touzani, K., Bodnar, R. J., Sclafani, A. Acquisition of glucose-conditioned flavor preference requires the activation of dopamine D1-like receptors within the medial prefrontal cortex in rats. Neurobiol. Learn. Mem. 94, 214-219 (2010).
  50. Malkusz, D. C., et al. Dopamine signaling in the medial prefrontal cortex and amygdala is required for the acquisition of fructose-conditioned flavor preferences in rats. Behav. Brain Res. 233, 500-507 (2012).
  51. Bernal, S. Y., et al. Role of dopamine D1 and D2 receptors in the nucleus accumbens shell on the acquisition and expression of fructose-conditioned flavor-flavor preferences in rats. Behav. Brain Res. 190, 59-66 (2008).
  52. Bernal, S. Y., et al. Role of amygdala dopamine D1 and D2 receptors in the acquisition and expression of fructose-conditioned flavor preferences in rats. Behav. Brain Res. 205, 183-190 (2009).
  53. Dragunow, M., Faull, R. The use of c-fos as a metabolic marker in neuronal pathway tracing. J. Neurosci. Methods. 29, 261-265 (1989).
  54. VanElzakker, M., Fevurly, R. D., Breindel, T., Spencer, R. L. Environmental novelty is associated with a selective increase in Fos expression in the output elements of the hippocampal formation and the perirhinal cortex. Learn. Mem. 15, 899-908 (2008).
  55. Norgren, R., Hajnal, A., Mungarndee, S. S. Gustatory reward and the nucleus accumbens. Physiol. Behav. 89, 531-535 (2006).
  56. Park, T. H., Carr, K. D. Neuroanatomical patterns of fos-like immunoreactivity induced by a palatable meal and meal-paired environment in saline- and naltrexone-treated rats. Brain Res. 805, 169-180 (1998).
  57. Zhao, X. L., Yan, J. Q., Chen, K., Yang, X. J., Li, J. R., Zhang, Y. Glutaminergic neurons expressing c-Fos in the brainstem and amygdala participate in signal transmission and integration of sweet taste. Nan.Fang Yi.Ke.Da.Xue.Xue.Bao. 31, 1138-1142 (2011).
  58. Mungarndee, S. S., Lundy, R. F., Norgren, R. Expression of Fos during sham sucrose intake in rats with central gustatory lesions. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 295, R751-R763 (2008).
  59. Otsubo, H., Kondoh, T., Shibata, M., Torii, K., Ueta, Y. Induction of Fos expression in the rat forebrain after intragastric administration of monosodium L-glutamate, glucose and NaCl. Neurosci. 196, 97-103 (2011).
  60. Yamamoto, T., Sako, N., Sakai, N., Iwafune, A. Gustatory and visceral inputs to the amygdala of the rat: conditioned taste aversion and induction of c-fos-like immunoreactivity. Neurosci. Lett. 226, 127-130 (1997).
  61. Mitra, A., Lenglos, C., Martin, J., Mbende, N., Gagne, A., Timofeeva, E. Sucrose modifies c-fos mRNA expression in the brain of rats maintained on feeding schedules. Neurosci. 192, 459-474 (2011).
  62. Pecoraro, N., Dallman, M. F. c-Fos after incentive shifts: expectancy, incredulity, and recovery. Behav. Neurosci. 119, 366-387 (2005).
  63. Hamlin, A. S., Blatchford, K. E., McNally, G. P. Renewal of an extinguished instrumental response: Neural correlates and the role of D1 dopamine receptors. Neurosci. 143, 25-38 (2006).
  64. Kerfoot, E. C., Agarwal, I., Lee, H. J., Holland, P. C. Control of appetitive and aversive taste-reactivity responses by an auditory conditioned stimulus in a devaluation task: A FOS and behavioral analysis. Learn. Mem. 14, 581-589 (2007).
  65. Zhang, M., Kelley, A. E. Enhanced intake of high-fat food following striatal mu-opioid stimulation: microinjection mapping and fos expression. Neurosci. 99, 267-277 (2000).
  66. Teegarden, S. L., Scott, A. N., Bale, T. L. Early life exposure to a high fat diet promotes long-term changes in dietary preferences and central reward signaling. Neurosci. 162, 924-932 (2009).
  67. Del Rio, D., et al. Involvement of the dorsomedial prefrontal cortex in high-fat food conditioning in adolescent mice. Behav. Brain Res. 283, 227-232 (2015).
  68. Knapska, E., Radwanska, K., Werka, T., Kaczmarek, L. Functional internal complexity of amygdala: focus on gene activity mapping after behavioral training and drugs of abuse. Physiol. Rev. 87, 1113-1173 (2007).
  69. Dela Cruz, J. A. D., et al. c-Fos induction in mesotelencephalic dopamine pathway projection targets and dorsal striatum following oral intake of sugars and fats in rats. Brain Res. Bull. 111, 9-19 (2015).
  70. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Elsevier. (2006).
  71. Ranaldi, R., et al. The effects of VTA NMDA receptor antagonism on reward-related learning and associated c-fos expression in forebrain. Behav. Brain Res. 216, 424-432 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

cie ki dopaminergiczne VTAprojekcje mezolimbiczneprojekcje mezokortykalneo rodki nagrody w m zguspo ycie cukru i t uszczuprotok immunohistochemicznybarwienie na tyrozynow hydroksylazwizualizacja DABanaliza liczenia kom rek

Powiązane artykuły